ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ХЛОРОТИЧЕСКОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ ЯБЛОНИ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

В открытых базах данных не было обнаружено российских патентов, посвященных ПЦР-диагностике вируса хлоротической пятнистости листьев яблони. Единственным обнаруженным патентом является RU2384045C2, предметом которого является разработка способа оценки растений яблони на вирусную инфекцию с использованием оптических характеристик листьев - степени когерентности светорассеяния и оценки изменения оптической плотности листа. Данный подход предполагает выявление заражённости ACLSV, в том числе при латентном протекании инфекции. Однако, эффективность предполагаемого подхода в значительной степени зависит от квалификации персонала, а также использование специализированного оборудования.

Было обнаружено несколько патентов Китайской Народной Республики, предметом которых являются методы ПЦР-диагностики ACLSV.

CN103382508A (прекратил свое действие, но может быть восстановлен). Предметом патентования являются 4 тест-системы на 3 ключевых вируса (в т.ч. ACLSV) с использованием мультиплексной ПЦР с обратной транскрипцией. При этом, способом детекции в предлагаемом подходе является гель-электрофорез, использование которого сопряжено с высокими рисками контаминации рабочего пространства продуктами амплификации, приводящей, в конечном итоге к получению ложноположительных результатов. Также проблемой мультиплексного подхода является возможное конкурентное ингибирование параллельных реакций, особенно в случаях, когда генетический материал патогена находится в низкой концентрации. Кроме того, не вполне понятна чувствительность разработанных систем.

CN111057794A (прекратил свое действие, но может быть восстановлен). Предмет патентования - несколько праймерных систем для выявления ключевых вирусных патогенов яблони, в т.ч. ACLSV. Однако и в данном случае детекция осуществляется исключительно электрофоретическим методом.

CN103966362A (прекратил свое действие, но может быть восстановлен). Метод определения 4-х вирусов яблони в формате мультиплексной ПЦР с обратной транскрипцией. Преимуществом данной разработки является то, что, помимо специфических праймеров, в её состав входят также праймеры внутреннего контроля (ген фактора элонгации трансляции 1 альфа яблони), позволяющие проводить выявление ложноотрицательных результатов. Детекция результатов также осуществляется исключительно в формате гель-электрофореза. Также не приводятся данные по чувствительности тест-системы.

Анализ опубликованных на сегодняшний день литературных источников показывает, что для диагностики ACLSV используются, главным образом три подхода: визуальная диагностика, иммунохимические методы (ELISA), и различные модификации методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот. При этом визуальные методы диагностики трудоемки и не позволяют выявлять латентную инфекцию. Иммунохимические подходы недостаточно чувствительны, и этот факт существенно снижает возможность их применения с учетом того факта, что в растительном соке вирусы содержатся, как правило, в низких концентрациях. Кроме того, существуют сложности с получением моноклональных антител. Что касается методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, то на эту тематику опубликован целый ряд работ, но детальный анализ опубликованных разработок позволяет выявить их некоторые недостатки. Некоторые статьи описывают разработку методов ПЦР-диагностики, при которых детекция осуществляется методом гель-электрофореза, что, как сказано выше, влечет высокий риск контаминации рабочей зоны [1-3]. Salmon et al., [4] предложили вариант флуоресцентной детекции ACLSV с использованием красителя, связывающегося с большой бороздкой ДНК. Такой подход позволяет снизить до минимума риск контаминации, однако поскольку интеркалирующий краситель может связываться с любой двуцепочечной ДНК, то существует риск неспецифической флуоресценции.

Альтернативой классической и флуоресцентной ПЦР могут быть изотермические методы амплификации, при использовании которых синтез специфического продукта происходит при постоянной температуре. Lu et al., [5] предложили системы выявления ACLSV и других вирусов яблони с использованием петлевой изотермической амплификации (LAMP). Jeong et al., [6] разработали системы выявления ACLSV с использованием рекомбиназно-полимеразной амплификации (RPA), которые, согласно опубликованным данным, в 100 раз превосходят тест-системы на основе классической ПЦР с точки зрения чувствительности. Однако авторы проводили сравнение с тест-системами, не обладающими высокой чувствительностью, поэтому сделать окончательный вывод относительно этого параметра затруднительно. Очевидным недостатком систем на основе изотермических методов является необходимость дизайна 6-8 праймеров, что существенно сужает перечень потенциальных генов-мишеней, а также создаёт риски недостаточной специфичности.

