Водорастворимые полимерные нанокомпозиты с наночастицами меди в матрице поли-1-винил-1,2,4-триазола, обладающие антимикробной активностью Российский патент 2025 года по МПК A61K9/14 A61K33/34 A61K47/32 A61P31/04 B82B1/00 B82Y30/00 C08F126/06 

Настоящее изобретение относится к области химии полимеров, современной медицины, биологии, фармакологии и нанотехнологии.

А именно, изобретение относится к водорастворимым полимерным нанокомпозитам с наночастицами меди на основе биосовместимого и нетоксичного поли-1 -винил-1,2,4-триазола, обладающим высокой антимикробной активностью, которые являются перспективными для разработки современных медико-биологических препаратов, фармацевтических материалов и косметических средств.

Наночастицы меди и оксидов меди играют важную роль в живых организмах. Они обладают биосовместимостью, способностью проникать через микробные мембраны и проявляют высокую антибактериальную активность [Usman М., El Zowalaty М., Shameli К., Zainuddin N., Salama М, Ibrahim N.A. Synthesis, characterization, and antimicrobial properties of copper nanoparticles // Int. J. Nanomedicine. 2013. V. 8. P. 4467-4479].

Показано, что наночастицы меди перспективны для использования при разработке антимикробных, противогрибковых, противоопухолевых и противовоспалительных препаратов, а также терапевтических средств для заживления ран [Letchumanan D., Sok S.P.M., Ibrahim S., Nagoor N.H., Arshad N.M. Plant-based biosynthesis of copper/copper oxide nanoparticles: An update on their applications in biomedicine, mechanisms, and toxicity // Biomolecules. 2021. V. 11. P. 564].

Основной проблемой при использовании наночастиц меди является их морфологическая и агрегатная неустойчивость в наноразмерном узкодисперсном состоянии. Проводятся интенсивные исследования для устранения этой проблемы путем использования различных органических соединений. Наиболее перспективными являются синтетические биосовместимые полимеры, которые используются в качестве эффективных стабилизирующих матриц, в которые равномерно интеркалируются наночастицы меди (или оксидов меди), образующиеся в процессе формирования полимерного нанокомпозита. При таком процессе полимеры обеспечивают формирование узко дисперсных (1-30 нм) наночастиц меди преимущественно сферической формы, препятствуют их агломерации и способствуют высокой стабильности размерного состояния частиц и их разнообразных свойств. Образующиеся при этом полимерные нанокомпозиты с наночастицами меди обладают широким спектром уникальных свойств и активно используются для создания эффективных биомедицинских материалов, каталитических систем, оптических наносенсоров и экологических биосорбентов. Для использования в биомедицине оптимальными и менее токсичными являются наночастицы меди размерами от 1 до 30 нм [Chen Z. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo // Toxicology Letters. 2006. V. 163. N. 2. P. 109-120.].

Задачей предлагаемого технического решения является разработка новых биосовместимых органо-неорганических полимерных нанокомпозитов с наночастицами меди на основе водорастворимого нетоксичного полимера, обладающих высокой антимикробной активностью.

Из проведенного сравнительного анализа современной научной и патентной литературы выявлены следующие аналоги.

Известны наночастицы меди и наночастицы оксида меди, полученные методом высокотемпературной конденсации, которые обладают антибактериальной активностью в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных штаммов микроорганизмов, а именно, Escherichia coli АВ1157 и Staphylococcus albus [Антимикробные агенты. Глущенко Н.Н., Богословская О.А., Рахметова А.А., Алексеева Т.П., Овсянникова М.Н., Ольховская И.П., Лейпунский И.О., Жигач А.Н., Дымникова Н.С., Галашина В.Н. Патентообладатель: Учреждение Российской академии наук Институт энергетических проблем химической физики РАН Российская Федерация (RU) Патент RU 2446810 С2. Опубл. 10.04.2012. Бюл. №10 Ошибка! Источник ссылки не найден.].

Недостатком синтезированных образцов наночастиц меди и наночастиц оксида меди являются существенные различия частиц по размеру, форме и структуре. Так размер наночастиц меди колеблется от 34 до 103 нм, при этом они различаются по фазовому составу, а именно, содержание кристаллической меди в ядре наночастиц колеблется от 67% до 96%. Средний размер наночастиц оксида меди колеблется от 77 до 124 нм, и содержание оксида меди меняется от 9.05 до 90%. Достаточно крупные размеры частиц и большой диапазон разброса их параметров указывает на их нестабильность и не позволяет однозначно установить характер их влияния на исследуемые микроорганизмы.

