ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТОФТОРОЗА КОРНЕВОЙ ШЕЙКИ PHYTOPHTHORA CACTORUM МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 

В открытых базах данных не было обнаружено российских патентов, посвященных ПЦР-диагностике возбудителя фитофтороза корневой шейки (Phytophthora cactorum). Поиск среди зарубежных патентов позволил выявить следующие патенты, уже прекратившие свое действие:

US 5780271 A (США, прекратил свое действие) – ПЦР-диагностика P.cactorum и близкородственных видов Phytophthora sp. с использованием ПЦР, основанной на амплификации фрагмента рибосомальной ДНК. Детекция результатов происходит с помощью гель-электрофореза, что сопряжено с высоким риском контаминации рабочей зоны продуктами амплификации.

DE 19815138 A1 (Германия, прекратил свое действие). ПЦР-диагностика Phytophthora spp. с использованием ПЦР на основе амплификации фрагмента гена рибосомальной ДНК. Детекция результатов – в формате гель-электрофореза.

Анализ опубликованной литературы показал, что целый ряд систем ПЦР-диагностики P. cactorum был разработан, однако они имеют ряд недостатков, способных ограничить возможность их использования в фитосанитарной практике. Так, Camele et al., [1], описали тест-систему, основанную на использовании комбинации ПЦР и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Система является специфичной, однако анализ с её помощью усложнён тем фактом, что требуется 2 этапа работы (ПЦР и рестриктный анализ). Кроме того, детекция результатов осуществляется в формате гель-электрофореза, что сопряжено с риском контаминации рабочей зоны продуктами амплификации и получению ложноположительных результатов. Bhat and Browne, [2] предложили систему идентификации P.cactorum с помощью гнездовой ПЦР, приводящейся в 2 раунда, с использованием «внешних» и «внутренних» праймеров. Однако в данной разработке детекция результатов также подразумевает проведение гель-электрофореза. Также необходимо отметить, что авторами не приводится данных по чувствительности разработанных систем. Cho et al., [3] приводит данные по чувствительности (минимальное значение – 100 пг/реакцию), однако в данной работе также используется электрофоретический метод анализа. Анализ с использованием «флуоресцентной» ПЦР описан в работе Verdecchia et al., [4], однако авторы используют неспецифический интеркалирующий краситель SYBR Green, создавая риски высокой фоновой и неспецифической флуоресценции. Альтернативой классической ПЦР являются изотермические методы амплификации, в частности петлевая амплификация (LAMP). Этот подход был использован Siegieda et al., [5] и показал высокую чувствительность (до 0,3 пг/реакцию). Однако необходимо отметить, что для проведения LAMP необходимы 6-8 пар праймеров, дизайн которых может вызвать трудности, а также связан с риском неспецифической амплификации.

Наиболее удачными и близкими по своим характеристикам к предлагаемой разработке являются системы, описанные Li et al., [6, 7], которым удалось добиться высоких значений чувствительности (1 пг/реакцию) при использовании гена Ypt1 в качестве мишени. Детекция проводилась в формате ПЦР в реальном времени с использованием гидролизуемых (TaqMan) зондов. Однако авторы использовали формат мультиплексной ПЦР (P.cactorum+P.nicotiniae), что может быть сопряжено с риском ингибирования одной из реакций, в особенности, если ДНК одного из патогенов присутствует в пробе в низкой концентрации.

Кроме того, важно отметить, что все описанные тест-системы применялись для диагностики зараженности плодово-овощных (цукини, перец), или плодово-ягодных (клубника) культур. Использование ПЦР-диагностики для выявления P.cactorum в коре яблони неизвестно.

Список иллюстраций

Рис. 1. Выравнивание фрагментов генов YPT1 P.cactorum и близкородственных видов, использованных для подбора прямого (PCACTF) и обратного (PCACTR) праймеров. Последовательности праймеров подчеркнуты.

Рис. 2. Карта вектора pAL2T, использованного для клонирования положительных контролей.

Рис. 3. Результаты ПЦР последовательных десятикратных разведений плазмиды, содержащей специфический продукт амплификации. По оси абсцисс показано логарифмические значения концентраций (геном-эквиваленты/реакцию), по оси ординат – значения соответствующих пороговых циклов.

Рис. 4. Флуоресцентный сигнал, детектируемый при ПЦР-анализе последовательных десятикратных разведений плазмид, содержащих специфический ампликон, с парой праймеров PCACTF-PCACTR и зондом PCACTT.

