Способ определения имидаклоприда в биологическом материале. Российский патент 2025 года по МПК G01N30/88 

Изобретение относится к экологии, биологии и токсикологической химии, а именно к способам количественного определения имидаклоприда в биологическом материале и продуктах питания, может использоваться в практике экологических, химико-токсикологических лабораторий и санэпидстанций. Объект исследования мелко измельчается подходящим способом, проводится тепловая деструкция окисляющей смесью до полного разрушения связей аналита с биоматериалом и его гидролиз. Далее проводится очистка продукта гидролиза на препаративной колонке, экстракция деривата с последующим его хроматографированием на пластине ТСХ, элюирование метанолом и количественное определение газо-хроматографическим способом с электронозахватным детектированием.

В данной методике достигается оптимальная степень извлечения, точность, селективность и чувствительность определения.

Существует методика определения имидаклоприда в овощах (картофеле, огурцах и томатах). Навеску средней пробы помещают в колбу и заливают экстрагирующей смесью ацетона с водой и перемешивают на встряхивателе в течение 30 минут. Экстракт фильтруют под вакуумом и повторяют экстракцию дважды и объединяют извлечения. Полученное извлечение упаривают на ротационном испарителе и переносят в делительную воронку для экстракции аналита хлороформом. Экстракцию повторяют дважды и упаривают хлороформное извлечение до объема 1 мл. Извлечение упаривают досуха и растворяют сухой остаток в ацетонитриле. Ацетонитрильное извлечение переносят в делительную воронку и встряхивают с порциями гексана, отбрасывая гексановые извлечения. Ацетонитрил упаривают досуха растворяют сухой остаток в этилацетате и пропусткают через колонку с флоризином и безводным сульфатом натрия. Этилацетат отбрасывают и элюируют ацетонитрилом имидаклоприд. Ацетонитрил упаривают досуха и остаток растворяют в ацетоне и количественно переносят на линию старта хроматографической пластины «Силуфол». Хроматографирование ведут в системе растворителей гекасан-ацетон (4:3). Пластины проявляют раствором ортотолидина под ультрафиолетовой лампой и проводят обработку полученных результатов. [Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в пищевых продуктах, кормах и внешней среде. Сборник №30. - Киев, 2001. - С.80-86].

Недостатками метода являются длительность анализа, а также множество трудоемких этапов с возможностью значительных потерь аналита в ходе анализа.

Один из методов определения имидаклоприда в биологическом материале заключается в экстракции измельченной навески ацетоном троекратно с последующим фильтрованием экстракта, его упариваем до суха, растворением в ацетоне и нанесением на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил». Элюирование аналита проводят в системе растворителей гексан-ацетон (4:3). После подъема растворителей на 10 см пластину подсушивают и проявляют раствором ортотолидина под светом ультрафиолетовой лампы. Далее проводят обработку результатов.[«Способ определения имидаклоприда в биологических объектах с использованием тонкослойной хроматографии» патент RU 2 467 323 C1].

Недостатком метода является низкая степень очистки аналита и не высокая степень избирательности метода.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и простого метода количественного определения имидаклоприда в биологических объектах при сохранении аналитических характеристик.

Поставленная задача достигается тем, что объект исследования мелко измельчается подходящим способом, проводится тепловая деструкция окисляющей смесью до полного разрушения связей аналита с биоматериалом и его гидролиз. Далее проводится очистка продукта гидролиза на препаративной колонке, экстракция деривата с последующим его хроматографированием на пластине ТСХ, элюирование метанолом и количественное определение газо-хроматографическим способом с электронозахватным детектированием.

Способ осуществляется следующим образом: навеску (точная навеска) биологического материала измельчают подходящим способом и количественно переносят в термостойкую пробирку. Окисляющую смесь, содержащую серную кислоту 1М и пероксид водорода в соотношении 1 к 1 добавляют к биоматериалу в соотношении 4 к 1 по массе биоматериала и проводят минерализацию на водяной бане при 95 – 100 °C. Минерализацию ведут до полной денатурации белков и разрушения связи компонентов биоматериала с имидаклопридом и его количественного перехода в основной дериват и метаболит в биоматериале – 6-хлорникотиновую кислоту. Дальнейшее определение ведут по полученному продукту гидролиза, деривату – 6-хлорникотиновой кислоты. Минерализат переносят в заранее подготовленную препаративную хроматографическую колонку, содержащую 0,5 грамма целлюлозы микрокристаллической для хроматографии. Минерализат элюируют, а затем пропускают через колонку, предварительно обмывая стенки пробирки от минерализата, троекратно порциями хлороформа. Элюаты переносят в делительную воронку и встряхивают с помощью встряхивателя в течение не менее 20 минут. После разделения фаз отделяют хлороформный экстракт и упаривают на водяной бане при 95-100°C до объема 0,1-0,2 мл. Упаренный экстракт количественно переносят на линию старта хроматографической пластины «Силуфол» и элюируют в системе растворителей гексан – спирт этиловый в соотношении 3 к 4. Проявляют пластины в свете ультрафиолета и идентифицируют 6-хлорникотиновую кислоту. Пятна вырезают и элюируют 6-хлорникотиновую кислоту 0,5 мл метанола и подвергают газохроматографическому анализу c электронозахватным детектированием. Расчеты ведут по уравнению калибровочного графика с учетом взятых колб, пипеток, навески и разведений.