Известен полимерный композит с наночастицами меди с антибактериальными свойствами, для синтеза которого в качестве полимерной матрицы использовали полиэтилен высокого давления марки 10803-020, в качестве металлического прекурсора -ацетат меди [Kurbanova N.I., Ragimova S.K., Bakhshaliyeva K.F. Preparation of metal containing nanocomposites based on high pressure polyethylene and research into their bactericidal properties // Chemical Problems. 2019. V. 17. N.2.ISSN 2221-8688].

Недостатком заявляемого композита является прежде всего его нерастворимость, в частности, в воде, и поэтому возможность его использования только в виде пленки.

Ближайшим аналогом настоящего изобретения и выбранный заявителем в качестве прототипа является описанный в патенте [Способ получения полимер-композитного состава, содержащего наночастицы меди, и полимер-композитный состав, полученный этим способом. Кутырева М.П., Медведева О.И., Улахович Н.А., Гатаулина А.Р. Патентообладатели: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ), Медведева Ольга Игоревна. Патент RU 2646465 С2. Опубл. 07.12.2017. Бюл. №34.] полимер-композитный состав, содержащий наночастицы меди в матрице синтетического полимера - гиперразветвленного полиэфирполиола третьей генерации на основе 2,2-дигидроксиметилпропановой кислоты с 32 гидроксильными группами. В патенте показано, что данный полимер-композитный состав обладает антимикотической активностью против культур рода Candida, Aspergillus и Penicillium.

В прототипе в качестве полимера-стабилизатора использован гиперразветвленный полиэфирполиол третьей генерации (ГРПО-Н30) на основе 2,2-дигидроксиметилпропановой кислоты (ЛД₅₀=2000 мг/кг). Отмечается, что частицы меди в композите имеют сферическую или близкую к сферической форму, диаметр частиц не более 30 нм, коллоидный раствор композита стабилен в течение 12 месяцев.

Недостатками описанного в прототипе полимер-композитного состава являются, прежде всего, высокая токсичность полимера (ЛД₅₀=2000 мг/кг), а также ограниченность фазового состояния композита, который существует только в виде коллоидного раствора. Отсутствуют сведения о выделении композита в сухом состоянии. Это ограничивает возможность его детального исследования, оптимизации и применения. В описании отсутствуют результаты рентгенофазового анализа, подтверждающие образование частиц меди именно в нульвалентном, наноразмерном состоянии. В характеристике заявленного состава отсутствует диаграмма распределения частиц меди по размерам, указан только приблизительный параметр, а именно, «диаметр частиц не более 30 нм». Поэтому неясно, какие размеры имеет преимущественное количество частиц меди. Недостаточно охарактеризован исходный полиэфирполиол, используемый в качестве стабилизирующей матрицы, не указана способность растворяться в воде и органических растворителях, что важно для его медико-биологического применения.

Таким образом целью настоящего изобретения является разработка новых водорастворимых биосовместимых органо-неорганических полимерных нанокомпозитов с наночастицами меди размерами не более 10 нм, инкорпорированными в матрицу нетоксичного водорастворимого полимера, обладающих высокой термостойкостью и антимикробной активностью.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве стабилизирующей полимерной матрицы нанокомпозитов выбран синтетический полимер - поли-1-винил-1,2,4-триазол, обладающий биосовместимостью, водорастворимостью, нетоксичностью (ЛД₅₀>5000 мг/кг), высокой термостойкостью (до 330°С), комплексообразуемостью и высокой способностью стабилизировать наночастицы различных металлов (Ag, Au, Fe), предотвращая их агломерацию и повышая стабильность структуры и морфологии композита [Prozorova G.F., Pozdnyakov A.S., Kuznetsova N.P., Korzhova S.A., Emel'yanov A.I., Ermakova T.G., Fadeeva T.V., Sosedova L.M. Green synthesis of water-soluble nontoxic polymeric nanocomposites containing silver nanoparticles // Int. J. Nanomedicine. 2014. V. 9. P. 1883-1889; Прозорова Г.Ф., Поздняков A.C., Коржова С.А., Ермакова Т.Г., Новиков М.А., Титов Е.А., Соседова Л.М. Токсикологические свойства поливинилтриазола и серебросодержащего нанокомпозйта на его основе // Известия АН. Сер. хим. 2014. №9. С.2126-2129; Мячина Г.Ф., Конькова Т.В., Коржова С.А., Ермакова Т.Г., Поздняков А.С., Сухов Б.Г., Арсентьев К.Ю., Лихошвай Е.В., Трофимов Б.А. Наночастицы золота, стабилизированные водорастворимым биосовместимым поли-1 -винил-1,2,4-триазолом // ДАН. 2010. Т. 431. №1. С.50-51; Прозорова Г.Ф., Коржова С.А., Емельянов А.И., Поздняков А.С., Хуцишвили С.С., Вакульская Т.И, Ермакова Т.Г. Полимерные нанокомпозиты с наночастицами оксидов железа // ЖПХ. 2013. Т. 86. №9. С. 1486-1489]. В качестве металлического прекурсора выбран моногидрат ацетата меди Сu(СНзСОО)₂ Н₂О. В качестве восстановителя ионов меди использован гидразин гидрат N₂H₄×H₂O, который в процессе реакции образует только один побочный продукт, а именно газообразный азот, который не влияет на состав и структуру полученных полимерных нанокомпозитов и легко удаляется из реакционной среды.