Техническим результатом является разработка тест-системы для проведения высокоспецифичной идентификации кДНК, с высокой чувствительностью для обнаружения фитофтороза корневой шейки Phytophthora cactorum методом ПЦР в реальном времени.

Предлагаемое техническое решение позволяет повысить чувствительность детекции, а также избежать проблем, связанных с контаминацией рабочего пространства продуктами амплификации.

Дизайн праймеров проводили с помощью выравнивания последовательностей нуклеотидов, депонированных в базе данных NCBI c использованием алгоритма ClustalW. Помимо последовательностей нуклеотидов P. cactorum, для выравнивания использовались последовательности нуклеотидов близкородственных видов. Наиболее вариабельным и пригодным для подбора праймеров был фрагмент гена YPT1. На рис. 1 приведены выравнивания фрагментов гена YPT1 P. cactorum и близкородственных видов, использованных для подбора праймеров.

В результате проведенного биоинформатического анализа был проведен дизайн олигонуклеотидов: прямого праймера (Seq1), обратного праймера (Seq2) и флуоресцентномеченого зонда (Seq3).

Оценку специфичности тест-системы проводили с использованием заражённых образцов древесины яблони, предоставленных сотрудниками Ставропольского государственного аграрного университета. Диагностика проводилась с помощью визуального осмотра на предмет признаков заражения фитофторозом корневой шейки.

Ниже приведены результаты ПЦР-анализа 10 образцов.

Табл. 1. Результаты ПЦР-анализа специфичности используемых систем.

№ образца Материал Зараженность P.cactorum, данные визуального осмотра Результат ПЦР, +/- (Cq) 1 Яблоня, кора Не заражен - 2 Яблоня, кора Не заражен - 3 Яблоня, кора Не заражен - 4 Яблоня, кора Не заражен - 5 Яблоня, кора Заражен + (25.6) 6 Яблоня, кора Заражен + (29.1) 7 Яблоня, кора Заражен + (28.4) 8 Яблоня, кора Заражен + (27.1) 9 Яблоня, кора Заражен + (27.3) 10 Яблоня, кора Заражен + (28.1)

Продукты ПЦР, полученные в результате амплификации фрагмента ДНК «положительных» образцов были проклонированы в плазмидный вектор pAL2T (схема вектора приведена на рис. 2). Соответствие проклонированной последовательности фрагменту генома P. cactorum подтверждали с помощью секвенирования по методу Сэнгера. Для вектора, содержащего вставку специфического продукта (pAL2T-PCACT, Seq4), было проведено определение концентрации с использованием флуориметра QUBIT. Плазмида pAL2T-PCACT затем использовалась в качестве положительного контрольного образца.

Чувствительность тест-системы определяли с использованием последовательных десятикратных разведений плазмиды pAL2T-PCACT.

Табл 2. Определение чувствительности тест-системы

Мишень Количество, нг/реакцию Число геном-эквивалентов/реакцию Результат ПЦР, Cq pAL2T-PCACT 3.5*10^-1 1*10⁸ + (10,8) pAL2T-PCACT 3.5*10^-2 1*10⁷ + (13,1) pAL2T-PCACT 3.5*10^-3 1*10⁶ + (15,9) pAL2T-PCACT 3.5*10^-4 1*10⁵ + (21,1) pAL2T-PCACT 3.5*10^-5 1*10⁴ + (23,7) pAL2T-PCACT 3.5*10^-6 1*10³ + (27,2) pAL2T-PCACT 3.5*10^-7 1*10² + (31,1) pAL2T-PCACT 3.5*10^-8 1*10¹ + (34,4) pAL2T-PCACT 3.5*10^-9 1*10⁰ + (38,3)

Зависимость сигнала ПЦР (пороговый цикл) от концентрации ДНК в реакционной пробирке, выраженной в количестве геном-эквивалентов, приведена на рис. 3. На рис. 4 показаны уровни флуоресцентного сигнала при ПЦР последовательных десятикратных разведений положительного контрольного образца.

Тест-системы для определения ДНК возбудителя фитофтороза корневой шейки P. cactorum используются следующим образом.

Предварительно выделяют ДНК из биологического материала любым подходящим методом. В настоящей работе использовался подход, основанный на использовании нескольких буферов, содержащих цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) в качестве детергента, с последующей экстракцией смесью фенол:хлороформ и переосаждением этанолом.