Пример 1. Определение имидаклоприда в трупной печени

0,50 г печени измельчали до кусочков 0,5 см и обрабатывали 0,1 мл спиртового раствора имидаклоприда, содержащего 1000 мкг/мл. Модельную смесь настаивали в течение двух часов для образования связей имидаклоприда с компонентами биоматрицы. Полученную модельную смесь переносили в термостойкую пробирку. Добавляли окисляющую смесь, содержащую серную кислоту 1М и пероксид водорода в соотношении 1 к 1 добавляют к биоматериалу в соотношении 4 к 1 по массе биоматериала (2 мл) и проводят минерализацию на водяной бане при 95 – 100 °C. Минерализацию вели в течение 40 минут. Минерализат переносили в заранее подготовленную препаративную хроматографическую колонку, содержащую 0,5 грамма целлюлозы микрокристаллической для хроматографии. Минерализат элюировали, а затем пропускали через колонку, предварительно обмывая стенки пробирки от минерализата, троекратно порциями хлороформа по 3 мл. Элюаты переносили в делительную воронку и встряхивали с помощью встряхивателя в течение 20 минут. После разделения фаз отделяли хлороформный экстракт и упаривали на водяной бане при 95-100 °C до объема 0,2 мл. Упаренный экстракт количественно переносили на линию старта хроматографической пластины «Силуфол» и элюировали в системе растворителей гексан – спирт этиловый в соотношении 3 к 4. Проявляли пластины в свете ультрафиолета и идентифицируют 6-хлорникотиновую кислоту. Пятна вырезали и элюировали 6-хлорникотиновую кислоту 0,5 мл метанола и подвергали газохроматографическому анализу с электронозахватным детектированием. В испаритель хроматографа вкалывали 1 мкл полученной пробы.

Рекомендуемые параметры хроматографического анализа

Газ-носитель – каталитически очищенный азот

Испаритель – температура 280°C в режиме без деления

Колонка – 5% фенил- 95% метил- полисилоксан 30 м в режиме постоянного потока 1 мл/мин

Термостат колонки – начальная температура 80°C с выдержкой 5 минут, далее нагрев со скоростью 15°C/мин до 250°C с выдержкой 5 минут

Электронозахватный детектор – температура 250°C, продувной газ 30мл/мин

Рисунок 1

Типичная хроматограмма получаемого экстракта

Расчеты ведут по уравнению калибровочного графика с учетом взятых колб, пипеток, навески и разведений. Калибровочный график строим в необходимом диапазоне концентраций, проводя стандартные растворы имидаклоприда через весь ход анализа, описанный выше.

Пример 2. Определения имидаклоприда в ткани клубней картофеля

0,5 г картофеля измельчали на терке и обрабатывали 0,1 мл этанольного раствора имидаклоприда, содержащего 1000 мкг/мл. Модельную смесь настаивали в течение двух часов для образования связей имидаклоприда с компонентами биоматрицы. Полученную модельную смесь переносили в термостойкую пробирку. Добавляли окисляющую смесь, содержащую серную кислоту 1М и пероксид водорода в соотношении 1 к 1 добавляют к биоматериалу в соотношении 4 к 1 по массе биоматериала (2 мл) и проводят минерализацию на водяной бане при 95 – 100 градусах Цельсия. Минерализацию вели в течение 40 минут. Минерализат переносили в заранее подготовленную препаративную хроматографическую колонку, содержащую 0,5 грамма целлюлозы микрокристаллической для хроматографии. Минерализат элюировали, а затем пропускали через колонку, предварительно обмывая стенки пробирки от минерализата, троекратно порциями хлороформа по 3 мл. Элюаты переносили в делительную воронку и встряхивали с помощью встряхивателя в течение 20 минут. После разделения фаз отделяли хлороформный экстракт и упаривали на водяной бане при 95-100 градусах Цельсия до объема 0,2 мл. Упаренный экстракт количественно переносили на линию старта хроматографической пластины «Силуфол» и элюировали в системе растворителей гексан – спирт этиловый в соотношении 3 к 4. Проявляли пластины в свете ультрафиолета и идентифицируют 6-хлорникотиновую кислоту. Пятна вырезали и элюировали 6-хлорникотиновую кислоту 0,5 мл метанола и подвергали газохроматографическому анализу с электронозахватным детектированием. Расчеты ведут по уравнению калибровочного графика с учетом взятых колб, пипеток, навески и разведений. Параметры газо-хроматографического определения использовали аналогичные описанным ранее.