Сущность настоящего изобретения заключается в получении водорастворимых биосовместимых полимерных нанокомпозитов с наночастицами меди размерами от 1 до 10 нм в количестве от 1.5 до 6.1 мас. % в матрице поли-1-винил-1,2,4-триазола, обладающих высокой термостойкостью и антимикробной активностью.

Новизна настоящего изобретения заключается в отсутствии совокупности признаков состава и свойств композитных полимерных материалов с наночастицами меди в информации научной и патентной отечественной и зарубежной литературы, проанализированной на дату предоставления настоящего патента.

Пример 1.

К 5 мл водного раствора поли-1-винил-1,2,4-триазола с концентрацией 40 мг/мл при комнатной температуре и непрерывном перемешивании добавляют 1.3 мл водного раствора гидразина гидрата с концентрацией 127 мг/мл, пропускают аргон в течение 20 мин и нагревают реакционную смесь до 80°С. Затем постепенно добавляют 2.5 мл водного раствора моногидрата ацетата меди с концентрацией 17 мг/мл. Реакционную смесь продолжают перемешивать в течение 2 часов, осаждают холодным ацетоном. Осадок отделяют центрифугированием и сушат в вакуумном сушильном шкафу до постоянного веса. Полученный полимерный нанокомпозит представляет собой порошок темно-коричневого цвета с содержанием меди 6.1 мас. %. Содержание меди в нанокомпозите определяли методом атомно-абсорбционного анализа на спектрометре Shimadzu АА-7000.

Пример 2.

К 5 мл водного раствора поли-1-винил-1,2,4-триазола с концентрацией 40 мг/мл при комнатной температуре и непрерывном перемешивании добавляют 0.7 мл водного раствора гидразина гидрата с концентрацией 125 мг/мл, пропускают аргон в течение 20 мин и нагревают реакционную смесь до 80°С. Затем постепенно добавляют 1.25 мл водного раствора моногидрата ацетата меди с концентрацией 17 мг/мл. Реакционную смесь продолжают перемешивать в течение 2 часов, осаждают холодным ацетоном. Осадок отделяют центрифугированием и сушат в вакуумном сушильном шкафу до постоянного веса. Полученный полимерный нанокомпозит представляет собой порошок темно-коричневого цвета с содержанием меди 3.5 мас. %. Содержание меди в нанокомпозите определяли методом атомно-абсорбционного анализа на спектрометре Shimadzu АА-7000.

Пример 3.

К 5 мл водного раствора поли-1-винил-1,2,4-триазола с концентрацией 40 мг/мл при комнатной температуре и непрерывном перемешивании добавляют 0.4 мл водного раствора гидразина гидрата с концентрацией 117 мг/мл, пропускают аргон в течение 20 мин и нагревают реакционную смесь до 80°С. Затем постепенно добавляют 0.7 мл водного раствора моногидрата ацетата меди с концентрацией 17 мг/мл. Реакционную смесь продолжают перемешивать в течение 2 часов, осаждают холодным ацетоном. Осадок отделяют центрифугированием и сушат в вакуумном сушильном шкафу до постоянного веса. Полученный полимерный нанокомпозит представляет собой порошок темно-коричневого цвета с содержанием меди 1.5 мас. %. Содержание меди в нанокомпозите определяли методом атомно-абсорбционного анализа на спектрометре Shimadzu АА-7000.

Состав, строение и свойства полученных полимерных нанокомпозитов на основе поли-1-винил-1,2,4-триазола с наночастицами меди определены с использованием методов ИК спектроскопии (спектрометр Varian 3100 FTIR), УФ спектроскопии (спектрометр Shimadzu UV-2450), рентгенофазового анализа (дифрактометр D8 Advance, Bruker Corporation, Германия, Сu излучение), просвечивающей электронной микроскопиии (электронный микроскоп Leo 906Е) и термогравиметрии (прибор STA 449 Jupiter, Netzsch, Selb, Germany) (Рис. 1-5).

