БЕЛОК СЛИЯНИЯ НАЦЕЛЕННОГО НА GPC3 АНТИТЕЛА И ИНТЕРФЕРОНА α И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C07K14/56 C07K16/30 C07K19/00 C12P21/02 A61K38/21 A61K47/68 A61P35/00 A61P31/00 A61P1/16 

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с китайской заявкой на выдачу патента 2021109267431 с датой подачи 12.08.2021.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к области биомедицины и конкретно относится к белку слияния, нацеленного на GPC3 антитела и интерферона а и его применению.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Интерферон α (IFNα) характеризуется широким спектром противовирусного и противоопухолевого действия. Он активирует эффекторные клетки посредством связывания с рецепторами IFNα, увеличивает активность иммунных клеток, таких как клетки-естественные киллеры, ингибирует пролиферацию вирусов и опухолевых клеток и индуцирует апоптоз опухолевых клеток и так далее. Поэтому он является одним из широко используемых в клинической практике биологических продуктов. Он в основном используется при лечении заболеваний печени (таких как хронический гепатит В, гепатит С и так далее), в противовирусных применениях (таких как при вирусных респираторных заболеваниях, кожных заболеваниях, заболеваниях крови, гинекологических заболеваниях и так далее) и при специфических опухолях (таких как хронический миелолейкоз, меланома, лимфома, рак почек и так далее) и используется в качестве адъювантной терапии опухолей и гематологических злокачественных новообразований.

Однако, поскольку рецепторы IFNα широко экспрессируются в различных тканях и органах человеческого тела, это часто сопровождается токсическими побочными эффектами, такими как лихорадка, утомляемость, миалгия, токсичность для печени, подавление функции костного мозга и нейротоксичность при клиническом применении. Большой объем данных клинических исследований показывает, что PEG-IFNα (6 мкг/кг в неделю в течение 8 недель лечения; 3 мкг/кг в неделю при поддерживающем лечении) вызывает у более чем 60% пациентов серьезные нежелательные явления (serious adverse events, SAE) степени 3 или выше во время адъювантного лечения меланомы (Practical Guidelines for the Management of Interferon-a-2b Side Effects in Patients Receiving Adjuvant Treatment for Melanoma. Cancer 2008; 112:982-94). Клиническая максимально переносимая доза (maximum tolerance dose, MTD) PEG-IFNα при лечении хронического миелолейкоза CML составляет 7,5-9 мкг/кг (Long-Term Results of the Randomized Phase III Trial EORTC 18991 of Adjuvant Therapy With Pegylated Interferon Alfa-2b Versus Observation in Resected Stage III Melanoma. JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, VOLUME 30, NUMBER 31, NOVEMBER 1 2012). Согласно доклиническим экспериментальным данным по эффективности лекарственных средств in vitro и in vivo оптимальная доза, ингибирующая опухоль, должна быть по меньшей мере в 100 раз выше, чем клинически переносимая доза (Treating Cancer with PEG Intron: Pharmacokinetic Profile and Dosing Guidelines for an Improved Interferon-A-2b Formulation. TALPAZ et al BLOOD, 15 SEPTEMBER 2001. VOLUME 98, NUMBER 6).

Кроме того, интерферон а обычно имеет плохую стабильность при замораживании и оттаивании из-за своих характеристик продукта. Например, агрегаты белка слияния рекомбинантного человеческого альбумина и интерферона-α2b (rHSA-IFN-α2b) постепенно увеличиваются после многократного замораживания и оттаивания. После четырехкратного замораживания и оттаивания содержание агрегатов достигает 17,91%. Белок слияния рекомбинантного человеческого альбумина и интерферона-α2b не подходит для замораживания и оттаивания (Xia Yi et al., Study on stability of recombinant human albumin interferon α-2b fusion protein, Journal of Biology, 2008, 25(006): 38-40), и это приводит к еще большим ограничениям в отношении производства, транспортировки и применения.

Глипикан-3 (GPC3) является членом семейства глипиканов гепарансульфат протеогликанов, присутствующих на поверхности клеток. Существующие экспериментальные исследования показали, что иРНК GPC3 и белок GPC3 особенно высоко экспрессируются при раке печени и тесно связаны с возникновением и развитием рака печени [Zhu Z.W., Friess Н., Wang L., Abou-Shady M., Zimmermann A., Lander A.D., Korc M., Kleeff J., Buchler M.W. Gut 2001; 48: 558-64]. Существующие исследования и литературные сообщения показали, что GPC3 тесно связан с возникновением и развитием рака печени. Мало того, что он характеризуется более высоким уровнем обнаружения на ранних стадиях рака печени, но уровень его обнаружения также увеличивается по мере прогрессирования рака печени. Кроме того, исследования показали, что коэффициент экспрессии GPC3 выше при плоскоклеточной карциноме легких (lung squamous cell carcinoma, LSCC), раке яичников и опухоли желточного мешка.

GPC3 характеризуется очевидной чувствительностью и специфичностью при диагностике рака печени и может использоваться в качестве новой мишени для лечения рака печени. Кодритузумаб (GC33) представляет собой первое антитело, нацеленное на GPC3 и в настоящее время находится в клинической фазе II. Однако предварительные результаты его клинических исследований показывают, что GC33 не демонстрирует клинической пользы в популяции НСС. Можно видеть, что эффект представляющего собой моноклональное антитело лекарственного средства GC33, нацеленного на GPC3, в клинической фазе II является плохим, и нет существенной разницы в общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования между группой лекарственного средства и контрольной группой.

Кроме того, моноклональное анти-GPC3 антитело кодритузумаб (GC33) и IFN-α 2b крайне несовместимы с точки зрения режима клинического лечения, дозировки, периода полувыведения и других аспектов. Например, IFN-α 2b обычно вводят подкожно, и переносимая доза для человеческого организма составляет 20 мкг/кг с периодом полувыведения всего 3-4 часа; тогда как моноклональное анти-GPC3 антитело кодритузумаб (GC33) вводят внутривенно, и максимальная переносимая доза в клинической фазе I может достигать 20 мг/кг в неделю, но оно еще не достигло оптимальной эффективности, и период его полувыведения превышает 4 дня. Таким образом, простая комбинация или слияние не могут обеспечить совместимость для одновременного достижения лучших эффектов лечения опухолей, чем IFN-α2b и моноклональное анти-GPC3 антитело кодритузумаб (GC33), и снижения токсических побочных эффектов IFN-α 2b.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Техническая проблема, которую предстоит решить с помощью настоящего изобретения, состоит в преодолении низкой эффективности моноклональных анти-GPC3 антител (таких как GC33) и недостатка безопасности и стабильности при замораживании и оттаивании интерферона а предшествующего уровня техники и в создании белка слияния антитела и интерферона а, нацеленного на GPC3, и его применения. Белок слияния антитела и интерферона а может значительно улучшить способность нацеливания функционального фрагмента интерферона а в белке слияния и улучшить уничтожающее действие белка слияния в отношении клеток-мишеней (таких как GPC3-положительные опухолевые клетки), при одновременном уменьшении токсических побочных эффектов функционального фрагмента интерферона а в отношении нормальных клеток (здоровых клеток, которые не экспрессируют GPC3). В то же время он значительно снижает токсические побочные эффекты возможных примесных молекул, содержащих функциональный фрагмент интерферона а, образующихся в процессе получения, на не являющиеся мишенями органы, ткани и клетки.

