Способ определения биоэквивалентности веществ с антиоксидантной активностью Российский патент 2025 года по МПК G01N21/78 G01N33/15 G01N33/50 

Изобретение относится к практике проведения научных исследований в области фармакологии, экологии, работе научно-исследовательских институтов и лабораторий доклинических исследований, а именно к способам определения биоэквивалентности вновь полученных субстанций препаратов-антиоксидантов и известных препаратов с незаявленными антиоксидантными свойствами.

При проведении научных исследований по изучению антиоксидантных свойств новых препаратов или известных препаратов с незаявленными антиоксидантными свойствами необходимо точно определять дозу антиоксиданта в эксперименте. Достаточно сложно экстраполировать дозу нового препарата на животное. Принято, что наиболее стандартным антиоксидантом для лечения и профилактики оксидативного стресса является аскорбиновая кислота (витамин С), для которого определена суточная потребность, восполняющая его дефицит и способная справиться и предупредить влияние оксидативного стресса. Существуют способы перевода дозы аскорбиновой кислоты (витамина С) на лабораторных животных в практике доклинических исследований. Целесообразно проводить определение биоэквиватентности доз новых препаратов-антиоксидантов или известных препаратов с выявленными антиоксидантными свойствами в практике доклинических исследований по их антиоксидантным свойствам для обоснования и правильного подбора дозы для лабораторного животного и далее человека.

Известен способ определения эквивалентности доз человека и лабораторных животных по Хабриеву Р.У. (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005 г.). Недостатком данного способа является пересчет дозы по массе или площади тела без определения антиоксидантной активности.

Наиболее близким является способ определения является антиоксидантной активности лекарственного растительного сырья, фитопрепаратов и биологически активных добавок к пище титрование 0,05Н перманганата калия в кислой среде 0,24М серной кислоты анализируемой пробой до обесцвечивания раствора и определения показателя В, характеризующего антиоксидантную активность исследуемого препарата (патент RU 2 170 930 C1). Недостатком данного способа является использование кверцетина в качестве стандарта, так как он не является общепринятым антиоксидантом, а также недостаточно кислая среда для выявления всех компонентов восстанавливающего характера в ходе титрования растительного сырья и других примеров, представляющих собой сложные многокомпонентные системы. Так же недостатком является применение различных растворяющих сред для тестируемых препаратов.

Технической задачей данного изобретения является описание способа определения биоэквивалентности вновь полученных субстанций препаратов-антиоксидантов и известных препаратов с выявленными антиоксидантными свойствами.

Преимуществом данного способа определения биоэквивалентности вновь полученных субстанций препаратов-антиоксидантов и известных препаратов с выявленными антиоксидантными свойствами является применение титриметрического определение антиоксидантных свойств с последующим расчетом адекватной биоэквивалентной дозы препарата-антиоксиданта в пересчете на антиоксидантную активность аскорбиновой кислоты (витамина С).

Техническим результатом изобретения является разработка нового способа определения биоэквивалентности вновь полученных субстанций препаратов-антиоксидантов и известных препаратов с незаявленными антиоксидантными свойствами.

Технический результат достигается тем, что проводится титриметрическое определение антиоксидантной активности аскорбиновой кислоты (витамина С) и вновь полученных субстанций препаратов-антиоксидантов и известных препаратов с незаявленными антиоксидантными свойствами с последующим расчетом их биоэквивалентности и установлением адекватной дозы.

Способ осуществляется следующим образом. 0,5 мл или 0,5 г (точная навеска) (в зависимости от агрегатного состояния препарата) количественно переносят в мерную колбу на 50,0 мл и доводят до метки спиртом этиловым 70% и тщательно перемешивают. В коническую колбу помещают 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливают 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титруют из микробюретки раствором антиоксиданта до обесцвечивания раствора. Параллельно проводят опыт с аскорбиновой кислотой (витамином С). Для этого 0,5 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты (витамина С) количественно помещают в мерную колбу на 50,0 мл и доводят до метки спиртом этиловым 70%. В коническую колбу помещают 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливают 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титруют из микробюретки раствором аскорбиновой кислоты до обесцвечивания раствора. рассчитывают эквивалент дозы активности аскорбиновой кислоты и исследуемого препарата по формуле:

Эд = (У*a_вс)/(Х*а_ао)*100%, где

Эд – эквивалент дозы аскорбиновой кислоты (витамина С) в процентах,

У – объем раствора аскорбиновой кислоты, израсходованный на титрование, мл,

а_вс – навеска аскорбиновой кислоты (витамина С), г,

Х - объем раствора исследуемого препарата, израсходованный на титрование, мл,

а_ао – навеска/аликвота исследуемпого препарата, г.

Зная эквивалентность дозы исследуемого препарата, следует рассчитать его биоэквивалентную дозу по активности аскорбиновой кислоты (витамина С), разделив дозу аскорбиновой кислоты (витамина С) на Эд (эквивалентную дозу), и умножить на 100%.