Canales et al., [7] и Costa et al. [8] для изучения спектра вирусов, заражающих яблоню, использовали мультиплексную ПЦР и высокопроизводительное секвенирование. Метод высокопроизводительного секвенирования позволяет получать информацию о полном спектре вирусных патогенов, присутствующих в пробе, однако является дорогостоящим и не может быть использован в рутинной диагностической практике.

Тест-системой с наиболее оптимальными характеристиками, и наиболее близкой к разработке, описываемой в настоящем патенте, является предложенный Nickel and Fajardo [9] предложили метод мультиплексной ПЦР с использованием гидролизуемых (TaqMan) зондов для определения трех вирусов яблони в одной пробе. Как было упомянуто выше, ограничением мультиплексной ПЦР может быть ингибирование одной или инескольких параллельных реакций амплификации. Кроме того, авторы не дают точной информации о чувствительности тест-системы: предел обнаружения составил 2 фг тотальной кДНК, однако данных по минимально детектируемому количеству геном-эквивалентов на реакцию не приводится.

Список иллюстраций

Рис. 1. Выравнивание фрагментов генов белка оболочки ACLSV и близкородственных вирусов, использованных для подбора прямого (ACLSVF) и обратного (ACLSVR) праймеров. Последовательности праймеров подчёркнуты.

Рис. 2. Карта вектора pAL2T, использованного для клонирования положительных контролей.

Рис. 3. Результаты ПЦР последовательных десятикратных разведений плазмиды, содержащей специфический продукт амплификации. По оси абсцисс показано логарифмические значения концентраций (геном-эквиваленты/реакцию), по оси ординат - значения соответствующих пороговых циклов.

Рис. 4. Флуоресцентный сигнал, детектируемый при ПЦР-анализе последовательных десятикратных разведений плазмид, содержащих специфический ампликон, с парой праймеров ACLSVF-ACLSVR и зондом ACLSVT

Техническим результатом является разработка тест-системы для проведения высокоспецифичной идентификации кДНК, с высокой чувствительностью для обнаружения вируса хлоротической пятнистости листьев яблони методом пцр в реальном времени.

Предлагаемое техническое решение позволяет повысить чувствительность детекции, а также избежать проблем, связанных с контаминацией рабочего пространства продуктами амплификации.

Тест-система включает: смесь для проведения амплификации, состоящую из реакционного буфера, дезоксинуклеотидтрифосфатов, двух олигонуклеотидных праймеров, специфичных к фрагменту гена, кодирующего белок оболочки вируса, одного олигонуклеотидного зонда, меченного флуоресцентным красителем FAM, положительного контрольного образца, представляющего собой рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую соответствующий фрагмент генома вируса. Изобретение позволяет проводить высокоспецифичную идентификацию кДНК, с высокой чувствительностью (количество геном-эквивалентов, детектируемое в одной реакционной пробирке - не менее 10).

Дизайн праймеров проводили с помощью выравнивания последовательностей нуклеотидов, депонированных в базе данных NCBI c использованием алгоритма ClustalW. Помимо последовательностей нуклеотидов ACLSV, для выравнивания использовались последовательности нуклеотидов близкородственных видов. Наиболее вариабельным и пригодным для подбора праймеров был фрагмент гена белка оболочки. На рис. 1 приведены выравнивания фрагментов генов белка оболочки ACLSV и близкородственных вирусов, использованных для подбора праймеров.

В результате проведённого биоинформатического анализа был проведён дизайн олигонуклеотидов: прямого праймера (Seq1), обратного праймера (Seq2) и флуоресцентно-меченого зонда (Seq3).

Оценку специфичности тест-системы проводили с использованием заражённых образцов листьев и коры яблони, предоставленных сотрудниками Ставропольского государственного аграрного университета. Диагностика проводилась визуально с использование контрольных (не заражённых) растений в качестве референсов.