Настоящее изобретение решает вышеуказанные технические проблемы посредством следующих технических решений.

Первый аспект настоящего изобретения относится к белку слияния антитела и интерферона а, нацеленному на GPC3, который состоит из А-цепи и В-цепи; причем аминокислотная последовательность А-цепи показана в SEQ ID NO: 1 и аминокислотная последовательность В-цепи показана в SEQ ID NO:2.

Второй аспект настоящего изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей белок слияния антитела и интерферона а, как описано в первом аспекте.

Третий аспект настоящего изобретения относится к рекомбинантному вектору экспрессии, содержащему нуклеиновую кислоту, как описано во втором аспекте.

Согласно настоящему изобретению рекомбинантный вектор экспрессии получают путем введения экзогенной нуклеиновой кислоты в вектор.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к трансформанту, содержащему рекомбинантный вектор экспрессии, как описано в третьем аспекте.

Согласно настоящему изобретению трансформант получают путем введения рекомбинантного вектора экспрессии в клетку-хозяина.

Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу получения белка слияния антитела и интерферона а, нацеленного на GPC3. Данный способ предусматривает следующие стадии: культивирование трансформанта, как описано в четвертом аспекте, и получение белка слияния антитела и интерферона а из культуры.

Шестой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, которая содержит белок слияния антитела и интерферона а, как описано в первом аспекте, и фармацевтически приемлемый носитель.

Седьмой аспект настоящего изобретения относится к применению белка слияния антитела и интерферона а, как описано в первом аспекте, или фармацевтической композиции, как описано в шестом аспекте, в производстве лекарственного средства для лечения, вспомогательного лечения или предупреждения заболевания.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения заболевание представляет собой связанное с наличием GPC3 заболевание.

Согласно настоящему изобретению связанное с наличием GPC3 заболевание выбрано из опухоли, заболевания печени и вирусного инфекционного заболевания.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения опухоль выбирают из рака молочной железы, рака кишечника, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака яичников, рака желудка, рака предстательной железы, рака почек, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, рака носоглотки, рака яичек, рака легких, меланомы, рака кожи, саркомы, глиомы, мезотелиомы и миелодиспластического синдрома.

Согласно настоящему изобретению к раку кишечника относится колоректальный рак, к раку яичника относится опухоль желточного мешка, к нейроэндокринному раку относится карцинома из клеток Меркеля, к раку легких относятся мелкоклеточный рак легких и немелкоклеточный рак легких, к раку кожи относятся базальноклеточный рак кожи и плоскоклеточный рак кожи, к саркоме относится выбухающая дерматофибросаркома, к глиомам относится глиобластома и к раку матки относятся рак эндометрия и саркома матки.

Восьмой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения связанного с наличием GPC3 заболевания, который предусматривает введение или введение в комбинации с терапевтически эффективным количеством белка слияния антитела и интерферона а, как описано в первом аспекте, или фармацевтической композиции, описанной в шестом аспекте, нуждающемуся в этом пациенту.

При использовании в настоящем документе термин «рекомбинантный белок» относится к искусственно созданному/сконструированному белку, а не к природному белку. Слово «рекомбинантный» в термине «рекомбинантный белок» согласно настоящему изобретению не обозначает способ его получения, оно используется только для указания на то, что «рекомбинантный белок» не существует в природе. Рекомбинантный белок согласно настоящему изобретению может представлять собой экспрессированный белок или собранный белок.

При использовании в настоящем документе термин «белок слияния» относится к продукту экспрессии, полученному рекомбинацией двух генов с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Технологию белков слияния можно использовать для конструирования и экспрессии новых целевых белков с множеством функций.

При использовании в настоящем документе термин «антитело» обычно относится к белку, содержащему один или несколько полипептидов, по существу кодируемых геном иммуноглобулина или фрагментом гена иммуноглобулина. К генам иммуноглобулинов могут относиться гены константных областей κ, λ, α, γ, δ, ε и μ, а также многочисленные гены вариабельных областей иммуноглобулинов. При использовании в настоящем документе легкие цепи могут быть классифицированы как κ или λ. Тяжелые цепи могут быть классифицированы как γ, μ, α, δ или ε, что в свою очередь определяет классы иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Антитела, используемые в настоящей заявке, могут иметь структурные единицы, содержащие тетрамеры. Каждый тетрамер может состоять из двух пар идентичных полипептидных цепей, причем каждая пара содержит «легкую» цепь (приблизительно 25 кДа) и «тяжелую» цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-конец каждой структурной единицы может определять вариабельную область, содержащую приблизительно от 100 до 110 или более аминокислот, которая в первую очередь отвечает за распознавание антигена. При использовании в настоящем документе термины «вариабельная область легкой цепи» (VL) и «вариабельная область тяжелой цепи» (VH) обычно относятся к этим областям легкой цепи и тяжелой цепи соответственно. Антитела могут существовать в виде интактных иммуноглобулинов или в виде ряда хорошо охарактеризованных фрагментов, образующихся в результате расщепления различными пептидазами или экспрессии de novo (более подробное описание других фрагментов антител смотри Fundamental Immunology, edited by W.E. Paul, Raven Press, N.Y. (1993)).

При использовании в настоящем документе «Fc-область» (кристаллизующийся фрагмент, Fc) состоит из доменов СН2 и СН3 константных областей IgG и шарнирной области.

При использовании в настоящем документе «антигенсвязывающий фрагмент», или «Fab-фрагмент» или «Fab» состоит из вариабельной области легкой цепи (VL), константной области легкой цепи (CL), вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области 1 домена тяжелой цепи (СН1) и может связываться с антигеном.

При использовании в настоящем документе «технология выступ(ы)-во-впадину(ы)», или технология «пестик и ступка», или технология «кнопки» используют технологию генной инженерии для введения различных мутаций в два домена СН3 тяжелых цепей, чтобы облегчить гетеродимеризацию тяжелых цепей. На одной тяжелой цепи делают выступ, а на другой тяжелой цепи делаются впадину, и затем они, предпочтительно, соединяются вместе с образованием асимметричного антитела (Ridgway J.B., et al. 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Engineering, 1996, 9(7): 617-621). Как известно специалистам в данной области техники, на одной тяжелой цепи может быть сделано множество выступов и/или впадин, и, соответственно, может быть сделано множество впадин и/или выступов на другой тяжелой цепи.

При использовании в настоящем документе термин «специфичность антигена» относится к специфическому антигену или его эпитопу, который селективно распознается антигенсвязывающей молекулой.