Таблица 1
Результаты определения имидаклоприда в трупной печени (n = 5, P = 0,95) № Внесено, мкг в 0,5 г печени Найдено Метрологические характеристики мкг % 1. 100 97,76 97,76 Х ср = 97,73
S = 0,1156
S xср = 0,0517
ΔХ ср = 0,14 2. 100 97,78 97,78 3. 100 97,56 97,56 4. 100 97,87 97,87 5. 100 96,69 96,69

Таблица 2
Результаты определения имидаклоприда в клубнях картофеля (n = 5, P = 0,95) № Внесено, мкг в 10 г печени Найдено Метрологические характеристики мкг % 1. 100 95,43 95,43 Х ср = 95,40
S = 0,0953
S xср = 0,0426
ΔХ ср = 0,12 2. 100 95,32 95,32 3. 100 95,47 95,47 4. 100 95,51 95,51 5. 100 95,29 95,29

Результаты определения среднего времени удерживания и предела детектирования представлены в таблице 3.

Таблица 3
Результаты определения среднего времени удерживания и предела детектирования
(n = 5, P = 0,95) № Время удерживания, мин Метрологические характеристики Предел детектирования, мг/кг Метрологические характеристики 1. 9,615 Х ср = 9,615
S = 0,00207
S xср = 0,00093
ΔХ ср = 0,00257 1,465*10^-3 Х ср = 1,465*10^-3
S = 9,61*10^-6
S xср = 4,30*10^-6
ΔХ ср = 1,19*10^-5 2. 9,613 1,457*10^-3 3. 9,617 1,478*10^-3 4. 9,612 1,469*10^-3 5. 9,616 1,454*10^-3

Таблица 4
Сравнение известного способа и предлагаемого способа Известный способ Предлагаемый способ Предел количественного определения, мг/кг 0,04-0,05 0,0015

Таким образом, предлагаемый способ при сохранении аналитических характеристик позволяет значительно понизить предел количественного определения имидаклоприда в биологическом материале.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения имидаклоприда в биологическом материале и продуктах питания, может использоваться в практике экологических, химико-токсикологических лабораторий и санэпидстанций. Способ определения имидаклоприда в биологическом материале заключается в том, что объект исследования мелко измельчается подходящим способом, проводится тепловая деструкция окисляющей смесью до полного разрушения связей аналита с биоматериалом и его гидролиз. Далее проводится очистка продукта гидролиза на препаративной колонке, экстракция деривата с последующим его хроматографированием на пластине ТСХ, элюирование метанолом и количественное определение газо-хроматографическим способом с электронозахватным детектированием. Техническим результатом является возможность достижения оптимальной степени извлечения, повышение точности, селективности и чувствительности определения. 1 ил., 4 таб.

Способ определения имидаклоприда в биологическом материале заключающийся в том, что навеску (точная навеска) биологического материала измельчают подходящим способом и количественно переносят в термостойкую пробирку, окисляющую смесь, содержащую серную кислоту 1М и пероксид водорода в соотношении 1 к 1 добавляют к биоматериалу в соотношении 4 к 1 по массе биоматериала и проводят минерализацию на водяной бане при 95–100°С, минерализацию ведут до полной денатурации белков и разрушения связи компонентов биоматериала с имидаклопридом и его количественного перехода в основной дериват и метаболит в биоматериале – 6-хлорникотиновую кислоту, дальнейшее определение ведут по полученному продукту гидролиза, деривату – 6-хлорникотиновой кислоты, затем минерализат переносят в заранее подготовленную препаративную хроматографическую колонку, содержащую 0,5 грамма целлюлозы микрокристаллической для хроматографии, элюируют, а затем пропускают через колонку, предварительно обмывая стенки пробирки от минерализата, троекратно порциями хлороформа, далее элюаты переносят в делительную воронку и встряхивают с помощью встряхивателя в течение не менее 20 минут, после разделения фаз отделяют хлороформный экстракт и упаривают на водяной бане при 95-100°С до объема 0,1-0,2 мл, упаренный экстракт количественно переносят на линию старта хроматографической пластины «Силуфол» и элюируют в системе растворителей гексан – спирт этиловый в соотношении 3 к 4, затем проявляют пластины в свете ультрафиолета и идентифицируют 6-хлорникотиновую кислоту, далее пятна вырезают и элюируют 6-хлорникотиновую кислоту 0,5 мл метанола и подвергают газохроматографическому анализу с электронозахватным детектированием, расчеты ведут по уравнению калибровочного графика с учетом взятых колб, пипеток, навески и разведений.