Металлополимерный композитный материал на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов, обладающий магнитными свойствами, антипротеиназной и антимикотической активностью, и способ его получения Российский патент 2024 года по МПК C08K3/22 B82B3/00 C01G51/00 

Изобретение относится к наноматериалам, а именно к магнитоактивным композитам, содержащим наноразмерные частицы металла, стабилизированные сверхразветвленной полимерной матрицей.

Изобретение также относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека, а именно - к области биотехнологии, ветеринарии и медицины, а также к области нанотехнологий, более конкретно, к магнитоактивному полимер-композитному составу, включающему наночастицы магнитоактивного металла и сверхразветвленных дендрито-подобных полимеров различных генераций, который может быть использован в качестве основы магнитоактивных диагностических агентов, магнитоуправляемых средств доставки лекарственных препаратов, основы агентов альтернативных методов лечения рака (метод гипертермии, магнитоуправлемая химиотерапия), синтетического модулятора активности протеиназ и антимикотических (антигрибковых) препаратов.

Металлосодержащие магнитные наночастицы (наноматериалы) представляют большой интерес для катализа [Iablokov, V. Superior Fischer-Tropsch performance of uniform cobalt nanoparticles deposited into mesoporous SiC / V. Iablokov, S.A. Alekseev, S. Gryn, I. Bezverkhyy, V. Zaitsev, L. Kovarik, T. Visart de Bocarme, N. Kruse // J. Catal. - 2020. - V. 383. - P. 297-303], биотехнологии [Tartaj, P. Advances in magnetic nanoparticles for biotechnology applications / P. Tartaj, M.P. Morales, T. S. Veintemillas-Verdaguer, C.J. Serna // J. Magn. Magn. Mater. - 2005. - V. 290-291. - P. 28-34], биомедицины [Ansari, S.M. Cobalt nanoparticles for biomedical applications: Facile synthesis, physiochemical characterization, cytotoxicity behavior and biocompatibility / S.M. Ansari, R.D. Bhor, K.R. Pai, D. Sen, S. Mazumder, K. Ghosh, Y.D. Kolekar, C.V. Ramana // Appl. Surf. Sci. - 2017. - V. 414. - P. 171-187.], адресной доставки лекарств [Ma, Y. Advances of Cobalt Nanomaterials as Anti-Infection Agents, Drug Carriers, and Immunomodulators for Potential Infectious Disease Treatment / Y. Ma, W. Lin, Y. Ruan, H. Lu, S. Fan, D. Chen, Y. Huang, T. Zhang, J. Pi, J.F. Xu // Pharmaceutics - 2022. - V. 14. - № 11. - Art. 2351] и магнитно-резонансной томографии [Parkes, L.M. Cobalt nanoparticles as a novel magnetic resonance contrast agent-relaxivities at 1.5 and 3 Tesla / L.M. Parkes, R. Hodgson, L.T. Lu, L.D. Tung, I. Robinson, D.G. Fernig, N.T.K. Thanh // Contrast Media amp; Mol. Imaging - 2008. - V. 3. - № 4. - P. 150-156].

Среди магнитоактивных наноматериалов наибольшими перспективами обладают системы на основе наночастиц железа и кобальта, которые демонстрируют самую высокую намагниченность насыщения и магнитную проницаемость в сочетании с хорошей механической прочностью. Следует отметить, что данные металлы также относятся к категории биофильных металлов, вследствие чего являются активными участниками широкого ряда биологических процессов [Kong, I.C. Comparative Effects of Particle Sizes of Cobalt Nanoparticles to Nine Biological Activities / I.C. Kong, K.S. Ko, D.C. Koh, C.M. Chon // Int. J. Mol. Sci. - 2020. - V. 21. - № 18. - Art. 6767]. Такие наноматериалы являются бифункциональными агентами и могут быть использованы для создания агентов для тераностики [Angelakeris, M. Magnetic nanoparticles: A multifunctional vehicle for modern theranostics / M. Angelakeris // Biochim. Biophys. Acta (BBA) - Gen. Subj. - 2017. - V. 1861. - № 6. - P. 1642-1651]. Тераностика - это передовая концепция, которая включает в себя интеграцию диагностики и терапии на единой платформе с использованием наноматериалов для целей персонифицированной медицины. Для целей тераностики необходимы мультифункциональные наноматериалы или нанотераностические платформы, обладающие одновременно свойствами диагностического агента (биомаркер, реагент для визуализации и т.п.) и свойствами терапевтического агента (химиотерапевтическая активность, свойства лиганда-мишени и т.д.). Тераностические наноматериалы обладают несомненными преимуществами относительно классических диагностических и терапевтических агентов, так как используются в рамках подхода «одно вещество» для раннего выявления и своевременного оптимального лечения заболеваний, обладают высоким терапевтическим эффектом при борьбе с лекарственной устойчивостью и обеспечивают снижение дозировок [Chen, F. Theranostic Nanoparticles / F.Chen, E. B.Ehlerding, W. Cai // Journal of Nuclear Medicine.- 2014.- V.55(12).- P. 1919-1922.].

Магнитоактивные наноматериалы на основе биофильных металлов однозначно перспективны для тераностики: наличие магнитной активности отвечает за позиционирование в качестве диагностического агента (например, в методе МРТ) или магнитоактивного вектора доставки лекарственных средств [Корсакова, A.С. Магнитные наночастицы для компонентов МРТ-диагностики и электронных устройств / А.С. Корсакова, Д.А. Котиков, К.С. Ливонович, Т.Г. Шутова, Ю.С. Гайдук, В.В. Паньков // Журнал белорусского государственного университета. Физика. - 2021.- Т.1.- С.12-19], [Garello, F. Micro Nanosystems for Magnetic Targeted Delivery of Bioagents / F. Garello, Y. Svenskaya, B. Parakhonskiy, M. Filippi // Pharmaceutics. - 2022. - V. 14. - № 6. - Reg. 1132], а биологическая активность нанофазы биофильного металла позволит дополнительно проявлять терапевтического агента за счет специфического взаимодействия с клеточными мембранами и ферментативными каскадами.

В этом направлении материалы на основе наночастиц кобальта и/или его оксидов являются наиболее перспективными. Во-первых, наночастицы кобальта имеет более высокое значение намагниченности насыщения, чем наночастицы железа (1422 emu/cm³ для кобальта и 395 emu/cm³ для оксида железа при комнатной температуре и сопоставимых размерах). Поэтому наночастицы кобальта могут оказывать большее влияние на релаксацию протонов, и соответственно давать улучшенный контраст в методе МРТ диагностики [Kashmira, P. Tank Cobalt-doped nanohydroxyapatite: synthesis, characterization, antimicrobial and hemolytic studies / P. Kashmira, Tank, S. Kiran et all // Journal of Nanoparticle Research. - 2013. - V. 15. - P. 1-11]. Во-вторых, модифицируя наночастицы кобальта лекарствами или другими различными веществами для медицины, ветеринарии и биотехнологий, возможно повысить эффективность лекарств при уменьшении дозировки, и влиять на направленность воздействия с помощью магнитных свойств. В третьих, помимо магнитной активности наночастицы кобальта обладают значимой биологической активностью. Наночастицы кобальта успешно используются в качестве потенциальных терапевтических агентов для лечения инфекционных заболеваний [Sharma, G. Nanoparticles based therapeutic efficacy against Acanthamoeba: Updates and future prospect / G. Sharma, S.K. Kalra, N. Tejan, U. Ghoshal // Exp. Parasitol. - 2020. - V. 218. - Art. 108008], вызывают выработку активных форм кислорода (АФК), которые обеспечивают ингибирующее действие наночастиц кобальта на различные виды бактерий, грибков и вирусов [Ma, Y. Advances of Cobalt Nanomaterials as Anti-Infection Agents, Drug Carriers, and Immunomodulators for Potential Infectious Disease Treatment / Y. Ma, W. Lin, Y. Ruan, H. Lu, S. Fan, D. Chen, Y. Huang, T. Zhang, J. Pi, J.F. Xu // Pharmaceutics - 2022. - V. 14. - № 11. - Art. 2351]. Однако, проблемой кобальто-содержащих наноматериалов является токсичность, которая показана на разных клеточных моделях in vitro [Wan, R. Cobalt nanoparticles induce lung injury, DNA damage and mutations in mice/ R. Wan, Y. Mo, Zh. Zhang, M. Jiang, Sh. Tang, Q. Zhang // Particle and Fibre Toxicology. - 2017. - V. 14.- Art.38]. Включение наночастиц кобальта включенные в нетоксичную матрицу гидроксиапатита (Co-HAP), позволяет сохранить антибактериальный эффект, который продемонстрирован в отношении патогенов Micrococcus luteus и Staphylococcus aureus [Kashmira, P. Tank Cobalt-doped nanohydroxyapatite: synthesis, characterization, antimicrobial and hemolytic studies / P. Kashmira, Tank, S. Kiran et all // Journal of Nanoparticle Research. - 2013. - V. 15. - P. 1-11]. Авторами доказано, что фунгицидная активность зависит от концентрации наночастиц кобальта в составе материала. Результаты гемолитического теста показали, что все образцы наночастиц кобальта, иммобилизованные в гидроксиаппатите не вызывают разрушение эритроцитов - гемолиз, что позволяет сделать вывод о том, что наночастицы кобальта в составе композитного материала на основе нетоксичного базового компонента можно отнести к безопасным биоматериалам для возможного использования в медицине.

Таким образом, наночастицы кобальта могут быть позиционированы как активный компонент перспективных наноматериалов с мультифункциональной (магнитной и биологической) активностью для тераностики.