При использовании в настоящем документе термин «замена» применительно к аминокислотным остаткам относится к замене одной или нескольких встречающихся в природе или введенных аминокислот в пептиде, полипептиде или белке на другую аминокислоту с образованием нового пептида, полипептида или белка (например, термины «мутант» или «мутация» в настоящем документе). Замены в полипептиде или белке могут приводить к сниженной или неизменной функции полипептида или белка. Замены также могут представлять собой «консервативные замены», которые в контексте аминокислотной последовательности относятся к замене одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, содержащим боковую цепь, имеющую сходные физико-химические свойства, или к заменам аминокислот, которые не являются очень важными для активности полипептида. Например, консервативные замены могут быть сделаны между аминокислотными остатками с неполярной боковой цепью (такими как Met, Ala, Val, Leu и He, Pro, Phe, Trp), между незаряженными остатками с полярной боковой цепью (такими как Cys, Ser, Thr, Asn, Gly и Gln), между остатками с кислотной боковой цепью (такими как Asp, Glu), между аминокислотами с основной боковой цепью (такими как His, Lys и Arg), между аминокислотами с β-разветвленной боковой цепью (такими как Thr, Val и Не), между аминокислотами с серосодержащей боковой цепью (такими как Cys и Met) или между остатками с ароматической боковой цепью (такими как Trp, Tyr, His и Phe). Согласно определенным вариантам осуществления замены, делеции или присоединения также можно рассматривать как «консервативные замены». Число вставленных или удаленных аминокислот может варьироваться от приблизительно 1 до 5. Консервативные замены обычно не вызывают существенного изменения конформации и структуры белка и, следовательно, сохраняют биологическую активность белка.

При использовании в настоящем документе термины «клетка с двойной положительной экспрессией», или «клетка-мишень», или «представляющая интерес клетка-мишень» относятся к клетке, которая может одновременно связываться с антигенсвязывающим фрагментом GC33 и функциональным фрагментом интерферона α.

При использовании в настоящем документе термины «не являющиеся мишенями клетки» или «представляющая интерес не являющаяся мишенью клетка» относятся к клетке, которая не экспрессирует GPC3 и взаимодействует только с функциональным фрагментом интерферона α.

При использовании в настоящем документе термины «IFNα», или «интерферон типа а», или «интерферон а» охватывают все природные или рекомбинантные α-интерфероны, особенно предпочтительно человеческие а-интерфероны, такие как рекомбинантные человеческие α-интерфероны, включая, но без ограничения, IFN-α2b (например, интерферон Intron®A или интерферон Viraferon®-A, доступные от Schering Corporation, Kenilworth, N.J.), IFN-α 2а (например, интерферон Roferon®-A, доступный от Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J.); такие как смесь природных а-интерферонов, включая, но без ограничения, IFN-α-n1 (например, интерферон α-nlWellferon®, доступный от Sumitomo, Япония, или Glaxo-Wellcome Ltd., Лондон, Великобритания) или IFN-α-n3 (например, интерферон Alferon N®, доступный от Interferon Sciences). Согласно настоящему изобретению термины «IFNα», или «интерферон типа α», или «интерферон а», или «функциональный фрагмент интерферона α», или «функциональный фрагмент IFNα» также охватывают любое вещество с биологической активностью IFNα, такое как мутированный, или усеченный, или модифицированный IFNα, такое как мутанты IFNα с низкой аффинностью, PEG-производные IFNα (PEG-IFNα). Согласно настоящему изобретению «IFNα», или «интерферон типа α», или «интерферон α» не ограничены каким-либо конкретным источником получения и могут быть получены из коммерческих источников или получены с помощью обычных методов, известных специалистам в данной области техники. К способам получения относятся, но без ограничения, способ экстракции из биологического источника и способ генно-инженерной экстракции, которые подробно описаны, например, в документе «Pestka S. Arch Biochem Biophys. 1983 Feb 15; 221 (1): 1-37». Согласно некоторым вариантам осуществления IFNα представляет собой IFNα вида, выбранного из группы, состоящей из человека, лошади, крупного рогатого скота, мыши, свиньи, кролика, кошки, собаки, крысы, козы, овцы и отличного от человека примата.

При использовании в настоящем документе термины «IFNα2b», или «IFN-α2b», или «IFN-α 2b», или «интерферон-α 2b» представляют собой подтип IFN-α и представляют собой экспрессию интерферона-α 2b. Аминокислотная последовательность интерферона-α 2b человеческого происхождения дикого типа, содержащего сигнальный пептид, показана в SEQ ID NO: 3.

При использовании в настоящем документе термин «мутант с низкой аффинностью» относится к мутанту IFNα, который характеризуется неизмененными или пониженными ингибированием пролиферации или противовирусной функциональной активностью по сравнению с IFNα дикого типа.

При использовании в настоящем документе термины «линкерная последовательность» или «линкер» относятся к аминокислотной последовательности, которая лигирует различные функциональные связывающие фрагменты (такие как антигенсвязывающий фрагмент GC33 и функциональный фрагмент интерферона α, антигенсвязывающий фрагмент GC33 или функциональный фрагмент интерферона α и Fc-область) или лигирует различные домены в пределах одного и того же функционального связывающего фрагмента.

При использовании в настоящем документе термины «GC33», «кодритузумаб», «анти-GPC3 mAb», «анти-GPC3 Ab» используются взаимозаменяемо в настоящем изобретении и относятся к анти-GPC3 антителу кодритузумаб.

При использовании в настоящем документе термин «рекомбинантный белок согласно настоящему изобретению» относится к белку слияния антитела и интерферона а, нацеленному на GPC3, конкретно относится к TTM101-LC03-M3.

Термин «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе обычно охватывает одну клетку, линию клеток или культуру клеток, которые могут быть или были реципиентом плазмиды или вектора материала, который содержит полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе, или который экспрессирует белковые гетеродимеры (например, гетеродимерные белки) согласно настоящему изобретению. К клетке-хозяину может относиться потомство одной клетки-хозяина. Из-за естественных, случайных или преднамеренных мутаций потомство не обязательно может быть идентично исходной родительской клетке (или морфологически, или с точки зрения полного набора геномной ДНК). К клеткам-хозяевам могут относиться клетки, трансфицированные in vitro векторами, раскрытыми в настоящем документе. Клетки-хозяева могут представлять собой бактериальные клетки (например, Е. coli), дрожжевые клетки или другие эукариотические клетки, такие как клетки НЕК293, клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa или клетки миеломы. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки-хозяева представляют собой клетки млекопитающих. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО.

При использовании в настоящем документе термин «вектор» обычно относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к саморепликации в подходящем хозяине, которая переносит встроенную молекулу нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева и/или между ними. Термин может охватывать векторы, используемые в основном для встраивания ДНК или РНК в клетки, векторы, используемые в основном для репликации ДНК или РНК, и векторы экспрессии, используемые для транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Также включены векторы, которые обеспечивают более одной из вышеперечисленных функций. «Вектор экспрессии» представляет собой полинуклеотид, который можно транскрибировать и транслировать в полипептид при введении в подходящую клетку-хозяина. «Система экспрессии» обычно означает подходящую клетку-хозяина, содержащую вектор экспрессии, способную обеспечивать желаемый выход экспрессии.