Ниже приведены результаты ПЦР-анализа 18 образцов растений яблони.

Табл. 1. Результаты ПЦР-анализа специфичности используемых систем.

№ образца Материал Зараженность ACLSV, данные визуального осмотра Результат ПЦР, +/- 1 Яблоня, лист Заражен + 2 Яблоня, лист Заражен + 3 Яблоня, лист Заражен + 4 Яблоня, лист Заражен + 5 Яблоня, лист Заражен + 6 Яблоня, лист Не заражен - 7 Яблоня, лист Не заражен + 8 Яблоня, лист Заражен + 9 Яблоня, лист Не заражен - 10 Яблоня, лист Заражен + 11 Яблоня, лист Не заражен - 12 Яблоня, лист Не заражен - 13 Яблоня, лист Не заражен - 14 Яблоня, лист Не заражен + 15 Яблоня, лист Не заражен - 16 Яблоня, лист Не заражен - 17 Яблоня, кора Не заражен - 18 Яблоня, кора Не заражен -

Продукты ПЦР, полученные в результате амплификации фрагмента ДНК «положительных» образцов были проклонированы в плазмидный вектор pAL2T (схема вектора приведена на рис. 2). Соответствие проклонированной последовательности фрагменту генома ACLSV подтверждали с помощью секвенирования по методу Сэнгера. Для вектора, содержащего вставку специфического продукта (pAL2T-ACLSV, Seq4), было проведено определение концентрации с использованием флуориметра QUBIT. Плазмида pAL2T-ACLSV затем использовалась в качестве положительного контрольного образца.

Чувствительность тест-системы определяли с использованием последовательных десятикратных разведений плазмиды pAL2T-ACLSV.

Табл. 2. Определение чувствительности тест-системы

Матрица Количество, нг/реакцию Число геном-эквивалентов/реакцию Результат ПЦР, Cq pAL2T-ACLSV 3.5 1*10⁹ + (6,1) pAL2T-ACLSV 3.5*10^-1 1*10⁸ + (8,4) pAL2T-ACLSV 3.5*10^-2 1*10⁷ + (11,4) pAL2T-ACLSV 3.5*10^-3 1*10⁶ + (14,5) pAL2T-ACLSV 3.5*10^-4 1*10⁵ + (17,6) pAL2T-ACLSV 3.5*10^-5 1*10⁴ + (20,8) pAL2T-ACLSV 3.5*10^-6 1*10³ + (24,0) pAL2T-ACLSV 3.5*10^-7 1*10² + (27,2) pAL2T-ACLSV 3.5*10^-8 1*10¹ + (30,4) pAL2T-ACLSV 3.5*10^-9 1*10⁰ + (33,2)

Зависимость сигнала ПЦР (пороговый цикл) от концентрации ДНК в реакционной пробирке, выраженной в количестве геном-эквивалентов, приведена на рис. 3. На рис. 4 показаны уровни флуоресцентного сигнала при ПЦР последовательных десятикратных разведений положительного контрольного образца.

Тест-системы для определения РНК вируса хлоротической пятнистости листьев яблони используется следующим образом.

Предварительно выделяют РНК из биологического материала любым подходящим методом. В настоящей работе использовался подход, основанный на использовании реагента TRIZOL с последующей очисткой смесью фенол:хлороформ и переосаждением этиловым спиртом.

Проводится реакция обратной транскрипции, для чего может быть использован термостат, либо ПЦР-амплификатор.

Для проведения реакции используют готовую смесь для амплификации, состоящую из буфера, дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченого зонда, Taq-полимеразы. Готовую реакционную смесь смешивают с образцами кДНК, положительным контрольным образцом и отрицательным контрольным образцом. Амплификацию проводят в течение в соответствии со следующей программой амплификации: ПЦР проводили в амплификаторе ДТ96 по следующей программе аплификации с детекцией в каналах FAM и HEX: 94°C - 90 сек 1 цикл; 94°C - 30 сек, 60°С - 30 сек - 5 циклов; 94°С - 10 сек, 60°С - 30 сек - 45 циклов.