Морфология и свойства наноматериалов определяются природой и соотношением их составляющих, а также синтетическим подходом, которая используется для их получения. На сегодняшний день существует достаточное количество надежных способов синтеза металлосодержащих наночастиц, которые могут быть разделены как по типу фазового перехода, так и в зависимости от природы основного процесса [Елисеев, А. А. Функциональные наноматериалы / А. А Елисеев, А. В. Лукашин // Москва: ФИЗМАТЛИТ. - 2010. - 456 с]. Синтез может осуществляться в твердой, газовой фазах и в растворе с использованием методов гидротермического разложения, лазерного пиролиза, совместного осаждения и соосаждения, сонохимии и химического восстановления в конденсированных средах (растворах), биосинтеза с использованием клеточных культур бактерий, грибов и экстрактов растений [Khusnuriyalova, A.F. Preparation of Cobalt Nanoparticles/ A.F. Khusnuriyalova, M. Caporali, E. Hey-Hawkins, O.G Sinyashin., D.G. Yakhvarov // Eur.J.Inorg.Chem. - 2021.- I. 30. - P.3023-3047]. Однако наиболее простой и доступной технологией синтеза наночастиц или их бинарных соединений (оксидов) является метод химического восстановления в растворе [Salman, S.A. Synthesis and Characterization of Cobalt Nanoparticles Using Hydrazine and Citric Acid / S.A. Salman, T. Usami, K. Kuroda, M. Okido // J. Nanotechnol. - 2014. - V. 2014. - P. 1-6.].

Для предотвращения нежелательных процессов агрегации и обеспечения химической стабильности наночастиц металлов синтез проводится в присутствии стабилизирующих агентов, в качестве которых могут выступать неорганические [Tank, K. P. Cobalt-doped nanohydroxyapatite: synthesis, characterization, antimicrobial and hemolytic studies / K. P. Tank, K. S. Chudasama, V. S. Thaker, M. J. Joshi // Journal of Nanoparticle Research. - 2013. - V. 15(5). - P.1-11], органические [Hussain, F. Polymer-matrix Nanocomposites, Processing, Manufacturing, and Application: An Overview / F. Hussain, M. Hojjati // J. of Comp. Mat. -2006. - V. 40. № 17. - P. 1511-1575] и биологические [Shah, M. Green Synthesis of Metallic Nanoparticles via Biological Entities / M. Shah, D. Fawcett, S. Sharma, S. K. Tripathy, G. E. J. Poinern // Materials. - 2015. -V. 8. - P.7278-7308] соединения. В зависимости от молекулярного строения используемых веществ - стабилизаторов, природы и концентрации их функциональных групп варьируется механизм стабилизации, морфология и функциональные свойства наночастиц. Особенно важен выбор стабилизатора при дизайне мультифункциональных наночастиц. Для этих целей наиболее подходящими являются синтетические полимеры. [Бронштейн, Л.М. Наноструктурированные полимерные системы как нанореактры для формирования наночастиц/ Л.М.Бронштейн, С.Н. Сидоров, П.М. Валецкий// Успехи химии. - 2004. - Т.73, Вып.5.- С. 542 - 558] Природа и архитектура макромолекулы полимера позволяет не только успешно стабилизировать металлические наночастицы с сохранением их функциональной активности, но и может усилить/дополнить целевую функциональную активность наноматериала. При создании металлосодержащих наноматериалов для биомедицинских приложений особый интерес в качестве стабилизатора представляют полимеры с трехмерной (3D) биоподобной архитектурой. К такому типу полимеров относятся сверхразветвленные полимеры [Bosman, A.W. About dendrimers: structure, physical properties and applications/ A. W. Bosman, H. M. Janssen, E. W. Meijer// Inorganic and Organometallic Macromolecules: Design and applications. -2008. - P.21-35], [Irfan, M. Encapsulation Using Hyperbranched Polymers: From Research and Technologies to Emerging Applications / M. Irfan, M. Seiler// Industrial & Engineering Chemistry Research. - 2010. - V. 49(3). - P. 1169-1196], [Santra, S. Aliphatic hyperbranched polyester: A new building block in the construction of multifunctional nanoparticles and nanocomposites / S. Santra, C. Kaittanis, J.M. Perez // Langmuir. - 2010. - V. 26(8) - P. 5364-5373]. Молекулы сверхразветвленных полимеров имеют состав и свойства, наиболее близкие к свойствам дендримеров [Wu, H. Preparation and magnetic properties of cobalt nanoparticles with dendrimers as template / H. Wu, C. Zhang, L. Jin, H. Yang // Materials Chemistry and Physics. - 2010. - V. 121. - P. 342-348], но отличаются менее строгой топологической структурой, растворимостью и простотой синтеза. Могут образовывать системы внутри- и межмолекулярных связей и выступать в качестве нанореакторов для наночастиц. Металлы в таких структурах могут находиться в ядре, точках ветвления, периферии или дендритных окнах. Использование нетоксичных биодеградируемых сверхразветвленных полимеров позволяет обеспечить успешных биодокинг полимер-металлических частиц с целевыми биомакромолекулами с достижением целой биологичкой активности.

Поэтому заявленное техническое решение ограничивается использованием в качестве стабилизаторов наночастиц кобальта синтетических дендритоподобных сверхразветвленных полимеров.

Из исследованного уровня техники выявлены следующие аналоги.

Наиболее широко представлена информация о синтезе, морфологии и функциональной активности магнитоактивных материалов на основе биметаллических наночастицах железо/кобальт [Vintuhra, C.H.Magnetic and antimicrobial properties of cobalt-zinc ferrite nanoparticles synthesized by citrate-gel method/ C.H.Vintuhra, Ch. B. N. Kadiyala, S.C. Chandra, R. Dachepalli // Int. J. Appl. Ceram. Technol. - 2019. - V. 16. - № 5. - P. 1944-1953], [De Lima, L.J. Magnetic behavior in CoFe₂-CoFe₂O₄ nanocomposites obtained from colloidal synthesis using chitosan and borohydride reduction / L.J. de Lima, E.L. Brito, R.B. da Silva, A. Franco, J.A.P. da Costa, C.L. de Vasconcelos, J.M. Soares // J. Magn. Magn. Mater. - 2017. - V. 444. - P. 378-382]. Сущностью представленных выше материалов являются биметаллические наноматериалы, содержащие кроме кобальта дополнительно наночастицы железа и цинка.

Суперпарамагнитные наночастицы Co_xZn_yFe₂O₄ [Vintuhra, C.H.Magnetic and antimicrobial properties of cobalt-zinc ferrite nanoparticles synthesized by citrate-gel method/ C.H.Vintuhra, Ch. B. N. Kadiyala, S.C. Chandra, R. Dachepalli // Int. J. Appl. Ceram. Technol. - 2019. - V. 16. - № 5. - P. 1944-1953] сферический формы с размерами 22-29 нм и антибактериальной активностью по отношению к культурам Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus Klebsiella planticola и Candida albicans получены цитратным золь-гель методом с последующим отжигом геля при 600 0С в течение 4 часов для получения золы, недостатком которого является ограниченная стабильность синтезированных наносистем в условиях стабилизации цитрат-анионом. Использование отжига стабилизирующей цитратной оболочки предполагает агломерацию наночастиц при хранении и потерю функциональной активности и увеличение токсичности.

Ферромагнитные нанокомпозиты CoFe₂-CoFe₂O₄ [De Lima, L.J. Magnetic behavior in CoFe₂-CoFe₂O₄ nanocomposites obtained from colloidal synthesis using chitosan and borohydride reduction / L.J. de Lima, E.L. Brito, R.B. da Silva, A. Franco, J.A.P. da Costa, C.L. de Vasconcelos, J.M. Soares // J. Magn. Magn. Mater. - 2017. - V. 444. - P. 378-382] с размером 4-13 нм. синтезированы восстановление железа и кобальта из смеси их хлоридов 0.5 моль/л водным раствором борогидрида натрия при температуре 3°С. в присутствии хитозана в качестве неорганического стабилизатора. Для лучшего сшивания хитозана добавляли 25% водного раствора глутарового альдегида. Полученную дисперсию отделяли центрифугированием, с последующей сушкой в трубчатой печи в течение 1 часа при 80°С. Образцы подвергались термообработке при 380°С в течение 2 часов в атмосфере N₂/H₂ для деградации чистого и сшитого хитозана, испарения с удалением летучих продуктов. К недостаткам можно отнести высокую концентрацию восстановителя - борогидрида натрия, который является токсичным реагентом, сложность и многоступенчатость синтетических процедур, требовательность методики синтеза к аппаратурному оформлению, также отсутствуют данные о биосовместимости или гемотоксичности и биологической активности синтезированного наноматериала.

Был предложен способ получения гибридных нанокомпозитных магнитных материалов на основе полидифениламина и наночастиц Co-Fe [С.Ж. Озкан, Г.П. Карпачева. Нанокомпозитные магнитные материалы на основе полидифениламина и наночастиц Co-Fe и способ его получения. Патент РФ № 2724251, 22.06.2020]. Способ его получения заключается в ИК-нагреве прекурсора на основе полидифениламина (ПДФА) и затравочных наночастиц Co-Fe в материале 2-45 масс. % от массы полимерной матрицы. Наночастицы диспергированы в полимерной матрице ПДФА, обладают сферической формой, и имеют диаметр 400<d<900 нм и суперпарамагнитными свойствами.

