Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/78 C12P13/02 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью.

Нитрилгидратаза - фермент, катализирующий процесс гидролиза нитрилов кар- боновых кислот в амиды.

Известны микроорганизмы, продуцирующие фермент нитрилгидратазу, относящиеся к родам Corynebacterium, Nocardia, Brevibacterium, Bacillus, Bacteridium,

Micrococcus, Pseudumonas Rhodococcus.

Одним из примеров использования этого фермента является получение акриламида из акрилонитрила.,

Известны штаммы, способные к трансформации акрилонитрила в акриламид: Corynebacterium N 771, Corynebacterium N 774, Nocardia N 775, Pseudomonas chlororophis B23, Rhodococcus rhodochrous 1-1.

Недостатком данных штаммов является низкая ферментативная активность нитрилгидратазы. В случае штамма Corynebacterium N 774 удельная активность нитрилгидратазы не превышала 38,5 ед.

Х|

iCJ

5

4

Известен штамм Pseudomonas chlororaphis B23, который при выращивании на среде, содержащей аминокислоту L-цистеин (2 г/л), проявлял ферментативную активность 105,7 ед,

Недостатком данного штамма является использование в культуральной среде дорогостоящей аминокислоты.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является штамм Ат-324, мутант Pseudomonas chlororaphis В23, который обладает удельной нитрилгид- ратазной активностью 141 ед.

Недостатками данного штамма являются использование в среде культивирования дорогостоящих аминокислот L-пролина и L- цистеина, дробное введение индуктора - метакриламида.

Целью изобретения является получение штамма с более высокой нитрилгидратаз- ной активностью, не требующего использования аминокислот при выращивании, культивирование на простой синтетической среде,

Заявляемый штамм Rhodococcus rhodochrous M8 депонирован под номером S-226 и характеризуется следующими мор- фолого-культуральными и физиолого-биохи- мическими признаками.

Морфологические признаки: штамм грамположительный, неподвижный, спор и капсул не образует, некислотоустойчив, аэроб. Клетки в возрасте 18-20 ч образуют длинные по 20 мкм, слабо ветвящиеся нити, которые через 48-72 ч распадаются на па- лочковидные и кокковидные элементы.

Палочковидные клетки имеют размеры 0,9-1,2 х 2,0-20,0 мкм. Деление клеток происходит как по раскалывающемуся, так и по сгибающемуся типу. В протоплазме клеток видны внутриклеточные включения в виде зерен (гранулярность протоплазмы).

Культуральные свойства: при росте на мясопептонном агаре штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм (48-72 ч), поверхность сухая, матовая, розового цвета. При росте на мясопептонном бульоне образует пленку и осадок. Лакмусовое молоко не изменяет.

Физиологические свойства: штамм редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра отрицательные. Образует сероводород. Штамм оксида за отрицательный, каталаза- и фос- фатазаположительный. Растет при рН 6-9, оптимальное значение рН 7,0, при температуре 5-45°С, оптимальное значение температуры 30°С. В качестве источников азота использует соединения аммония и нитраты,

Штамм дает кислую реакцию при росте на глюкозе, фруктозе, сорбите, манните и глицерине. Газообразование ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника углерода использует инозит, маннит, мальтозу, сорбит, глюкозу, глицерин, лактат, пируват, не использует рамнозу, галактозу. Крахмал и целлюлозу не гидролизует, твин 60 и твин 80 гидролизует. Аденин не утилизирует.

Химический состав клеток: в клеточной стенке содержится meso-диаминопимели- новая кислота, арабиноза и галактоза. Содержится липид A (LCN), характерный для родококков.

Чувствительность к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к канами- цину, хлорамфениколу, ампициллину, пенициллину, мономициину, тетрациклину, рифампицину.

Патогенность: штамм непатогенный. Ферментативную активность определяли с использованием в качестве субстратов нитрилов карбоновых кислот. За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль амида в одну минуту, содержащегося в 1 мг сухого веса клеток.

Штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 обладает более высокой активностью нитрилгидратазы (150 ед.) по сравнению со штаммом прототипом Ат-324 (141 ед.) и не требует использования в культуральной среде дорогостоящих аминокислот. П р и м е р 1. Выделение штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926. Заявляемый штамм был выделен из почвы с производства акрилонитрила. Навеску почвы 1,0 г ресуспендировали в 10 мл физиологического раствора и отстаивали в течение 1 ч. Надосадочную жидкость в количестве 2 мл вносили в среду следующего состава, г:

К2НР040,5

КН2Р040,5

MgS04 7H200,5

FeSCV7H200,01

Глюкоза1,0

Изобутиро нитрил1,0

Вода водопроводная, мл1000 рН 7,2 ±0,2 50 мл суспензии инкубировали в 300 мл колбе Эрленмейера при 28-30°С, при круговом перемешивании (число качаний 180-200 ). Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высевали на чашки Петри с агаризованной средой (1,5% агар-агара) вышеуказанного состава. Посевы инкубировали 48-72 ч при 28-30°С, после чего отбирали наиболее крупные колонии, которые использовали в дальнейших исследованиях. Колонии пересевали на чашки Петри с мясопептонным агаром. Выделенные культуры изучали на способность к трансформации акрилонит- рила в акриламид.

Микроорганизмы выращивали в течение двух суток на среде выделения, отбирали 5 мл клеточной суспензии, центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6, ресуспендировали в 2 мл буфера того же состава, содержащего акрилонитрил в концентрации 1 г/л. Реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 1 н. HCI. Количественное определение акрила- мида осуществляли методом газожидкост- ной хроматографии на хроматографе ЛХМ-80 с пламенно-ионизационным детектором. В качестве неподвижной фазы использовали Reoplex 400.

В результате была выделена культура Rhodococcus rhodochrous М8 с высокой нит- рилгидратазной активностью.

П р и м е р 2. Использование штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 для трансформации изобутиронитрила в изобутирамид.

Полученный штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 предкультиви- ровали в колбах Эрленмейера, заполненных на 1/10 часть бульоном Хоттингера в течение суток, на качалке (число качаний 120 ) при 30°С. Культуральную жидкость в объеме 10 мл инокулировали в 1,5 л ферментер. Состав среды, г:

КаНРСМ0,5

КНаРСМ0,5

MgS04 7H200,5

CoCi2 7H200,02

Глюкоза10,0

Изобутирамид2,5

Дистиллированная вода, мл1000

рН7,2±0,2

Условия культивирования: Объем культуральной

среды, мл1000

Скорость перемешивания, об/мин600 Аэрация, мин 11:2 Температура, °С30 рН 7,2 Ферментацию вели при контролируемом значении рН. Подтитровку осуществляли 1 н. 1 н. КОН.

0

5 0

5

0

5

0

5

0

5

Из реакционной среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности. Концентрацию клеток определяли фотокалориметрически при длине волны 540 нм, толщине слоя 5,07 мм.

Активность нитрилгидратазы оценивали следующим образом.

1 мл культуральной жидкости центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6. Буферную емкость и значение рН подбирали экспериментально. Клетки ресуспендировали в буфере указанного состава до значения оптической плотности 0,2-0,5 (А 540 нм). К 2 мл клеточной взвеси в фосфатном буфере добавляли изобу- тиронитрил в количестве 25 мкл. Реакцию проводили при 20°С в течение 10 мин, а затем останавливали добавлением 0,1 мл 1 н. HCI. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию изобутирамида в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии.

Удельная активность нитрилгидратазы в отношении изобутиронитрила достигала 140ед.

П р и м е р 3. Использование штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 для трансформации ацетонитрила в ацета- мид.

Штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 подготавливали к процессу трансформации по примеру 2. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата добавляли ацетонитрил в количестве 25 мкл.

Активность нитрилгидратазы в отношении ацетонитрила достигала 220 ед.

П р и м е р 4. Использование штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 для трансформации акрилонитрила в акриламид.

Штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 подготавливали к процессу трансформации как в примере 2. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата добавляли акрилонитрил в количестве 25 мкл.