Результат, для конкретного образца, считается положительным образца при превышении порового уровня флуоресценции в канале FAM выше определённого уровня. При этом. Пороговый уровень флуоресценции определяется программным обеспечением оборудования.

Для апробации разработанной тест-системы сотрудниками Ставропольского государственного аграрного университета было передано 6 образцов листьев яблони (вместе с черешками), выделенных в различных хозяйствах в разных районах Ставропольского края. Для проведения анализа на первом этапе проводилось выделение РНК. Для этого зелёную массу листьев гомогенизировали в 1 мл реагента TRIZOL (Ambion, Германия), после чего к гомогенату добавляли 0.3 мл хлороформа, центрифугировали 10 мин при 13400 об/мин, к верхней фазе добавляли 500 мкл изпропанола, инкубировали 10 мин во льду. После чего повторно центрифугировали 10 мин при 13400 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, осадок промывали 75 % этанолом, после чего растворяли в 50 мкл деионизированной воды. Полученные РНК использовали для обратной транскрипции, которую проводили с использованием набора MMLV RT kit (Евроген, Россия) по протоколу производителя. Полученные кДНК использовали в качестве матриц в ПЦР в реальном времени с использованием разработанных специфических праймеров и зонда. ПЦР и анализ результатов проводили по протоколам, приведённым выше. В таблице 3 приведены результаты ПЦР-анализа.

Табл. 3. Результаты ПЦР-анализа образцов, переданных из Ставропольского государственного аграрного университета

Образец Происхождение Матрица Результат ПЦР, Cq Яблоня, лист Ставропольский край, Александровский район кДНК + (22,1) Яблоня, лист Ставропольский край, Новоселицкий район кДНК + (24,4) Яблоня, лист+черенок Ставропольский край, Александровский район кДНК + (25,1) Яблоня, лист+черенок Ставропольский край, Новоалександровский район кДНК - Яблоня, лист Ставропольский край, Новоалександровский район кДНК - Яблоня, лист Ставропольский край, Шпаковский район кДНК + (22,6)

Как видно из полученных данных, 4 из 6 переданных образцов заражены ACLSV. Достоверность полученных данных была подтверждена секвенированием полученных продуктов, показавшим соответствие их нуклеотидных последовательностей структурам специфического фрагмента ACLSV.

По результатам проведённого исследования были предложены рекомендации по принятию мер фитосанитарного контроля. В частности, рекомендовано не использовать зараженные растения в качестве посадочного и/или прививочного материала; желательно утилизировать уже собранный материал.

Перечень используемых нуклеотидных последовательностей

Seq1

Олигонуклеотид: прямой праймер

Наименование: ACLSVF

Последовательность (5’-3’): GGAAAGACAGGGGCAATYC

Seq2

Олигонуклеотид: обратный праймер

Наименование: ACLSVR

Последовательность (5’-3’): TBACYTTCTGRTCCTCCATBGA

В структуру входят вырожденные нуклеотиды: B=C или G или T; Y=C или T; R=G или А

Seq3

Олигонуклеотид: флуоресецнтно-меченый зонд

Наименование: ACLSVT

Последовательность (5’-3’): (BHQ1) - TGGAGTCCATCTT(FAMdT)CGCGARCATAGC

В структуру входят флуорофор 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM) и гаситель флуоресценции Black Hole Quencher 1 (BHQ1)

Seq4

Специфический продукт амплификации, представляющий собой фрагмент гена белка оболочки вируса хлоротической пятнистости листьев яблони, проклонированный в плазмидный вектор pAL2T, длина 133 п.о.

Последовательность (5’-3’): GGAAAGACAGGGGTAATCCTGGAACAGATACTGGAGTCCATCTTCGCGAACATAGCAATCCAAGGGACGTCAGAGCAGACAGAGTTTCTGGACCTGATGGTGGAGGTAAAATCAATGGAGGACCAGAAGGTGA

Список литературы

1. Kinard G.R., Scott S. W. Detection of Apple chlorotic leaf spot and Apple stem grooving viruses using RT-PCR. Plant Disease 1996, 80, 616-621.

2. Park H., Yoon J., Kim H., Baek K. Multiplex RT-PCR assay for the detection of Apple stem grooving virus and apple chlorotic leaf spot virus in infected Korean apple cultivars. Plant Pathology Journal 2006, 22, 168-173.