К недостаткам по способу синтеза можно отнести использование в качестве стабилизитора цитотоксичного реагента - полифенилендиамина и сложность и многостадийность экспериментальной методики, включающей предварительный синтез затравочных наночастиц Co-Fe и аппаратуру для ИК-нагрева. К недостаткам по морфологии и функциональным свойствам наномпозита можно отнести: широкое распределение по размерам и значение диаметра наночастиц более 80 нм не позволяет использовать данный материал в биомедицине и фармации; неоднородность состава - присутствие дополнительно анизотропных частиц прямоугольной формы.

По способу синтеза и свойствам материалов на основе наночастиц кобальта (без примесей других металлов) выявлены следующие технические решения.

Представлены данные о материале на основе наночастиц кобальта, полученного методом термического разложения нормального или кислого малеата кобальта (II) в атмосфере гелия (Не) до температуры 500°С с последующим охлаждением до комнатной температуры [Л.И. Юданова, В.А. Литвиненко, Н.Ф. Юданов Полимерный кобальтосодержащий нанокомпозит. Патент РФ №2538887, 10.01.2015]. В качестве результирующего наноматериала получены наночастицы кобальта, содержащие СоО и Со₃О₄ на поверхности. Частицы кобальто-содержащего нанокомпозита однородны, имеют сферическую форму и диаметр 3-4 нм стабилизированы в частицах линейного полимера, образующегося в ходе термолиза малеатного фрагмента прекурсора (диаметр частиц кобальта в полимерной оболочке также сферической формы - 5-8 нм). Содержание кобальта в композитах 65-67%, углерода - 31-32%, водорода 1.9-2%, кислорода 0.1%.

К недостаткам метода синтеза кобальто-содержащего нанокомпозита можно отнести сложность процедур высокотемпературного синтеза в токе инертного газа гелия. Недостатком синтезированного продукта является отсутствие магнитной активности (композит является диэлектриком), отсутствие данных о стабильности, биосовместимости или гемосовместимости и биологической активности наночастиц.

Известен способ [Г.Л. Пашков, С.В. Сайкова, М.В. Пантелеева, Е.В. Линок Способ получения наноразмерного порошка кобальта. Патент РФ №2483841, 10.06.2013] получения наноразмерного порошка кобальта с магнитными свойствами сольвотермическим разложением в течение 10 до 30 ч при температуре 400°С α-модификации гидроксида кобальта, интеркалированной додецилсульфатом натрия в углеводородном масле, с последующим отделением нанокомпозита в виде осадка, его отделением и промывкой. Продуктом синтеза являются суперпарамагнитные наночастицы металлического кобальта в вакуумном масле сферической формы с размерами 120-125 нм, покрытых оболочкой углерода. Также были получены ферромагнитные наночастицы кобальта в индустриальном масле, в которых присутствует аморфная фаза Со(ОН)₂.

К недостаткам данного технического решения по способу синтеза относится использование токсичного углеводородного масла в качестве стабилизатора, что не позволяет использовать наноматериал для биомедицины, сложность аппаратурного оформления синтеза в сверхкритических условиях, длительность кипячения при высоких температурах. К недостаткам технического решения по морфологии (размер, форма, состав) и функциональным свойствам наноматериала относятся: присутствие в составе материала примеси - аморфной фазы неразложившегося Со(ОН)₂; формирование наночастиц кобальта анизотропной формы (иглы), что потенциально увеличивает токсичность наноматериала. Кроме того, отсутствуют данные о магнитных свойствах, био-/гемосовместимости и биологической активности синтезированного композита.

Предложен способ [Л.О. Ниндакова Способ получения нанодисперсного порошка кобальта. Патент РФ №2492029, 10.09.2013] получения нанодисперсного порошка кобальта, включающий восстановление ацетилацетоната кобальта (II) триэтилалюминием в растворе толуола в атмосфере аргона. Для синтеза растворяют ацетилацетонат кобальта в 10 мл 0.01 М толуольном растворе, с последующим прикапыванием в течение 30 минут 0.1 М раствора триэтилалюминия в атмосфере аргона. Реакционную смесь выдерживают в течении 1-2 часов при 20-30°С, концентрируют до 3-6 мл, добавляют 1-2 мл насыщенного углеводорода (пентан, гексан, гептан или октан), после формирования ультрадисперсного осадка декантируют раствор над осадком, промывают и высушивают его при пониженном давлении при температуре 20-30°С. В качестве результирующего нанокомпозита получены ультрадисперсные осадки наночастиц кобальта в пентане, гексане, гептане или октане. Кобальтосодержащий композит представлен частицами размером 2-5 нм и их агломератов размером 20-40 нм, с содержанием металла в 52-62%.

К недостаткам данного технического решения по способу синтеза является использование высокотоксичного и пожароопасного восстановителя триэтилалюминия, высокотоксичных растворителей, проведение синтетических процедур в атмосфере аргона, что усложняет аппаратуру. К недостаткам технического решения по морфологии (размер, форма, состав) и функциональным свойствам наноматериала относятся: использование для стабилизации нанофазы кобальта органических растворителей, что ограничивает применение материала в области биотехнологии, ветеринарии и медицины; отсутствие данных о составе композита и устойчивости; отсутствие данных о магнитных характеристиках, биологических свойствах, биосовместимости или гемолитической активности.

Предложен гидротермальный способ [Ansari, S.M. Cobalt nanoparticles for biomedical applications: Facile synthesis, physiochemical characterization, cytotoxicity behavior and biocompatibility / S.M. Ansari, R.D. Bhor, K.R. Pai, D. Sen, S. Mazumder, K. Ghosh, Y.D. Kolekar, C.V. Ramana // Appl. Surf. Sci. - 2017. - V. 414. - P. 171-187] синтеза наночастиц кобальта стабилизированных олеиновой кислотой, в качестве осадителя и восстановителя использовался гидразин гидрат. Наночастица представляет собой металлический кобальт, покрытый оксидным слоем СоО в оболочке из олеиновой кислоты. Средний радиус наночастиц 22 нм и агломерированной структуры 192 нм. Наночастицы обладают ферромагнитными свойствами. Токсикологическая активность синтезированных наночастиц в отношении устойчивых к цисплатину клеток рака яичников человека и нормальных мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС) позволяет предположить, что наночастицы были умеренно антипролиферативными в отношении раковых клеток и безопасными в отношении нормальных клеток. Оценка биосовместимости наноматериала по величине токсичности по отношению к эритроцитам человека выявила менее 5% гемолиза до концентрации 250 мкг/мл.

Недостатком известного технического решения по способу синтеза является использование высокотоксичного осадителя - гидрата гидразина; недостатком по функциональным свойствам нанокомпозита: является отсутствие данных об антипротеиназной активности материала.

Предложен способ синтеза наночастиц кобальта (Co-SD) [Nagababu, U. Facile synthesis, physiochemical characterization and bio evaluation of sulfadimidine capped cobalt nanoparticles / U. Nagababu, J.V. Shanmukha Kumar, M. Rafi Shaik, M.A.F. Sharaf // Saudi J. Biol. Sci. - 2021. - V. 28. - № 4. - P. 2168-2174] с размером 3-5 нм покрытых лекарственным препаратом сульфадимезином (SD) методом химического восстановления в растворе. К соли хлорида кобальта 0.1 М растворенной в дистилированной воде добавляют 50 мл 0.1 М сульфадимизинового препарата для стабилизации. К реакционной смеси добавляют 20 мл боргидрида натрия при постоянном перемешивании в течение 30 минут при комнатной температуре. Полученный осадок отделяют декантацией и сушат при 60°С в течение 12 часов. Наночастицы Co-SD проявляют ингибирующее действие в отношении бактерий Klebsiella pneumonia (зона ингибирования 26 мм), Escherichia coli (зона ингибирования 22 мм), Pseudomonas syringae (зона ингибирования 22 мм).

К недостаткам известного технического решения по способу синтеза относится отсутствие информации о концентрации восстановителя - борогидрида натрия в синтезе и процедурах очистки нанокомпозита от боратов натрия, образующихся в рамках данной методики. К недостаткам по морфологии и функциональным свойствами кобальто-содержащего нанокомпозита относится: отсутствие данных об устойчивости, магнитной активности, антипротеиназной активности, биосовместимости нанокомпозита; отсутствие сопоставления и оценочных характеристик вклада наночастиц кобальта в антибактериальную активность нанокомпозита по сравнению с антибактериальным препаратом сульфидимезином, находящимся в оболочке наночастиц.

При рассмотрении способов получения наночастиц кобальта с использованием полимерных стабилизаторов выявлены следующие технические решения.

Описан метод формирования металлополимерного дисперсного магнитного материала Со/ПФОА на основе частиц кобальта [Карпачева Г.П., Озкан С.Ж. Металлополимерный дисперсный магнитный материал и способ его получения. Патент РФ № 2601005, 27.10.2016.], где ПФОА - полидифениламин. Синтез проводится в условиях ИК-нагрева прекурсора на основе полифеноксазина (ПФОА) и солей Со (ацетат Со(ООССН₃)₂⋅4H₂O, ацетилацетонат Со(СН₃СОСН=С(СН₃)O)₂, карбонат CoCO₃≥6H₂O, нитрат Co(NO₃)₂⋅6H₂O кобальта) и позволяет получать материал Со/ПФОА в виде порошка черного цвета, содержащий 1÷50 мас.% наночастиц Со, относительно массы полимера без учета кислотного остатка. Наночастицы α-Со с гексагональной плотноупакованной решеткой и β-Со с кубической гранецентрированной решеткой, а также наночастиц СоО диспергированы в полимерной матрице, имеют размеры 4<d<14 нм, обусловливающие суперпарамагнитное поведение нанокомпозитного материала.