Пример 1. Определение дозы яблочного сока для профилактики оксидативного стресса у крысы

Яблоки зимних сортов промыли под проточной водой, натерли на терке и с помощью марли отжали сок. 0,5 мл сока пипеткой поместили в мерную колбу на 50,0 мл прибавили около 10 мл спирта этилового 70% и тщательно перемешали, далее довели до метки тем же растворителем. В коническую колбу помещали пипеткой 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливали 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титровали из микробюретки раствором яблочного сока до обесцвечивания. Параллельно проводили опыт с аскорбиновой кислотой (витамином С). Для этого 0,5 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты (витамина С) количественно помещали в мерную колбу на 50,0 мл и доводили до метки спиртом этиловым 70%. В коническую колбу помещали 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливали 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титровали из микробюретки раствором аскорбиновой кислоты до обесцвечивания раствора.

Эквивалент дозы рассчитывали по формуле:

Эд = (1,03*0,495)/(4,1*0,50)*100= 24,88%

Согласно Руководству Хабриева Р.У. (Руководство по экспериментальному (доклиническому) доза аскорбиновой кислоты (витамина С) для крысы массой 200 г составляет:

(1,29*39)/6,5*0,200 = 1,55 мг

Дозу аскорбиновой кислоты делим на полученный эквивалент дозы (Эд) и умножаем на 100%:

1,55*100/24,88 = 6,23 мл

Таким образом эквивалентная доза яблочного сока для крысы для профилактики оксидативного стресса равна 6,23 мл на одно лабораторное животное.

Пример 2. Определение дозы препарата «Бефунгин» с незаявленными в инструкции по применению антиоксидантными свойствами для профилактики оксидативного стресса у крысы

Пипеткой отбирали 0,5 мл препарата в мерную колбу на 50,0 мл прибавили около 10 мл спирта этилового 70% и тщательно перемешали, далее довели до метки тем же растворителем. В коническую колбу помещали пипеткой 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливали 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титровали из микробюретки раствором препарата «Бефунгин» до обесцвечивания. Параллельно проводили опыт с аскорбиновой кислотой (витамином С). Для этого 0,5 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты (витамина С) количественно помещали в мерную колбу на 50,0 мл и доводили до метки спиртом этиловым 70%. В коническую колбу помещали 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливали 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титровали из микробюретки раствором аскорбиновой кислоты до обесцвечивания раствора.

Эквивалент дозы рассчитывали по формуле:

Эд = (1,02*0,500)/(0,6*0,50)*100= 170,0%

Согласно Руководству Хабриева Р.У. (Руководство по экспериментальному (доклиническому)доза аскорбиновой кислоты (витамина С) для крысы массой 200 г составляет:

(1,29*39)/6,5*0,200 = 1,55 мг

Дозу аскорбиновой кислоты делим на полученный эквивалент дозы (Эд) и умножаем на 100%:

1,55*100/170,0 = 0,91 мл

Таким образом, эквивалентная доза препарата «Бефунгин» для крысы для профилактики оксидативного стресса равна 0,91 мл на одно лабораторное животное.

Пример 3. Определение дозы пчелиной пыльцы (обножки) для профилактики оксидативного стресса у крысы

Пробу пчелиной пыльцы (обножки) растирали в ступке до однородного порошка, из полученной пробы отбирали навеску 0,5 грамма (точная навеска) и помещали в мерную колбу на 50,0 мл прибавили около 10 мл спирта этилового 70% и тщательно перемешали, далее довели до метки тем же растворителем. В коническую колбу помещали пипеткой 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливали 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титровали из микробюретки раствором пчелиной пыльцы (обножки) до обесцвечивания. Параллельно проводили опыт с аскорбиновой кислотой (витамином С). Для этого 0,5 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты (витамина С) количественно помещали в мерную колбу на 50,0 мл и доводили до метки спиртом этиловым 70%. В коническую колбу помещали 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливали 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титровали из микробюретки раствором аскорбиновой кислоты до обесцвечивания раствора.

Эквивалент дозы рассчитывали по формуле:

Эд = (1,05*0,505)/(0,7*0,505)*100= 150,0%

Согласно Руководству Хабриева Р.У. (Руководство по экспериментальному (доклиническому) доза аскорбиновой кислоты (витамина С) для крысы массой 200 г составляет:

(1,29*39)/6,5*0,200 = 1,55 мг

Дозу аскорбиновой кислоты делим на полученный эквивалент дозы (Эд) и умножаем на 100%:

1,55*100/150,0 = 1,03 мг

Таким образом, эквивалентная доза пчелиной пыльцы (обножки) для крысы для профилактики оксидативного стресса равна 1,03 мг на одно лабораторное животное.

Пример 3. Определение дозы сухого экстракта Иван-чая узколистного для профилактики оксидативного стресса у крысы

Пробу сухого экстракта Иван-чая узколистного растирали в ступке до однородного порошка, из полученной пробы отбирали навеску 0,5 грамма (точная навеска) и помещали в мерную колбу на 50,0 мл прибавили около 10 мл спирта этилового 70% и тщательно перемешали, далее довели до метки тем же растворителем. В коническую колбу помещали пипеткой 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливали 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титровали из микробюретки раствором сухого экстракта Иван-чая узколистного до обесцвечивания. Параллельно проводили опыт с аскорбиновой кислотой (витамином С). Для этого 0,5 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты (витамина С) количественно помещали в мерную колбу на 50,0 мл и доводили до метки спиртом этиловым 70%. В коническую колбу помещали 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливали 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титровали из микробюретки раствором аскорбиновой кислоты до обесцвечивания раствора.