Термины «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относятся к количеству композиции (например, рекомбинантного белка, описанного в настоящем документе), достаточному для достижения предполагаемого применения (включая, но без ограничения, лечение заболеваний). Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от предполагаемого применения (например, in vitro или in vivo) или состояния субъекта и заболевания, подлежащего лечению, например от веса и возраста субъекта, тяжести болезненного состояния, способа введения и так далее, которые могут быть легко определены рядовыми специалистами в данной области техники. Этот термин также можно применять к дозировке, которая индуцирует специфический ответ в клетке-мишени (например, индукцию, пролиферацию и/или апоптоз гена-мишени). Конкретная дозировка будет варьироваться в зависимости от конкретного выбранного соединения, соблюдаемого режима дозирования, от того, вводят ли его в комбинации с другими соединениями, от времени введения, ткани, в которую его вводят, и физической системы доставки, в которой его вводят.

Термины «лечение», или «проведение лечения», или «смягчение», или «улучшение» взаимозаменяемо используются в настоящем документе и относятся к способам получения полезных или желаемых результатов (включая, но без ограничения, терапевтические эффекты и/или профилактические эффекты). При использовании в настоящем документе терапевтические эффекты обычно относятся к искоренению или уменьшению тяжести основного состояния, подлежащего лечению. Кроме того, терапевтические эффекты могут быть достигнуты путем искоренения, уменьшения тяжести или снижения частоты одного или нескольких физических симптомов, связанных с основным состоянием, так что у субъекта наблюдается улучшение (хотя субъект все еще может страдать от основного состояния). Для профилактических эффектов композицию можно вводить субъекту, который подвержен риску развития конкретного заболевания или который сообщает об одном или нескольких физиологических симптомах заболевания, даже если диагноз заболевания не был поставлен.

При использовании в настоящем документе термины «совместное введение», «введение в комбинации» и их грамматические эквиваленты обычно охватывают введение животному двух или более средств, так что средства и/или их метаболиты одновременно присутствуют в субъекте. К совместному введению относятся одновременное введение в отдельных композициях, введение в разное время в отдельных композициях или введение в композиции, в которой присутствуют оба средства.

При использовании в настоящем документе термин «пролиферация клеток» обычно относится к явлению изменения количества клеток вследствие деления. Например, пролиферация клеток может приводить к увеличению количества клеток. Этот термин также охватывает рост клеток, при котором изменяется морфология клеток (например, увеличение размера), что соответствует пролиферативному сигналу.

При использовании в настоящем документе термин «ингибирование пролиферации» или «ингибирование пролиферации клеток» обычно относится к снижению скорости роста и/или скорости пролиферации раковых клеток. Например, это может включать гибель раковых клеток (например, путем апоптоза). Согласно некоторым вариантам осуществления этот термин может также относиться к ингибированию роста и/или пролиферации солидных опухолей и/или к индуцированию уменьшения размера или элиминации опухолей.

При использовании в настоящем документе термин «стабильность при замораживании и оттаивании» обычно относится к стабильности эмульсионной системы при ее попеременном замораживании и оттаивании.

Термины «субъект», или «индивидуум», или «животное», или «пациент» при использовании в настоящем документе относятся к человеку или животным, отличным от человека, включая млекопитающих или приматов. Субъекты-млекопитающие включают человека, относящихся к домашнему скоту животных, сельскохозяйственных животных и зоопарковых, спортивных или домашних животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, свиньи, коровы, медведи и так далее.

При использовании в настоящем документе термин «in vivo» обычно относится к событиям, которые происходят внутри тела субъекта.

При использовании в настоящем документе термин «in vitro» обычно относится к событиям, которые происходят вне тела субъекта. Например, к анализам in vitro относят любой анализ, проводимый вне субъекта. К анализам in vitro относятся клеточные анализы, в которых используются мертвые или живые клетки.

К анализам in vitro также относятся бесклеточные анализы, в которых не используются интактные клетки.

При использовании в настоящем документе термин «введение» относится к доставке субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный белок или белок слияния согласно настоящему изобретению. Введение может быть системным или местным. Введение можно осуществлять с помощью устройства для введения, такого как шприц. К способам введения относятся, но без ограничения, инкапсуляция, назальная ингаляция, распыление, инъекция и так далее. К путям введения относятся ингаляционное, интраназальное, пероральное, внутривенное, подкожное или внутримышечное введение и так далее.

По сравнению с предшествующим уровнем техники настоящее изобретение обладает следующими положительными эффектами:

Новый белок слияния нацеленного на GPC3 антитела и интерферона а настоящего изобретения характеризуется чрезвычайно сильным ингибированием пролиферации и активностью уничтожения опухолей в отношении GPC3-положительных клеток-мишеней (опухолевых клеток, таких как клетки рака печени HepG2 и HuH-7), при этом он чрезвычайно безопасен для не являющихся мишенями клеток, которые не экспрессируют GPC3. Кроме того, стабильность при замораживании и оттаивании белка слияния значительно лучше, чем у интерферона а, что полезно для производства, транспортировки и применения продукта.

Для клеток, экспрессирующих рецепторы IFNα, положительные эффекты заключаются в следующем:

1. Активность связывания, активность ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность), активность ингибирования пролиферации и так далее рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении GPC3-положительных клеток-мишеней (таких как клетки рака печени HepG2 и HuH-7) значительно сильнее, чем у IFNα при равных молярных концентрациях, и его активность связывания и активность ингибирования пролиферации и так далее в отношении GPC3-отрицательных не являющихся мишенями клеток (таких как нормальные клетки) неожиданно слабее, чем у IFNα при равных молярных концентрациях. В некоторых экспериментах результаты обнаружения активности ингибирования пролиферации рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении GPC3-отрицательных не являющихся мишенями клеток были отрицательными. То есть, когда не являющиеся мишенями клетки не обладают способностью связываться с антигенсвязывающим фрагментом GC33, активность связывания и активность ингибирования пролиферации и так далее функционального фрагмента IFNα рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении клеток, экспрессирующих рецепторы IFNα, значительно уменьшаются, или соответствующая активность даже не обнаруживается.

2. Потенциально опасная примесь (гомодимер В-цепей) рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению обладает чрезвычайно слабой ингибирующей активностью в отношении пролиферации GPC3-отрицательных не являющихся мишенями клеток. По сравнению с биспецифическим рекомбинантный белком CN 108864290 В потенциально опасная примесь рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению обладает более слабой ингибирующей активностью в отношении пролиферации GPC3-отрицательных не являющихся мишенями клеток. Таким образом, риски для безопасности или токсические побочные эффекты, вызываемые потенциально опасной примесью рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению, чрезвычайно низки. В то же время снижается высокая стоимость получения, обусловленная контролем качества в отношении опасной примеси.