Для проведения реакции используют готовую смесь для амплификации, состоящую из буфера, дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентномеченого зонда, Taq-полимеразы. Готовую реакционную смесь смешивают с образцами кДНК, положительным контрольным образцом и отрицательным контрольным образцом. ПЦР проводили в амплификаторе ДТ96 по следующей программе аплификации с детекцией в каналах FAM и HEX: 94°C – 90 сек 1 цикл; 94°C – 30 сек, 64°C – 30 сек – 5 циклов; 94°C – 10 сек, 64°C – 30 сек – 45 циклов.

Результат для конкретного образца считается положительным при превышении порового уровня флуоресценции в канале FAM выше определенного уровня. При этом пороговый уровень флуоресценции определяется программным обеспечением оборудования.

Для апробации разработанной тест-системы сотрудниками Ставропольского государственного аграрного университета было передано 4 образца древесины яблони, из различных районов Ставропольского края. Для проведения анализа на первом этапе проводилось выделение ДНК. Для этого был адаптирован метод, основанный на использовании цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ) в качестве детергента. 2 г молотой коры гомогенизировали в фарфоровой ступке с небольшим количеством буфера 2Х ЦТАБ буфер (0,5-1 мл), предварительно прогретого до температуры 65°С на водяной бане. Для более эффективной гомогенизации добавляли корунд. Полученную суспензию переносили в 50 мл пробирки и доводили объем буфером 2Х ЦТАБ буфером до 25 мл. Перемешивали и добавляли 50 мкл 2-меркаптоэтанола. Пробирки с гомогенатом инкубировали при температуре 65°С на водяной бане в течение 2 часов, при периодическом перемешивании. Затем охлаждали до комнатной температуры и инкубировали при температуре 4°С в течение ночи. В пробирки с гомогенатом добавляли равный объем смеси хлороформ:изоамиловый спирт в соотношении 24:1, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре на 20 мин. Центрифугировали при комнатной температуре 10 мин на скорости 5000 об/мин. Верхнюю водную фазу переносили в чистые пробирки, добавляли 0,2 объема буфера 5Х ЦТАБ буфера и 1 мкл РНКазы. Раствор перемешивали и инкубировали 20 мин при температуре 65°С на водяной бане. Добавляли равный объем смеси хлороформ:изоамиловый спирт в соотношении 24:1, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 10 мин. Центрифугировали 10 мин на скорости 12000 об/мин. Верхнюю водную фазу переносили в чистые пробирки (на 50 мл). К водной фазе добавляли равный объем буфера для преципитации, перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Центрифугировали при комнатной температуре 15 мин на скорости 12000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок растворяли в 2 мл буфера HS-TE. Добавить 2V 95% этанола, перемешать и инкубировать в течение ночи при температуре -20°С. Центрифугировать при температуре 40°С 15 мин на скорости 12000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, а к осадку добавляли 400 мкл деионизированной воды и 200 мкл 3М ацетата натрия. Инкубировали во льду 20 мин. По ½ полученного объема переносили в чистые пробирки на 1,5 мл, добавляли по 2 объема 95% этанола и инкубировали ночь при температуре -20°С. Центрифугировали при комнатной температуре 10 мин на скорости 13500 об/мин. Осадок растворяли в 50-100 мкл деионизированной воды.

Состав буферов, используемых в работе:

2Х ЦТАБ: 2% СТАВ; 0,1 М Трис HCl (pH 8,0); 20 мM EDTA; 1,4 M NaCl

5Х ЦТАБ - 5% СТАВ; 350mM EDTA

Буфер для преципитации: 1% СТАВ; 50 мМ Трис HCl (pH 8,0); 10 мM EDTA

HS-TE: 10 мМ Трис HCl (pH 8,0); 1 мM EDTA; 1 M NaCl

Полученные ДНК использовали в качестве матриц в ПЦР в реальном времени с использованием разработанных специфических праймеров и зонда. ПЦР и анализ результатов проводили по протоколам, приведенным выше. В табл. 3 приведены результаты ПЦР-анализа.

Табл. 3. Результаты ПЦР-анализа образцов, переданных из Ставропольского государственного аграрного университета

Образец Происхождение Матрица Результат ПЦР, Cq Яблоня, кора дерева Ставропольский край, Александровский район ДНК + (19.7) Яблоня, кора + фрагмент древесины Ставропольский край, Александровский район ДНК - Яблоня, кора+фрагмент древесины Ставропольский край, Новоалександровский район ДНК + (22.3) Яблоня, кора Ставропольский край, Новоалександровский район ДНК -

Как видно из полученных данных, 2 из 4 переданных образцов заражены P. cactorum. Достоверность полученных данных была подтверждена секвенированием продуктов амплификации, показавшим соответствие их нуклеотидных последовательностей структурам специфического фрагмента возбудителя корневой шейки.