К недостаткам по способу синтеза можно отнести использование цитотоксичного линейного полимера- стабилизатора полифенилендиамина и использование аппаратуры для ИК-нагрева. К недостаткам по морфологии и функциональным свойствам наномпозита можно отнести отсутствие данных о биосовместимости, биологической, активности и устойчивости наночастиц.

Описан способ получения [Соколов М.Е., Войцеховская С.А., Панюшкин В.Т. Полимерный магнитный материал, содержащий наночастицы кобальта. Патент РФ № 2475878, 04.08.2011] магнитного материала, содержащего полимерное связующее - сополимер акриловой кислоты (АК) с этилметакрилатом (ЭМА) и сферические магнитоактивные наночастицы кобальта размером 5-15 нм при следующих соотношениях компонентов, мас.%: сополимер 49,3-79,55; наночастицы кобальта 20,45-50,7. Синтез ведут методом термолиза раствора, полученного смешиванием раствора октакарбонилдикобальта в 10%-ном растворе сополимера АК:ЭМА 1:100. В результате получают ферромагнитный полимерный материал с массовым содержанием наночастиц кобальта 20,45%.

Недостатком известного технического решения по способу синтеза является использование токсичного прекурсора кобальта октакарбонилдикобальта, крайне опасного для человека и окружающей среды. К недостаткам кобальто-содержащего нанокомпозита можно отнести: форму существования в виде тонких пленок, отсутствие данных о биологической активности, биосовместимости и устойчивости наноматериала.

Предложен способ синтеза [Qiao, R. Fabrication of Superparamagnetic Cobalt Nanoparticles-Embedded Block Copolymer Microcapsules / R. Qiao, X.L. Zhang, R. Qiu, Y. Li, Y.S. Kang // J. Phys. Chem. C - 2007. - V. 111. - № 6. - P. 2426-2429] суперпарамагнитных наночастиц кобальта, встроенных в блок-сополимерные микрокапсулы с использованием полиэтиленгликоля (PEG-b-PPG-b-PEG) методом сольвотермической реакции в присутствие 7.5 ммоль щелочи гидроксида натрия при постоянном перемешивании при комнатной температуре в атмосфере азота. Суспензию помещают в автоклав с тефлоновым вкладышем с нагреванием при 200°С в течение 12 часов с последующим охлаждением до комнатной температуры. Полученный материал промывают этанолом для удаления побочных продуктов. Полимер-композитный материал представляет собой капсулы сферической формы с размером 2-4 мкм с включенными наночастицами кобальта с размерами 13 нм, обладающие суперпарамагнитными свойствами.

К недостаткам известного технического решения по способу синтеза является использование линейного полимера для стабилизации и сложность аппаратуры для сольвотермального синтеза в сверхкритических условиях. К недостаткам по морфологии и функциональным свойствам нанокомпозита относятся отсутствие данных о биологической активности, биосовместимости и устойчивости материала.

Известен аналог композитного материала на основе дендримера полиамидоамина (ПАМАМ) [Kavas, H. Fabrication and characterization of dendrimer-encapsulated monometallic Co nanoparticles / H. Kavas, Z. Durmus, E. Tanrıverdi, M. Şenel, H. Sozeri, A. Baykal // J. Alloys Compd. - 2011. - V. 509. - № 17. - P. 5341-5348]. Сущностью является способ синтеза наночастиц кобальта стабилизированных ПАМАМ различной генерации (G0.0-3.0) с различным соотношением металла Со²⁺/дендример методом химического восстановления. В качестве восстановителя использовался борогидрид натрия с концентрацией 0.3 моль/л. Синтезировнанный нанокомпозит обладает суперпарамагнитными свойствами, является рентгеноаморфным порошком, содержащим агреггированные наночастицы кобальта в матрице ПАМАМ.

К недостаткам известного технического решения по способу синтеза является использование цитотоксичного дендримера - ПАМАМ для стабилизации [Janaszewska, X.X. Cytotoxicity of Dendrimers / X.X. Janaszewska, X.X. Lazniewska, X.X. X.X. Marcinkowska, X.X. Klajnert-Maculewicz // Biomolecules - 2019. - V. 9. - № 8. - Reg. 330] наночастиц кобальта, отсутствие данных об очистке синтезированного нанокомпозита от побочных продуктов окисления борогидрида натрия. Недостатками синтезированного металло-полимерного нанокомпозита являются: высокая агрегационная активность, отсутствие данных о форме частиц; отсутствие данных о биологической активности, биосовместимости и устойчивости наночастиц.

Описан способ синтеза наночастиц кобальта путем химического восстановления восстановления комплексных форм CoCl₂-ПАМАМ борогибридом натрия [Wu, H. Preparation and magnetic properties of cobalt nanoparticles with dendrimers as template / H. Wu, C. Zhang, L. Jin, H. Yang // Materials Chemistry and Physics. - 2010. - V. 121. - P. 342-348]. Для синтеза использовался ПАМАМ четырех генераций (G3-G6), варьировалось соотношение металл-полимер (10:1, 20:1, 30:1 и 40:1). Наночастицы кобальта, полученные на платформе дендримеров третьей генерации G3, обладают формой близкой к сферической, размер частиц составляет около 8.9 нм. Наночастицы обладают суперпарамагнитными свойствами и легко агрегируют, вероятно, из-за высокой подвижности и магнитного взаимодействия. С увеличением генерации от G3 до G6 наблюдается уменьшение среднего размера полученных наночастиц кобальта в ряду G3 – 8.9 нм, G4 – 7.1 нм, G5 – 5.6 нм и G6 – 4.5 нм.

К недостаткам известного технического решения по способу синтеза является использование цитотоксичного дендримера - ПАМАМ для стабилизации [Janaszewska, X.X. Cytotoxicity of Dendrimers / X.X. Janaszewska, X.X. Lazniewska, X.X. Trzepiński, X.X. Marcinkowska, X.X. Klajnert-Maculewicz // Biomolecules – 2019. – V. 9. – № 8. – Reg. 330] наночастиц кобальта, отсутствие данных об очистке синтезированного нанокомпозита от побочных продуктов окисления борогидрида натрия. Недостатками синтезированного металло-полимерного нанокомпозита являются: отсутствие данных о биологической активности, биосовместимости и устойчивости наночастиц.

Применение альтернативных дендримерам структур, а именно сверхразветвленных полимеров (СРП), в качестве стабилизаторов наночастиц кобальта ограничено небольшим количеством работ по синтезу СРП - стабилизированных наночастиц благородных металлов [Gao, C. Hyperbranched polymers: from synthesis to applications / C.Gao, D Yan // Progress in Polymer Science .- 2004.- V.29, Iss. 3.- P. 183-275].

Прямых аналогов заявляемому техническому решению не выявлено.

Техническим результатом заявленного технического решения в целом является разработка полимер-композитного состава, содержащего наночастицы кобальта, в среде сверхразветвленного полимера-стабилизатора для применения в области биотехнологии, диагностики, медицины и ветеринарии, обладающего следующими свойствами:

– диаметр частиц – не более 30 нм,

– форма частиц – сферическая или близкая к сферической,

– фазовое состояние – порошок,

– наличие магнитной активности,

– наличие биосовместимости в соответствии с величиной коэффициента гемолиза не превышающего 10 %,

– проявление антимикотической активности,

– проявление антипротеиназной активности,

и способа его (полимер-композитного состава) получения.

Сущностью заявленного технического решения является: металлополимерный композитный материал в виде порошка для использования в биомедицине и ветеринарии, состоящий из наночастиц кобальта со структурой ядро Со⁰ – оболочка, состоящая из оксидов кобальта, в матрице сверхразветвленного полиэфирополиола, коэффициент полидисперсности которого не превышает 1,3; обладающий сферической формой индивидуальных частиц, диаметром частиц композита не более 30 нм. Металлополимерный композитный материал по п.1, характеризующийся тем, что обладает магнитной активностью, биосовместимостью в соответствии с величиной коэффициента гемолиза не превышающего 10%, свойствами модулятора активности протеиназы химозин, антигрибковой активностью против клеток дрожжевых грибов Candida albicans, Cryptococcus laurentii и плесневых грибов Аspergillus fumigatus, Аspergillus niger. Способ получения металлополимерного композитного материала на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов по любому из пп. 1 и 2, заключающийся в том, что сверхразветвленный полиэфирополиол растворяют в 50 об.% водно-этанольном растворе, затем добавляют кобальтосодержащую соль-предшественник – хлорид или сульфат кобальта (II), растворенную в деионизированной воде; при этом соблюдают мольное соотношение: кобальтосодержащая соль-предшественник : ОН группы сверхразветвленного полиэфирополиола = 1:1, 1.3:1, 1:1.3, и перемешивают в течение 2 часов при температуре 50 °С; затем при постоянном перемешивании и нагревании добавляют водный раствор борогидрида натрия NaBH₄ при мольном соотношении ν_Co2+ : ν_NaBH4 = от 1.5:1 до 3:1 и перемешивают при температуре 50 °С со скоростью 500 об/мин до выпадения осадка – порошка полимер-композитного материала черного или черно-зелёного цвета, который отделяют от реакционной среды методом магнитной сепарации и промывают последовательно 2 раза деионизированной водой с температурой 2 °С при перемешивании в течение 1 часа; затем порошок полимер-композитного материала промывают последовательно ацетоном и диэтиловым эфиром; промывку повторяют дважды; затем нанокомпозит осушают под вакуумом без нагревания в режиме: 30 минут при 850 мбар для удаления следов диэтилового эфира, 30 мин при 560 мбар для удаления следов ацетона, 1 час при 72 мбар для удаления следов воды.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг.1 – Фиг. 43.