3. Рекомбинантный белок согласно настоящему изобретению характеризуется хорошей стабильностью при замораживании и оттаивании. После 5-кратного повторного замораживания и оттаивания чистота превышает 95%, внешний вид прозрачный, и стабильность при замораживании и оттаивании значительно лучше, чем у мономера IFN-α2b или ПЭГ шифрованного IFN-α2b.

Подводя итог, можно сказать, что рекомбинантный белок согласно настоящему изобретению может значительно улучшать уничтожающее действие в отношении клеток-мишеней, особенно опухолевых клеток, при этом значительно снижать токсические побочные эффекты, вызываемые связыванием с клетками, не являющимися мишенями, с лучшей безопасностью и меньшей стоимостью получения и хорошей стабильностью при замораживании и оттаивании.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена схематическая структурная диаграмма рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению.

На фиг. 2 представлена диаграмма электрофореза в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях очищенного рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению.

На фиг. 3 представлен график связывающей активности рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению и контрольного образца в отношении клеток-мишеней HuH-7 и не являющихся мишенями клеток MDA-MB-231, измеренной с помощью проточной цитометрии.

На фиг. 4 представлен график активности ADCC рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении клеток-мишеней HuH-7, измеренной с помощью метода репортерного гена.

На фиг. 5 представлен график активности ингибирования пролиферации рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении GPC3-положительных клеток-мишеней HuH-7.

На фиг. 6А представлен график активности ингибирования пролиферации рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении GPC3-отрицательных не являющихся мишенями клеток MDA-MB-231.

На фиг. 6В представлен график активности ингибирования пролиферации рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении GPC3-отрицательных не являющихся мишенями клеток U266.

На фиг. 7 представлена гистограмма активности ингибирования пролиферации потенциально опасной примесью рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении GPC3-отрицательных не являющихся мишенями клеток MDA-MB-231.

На фиг. 8 представлен график противоопухолевой эффективности рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении модели подкожной опухоли HuH-7 на голых мышах BALB/c.

На фиг. 9 представлена гистограмма противоопухолевой эффективности рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении модели подкожной опухоли HuH-7 на голых мышах BALB/c.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Чтобы облегчить понимание технических средств, творческих признаков, целей и эффектов, достигаемых с помощью настоящего изобретения, настоящее изобретение более подробно описано ниже со ссылкой на конкретные иллюстрации. Однако настоящее изобретение не ограничено нижеследующими примерами воплощения.

Концепции, конкретные конструкции и технические эффекты настоящего изобретения будут дополнительно описаны ниже в сочетании с прилагаемыми фигурами, чтобы полностью объяснить цели, признаки и эффекты настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Конструкция рекомбинантного белка

Структура рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению показана на фигуре 1. Рекомбинантный белок содержит антигенсвязывающий фрагмент GC33, функциональный фрагмент IFNα и Fc-область, причем N-конец функционального фрагмента IFNα лигирован с С-концом CL в антигенсвязывающем фрагменте через (GGGGS)4 (как показано на фиг. 1), С-конец функционального фрагмента IFNα непосредственно лигирован с Fc-областью, и вариабельная область (V-область) и константная область (С-область) в антигенсвязывающем фрагменте непосредственно лигированы. Fc-область использует технологию «выступы-во-впадины».

В этом примере TTM101-LC03-M3 используется в качестве примера для иллюстрации конструкции рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению. Информация о молекулярной структуре TTM101-LC03-M3 показана в таблице 1, и контрольные образцы показаны в табл. 2.

В приведенных выше таблицах 1 и 2 (И) относится к домену, состоящему из тяжелой цепи VH и CHI, (L) относится к домену, состоящему из легкой цепи VL и CL; GC33 представляет собой моноклональное антитело против глипикана-3 (GPC3) кодритузумаб; Fc представляет собой Fc-область дикого типа, Fc1 представляет собой Fc-область с мутацией впадины или впадин, и Fc2 представляет собой Fc-область с мутацией выступа или выступов.

Номера ID последовательностей, соответствующие названиям последовательностей, упомянутым в таблице 1, показаны в таблице 3. Из них сигнальный пептид А-цепи и В-цепи показан в SEQ ID NO:8; аминокислотная последовательность IFN-α 2b показана в SEQ ID NO:3, причем положения 1-23 представляют собой последовательность сигнального пептида; аминокислотная последовательность кодритузумаба приведена по патенту US 7919086, аминокислотная последовательность тяжелой цепи показана в SEQ ID NO:6, и аминокислотная последовательность легкой цепи показана в SEQ ID NO:7. Изотипический контроль человеческий IgG1 (В117901) был приобретен у Biointron Biotech. Рекомбинантно экспрессируемый белок IFN-α2b (Z03003) был приобретен у Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.

Пример 2. Конструкция, экспрессия и очистка плазмиды для рекомбинантного белка

1. Конструкция плазмиды, трансфекция клеток и экспрессия белка Плазмида экспрессии рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению была синтезирована компанией GENEWIZ после оптимизации кодонов в соответствии с последовательностью белка, лигирована в плазмиду pCDNA3.1, и последовательность была подтверждена секвенированием.

После фильтрации полученных плазмид экспрессии с помощью фильтра 0,22 мкм 50 мкг плазмид отбирали пипеткой и добавляли (массовое соотношение экспрессирующих А-цепь и В-цепь плазмид составляло 2:1 или 3:1) в 2 мл среды OptiPRO SFM (GIBCO) и хорошо перемешивали. 160 мкл реагента для трансфекции ExpiFectamine СНО Reagent отбирали пипеткой и добавляли в 2 мл среды OptiPRO SFM и хорошо перемешивали. Полученный раствор смеси с реагентом для трансфекции добавляли к раствору смеси, содержащей плазмиды, и хорошо перемешивали. Смесь плазмид и реагента для трансфекции медленно и равномерно добавляли к суспензии клеток-хозяев ExpiCHO-S (Thermo Fisher) объемом 50 мл и с плотностью клеток 6×10⁶ жизнеспособных клеток на мл, и суспензию помещали в инкубатор с 37°С, 8% CO2 для культивирования. В день 1 (через 18-22 часа), добавляли 300 мкл ExpiCHO Enhancer и 8 мл ExpiCHO Feed, и температуру культуры снижали до 32°С. В день 5 проводили вторую подкормку и добавляли 8 мл ExpiCHO Feed, а клеточную суспензию собирали после 12 дней культивирования. Клеточную суспензию центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант, полученный центрифугированием, то есть жидкость сбора культуры клеток, использовали для очистки целевого белка.