По результатам проведенного исследования были предложены рекомендации по принятию мер фитосанитарного контроля. В частности, рекомендовано не использовать зараженные растения в качестве посадочного и/или прививочного материала; желательно утилизировать уже собранный материал.

Список литературы

1. Camele I., Marcone C., Cristinzio G. Detection and identification of Phytophthora species in southern Italy by RFLP and sequence analysis of PCR-amplified nuclear ribosomal DNA. European Journal of Plant Pathology 2005, 113, 1-14.

2. Bhat R.G., Browne G.T. Specific detection of Phytophthora cactorum in diseased strawberry plants using nested polymerase chain reaction. Plant Pathology 2010, 121-129.

3. Cho H., Hong S.W., Kim H.-j., Kwak Y-S. Development of a multiplex PCR method to detect fungal pathogens for quarantine on exported cacti. The Plant Pathology Journa 2016,l 32, 53-57.

4. Verdecchia E., Ceustermans A., Baets D., Ferreira J., Bonants P., Melis P., van Hemelrijck W., Bylemans D., Rediers H., Lievens B. Quantitative PCR for detection and quantification of Phytophthora cactorum in the cultivation of strawberry. European Journal of Plant Pathology 2021, 160, 867-882.

5. Siegieda D.G., Panek J., Frac M. “Shining a LAMP” (Loop-mediated isothermal amplification) on the molecular detection of phytopathogens Phytophthora spp. and Phytophthora cactorum in strawberry fields. Pathogens 2021, 10, 1453.

6. Li M., Asano T., Suga H., Kageyama K. A multiplex PCR for the detection of Phytophthora nicotianae and P. cactorum, and a survey of their occurrence in strawberry production areas of Japan. Plant Disease 2011, 95, 1270-1278.

7. Li M., Inada M., Watanabe H., Suga H., Kageyama K. Simultaneous detection and quantification of Phytophthora nicotianae and P.cactorum, and distribution analyses in strawberry greenhouses by duplex real-time PCR. Microbes and Environments, 2013, 28, 195-203.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ

ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТОФТОРОЗА КОРНЕВОЙ ШЕЙКИ PHYTOPHTHORA

CACTORUM.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2024-08-13">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ

ФИТОФТОРОЗА КОРНЕВОЙ ШЕЙКИ PHYTOPHTHORA CACTORUM МЕТОДОМ ПЦР В

РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ</ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ

ФИТОФТОРОЗА КОРНЕВОЙ ШЕЙКИ PHYTOPHTHORA CACTORUM МЕТОДОМ ПЦР В

РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской

Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина

и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic

Chemistry</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ

ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТОФТОРОЗА КОРНЕВОЙ ШЕЙКИ PHYTOPHTHORA CACTORUM МЕТОДОМ

ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagctccagatttccaccaga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gttgaataggaaacacgccacgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgagctggacggaaagaccatcaagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>141</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..141</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagctccagatttccaccagaattgctgacattcttttttgcggttgtg

cccagaaaatccgtacgatcgagctggacggaaagaccatcaagctccagattgtacgtcctccagcgga

cgtggcgtgtttcctattcaac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биологии и медицине. Изобретение представляет собой тест-систему для обнаружения возбудителя фитофтороза корневой шейки Phytophthora cactorum ПЦР в реальном времени. Тест-система включает смесь для проведения амплификации, состоящую из реакционного буфера, дезоксинуклеотидтрифосфатов, двух олигонуклеотидных праймеров, специфичных к фрагменту гена YPT1, одного олигонуклеотидного зонда, меченного флуоресцентным красителем FAM, положительного контрольного образца, представляющего собой рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую соответствующий фрагмент генома патогена. Изобретение позволяет проводить высокоспецифичную идентификацию кДНК с высокой чувствительностью, количество геном-эквивалентов, детектируемое в одной реакционной пробирке, не менее 10. 3 табл., 4 ил.

Тест-система для обнаружения вируса возбудителя фитофтороза корневой шейки Phytophthora cactorum, включающая смесь для проведения амплификации, состоящую из реакционного буфера, дезоксинуклеотидтрифосфатов, двух олигонуклеотидных праймеров Seq1 и Seq2, специфичных к фрагменту гена YPT1, одного олигонуклеотидного зонда Seq3, меченного флуоресцентным красителем FAM, положительного контрольного образца, представляющего собой рекомбинантную плазмидную ДНК Seq4, содержащую соответствующий фрагмент генома патогена.