На Рис. 1 представлен характерный ИК спектр синтезированных нанокомпозитов с наночастицами меди в матрице поли-1-винил-1,2,4-триазола, в которых присутствуют полосы поглощения, соответствующие валентным и деформационным колебаниям триазольного цикла (см^-1): 3114 (С-Н), 1507 (C=N), 1435 (C-N), 1277 (N-N), 1139, 1004 (С-Н), 660 (C-N) и основной алифатической цепи: 2930 см^-1 (СН, СН₂).

На Рис. 2. представлен характерный спектр оптического поглощения водного раствора нанокомпозита с наночастицами меди в матрице поли-1-винил-1,2,4-триазола. Появление полосы плазмонного поглощения с максимумом 590 нм, характерной для наночастиц нульвалентной меди, свидетельствует об успешном формировании полимерного нанокомпозита с наночастицами меди.

Методом просвечивающей электронной микроскопии (Рис. 3) установлено, что нанокомпозиты на основе поли-1-винил-1,2,4-триазола состоят из изолированных наночастиц меди преимущественно сферической формы, равномерно распределенных в объеме полимерной матрицы с размерами 1-10 нм. При этом преобладающее количество наночастиц меди, а именно 91.6%, имеют размеры от 2 до 4 нм.

Результаты рентгенофазового анализа подтверждают формирование в нанокомпозитах наночастиц нульвалентной меди в кристаллическом состоянии (Рис. 4). На рентгеновских дифрактограммах композитов имеются аморфное гало полимерной матрицы и интенсивные рефлексы с максимумами при углах 20: 43.4, 52.0, 74.4, соответствующие межплоскостным расстояниям гранецентрированной кубической кристаллической решетки металлической меди (111), (200) и (220).

Полученные органо-неорганические полимерные нанокомпозиты с наночастицами меди на основе водорастворимого полимера поли-1-винил-1,2,4-триазола характеризуются высокой термостойкостью: до 280-300°С, согласно данным термогравиметрического анализа (Рис. 5). При температурах выше 300°С снижение веса нанокомпозита обусловлено выделением адсорбированной воды и последующим процессом выгорания углеродного скелета основной полимерной цепи и триазольных групп полимера.

Пример 4.

Для изучения антимикробной активности препаратов использовали суспензии суточных контрольных тест - штаммов коллекции типовых культур Escherichia coli АТСС 25922 и Staphylococcus aureus АТСС 25923 в стерильном 0,9% растворе NaCl (физиологический раствор). Серию разведений водных растворов нанокомпозита с содержанием меди 1.5% и 3.5% готовили в концентрациях 10, 100, 250, 500, 1000 мкг/мл в физиологическом растворе с конечной концентрацией исследуемого микроорганизма 5 х 10⁵ КОЕ/мл (объем 1 мл). Контрольные пробирки, выдержанные в тех же временных интервалах, содержали 1 мл физраствора без препарата и культуру испытуемого штамма. Каждый тест проводили в 4-х повторностях.

Через 0.5, 1, 2, 3 и 24 часа культивирования при комнатной температуре из опытных и контрольных пробирок производили мерный высев (100 мкл) на чашки с агаром Мюллер - Хинтона («Himedia», Индия). После 24-х часовой инкубации в термостате при 37°С подсчитывали количество выросших на чашках колоний в (Таблицы 1-4).

Статистическую обработку проводили с помощью программ Microsoft Excel (2013) и R 4.2.0 (2022). Рассчитаны медианы и первый и третий квартили. Для дисперсионного анализа использовался критерий Крускала-Уоллиса, для сравнения индивидуальных средних значений дисперсионного анализа между контрольными и экспериментальными образцами был проведен тест множественного сравнения Тьюки-Крамера. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

Проведенные исследования показали, что изученные полимерные нанокомпозиты обладают антимикробной активностью в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных штаммов микроорганизмов (Таблицы 1-4). При этом выраженность антимикробного эффекта нанокомпозита зависит от содержания в нем наночастиц меди, концентрации препарата, вида микроорганизмов и времени воздействия на бактериальную взвесь. Предварительно установлено, что исходный полимер - поли-1-винил-1,2,4-триазол, в аналогичных условиях не проявляет антимикробную активность.