2. Очистка белка

2.1. Захват образца

Целевой белок захватывали с помощью аффинного наполнителя Mabselect Sure (то есть белка А, приобретенного у Cytiva) из супернатанта экспрессии рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению. Экспериментальный процесс заключался в следующем:

a) Уравновешивание: Раствор для уравновешивания (50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,2) использовали для уравновешивания хроматографической колонки до тех пор, пока линия УФ-детектирования не становилась стабильной;

b) Загрузка образца: Для загрузки образца использовали насос для образца с временем удерживания 5 минут и емкостью загрузки <30 мг/мл;

c) Повторное уравновешивание: Раствор для уравновешивания (50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,2) использовали для промывки хроматографической колонки в количестве 5 объемов колонки;

d) Элюирование: Элюент (50 мМ NaAC-HAC, рН 3,5) использовали для элюирования целевого белка, а 1М Tris-буфер использовали для доведения рН элюата до 5,5. Чистоту белка определяли с помощью ДСН-ПААГ.

2.2. Очистка образца

Агрегаты и другие примеси в образце удаляли из супернатанта экспрессии рекомбинантного белка TTM101-LC03-M3 согласно настоящему изобретению с помощью наполнителя SULFATE 650F (TOSOH). Экспериментальный процесс заключался в следующем:

a) Уравновешивание: Раствор для уравновешивания (50 мМ NaAC-HAC, рН 5,5) использовали для уравновешивания хроматографической колонки до тех пор, пока линия УФ-детектирования не становилась стабильной;

b) Загрузка образца: Для загрузки образца использовали насос для образца с временем удерживания 5 минут и емкостью загрузки ≤50 мг/мл;

c) Повторное уравновешивание: Раствор для уравновешивания (50 мМ NaAC-HAC, рН 5,5) использовали для промывки хроматографической колонки в количестве 5 объемов колонки;

d) Элюирование: Элюент (50 мМ NaAC-HAC, 250 мМ, рН 5,5) использовали для элюирования целевого белка. Чистоту белка определяли с помощью ДСН-ПААГ.

Способ очистки контрольного образца кодритузумаба в табл. 2 был таким же, как 2.1.

Теоретический молекулярный вес рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению, показанный в таблице 1, составил приблизительно 120 кДа, и молекулярный вес контрольного антитела кодритузумаб, показанный в табл. 2 составил 150 кДа. Результаты детектирования рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению с помощью электрофореза белка в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях (смотри фиг. 1) после очистки показаны на фиг. 2. Результаты детектирования с помощью электрофореза белка в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях после очистки (то есть после очистки с помощью SULFATE 650F) показывают, что большинство примесей можно удалить с помощью катионообменного наполнителя для хроматографии.

Пример 3. Детектирование связывающей активности рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении линии GPC3-положительных клеток рака печени (клетки с двойной положительной экспрессией, клетки-мишени) и линии GPC3-отрицательных клеток (не являющиеся мишенями клетки)

Аффинность связывания рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению с целевой линией GPC3-положительных клеток рака печени или линией GPC3-отрицательных клеток измеряли с помощью проточной цитометрии.

Тестируемые клетки представляли собой линию GPC3-положительных опухолевых клеток HuH-7 (Банк клеток Китайской академии наук в Шанхае) и линию GPC3-отрицательных опухолевых клеток MDA-MB-231 (приобретены у Nanjing Cobioer Biotechnology Co., Ltd.). Клетки, которые хорошо росли, собирали и подсчитывали, центрифугировали и ресуспендировали в буфере для FACS (PBS+2% FBS) до концентрации 1×10^б клеток/мл. Клетки добавляли на 96-луночный U-образный планшет (кат. №: 3799, Corning) по 100 мкл на лунку, и добавляли 7 разведений TTM101-LC03-M3, GC33 и изотипического контроля (начиная со 100 нМ, 3-кратное градиентное разведение, всего 7 концентраций). Планшет инкубировали при 4°С в течение 1 часа. После промывания с помощью буфера для FACS добавляли козьи антитела к человеческому IgG (Alexa Fluor488 goat anti-human IgG (H+L), Invitrogen), и планшет инкубировали при 4°С в течение 1 часа. После промывания с помощью буфера для FACS и ресуспендирования определяли значение флуоресценции с помощью проточной цитометрии (Attune Nxt, Invitrogen).

Результаты эксперимента показаны на фигуре 3. Как TTM101-LC03-M3, так и моноклональное анти-GPC3 антитело GC33 характеризуются определенной активностью связывания с клетками-мишенями HuH-7, которые экспрессируют как GPC3, так и рецепторы IFNα. По сравнению с моноклональным анти-GPC3 антителом (анти-GPC3 mAb, GC33, то есть контрольным образцом кодритузумаба), связывание TTM101-LC03-М3 с клетками HuH-7 характеризуется более высокой максимальной средней интенсивностью флуоресценции. В то же время, как показано на фигуре 3, TTM101-LC03-М3 не связывается GPC3-отрицательными (то есть не экспрессирующими GPC3, но экспрессирующими рецептор IFNα) не являющимися мишенями клетками MDA-MB-231.

Пример 4. Детектирование активности антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению

Активность ADCC рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении целевой линии GPC3-положительных клеток рака печени измеряли с помощью метода репортерного гена.

Конкретный способ заключался в следующем:

1. Подготовка клеток-мишеней и эффекторных клеток: Клетки-мишени HuH-7 (5Е4/мл, 100 мкл/лунку) и эффекторные клетки Jurkat-NFAT-Luc-CD16A (2е6/мл, 50 мкл/лунку) добавляли на планшет 3904.

2. Образец (50 нМ, 6Х) разводили до 8 точек концентрации и инкубировали в количестве 50 мкл/лунку с клетками-мишенями и эффекторными клетками при 37°С в течение 5-6 часов.

3. Клеточный планшет центрифугировали при комнатной температуре в течение 5 минут, и 20 мкл культурального супернатанта отбирали пипеткой и переносили на 96-луночный планшет (с белым прозрачным дном).

4. Реагент для детектирования в растворе QUANTI-Blue (Invivogen) добавляли в количестве 50 мкл/лунку, хорошо перемешивали, и детектировали значение сигнала с помощью устройства для считывания микропланшетов (SpectraMax М2).

Как показано на фиг. 4, TTM101-LC03-M3 сохранял активность ADCC, и активность ADCC TTM101-LC03-M3 была сравнима с активностью моноклонального анти-GPC3 антитела (анти-GPC3 mAb, GC33, то есть контрольного образца кодритузумаба).