Изменение ферментативной активности в зависимости от стадии роста клеток представлена в табл.1.

Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила достигала 150 ед.

П р и м е р 5. Влияние температуры на активность нитрилгидратазы штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926.

Бактерии Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 выращивали в течение 70 ч и подготавливали к трансформации по примеру 2. Образцы с реакционной смесью, содержащие 25 мкл акрилонитрила и 0,04 мг клеток по сухому весу в 2 мл 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,6, инкубировали в течение 5 мин при различных температурах. Концентрацию образовавшегося в реакционной смеси акриламида определяли с помощью газожидкостной хроматографии. Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от температуры проведения реакции трансформации представлено в табл. 2.

Таким образом нитрилгидратаза из штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 обладает более высокой термо- стабильностью, чем аналогичный фермент из Pseudomonas chlororaphis B23 (температурный оптимум 20°С) и Rhodococcus sp. N 774 (температурный оптимум 35°С).

П р и м е р 6. Индукция нитрилгидратазы при росте штамма Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 на мочевине.

Штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 предкультивировали в колбах Эрленмейера, содержащих бульон Хоттин- гера в течение суток на качалке при 30°С. 10 мл культуральной жидкости инокулиро- вали в колбы Эрленмейера, содержащие 200 мл синтетической среды с различным количеством мочевины. Состав синтетиче

ской среды, г:

К2НР04

NaH2P04 MgS04 7H20 CoCl2 6HiO FeS04- 7H20 Глюкоза

Дистиллированная вода, мл

Клетки растили в течение Активность нитрилгидратазы примеру 2. Изменение активгидратазы в зависимости от мочевины в среде представле

5 10

15

0

5

0

5

0

5

Результаты табл. 3 показывают, что уровень индукции нитрилгидратазы возрастает с ростом концентрации мочевины в среде и удельная активность достигает максимального значения при концентрации мочевины 16 г/л.

Заявляемый бактериальный штамм М8, ВКПМ S-926 на основании таксономического изучения отнесен к виду Rhodococcus rhodochrous. Штамм обладает индуцибель- ной нитрилгидратазой, осуществляющей гидролиз алифатических нитрилов в амиды. Индукция нитрилгидратазы достигается при выращивании клеток Rhodococcus rhodochrous M8 на минеральной среде с ионами кобальта, содержащей в качестве источника азота и индуктора нитрилы и амиды органических кислот, например изобути- ронитрил или изобутирамид, а в качестве источника углерода - глюкозу. Максимальная активность нитрилгидратазы (удельная активность 300 и общая активность 2400) наблюдается при использовании в качестве источника азота и индуктора мочевины ко- мерчески доступного соединения, что особенно важно в случае промышленного использования штамма. Еще одним важным технологическим преимуществом использования штамма Rhodococcus rhodochrous M8 в качестве катализатора при гидролизе нитрилов является высокая термостабильность нитрилгидратазы. Максимальная активность фермента (1000 ед.) наблюдается при 53°С.

Штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 может быть рекомендован как продуцент фермента нитрилгидратазы и использован в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов кар- боновых кислот.

Формула изобретения

Штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ S-926-продуцент нитрилгидратазы.

Таблица 1

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: получение нового штамма бактерий - продуцента фермента нит- рилгидратазы, выделенного из почвы производства акрилонитрила, с использованием в качестве селектирующего агента изобутиронитрила. Штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМЗ-926 обладает следующими признаками: грампо- зитивный, неподвижный, спор не образует, некислотоустойчив, аэроб. Клетки в возрасте 18-20 ч образуют длинные слабоветвящиеся нити, которые через 48-72 ч распадаются на палочковидные и кокковид- ные элементы. Штамм Rhodococcus rhodochrous 926 обладает высокой активностью нитрилгидратазы, достигающей 140 ммоль мг/мин в отношении изобутиронитрила, 220 ммоль/мг/мин в отношении аце- тонитрила, 150 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила. Штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМЗ-926 может быть использован в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов кар- боновых кислот. 3 табл.

Указанные величины оптической плотности промеряли после соответствующих разведений.

Таблица 2

Таблица 3