3. Paduch-Cichal E., Tomala K. Detection of Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) and Apple stem grooving virus (ASGV) in different tissues of ‘mustu’ apple cultivar trees by ELISA. Phytopathologia Polonica 2007, 43, 53-59.

4. Salmon M.A., Vendrame M., Kummert J., Lepoivre P. Detection of apple chlorotic leaf spot virus using a 5’ nuclease assay with a fluorescent 3’ minor groove binder-DNA probe. Journal of Virological Methods 2002, 104, 99-106.

5. Lu Y., Yao B., Wang G., Hong N. The detection of ACLSV and ASPV in pear plants by RT-LAMP assays. Journal of Virological Methods 2017, 252, 80-85.

6. Jeong H.-W., Go S.-M., Jeong R.-D. Rapid and specific detection of apple chlorotic leaf spot virus in pear by reverse-transcription recombinase polymerase amplification. Acta Virology 2021, 65, 237-241.

7. Canales C., Morán F., Olmos A., Ruiz-García A.B. First detection and molecular characterization of Apple stem grooving virus, Apple chlorotic leaf spot virus and Apple hammerhead viroid in Loquat in Spain. Plants 2021, 10, 2293.

8. Costa L.C., Athalli B., Hu X., Lamour K., Yang Y., O’Connell M., McFarland C., Foster J.A., Hurtado-Gonzales O.P. High-throughput detection of a large set of viruses and viroids of pome and stone fruit trees by multiplex PCR-based amplicon sequencing. Frontiers in Plant Science 2022, 13, 1072768.

9. Nickel O., Fajardo T.V.M. Detection of viruses in apples and pears by real time RT-PCR using 5’-hydrolysis probes. Journal of Plant Pathology 2014, 96, 207-213.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ

ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ХЛОРОТИЧЕСКОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ ЯБЛОНИ МЕТОДОМ

ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.2.0" productionDate="2024-08-13">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА

ХЛОРОТИЧЕСКОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ ЯБЛОНИ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ

ВРЕМЕНИ</ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА

ХЛОРОТИЧЕСКОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ ЯБЛОНИ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ

ВРЕМЕНИ</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской

Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина

и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic

Chemistry</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ

ВИРУСА ХЛОРОТИЧЕСКОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ ЯБЛОНИ МЕТОДОМ ПЦР В

РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggaaagacaggggcaatyc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tbacyttctgrtcctccatbga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggagtccatcttcgcgarcatagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>133</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..133</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggaaagacaggggtaatcctggaacagatactggagtccatcttcgcga

acatagcaatccaagggacgtcagagcagacagagtttctggacctgatggtggaggtaaaatcaatgga

ggaccagaaggtga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к молекулярной биологии. Описана тест-система для обнаружения вируса хлоротической пятнистости листьев яблони, включающая смесь для проведения амплификации, состоящую из реакционного буфера, дезоксинуклеотидтрифосфатов, двух олигонуклеотидных праймеров Seq1 и Seq2, специфичных к фрагменту гена, кодирующего белок оболочки вируса, одного олигонуклеотидного зонда Seq3, меченного флуоресцентным красителем FAM. Смесь также включает положительный контрольный образец, представляющий собой рекомбинантную плазмидную ДНК Seq4, содержащую соответствующий фрагмент генома вируса. Изобретение позволяет проводить высокоспецифичную идентификацию ДНК вируса хлоротической пятнистости листьев яблони, с высокой чувствительностью. 4 ил., 3 табл.

Тест-система для обнаружения вируса хлоротической пятнистости листьев яблони, включающая смесь для проведения амплификации, состоящую из реакционного буфера, дезоксинуклеотидтрифосфатов, двух олигонуклеотидных праймеров Seq1 и Seq2, специфичных к фрагменту гена, кодирующего белок оболочки вируса, одного олигонуклеотидного зонда Seq3, меченного флуоресцентным красителем FAM, положительного контрольного образца, представляющего собой рекомбинантную плазмидную ДНК Seq4, содержащую соответствующий фрагмент генома вируса.