Пример 5. Детектирование активности ингибирования пролиферации рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению Активность ингибирования пролиферации рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении различных линий опухолевых клеток измеряли с помощью набора Cell Titer Glo (Promega, кат.: G7558)

Линию GPC3-положительных клеток HuH-7, или линию GPC3-отрицательных опухолевых клеток U266 (приобретенную у Nanjing Cobioer Biotechnology Co., Ltd.), или линию GPC3-отрицательных опухолевых клеток MDA-MB-231 (клетки рака молочной железы человека) (приобретенную у Nanjing Cobioer Biotechnology Co., Ltd.) помещали в 96-луночный прозрачный планшет с черным дном (Corning, 3904), и добавляли ТТМ101-LC01-M3 или контрольный образец IFN-α2b (приобретенный у Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.), PEG-IFN-α 2b (приобретенный у Xiamen Amoytop Bioengineering Co., Ltd.) и анти-GPC3 антитело GC33 (начиная со 100 нМ, 6-кратное градиентное разведение, всего 9 точек). Планшет помещали в СO2-инкубатор при 37°С и культивировали в течение 3 дней, а затем помещали в Cell Titer Glo, многорежимное устройство для считывания (PerkinElmer, Envision2105), для детектирования значения сигнала.

Результаты показали, что ингибирующая активность (IC50) TTM101-LC03-M3 в отношении пролиферации GPC3-положительных (GPC3+) клеток-мишеней HuH-7 была выше, чем у контрольных образцов IFN-α2b и PEG-IFN-α2b (смотри фиг. 5), а также была выше, чем у моноклонального анти-GPC3 антитела (анти-GPC3 mAb, GC33, то есть контрольного образца кодритузумаба, который не оказывает ингибирующего действия на пролиферацию HuH-7). В частности, как показано на фигуре 5, активность ингибирования пролиферации у TTM101-LC03-M3 в отношении GPC3-положительных (GPC3+) клеток-мишеней HuH-7 (IC50=0,04638 нМ) была примерно в 100 раз сильнее, чем у контрольного образца PEG-IFN-α 2b (IC50=4,81 нМ). Активность ингибирования пролиферации у TTM101-LC03-M3 в отношении GPC3-отрицательных не являющихся мишенями клеток была значительно ниже, чем у контрольных образцов IFN-α 2b и PEG-IFN-α 2b. В частности, как показано на фиг. 6А, активность ингибирования пролиферации у TTM101-LC03-M3 в отношении GPC3-отрицательных (GPC3-) не являющихся мишенями клеток MDA-MB-231 (IC50=83,96 нМ) была примерно в 200 раз слабее, чем у контрольного образца IFN-α 2b (IC50=0,3933 нМ). Как показано на фигуре 6 В, активность ингибирования пролиферации у TTM101-LC03-M3 в отношении GPC3-отрицательных (GPC3-) не являющихся мишенями клеток U266 (IC50=31,33 нМ) была приблизительно в 400 раз слабее, чем у контрольного образца IFN-α 2b (IC50=0,07183 нМ).

Вышеупомянутые результаты по активности ингибирования пролиферации рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении GPC3-положительных или GPC3-отрицательных клеток показывают, что рекомбинантный белок TTM101-LC03-M3 согласно настоящему изобретению может значительно усиливать активность ингибирования пролиферации функционального фрагмента IFN-α 2b в TTM101-LC03-M3 посредством связывания с GPC3 на GPC3-положительных клетках-мишенях. Неожиданно активность ингибирования пролиферации функционального фрагмента IFN-α 2b в рекомбинантном белке TTM101-LC03-M3 согласно настоящему изобретению в отношении не являющихся мишенями клеток, которые не экспрессируют GPC3, была снижена в 200 раз или даже более чем в 400 раз. Рекомбинантный белок согласно настоящему изобретению оказывает более сильное ингибирующее пролиферацию действие только в отношении клеток-мишеней, которые содержат GPC3, но оказывает более слабое действие в отношении не являющихся мишенями клеток, которые не содержат GPC3. Это показывает, что рекомбинантный белок согласно настоящему изобретению чрезвычайно безопасен.

Пример 6. Детектирование активности ингибирования пролиферации потенциально опасной примесью рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению в отношении не являющихся мишенями клеток

Для того чтобы снизить риск для безопасности, связанный с потенциальными примесями, в будущем способе получения рекомбинантного белка, в настоящем изобретении сравнивали потенциально опасную примесь, гомодимера В-цепи ТТМ101-LC03-M3, и ингибирование ей пролиферации не являющихся мишенями клеток-мишеней.

В процессе очистки TTM101-LC03-M3 (как описано в примере 2) выделяли гомодимер В-цепи TTM101-LC03-M3 (гомодимер с молекулярным весом приблизительно 140 кДа), и детектировали активность ингибирования пролиферации им и IFN-α 2b-Fc1 (гомодимер правого плеча структуры рекомбинантного белка, показанной на фигуре 3 документа CN108864290B) в отношении не являющихся мишенями клеток (GPC3-отрицательных клеток) MDA-MB-231. Результаты показаны на фигуре 7. В концентрации 3 нМ IFN-α2b ингибировал пролиферацию MDA-MB-231 (GPC3-отрицательные клетки, не являющиеся мишенями клетки) на 88,3%, а IFN-α2b-Fc1 ингибировал пролиферацию MDA-MB-231 (GPC3-отрицательные клетки, не являющиеся мишенями клетки) на 32,1% (приблизительно на 56,2% слабее, чем IFN-α2b). Гомодимер В-цепи TTM101-LC03-M3 ингибировал пролиферацию MDA-MB-231 (GPC3-отрицательные клетки, не являющиеся мишенями клетки) только на 9,3% (приблизительно на 79% слабее, чем IFN-α 2b и приблизительно на 22,8% слабее, чем IFN-α 2b-Fc1).

Таким образом, потенциальные опасные примеси оказывали очень слабое воздействие на не являющиеся мишенями клетки. То есть потенциальные риски для безопасности или потенциальные токсические побочные эффекты оказались чрезвычайно низкими.

Пример 7. Детектирование противоопухолевой активности in vivo рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению

Противоопухолевая эффективность нацеленного на GPC рекомбинантного белка в модели подкожной опухоли HuH-7 на голых мышах BALB/c.

Опухолевую массу Huh-7 ~30 мм³ инокулировали сзади в правую часть шеи голых мышей BALB/c. Одновременно с инокуляцией экспериментальных животных маркировали с помощью ушных бирок в качестве единственного знака подтверждения последующих экспериментов. Когда опухоль вырастала до среднего объема опухоли 150 мм³, начинали введение лекарственного средства в случайных группах по 6 мышей в каждой группе. Введение всем мышам осуществляли посредством внутривенной инъекции, и объем введения составлял 10 мл/кг. Введение продолжали в течение 3 недель два раза в неделю, всего 6 введений.

Исследуемым показателем была проверка, происходят ли ингибирование, отсрочка или излечение роста опухоли. Диаметр опухоли измеряли два раза в неделю с помощью кронциркуля с верньером. Формула расчета объема опухоли была следующей: V=0,5a×b², где а и b представляли собой длинный и короткий диаметры опухоли, соответственно. Статистический анализ включал среднее значение и стандартную ошибку (SEM) объема опухоли в каждой временной точке для каждой группы. Сравнения между двумя группами анализировали с использованием одностороннего Т-критерия, и использовали GraphPad Prism для анализа всех данных. Значимой разницей считали р <0,05.