На Фиг.1 представлена структура сверхразветвленого полиэфирполиола G2_ОН.

На Фиг.2 представлена структура сверхразветвленого полиэфирполиола G3_ОН.

На Фиг.3 представлен внешний вид образца нанокомпозита CoNP-1.

На Фиг.4 представлен ИК-спектр образца нанокомпозита CoNP-1.

На Фиг.5 представлена дифрактограмма образца нанокомпозита CoNP-1.

На Фиг.6 представлено ПЭМ-изображение для образца нанокомпозита CoNP-1.

На Фиг.7 представлено распределение частиц по размеру для образца нанокомпозита CoNP-1.

На Фиг.8 представлено СЭМ-изображение для образца нанокомпозита CoNP-1.

На Фиг.9 представлен элементный анализ для образца нанокомпозита CoNP-1.

На Фиг.10 представлены данные ТГ-ДТГ анализа образца нанокомпозита CoNP-1 (сплошная линия - ТГ; штрих-пунктирная линия - ДТГ).

На Фиг.11 представлен внешний вид образца нанокомпозита CoNP-2.

На Фиг.12 представлен ИК-спектр образца нанокомпозита CoNP-2.

На Фиг.13 представлена дифрактограмма образца нанокомпозита CoNP-2.

На Фиг.14 представлено ПЭМ-изображение для образца нанокомпозита CoNP-2.

На Фиг.15 представлено распределение частиц по размеру для образца нанокомозита CoNP-2.

На Фиг.16 представлено СЭМ-изображение для образца нанокомпозита CoNP-2.

На Фиг.17 представлен элементный анализ для образца нанокомпозита CoNP-2.

На Фиг.18 представлены данные ТГ-ДТГ анализа образца нанокомпозита CoNP-2 (сплошная линия - ТГ; штрих-пунктирная линия - ДТГ).

На Фиг.19 представлен внешний вид образца нанокомпозита CoNP-3.

На Фиг.20 представлен ИК-спектр образца нанкомпозита CoNP-3.

На Фиг.21 представлена дифрактограмма образца нанокомпозита CoNP-3.

На Фиг.22 представлено ПЭМ-изображение для образца нанокомпозита CoNP-3.

На Фиг.23 представлено распределение частиц по размеру для образца нанокомозита CoNP-3.

На Фиг.24 представлено СЭМ-изображение для образца нанокомпозита CoNP-3.

На Фиг.25 представлен элементный анализ для образца нанокомпозита CoNP-3.

На Фиг.26 представлены данные ТГ-ДТГ анализа образца нанокомпозита CoNP-3 (сплошная линия - ТГ; штрих-пунктирная линия - ДТГ).

На Фиг.27 представлен внешний вид образца нанокомпозита CoNP-4.

На Фиг.28 представлен ИК-спектр образца нанкомпозита CoNP-4.

На Фиг.29 представлена дифрактограмма образца нанокомпозита CoNP-4.

На Фиг.30 представлено ПЭМ-изображение для образца нанокомпозита CoNP-4.

На Фиг.31 представлено распределение частиц по размеру для образца нанокомпозита CoNP-4.

На Фиг.32 представлено СЭМ-изображение для образца нанокомпозита CoNP-4.

На Фиг.33 представлен элементный анализ для образца нанокомпозита CoNP-4.

На Фиг.34 представлены данные ТГ-ДТГ анализа образца нанокомпозита CoNP-4 (сплошная 34линия - ТГ; штрих-пунктирная линия - ДТГ).

На Фиг.35 представлены экспериментальные данные к оценке магнитных свойств образов нанокомпозита: петли гистерезиса для образа нанокомпозита CoNP-1.

На Фиг.36 представлены экспериментальные данные к оценке магнитных свойств образов нанокомпозита: петли гистерезиса для образа нанокомпозита CoNP-2.

На Фиг.37 представлены экспериментальные данные к оценке магнитных свойств образов нанокомпозита: петли гистерезиса для образа нанокомпозита CoNP-3.

На Фиг.38 представлены экспериментальные данные к оценке магнитных свойств образов нанокомпозита: петли гистерезиса для образа нанокомпозита CoNP-4.

На Фиг.39 представлены экспериментальные данные к определению гемолитической активности нанокомпозитов CoNP-1 (39а), CоNP-2 (39б), CоNP-3 (39в) и CоNP-4 (39г) после инкубации и центрифугирования (А_- - ФСБ; А₊ - Н₂О. Концентрация CoNP, мг/мл: 1-1; 2- 0.5; 3-0.2; 4-0.1; 5- 0.05; 6-0.01; 7-0.001).

На Фиг.40 представлены результаты определения гемолитической активности образцов нанокомпозитов CoNP-1-4 (C_CoNP=1-1000 мкг/мл).

На Фиг.41 представлены изображения чашек Петри в эксперименте по оценке фунгицидной активности дисперсии, содержащей 20 мг/мл нанокомпозита CoNP-1 (№1), CoNP-2 (№2), CoNP-3 (№3) и CoNP-4 (№4) по отношению дрожжевым грибам Candida albicans АТСС - 885653 (41а), Candida albicans РКПГ (41б), Cryptococcus laurentii (41в) и плесневым грибам Аspergillus fumigatus РКПГ (41г), Аspergillus fumigatus F753 (41д), Аspergillus niger F1119 (41е).

На Фиг.42 представлены Изображения чашек Петри в эксперименте по оценке фунгицидной активности дисперсии, содержащей 42 мг/мл нанокомпозита CoNP-1 (№1) по отношению дрожжевым грибам Candida albicans АТСС - 885653 28 (42а), Candida albicans РКПГ (42б), Cryptococcus laurentii (42в) и плесневым грибам Аspergillus fumigatus РКПГ (42г), Аspergillus fumigatus F753 (42д), Аspergillus niger F1119 (42е).

На Фиг.43 представлены изображения чашек Петри в эксперименте по оценке фунгицидной активности дисперсии, содержащей 42 мг/мл нанокомпозита CoNP-2 (№2) по отношению дрожжевым грибам Candida albicans АТСС - 885653 (43а), Candida albicans РКПГ (43б), Cryptococcus laurentii (43в) и плесневым грибам Аspergillus fumigatus РКПГ (43г), Аspergillus fumigatus F753 (43д), Аspergillus niger F1119 (43е).

Далее заявителем представлено описание заявленного технического решения.

Заявленный технический результат достигается способом синтеза металлополимерного композитного материала на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов 2 и 3 генераций (ядро - этоксилированный пентаэритрит, мономер - 2,2 -бисгидроксиметрилпропановая кислота) в виде порошка.

Способ получения металлополимерного композитного материала на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов заключается в том, что сверхразветвленный полиэфирополиол растворяют в 50 об.% водно-этанольном растворе, затем добавляют кобальтосодержащую соль-предшественник - хлорид или сульфат кобальта (II), растворенную в деионизированной воде. При этом соблюдают мольное соотношение кобальтосодержащая соль-предшественник : ОН группы сверхразветвленного полиэфирополиола = 1:1, 1.3:1, 1:1.3 и перемешивают в течение 2 часов при температуре 50°С. Затем при постоянном перемешивании и нагревании добавляют водный раствор борогидрида натрия NaBH₄ при мольном соотношении ν_Co2+ : ν_NaBH4 = от 1.5:1 до 3:1 и перемешивают при температуре 50°С со скоростью 500 об/мин до выпадения осадка - порошка полимер-композитного материала черного или черно-зелёного цвета, который отделяют от реакционной среды методом магнитной сепарации и промывают последовательно 2 раза деионизированной водой с температурой 2°С при перемешивании в течение 1 часа. Затем порошок полимер-композитного материала промывают последовательно ацетоном и диэтиловым эфиром. Промывку повторяют дважды. Затем нанокомпозит осушают под вакуумом без нагревания в режиме: 30 минут при 850 мбар для удаления следов диэтилового эфира, 30 мин при 560 мбар для удаления следов ацетона, 1 час при 72 мбар для удаления следов воды.

Также заявленный технический результат достигается использующимися реагентами при синтезе полимер-композитных наночастиц кобальта и их мольным соотношением.