Результаты подсчета количества колоний Escherichia coli, выросших на твердой питательной среде Мюллер-Хинтона после воздействия различных концентраций полимерного нанокомпозита с содержанием меди 1,5% в течение 0,5-24 часов в сравнении с контрольной группой, представлены в Таблице 1. Показан выраженный антимикробный эффект, начиная с 1 часа инкубации.

Таблица 1. Антимикробное действие на Escherichia coli АТСС 25922 полимерного нанокомпозита с содержанием меди 1,5% при его различных концентрациях.

Примечание: * р<0,05.

Результаты тестирования полимерного нанокомпозита с содержанием меди 1,5% в отношении Staphylococcus aureus АТСС 25923 приведены в Таблице 2.

Таблица 2. Антимикробное действие на Staphylococcus aureus АТСС 25923 полимерного нанокомпозита с содержанием меди 1,5% при его различных концентрациях.

Примечание: * р<0,05.

Полная гибель микробных клеток в присутствии полимерного нанокомпозита с содержанием меди 1,5% наблюдалась при его концентрации 250-1000 мкг/мл (в отношении Е. coli) и 500 -1000 мкг/мл (в отношении S. aureus) с увеличением времени воздействия до 24-х часов.

Антимикробная активность полимерного нанокомпозита с содержанием меди 3,5% была протестирована тем же методом, с использованием тех же концентраций и в течение того же времени воздействия. В Таблицах 3 и 4 показано антимикробное действие полимерного нанокомпозита с концентрацией меди 3,5% в отношении Escherichia coli АТСС 25922 и Staphylococcus aureus АТСС 25923.

Таблица 3. Антимикробное действие на Escherichia coli АТСС 25922 полимерного нанокомпозита с содержанием меди 3,5% при его различных концентрациях.

Примечание: * р<0,05.

Данные таблицы 3 достоверно демонстрируют, что потребовалось всего 2 часа для полного уничтожения Е. coli при тестируемых концентрациях нанокомпозита: 500 - 1000 мкг/мл, а через 24 часа происходит полное уничтожение клеток Е. coli при концентрациях нанокомпозита: 100-250 мкг/мл.

Таблица 4. Антимикробное действие на Staphylococcus aureus АТСС 25923 полимерного нанокомпозита с содержанием меди 3,5% при его различных концентрациях.

Примечание: * р<0,05.

Результаты испытаний, представленные в таблице 4, демонстрируют высокую антимикробную активность исследуемого полимерного нанокомпозита с содержанием меди 3,5% по отношению к Staphylococcus aureus. Через 24 часа происходит полное уничтожение клеток Staphylococcus aureus при концентрациях нанокомпозита: 10-1000 мкг/мл.

Список документов, цитированных в отчете о поиске:

Usman М., and all. Synthesis, characterization, and antimicrobial properties of copper nanoparticles // Int. J. Nanomedicine. 2013. V. 8. P. 4467-4479.

Letchumanan D., and all. Plant-based biosynthesis of copper/copper oxide nanoparticles: An update on their applications in biomedicine, mechanisms, and toxicity // Biomolecules. 2021. V. 11. P. 564.

Chen Z. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo // Toxicology Letters. 2006. V. 163. N. 2. P. 109-120.

Антимикробные агенты. Глушенко H.H. др. Патент RU 2446810 С2. Опубл. 10.04.2012. Бюл. №109.

Kurbanova N.I., and all. Preparation of metal containing nanocomposites based on high pressure polyethylene and research into their bactericidal properties // Chemical Problems. 2019. V. 17. N.2.ISSN 2221-8688.

Кутырева М.П. и др. Способ получения полимер-композитного состава, содержащего наночастицы меди, и полимер-композитный состав, полученный этим способом. Патент RU 2646465 С2. Опубл. 07.12.2017. Бюл. №34.

Изобретение относится к химии, а именно к водорастворимому термостойкому полимерному нанокомпозиту с антимикробной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных штаммов микроорганизмов. Предложенный нанокомпозит состоит из наночастиц меди размером 1-9 нм в матрице поли-1-винил-1,2,4-триазола, при этом содержание меди составляет от 1.5 до 6.1 мас.%. Изобретение обеспечивает полимерные нанокомпозиты в виде порошка, включающие наночастицы меди с гранецентрированной кристаллической решеткой, а также предотвращение агломерации наночастиц и повышение стабильности структуры и морфологии нанокомпозита. 5 ил., 4 табл., 4 пр.

Водорастворимый термостойкий полимерный нанокомпозит с антимикробной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных штаммов микроорганизмов, характеризующийся тем, что состоит из наночастиц меди размером 1-9 нм в матрице поли-1-винил-1,2,4-триазола, где содержание меди составляет от 1.5 до 6.1 мас.%.