Эквивалент дозы рассчитывали по формуле:

Эд = (1,05*0,485)/(0,85*0,500)*100= 119,8%

Согласно Руководству Хабриева Р.У. (Руководство по экспериментальному (доклиническому) доза аскорбиновой кислоты (витамина С) для крысы массой 200 г составляет:

(1,29*39)/6,5*0,200 = 1,55 мг

Дозу аскорбиновой кислоты делим на полученный эквивалент дозы (Эд) и умножаем на 100%:

1,55*100/119,8 = 1,29 мг

Таким образом эквивалентная доза сухого экстракта Иван-чая узколистного для крысы для профилактики оксидативного стресса равна 1,29 мг на одно лабораторное животное.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить дозу для человека и лабораторного животного для любого перспективного препарата-антиоксиданта. Повышение кислотности среды за счет увеличения содержания серной кислоты помогает в ходе титрования определить большее количество веществ восстанавливающей природы, в том числе и за счет водоотнимающих свойств серной кислоты. Использование спирта этилового 70% повышает растворимость многих гидрофильных и липофильных соединений восстанавливающего характера, что позволяет точнее определить антиоксидантные свойства в ходе титрования. Снижение концентрации перманганата калия позволяет точнее установить точку эквивалентности по явности перехода окраски.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для точного определения дозы антиоксиданта, биоэквивалентной дозе аскорбиновой кислоты. Способ определения биоэквивалентности веществ с антиоксидантной активностью заключается в том, что 0,5 мл или 0,5 г вещества (точная навеска) в зависимости от агрегатного состояния препарата количественно переносят в мерную колбу на 50,0 мл и доводят до метки спиртом этиловым 70% и тщательно перемешивают, затем в коническую колбу помещают 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливают 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титруют из микробюретки раствором антиоксиданта до обесцвечивания раствора. Параллельно проводят аналогичный опыт с 0,5 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты (витамином С). Далее рассчитывают эквивалент дозы активности аскорбиновой кислоты и исследуемого препарата по формуле:

Эд = (У*a_вс)/(Х*а_ао)*100%, где

Эд - эквивалент дозы аскорбиновой кислоты (витамина С) в процентах; У - объем раствора аскорбиновой кислоты, израсходованный на титрование, мл; а_вс - навеска аскорбиновой кислоты (витамина С), г; Х - объем раствора исследуемого препарата, израсходованный на титрование, мл; а_ао - навеска/аликвота исследуемого препарата, г. Для расчета дозы антиоксидантного вещества, биоэквивалентной по активности дозе аскорбиновой кислоты (витамина С), следует разделить дозу аскорбиновой кислоты (витамина С) на Эд (эквивалентную дозу) и умножить на 100%. Изобретение позволяет определить биоэквивалентность вновь полученных субстанций препаратов-антиоксидантов и известных препаратов с незаявленными антиоксидантными свойствами, а также рассчитать адекватную биоэквивалентную дозу препарата-антиоксиданта в пересчете на антиоксидантную активность аскорбиновой кислоты (витамина С). 4 пр.

Способ определения биоэквивалентности веществ с антиоксидантной активностью, заключающийся в том, что 0,5 мл или 0,5 г вещества (точная навеска) в зависимости от агрегатного состояния препарата количественно переносят в мерную колбу на 50,0 мл и доводят до метки спиртом этиловым 70% и тщательно перемешивают, затем в коническую колбу помещают 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливают 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титруют из микробюретки раствором антиоксиданта до обесцвечивания раствора, также параллельно проводят опыт с аскорбиновой кислотой (витамином С), для чего 0,5 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты (витамина С) количественно помещают в мерную колбу на 50,0 мл и доводят до метки спиртом этиловым 70%, затем в коническую колбу помещают 1,0 мл титрованного 0,02Н раствора перманганата калия и 5 мл спирта этилового 70%, приливают 1 мл раствора серной кислоты 1/3 и титруют из микробюретки раствором аскорбиновой кислоты до обесцвечивания раствора, далее рассчитывают эквивалент дозы активности аскорбиновой кислоты и исследуемого препарата по формуле:

Эд = (У*a_вс)/(Х*а_ао)*100%, где

Эд - эквивалент дозы аскорбиновой кислоты (витамина С) в процентах,

У - объем раствора аскорбиновой кислоты, израсходованный на титрование, мл,

а_вс - навеска аскорбиновой кислоты (витамина С), г,

Х - объем раствора исследуемого препарата, израсходованный на титрование, мл,

а_ао - навеска/аликвота исследуемого препарата, г, далее следует рассчитать его биоэквивалентную дозу по активности аскорбиновой кислоты (витамина С), разделив дозу аскорбиновой кислоты (витамина С) на Эд (эквивалентную дозу), и умножить на 100%.