В качестве полимера-стабилизатора используются сверхразветвленные полиэфирополиолы второй (G2_ОН), третьей (G3_ОН) генераций, содержащих периферические ОН группы, которые могут быть синтезированы по методикам [Gao, C. Hyperbranched polymers: from synthesis to applications / C.Gao, D Yan // Progress in Polymer Science .- 2004.- V.29, Iss. 3.- P. 183-275], [Jasna Vukovic Hyperbranched Polymers Based on Aliphatic Polyesters: Synthesis and Characterization.- 2008.- VDM Verlag Dr. (November 21, 2008).- 144 p]. Сверхразветвленные полиэфирополиолы G2_ОН и G3_ОН представляют собой прогрессивно развивающиеся дендрито-подобные макромолекулы, содержащие ветви с внутренними сложноэфирными и периферическими гидроксильными группами. Ядром макромолекулы являются этоксилированный пентаэритрит, мономером является 2,2-бисгидроксиметилпропановая кислота. Примеры структур сверхразветвленых полиэфирполиолов G2_ОН и G3_ОН представлены на Фиг. 1, 2. Среднечисловая молекулярная масса сверхразветвленого полиэфирполиола G2_ОН составляет 1749.5 г/моль и G3_ОН - 3607.6 г/моль. Полидисперсность не выше значения 1.3. Гидроксильное число полимера определяется по методике [Торопцева А.М. Лабораторный практикум по химии и технологии высокомолекулярных соединений / А.М. Торопцева, К.В. Белогородская, В.М. Бондаренко. - М.: Химия. - 1972. - 360 c] составляет не менее 510±5 мг КОН/г (соответствует концентрации ОН групп 9.09 ммоль/г) для для G2_ОН и 500±4 мг КОН/г (соответствует концентрации ОН групп 8.91 ммоль/г) для G3_ОН. Температура термолиза сверхразветвленого полиэфирполиола G2_ОН составляет 150 - 160°С [Khannanov, A. Effect of the Synthetic Approach on the Formation and Magnetic Properties of Iron-Based Nanophase in Branched Polyester Polyol Matrix / A. Khannanov , A. Burmatova , K. Ignatyeva , F. Vagizov, A. Kiiamov, D. Tayurskii, M. Cherosov, A. Gerasimov, E. Vladimir, M. Kutyreva // J. Mol. Sci. - 2022.- V. 23.- Art. 14764] и G3_ОН - 200-220°С [Гомзяк, В.И. Полимеризация D,L-лактида в присутствии полиэфирполиола Boltorn™ / В.И. Гомзяк, Н.В. Бычков, А.Ш. Адуев, В.А. Иванова, А.Д. Кошелев, С.Н. Чвалун // Тонкие химические технологии.- 2022.- Т.17(3).- С.242-252].

В качестве соли-предшественника применяются хлорид кобальта СоCl₂×6H₂O (99%), сульфат кобальта CoSO₄×7H₂O (99%). Мольное соотношение: ν_Co²⁺: ν_{OH-группы полимера} =1:1, 1:1.3, 1.3:1.

В качестве восстановителя используется борогидрид натрия (NaBH₄) (98%) в виде раствора, полученного растворением 0.025 г NaOH и 0.15 г NaBH₄ в 25 мл дистилированной воды, молярная концентрация раствора с_NaBH4=0.15 моль/л. Мольное соотношение реагентов в синтезе ν_Co²⁺: ν_NaBH4=1.6:1 и 3:1 для синтеза CoNP с использованием G2_ОН и ν_Co²⁺: ν _NaBH4 =1.5:1 для синтеза CoNP с использованием G3_ОН. Способ введения восстановителя порционный (5 мл каждые 5 минут всего 20 мл) и капельный (1 капля каждые 60 секунд, всего 20 мл).

Растворителями для синтеза и очистки полимер-композитных наночастиц кобальта являлись деионизированная вода (1 класс очистки, сопротивление 18 МОм), органические растворители этанол, ацетон, диэтиловый эфир, очищенные по стандартным методикам.

Результатом синтеза является магнитоактивноый полимер-композитный материал СoNP, содержащий наночастицы кобальта со структурой ядро Со⁰ - оболочка - оксиды кобальта, включенные в матрицу сверхразветвленного полиэфирополиола второй (G2_OH) или третьей (G3_OH) генерации в виде порошка. Частицы полимер-композитного материала СoNP имеют сферическую или близкую к сферической форму с размерами не более 30 нм, обладают дополнительно магнитной активностью, биосовместимостью в соответствии с величиной коэффициента гемолиза не превышающего 10 %, свойствами модулятора активности протеиназы химозин, антигрибковой активностью против клеток дрожжевых грибов Candida albicans, Cryptococcus laurentii и плесневых грибов Аspergillus fumigatus, Аspergillus niger.

Заявленное техническое решение реализовано на практике следующим путем:

ПРИМЕР 1. Для получения нанокомпозита CoNP-1 0.1224 г сверхразветвленного полиэфирополиола G2_ОН растворяют в 25 мл в 50 об.% водно-этанольном растворе, затем медленно добавляют 0.1998 г соли СоCl₂×6H₂O, растворенной в 25 мл деионизированной воды. При этом соблюдают мольное соотношение соль: ОН группы полиэфирополиола = 1:1.3 и перемешивают в течение 2 часов при температуре 50°С. Затем при постоянном перемешивании и нагревании по каплям добавляют 20 мл водного раствора борогидрида натрия NaBH₄ при мольном соотношении ν_Co2+ : ν_NaBH4 = от 1.6:1 и перемешивают при температуре 50°С со скоростью 500 об/мин до выпадения осадка - порошка полимер-композитного материала CoNP-1 черно-зелёного цвета, который отделяют от реакционной среды методом магнитной сепарации и промывают последовательно 2 раза деионизированной водой с температурой 2°С при перемешивании в течение 1 часа. Затем порошок полимер-композитного материала CoNP-1 промывают последовательно ацетоном и диэтиловым эфиром. Промывку повторяют дважды. Затем нанокомпозит осушают под вакуумом без нагревания в режиме: 30 минут при 850 мбар для удаления следов диэтилового эфира, 30 мин при 560 мбар для удаления следов ацетона, 1 час при 72 мбар для удаления следов воды.

Нанокомпозит CoNP-1 представляет собой мелкодисперсный порошок черно-зелёного цвета (Фиг. 3), который легко собирается магнитом.

Состав, морфология и термическая устойчивость нанокомпозита CoNP-1 определены методами ИК-спектроскопии, рентгенофазового анализа (РФА), просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии (ПЭМ и СЭМ), термогравиметрии и дифференциальной термогравиметрии (ТГ-ДТГ).

Металлополимерный нанокомпозит CoNP-1 представляет собой сфероидные частицы, состоящие из сверхразветвленного полиэфирополиола G2_ОН с включенными наночастицами кобальта. Наночастицы кобальта, организованы периферическом функциональном слое полиэфирополиола G2_ОН и имеют структуру ядро (Со⁰) - оболочка (СоО, Со₃О₄).

Данные ИК- спектроскопии для CoNP-1 подтверждают иммобилизацию наночастиц кобальта в матрице G2_ОН (ν, см^-1): 3379 ν(OH_связ); 2970 ν_аs(CH₃), 2871 ν_s(CH₂), 1730 ν(C=O), 1646 ν(C=O_Н-связ.), 1403 Δ_s(CH₃), 1344 Δ_as(CH₂), 1249 ν _эфир.(С-О), 1107 ν _эфир.(О-С), 1058 ν(_.С-О)-ОН), 1010 ν(НО-(О-С), 684 ν(Co²⁺-О_Со3О4), 619 ν(Со⁰-О), 525 ν(Co³⁺-О_Со3О4) (Фиг. 4).

Методом РФА в составе CoNP-1 подтверждено наличие металлических наночастиц кобальта Со⁰: рефлексы 41.47⁰, 44.55⁰, 47.46⁰ и 62.83⁰. Оболочкой металлических наночастиц Со⁰ является Со₃О₄ и СоО: рефлексы при 55.06⁰ и 59.19⁰, 90.88⁰ соответственно (Фиг. 5).

Методом ПЭМ установлено, что частицы CoNP-1 имеют сферическую форму (Фиг. 6), диаметр индивидуальной частицы составляет 22.15±6.17 нм (Фиг. 7). Методом СЭМ установлено, что агрегаты нанокомпозита CoNP-1 также имеют сферическую форму и размер 52.67±17.28 нм (Фиг. 8). Содержание кобальта по данным элементного анализа составляет 41.13 вес.%. (Фиг. 9).

Методом ТГ-ДТГ (Фиг. 10) установлено, что нанокомпозит CoNP-1 теряет адсорбированную воду при 98.6°С, термолиз нанокомпозита начинается при температуре 262.8°С в связи с легирующим действием металлической нанофазы кобальта в составе нанокомпозита СoNP-1.

ПРИМЕР 2. Для получения нанокомпозита CoNP-2 0.1662 г сверхразветвленного полиэфирополиола G2_ОН растворяют в 25 мл в 50 об.% водно-этанольном растворе, затем медленно добавляют 0.4272 г соли СоSO₄×7H₂O, растворенной в 25 мл деионизированной воды. При этом соблюдают мольное соотношение соль: ОН группы полиэфирополиола = 1.3:1 и перемешивают в течение 2 часов при температуре 50°С. Затем при постоянном перемешивании и нагревании порционно добавляют 20 мл водного раствора борогидрида натрия NaBH₄ при мольном соотношении ν_Co2+ : ν_NaBH4 = от 3:1 и перемешивают при температуре 50°С со скоростью 500 об/мин до выпадения осадка - порошка полимер-композитного материала CoNP-2 черного цвета, который отделяют от реакционной среды методом магнитной сепарации и промывают последовательно 2 раза деионизированной водой с температурой 2°С при перемешивании в течение 1 часа. Затем порошок полимер-композитного материала CoNP-2 промывают последовательно ацетоном и диэтиловым эфиром. Промывку повторяют дважды. Затем нанокомпозит осушают под вакуумом без нагревания в режиме: 30 минут при 850 мбар для удаления следов диэтилового эфира, 30 мин при 560 мбар для удаления следов ацетона, 1 час при 72 мбар для удаления следов воды.

Нанокомпозит CoNP-2 представляет собой мелкодисперсный порошок черного цвета (Фиг. 11), который легко собирается магнитом.

Состав, морфология и термическая устойчивость нанкомпозита CoNP-2 определены методами ИК-спектроскопии, рентгенофазового анализа (РФА), просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии (ПЭМ и СЭМ), термогравиметрии и дифференциальной термогравиметрии (ТГ-ДТГ).