Результаты показаны на фигурах 8 и 9 и в табл. 4. TTM101-LC03-M3 ингибировал рост опухоли дозозависимым образом, а противоопухолевый эффект был лучше, чем у GC33 в той же дозировке, а также был лучше, чем у высокой дозировки PEG-IFN-α2b (в дозировке, превышающей клинически переносимую дозу). Приведенные выше результаты показывают, что TTM101-LC03-M3 может эффективно ингибировать рост опухоли клеток рака печени.

Пример 8. Исследование стабильности при замораживании и оттаивании рекомбинантного белка

Существующий белок слияния рекомбинантного человеческого альбумина и интерферона-α 2b характеризуется плохой стабильностью при замораживании и оттаивании и не подходит для многократного замораживания и оттаивания. Например, ПЭГилированный интерферон длительного действия нельзя замораживать и встряхивать, он требует более строгих условий транспортировки и хранения. Для изучения стабильности при замораживании и оттаивании рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению рекомбинантный белок согласно настоящему изобретению подвергали повторным тестам на стабильность при замораживании и оттаивании. Белок помещали в 20 мМ NaAc (РН=5) буфер и замораживали и оттаивали пять раз при -40°С. Образцы до и после замораживания и оттаивания анализировали на чистоту (эксклюзионная хроматография, SEC) и внешний вид. Результаты показаны в таблице 5. TTM101-LC03-M3 характеризовался хорошей стабильностью при замораживании и оттаивании с чистотой выше 97%. Внешний вид был прозрачным после 5 повторных замораживаний-оттаиваний, что указывает на то, что стабильность при замораживании и оттаивании рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению оказалась значительно лучше, чем у мономера IFN-α2b или ПЭГилированного IFN-α2b.

Использование всех без исключения примеров или вводных слов с примерами (например, «такой как»), представленных в настоящем документе, предназначено только для лучшего освещения настоящего изобретения и не накладывает ограничения на объем настоящего изобретения, если не заявлено иное. Никакие формулировки в описании не должны быть истолкованы как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения настоящего изобретения.

Все публикации, цитированные в данном описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была конкретно и индивидуально указана как включенная посредством ссылки. Кроме того, любые теория, механизм, демонстрация или открытие, описанные в настоящем документе, предназначены для дальнейшего улучшения понимания настоящего изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения каким-либо образом такими теорией, механизмом, демонстрацией или открытием. Хотя настоящее изобретение было показано и подробно описано на фигурах и в приведенном выше описании, настоящее изобретение следует рассматривать как иллюстративное, а не ограничительное.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="zh"

dtdVersion="V1_3" fileName="FPCH23160368.sequence listing.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-12-25">

<ApplicantFileReference>P22405018C</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>CN</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2021109267431</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2021-08-12</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ШАНХАЙ ДжиЭмТи-БАЙО ТЕКНОЛОДЖИ КО.,

ЛТД.</ApplicantName>

<InventionTitle languageCode="ru">БЕЛОК СЛИЯНИЯ НАЦЕЛЕННОГО НА GPC3

АНТИТЕЛА И ИНТЕРФЕРОНА α И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>445</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..445</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMG

ALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSASTK

GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS

SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP

IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>631</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..631</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSP

QLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRTVAAPS

VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQ

MRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQ

QLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRGEIMRSFSLSTNLQES

LRSKEDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH

NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR

DELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>188</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..188</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISL

FSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLE

ACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE<

/INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>165</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..165</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQK

AETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAV

RKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>392</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..392</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQK

AETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAV

RKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKEDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP

PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL

NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDS

eq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>445</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..445</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMG

ALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSASTK

GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS

SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP

IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>219</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..219</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSP

QLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRTVAAPS

VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MRAWIFFLLCLAGRALA</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуноцитокинам, и может быть использовано в медицине для лечения или предупреждения опухоли, связанной с положительным GPC3. Предложен белок слияния антитела и интерферона α, нацеленный на GPC3, отличающийся тем, что данный белок слияния состоит из A-цепи с SEQ ID NO: 1 и B-цепи с SEQ ID NO: 2. Изобретение обеспечивает получение белка слияния нацеленного на GPC3 антитела и интерферона α, который характеризуется чрезвычайно сильным ингибированием пролиферации и активностью уничтожения опухолей в отношении GPC3-положительных клеток-мишеней (опухолевых клеток, таких как клетки рака печени HepG2 и HuH-7), безопасностью для не являющихся мишенями клеток, которые не экспрессируют GPC3, и стабильностью при замораживании и оттаивании, которая у белка слияния значительно лучше, чем у интерферона α, что полезно для производства, транспортировки и применения продукта. 7 н. и 2 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 табл., 8 пр.

1. Белок слияния антитела и интерферона α, нацеленный на GPC3, отличающийся тем, что данный белок слияния состоит из A-цепи и B-цепи; причем аминокислотная последовательность A-цепи показана в SEQ ID NO: 1 и аминокислотная последовательность B-цепи показана в SEQ ID NO:2.

2. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая белок слияния антитела и интерферона α по п. 1.

3. Рекомбинантный вектор экспрессии для экспрессии белка слияния антитела и интерферона α, отличающийся тем, что данный рекомбинантный вектор экспрессии содержит нуклеиновую кислоту по п. 2.

4. Клетка-хозяин для экспрессии белка слияния антитела и интерферона α, отличающаяся тем, что данная клетка-хозяин содержит рекомбинантный вектор экспрессии по п. 3, и клетка-хозяин выбрана из клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa и клетки миеломы.

5. Способ получения белка слияния антитела и интерферона α, нацеленного на GPC3, отличающийся тем, что данный способ предусматривает следующие стадии: культивирование клетки-хозяина по п. 4 и получение белка слияния антитела и интерферона α из культуры.

6. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения опухоли, связанной с положительным GPC3, отличающаяся тем, что данная фармацевтическая композиция содержит эффективное количество белка слияния антитела и интерферона α по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Применение белка слияния антитела и интерферона α по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 6 в производстве лекарственного средства для лечения или предупреждения опухоли, связанной с положительным GPC3.

8. Применение по п. 7, отличающееся тем, что опухоль выбирают из рака молочной железы, рака кишечника, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака яичников, рака желудка, рака предстательной железы, рака почек, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, рака носоглотки, рака яичек, рака легких, меланомы, рака кожи, саркомы, глиомы, мезотелиомы и миелодиспластического синдрома.

9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что к раку кишечника относится колоректальный рак, к раку яичника относится опухоль желточного мешка, к нейроэндокринному раку относится карцинома из клеток Меркеля, к раку легких относятся мелкоклеточный рак легких и немелкоклеточный рак легких, к раку кожи относятся базальноклеточный рак кожи и плоскоклеточный рак кожи, к саркоме относится выбухающая дерматофибросаркома, к глиомам относится глиобластома, и к раку матки относятся рак эндометрия и саркома матки.