Металлополимерный нанокомпозит CoNP-2 представляет собой сфероидные частицы, состоящие из сверхразветвленного полиэфирополиола G2_ОН с включенными наночастицами кобальта. Наночастицы кобальта, организованы периферическом функциональном слое полиэфирополиола G2_ОН и имеют структуру ядро (Со⁰) - оболочка (Со₃О₄).

Данные ИК- спектроскопии для CoNP-2 подтверждают иммобилизацию наночастиц кобальта в матрице G2_ОН (ν, см^-1): 3356 ν(OH_связ), 2972 ν_аs(CH₃), 2882 ν _s(СН₃) 1727 ν(C=O), 1641 ν( C=O_Н-связ.), 1455 Δ_s(СН₃), 1407 Δ_as(СН₂), 1247 ν_эфир.(С-О), 1103, ν_эфир.(О-С), 1044 ν(С-О)-OH), 693 ν(Co²⁺-О_Со3О4), 601 ν(Со⁰-О), 510 ν(Co³⁺-О_Со3О4), 416 ν_as(Co⁰-O) (Фиг. 12).

Методом РФА в составе CoNP-1 подтверждено наличие металлических наночастиц кобальта Со⁰: рефлексы 62.83⁰ и 84.10⁰. Оболочкой металлических наночастиц Со⁰ является Со₃О₄ который характеризуется рефлексами при 65.17⁰ и 78.35⁰ (Фиг. 13).

Методом ПЭМ установлено, что частицы CoNP-2 имеют сферическую форму (Фиг. 14), диаметр индивидуальной частицы составляет 8.73±2.31 нм (Фиг. 15). Методом СЭМ установлено, что агрегаты нанокомпозита CoNP-2 имеют сферическую симметрию, размер 39.06±14.46 нм (Фиг. 16). Содержание кобальта составляет 36.77 вес.%. (Фиг. 17).

Методом ТГ-ДТГ (Фиг. 18) установлено, что нанокомпозит CoNP-2 теряет адсорбированную воду при 102.6°С, термолиз нанокомпозита начинается при температуре 317.5^ƒС в связи с легирующим действием металлической нанофазы кобальта в составе нанокомпозита СoNP- 2.

ПРИМЕР 3. Для получения нанокомпозита CoNP-3 0.0854 г сверхразветвленного полиэфирополиола G3_ОН растворяют в 25 мл в 50 об.% водно-этанольном растворе, затем медленно добавляют 0.1827 г соли СоCl₂×6H₂O, растворенной в 25 мл деионизированной воды. При этом соблюдают мольное соотношение соль: ОН группы полиэфирополиола = 1:1 и перемешивают в течение 2 часов при температуре 50°С. Затем при постоянном перемешивании и нагревании по каплям добавляют 20 мл водного раствора борогидрида натрия NaBH₄ при мольном соотношении ν_Co2+ : ν_NaBH4 = от 1.5:1 и перемешивают при температуре 50°С со скоростью 500 об/мин до выпадения осадка - порошка полимер-композитного материала CoNP-3 черного цвета, который отделяют от реакционной среды методом магнитной сепарации и промывают последовательно 2 раза деионизированной водой с температурой 2°С при перемешивании в течение 1 часа. Затем порошок полимер-композитного материала CoNP-3 промывают последовательно ацетоном и диэтиловым эфиром. Промывку повторяют дважды. Затем нанокомпозит осушают под вакуумом без нагревания в режиме: 30 минут при 850 мбар для удаления следов диэтилового эфира, 30 мин при 560 мбар для удаления следов ацетона, 1 час при 72 мбар для удаления следов воды.

Нанокомпозит CoNP-3 представляет собой мелкодисперсный порошок черного цвета (Фиг. 19), который легко собирается магнитом.

Состав, морфология и термическая устойчивость нанокомпозита CoNP-3 определены методами ИК-спектроскопии, рентгенофазового анализа (РФА), просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии (ПЭМ и СЭМ), термогравиметрии и дифференциальной термогравиметрии (ТГ-ДТГ).

Металлополимерный нанокомпозит CoNP-3 представляет собой сфероидные частицы, состоящие из сверхразветвленного полиэфирополиола G3_ОН с включенными наночастицами кобальта. Наночастицы кобальта, организованы периферическом функциональном слое полиэфирополиола G3_ОН и имеют структуру ядро (Со⁰) - оболочка (СоО, Со₃О₄).

Данные ИК- спектроскопии для CoNP-3 подтверждают иммобилизацию наночастиц кобальта в матрице G3_ОН (ν, см^-1): 3384 ν(OH_связ), 2935 ν_аs(CH₃), 2852 ν_s(СН₃), 1728 ν(C=O), 1636 ν(NaBO₃), 1459 Δ_sСН₃), 1439 Δ_as(СН₂), 1246 ν_эфир.(С-О), 1127 ν _эфир.(О-С), 1050 ν(С-О)-ОН), 656 ν(Co²⁺-О_Со3О4), 603 ν(Со⁰-О), 516 ν(Co³⁺-О_Со3О4) (Фиг. 20).

Методом РФА в составе CoNP-3 подтверждено наличие металлических наночастиц кобальта Со⁰: рефлексы 43.76⁰, 47.46⁰ и 62.50⁰. Оболочкой металлических наночастиц Со⁰ является оксидная фаза СоО и Со₃О₄, которая характеризуется рефлексами при 42.28⁰, 59.35⁰ и 65.17⁰ соответственно (Фиг. 21).

Методом ПЭМ установлено, что частицы CoNP-3 имеют сферическую форму (Фиг. 22), диаметр индивидуальной частицы составляет 15.72±6.64 нм (Фиг. 23). Методом СЭМ установлено, что нанокомпозита CoNP-3 также имеют сферическую форму и размер 103.1±22.9 нм (Фиг. 24). Содержание кобальта составляет 24.63 вес.%. (Фиг. 25)

Методом ТГ-ДТГ (Фиг. 26) установлено, что нанокомпозит CoNP-3 теряет адсорбированную воду при 93.6°С, термолиз нанокомпозита начинается при температуре 272.1°С в связи с легирующим действием металлической нанофазы кобальта в составе нанокомпозита СoNP-3.

ПРИМЕР 4. Для получения нанокомпозита CoNP-4 0.0854 г сверхразветвленного полиэфирополиола G3_ОН растворяют в 25 мл в 50 об.% водно-этанольном растворе, затем медленно добавляют 0.1827 г соли СоCl₂×6H₂O, растворенной в 25 мл деионизированной воды. При этом соблюдают мольное соотношение соль: ОН группы полиэфирополиола = 1:1 и перемешивают в течение 2 часов при температуре 50°С. Затем при постоянном перемешивании и нагревании порционно добавляют 20 мл водного раствора борогидрида натрия NaBH₄ при мольном соотношении ν_Co2+ : ν_NaBH4 = от 1.5:1 и перемешивают при температуре 50°С со скоростью 500 об/мин до выпадения осадка - порошка полимер-композитного материала CoNP-4 черного цвета, который отделяют от реакционной среды методом магнитной сепарации и промывают последовательно 2 раза деионизированной водой с температурой 2°С при перемешивании в течение 1 часа. Затем порошок полимер-композитного материала CoNP-4 промывают последовательно ацетоном и диэтиловым эфиром. Промывку повторяют дважды. Затем нанокомпозит осушают под вакуумом без нагревания в режиме: 30 минут при 850 мбар для удаления следов диэтилового эфира, 30 мин при 560 мбар для удаления следов ацетона, 1 час при 72 мбар для удаления следов воды.

Нанокомпозит CoNP-4 представляет собой мелкодисперсный порошок черного цвета, который легко собирается магнитом (Фиг. 27).

Состав, морфология и термическая устойчивость CoNP-4 определены методами ИК-спектроскопии, рентгенофазового анализа (РФА), просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии (ПЭМ и СЭМ), термогравиметрии и дифференциальной термогравиметрии (ТГ-ДТГ).

Металлополимерный нанокомпозит CoNP-4 представляет собой сфероидные частицы, состоящие из сверхразветвленного полиэфирополиола G3_ОН с включенными наночастицами кобальта. Наночастицы кобальта, организованы периферическом функциональном слое полиэфирополиола G3_ОН и имеют структуру ядро (Со⁰) - оболочка (Со₃О₄).

Данные ИК- спектроскопии для CoNP-3 подтверждают иммобилизацию наночастиц кобальта в матрице G3_ОН (ν, см^-1): 3366 ν(OH_связ), 1730 ν(C=O), 1636 ν(NaBO₃), 1352 Δ_S(СН₂), 1124 ν_эфир.(О-С), 1022 ν(О-С)-Щр), 655 ν(Co²⁺-О_Со3О4) , 597 ν(Со⁰-О), 519 ν(Co³⁺-О_Со3О4) (Фиг. 28).

Методом РФА в составе CoNP-1 подтверждено наличие металлических наночастиц кобальта Со⁰: рефлексы 41.16⁰, 47.39⁰, 47.46⁰ и 84.41⁰. Оболочкой металлических наночастиц Со⁰ является Со₃О₄: рефлексы при 65.33⁰ и 78.03⁰ (Фиг. 29).

Методом ПЭМ установлено, что частицы CoNP-4 имеют сферическую форму (Фиг. 30), диаметр индивидуальной частицы составляет 18.0±5.2 нм (Фиг. 31). Методом СЭМ установлено, что агрегаты нанокомпозита CoNP-4 также имеют сферическую форму и размер 117.77±12.38 нм (Фиг. 32). Содержание кобальта составляет 45.92 вес.%. (Фиг. 33).

Методом ТГ-ДТГ (Фиг. 34) установлено, что нанокомпозит CoNP-4 теряет адсорбированную воду при 95.2°С, термолиз нанокомпозита начинается при температуре 314.3°С в связи с легирующим действием металлической нанофазы кобальта в составе нанокомпозита СoNP-4.

Заявленное техническое решение было исследовано посредством проведения экспериментов с получением результатов, соответствующих заявленному техническому результату.

Изучение магнитных свойств металлополимерного композитного материала на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов CoNP

Метод. Магнитные свойства порошков нанокомпозитов CoNP измеряли на приборе PPMS-9 (Quantum Design, США), оснащенном вибрационным магнитометром (VSM). Полевые зависимости намагниченности измеряли при 5-395 К в диапазоне полей от -1 Тл до 1 Тл.

Результаты. Для нанокомпозитов CoNP петли гистерезиса замкнуты и симметричны относительно начала координат (Фиг. 35 - 38). Магнитные характеристики приведены в таблице 1.

Таблица 1. Магнитные характеристики CoNP-1-4 при Т=5, 395 К (H_c - коэрцитивная сила, M_R - остаточная намагниченность, M_s - намагниченность насыщения) Образец Hc, Э M_R, emug^-1 M_s, emug^-1 Hc, Э M_R, emug^-1 M_s, emug^-1 Магнитные свойства Т=5К Т=395К CoNP-1 41 0.0190 0.3254 - - - Суперпарамагнитные свойства CoNP-2 42 0.54 23.3 23.5 0.04 1.5 Ферромагнитные свойства CoNP-3 392 13.72 38.2 68 2.83 11.2 Ферромагнитные свойства CoNP-4 282 20.89 49.2 49 5.80 33.3 Ферромагнитные свойства

Таким образом, композитный материал на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов обладает магнитными свойствами: нанокомпозит CoNP-1 обладает суперпарамагнитным характером; нанокомпозиты CoNP-2, CoNP-3 и CoNP-4 обладают ферромагнитными свойствами.

Изучение ферментативной активности металлополимерного композитного материала на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов CoNP

Метод. Для оценки ферментативной активности использовали фермент химозин, выделенный из культуры Aspergillus niger (CAS 9001-98-3 Реннет). В качестве субстрата использовали гемоглобин (Hb). Для проведения эксперимента готовили растворы химозина и гемоглобина с концентрациями 2 мг/мл в цитратном буфере с pH=3.50. Пробоподготовка дисперсии CoNP в деионизированной воде осуществлялась следующим образом: 0.1 г порошка нанкомпозита CoNP взвешивалась на аналитических весах с точностью 0.002 г и диспергировалась в 2 мл деионизированной воды с помощью ультразвукового диспергатора марки SONICS MATERIAL Vibra-Cell VCX 750W зондовый (режим пульсации 2с:2с, амплитуда 70%, время диспергирования 10 мин). Для определения ферментативной активности смешивали 0.5 мл раствора Hb, 0.1 мл раствора химозина цитратном буфере с рН=3.5. Затем аликвоту дисперсии CoNP в соответствии с заданной концентрацией нанкомпозита вносили в раствор с фермент-субстратной парой химозин-гемоглобин. Концентрация нанокомпозита CoNP в исследуемом растворе варьировалась в диапазоне cCoNP = 0.1-1000 мкг/мл. Затем систему инкубировали в течении 30 минут при 50°^С, затем центрифугировали при 10000 об/мин 20 минут и охлаждали в течении 5 минут. Измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости (супернатанта) в области длин волн 250-900 нм при Т=36.6±0.01°С. В качестве растворов сравнения использовали растворы без субстрата. Оценивали интенсивность полосы поглощения гемоглобина при длине волны λ=280 нм. В аналогичных условиях проводили измерение оптической плотности надосадочной жидкости (супернатанта) и оценку интенсивность полосы поглощения при длине волны λ=280 нм для системы химозин-гемоглобин в отсутствие нанкомпозита CoNP. Оставшуюся после взаимодействия с химозином в растворе C_Hb определяли по градуировочному графику зависимости величины поглощения от C_Hb описываемому уравнением:

А₂₈₀ = (-0.05273 ± 0.00002) + (1.58052 ± 0.01456) ×C_Hb, R=0.99959.

Определяли скорость ферментативной реакции в отсутствие - υ_Е^o и в присутствии дисперсии CoNP - υ_E^CoNP по формуле:

, мг×мл^-1×с^-1

где υ_Е - скорость ферментативной реакции, C_Hb - концентрация гидролизовавшегося субстрата (Hb) (мг/мл), t- время (с), ΔC_Hb = C_Hb(исх) -C_Hb(ост).

Затем рассчитывали ферментативную активность А_Е^СoNP(%), принимая за 100% ферментативную активность при υ_Е по формуле:

Результат. Сопоставительный анализ ферментативной активности химозина в присутствии синтезированных нанкомпозитов CoNP показал, что в зависимости от концентрации наночастицы могут проявлять как ингибирующий эффект, так и активирующий (Таблица 2).

Таким образом, CoNP можно использовать для управления активностью протеолитических ферментов. В диапазоне концентраций 0.1-1 мг/мл СоNP-1, CoNP-2, CoNP-4 и диапазоне концентраций 0.1-300 мг/мл CoNP-3 проявляют антипротеиназную активность.

Таблица 2. Минимальное (А_Еmin^СoNP, % ) и максимальное (А_Еmax^СoNP, %) значения ферментативной активности протеиназы химозин Aspergillus niger в присутствии металлополимерных нанокомпозитов CoNP; диапазоны концентраций нанокомпозитов CoNP соответвующие эффекту ингибирования (С^ing_CoNP, мкг/мл) и активации (C^act_CoNP, мкг/мл); значения концентраций полумаксимальной активации (АС₅₀) и полумаксимального ингибирования (IC₅₀) ферментативной активности протеиназы химозин Aspergillus niger в присутствии металлополимерных нанокомпозитов CoNP. Образец А_Еmin ^СoNP, % С^ing_CoNP, мкг/мл IC₅₀,
мкг/мл А_Еmax ^СoNP,
% C^act_CoNP, мкг/мл АС₅₀,
мкг/мл Ингибирование Активация CoNP-1 18±4 0.1-1 0.5 442±14 3-1000 144 CoNP-2 25±7 0.1-1 0.5 153±8 5-1000- 10 CoNP-3 46±7 0.1-300 250 152±31 500-1000 850 CoNP-4 52±5 0.1-1 1.0 185±10 0.1-1000 700

Изучение биосовместимости металлополимерного композитного материала на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов CoNP

Метод. Оценка биосовместимости проводилась по величине коэффициента гемолиза - разрушения эритроцитов крови [Торопова, Я.Г. Влияние наночастиц на основе оксида железа, модифицированных различными оболочками, на генерацию активных форм кислорода стимулированными клетками крови человека в условиях in vitro / Я. Г. Торопова, М. Н. Горшкова, Д. С. Моторина, Д. В. Королев, Ю. А. Скорик, Г. А. Шульмейстер, Е. Ю. Подъячева, А. Я. Багров // Журнал эволюционной биохимии и физиологии.- 2021.- Т. 57, № 4.- с. 310-319] в присутствии металлополимерного нанокомпозита CoNP.

Определение коэффициента гемолиза проводили по методике Кляйнерт [Klajnert, B. Cytotoxicity, haematotoxicity and genotoxicity of high molecular mass arborescent polyoxyethylene polymers with polyglycidol-block-containing shells / B. Klajnert, W. Walach, M. Bryszewska et all // Cell. Bio. Internat., - 2006, - V. 30. - P. 248-252] на клетках крови здорового донора в 3% цитрате натрия. Эритроциты отделяли от плазмы и лейкоцитов промывкой раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ) при рН=7.4 с последующим центрифугированием (5000 g, 5 мин) и удалением надосадочной жидкости декантацией. Процедура повторялась 3 раза.

Пробоподготовка дисперсии CoNP в фосфатно-солевом буфере с рН=7.4 осуществлялась следующим образом: навеска порошка нанкомпозита CoNP 0.2 г взвешивалась на аналитических весах с точностью 0.0001 г и диспергировалась в 2 мл деионизированной воды с помощью ультразвукового диспергатора SONICS MATERIAL Vibra-Cell VCX 750W зондовый (режим пульсации 2с:2с, амплитуда 70%, время диспергирования 10 мин). Концентрация нанокомпозита CoNP в исследуемом растворе варьировалась в диапазоне cCoNP = 1-1000 мкг/мл.

Для определения коэффициента гемолиза в присутствии нанокмпозита CoNP использовали 2% эмульсию эритроцитов в ФСБ. Для этого смешивали 0.75 мл эмульсии эритроцитов и 0.75 мл дисперсии CoNP заданной концентрации. Инкубировали в течение 30 минут при температуре 20°C, потом центрифугировали при 1000 g, 5 мин для отделения эритроцитов. Внешний вид образа после центрифугирования представлен на Фиг. 39. Измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости при λ=540 нм (А). Отрицательный контроль (А-) - оптическая плотность образца эритроцитов (0.75 мл) в ФСБ (0.75 мл). В положительном контрольном опыте (А+) эритроциты (0.75 мл) обрабатывались дважды дистиллированной водой (0.75 мл), в присутствии которой происходит 100% гемолиз. Коэффициент гемолиза (КГ) в % рассчитывали по данным спектрофотометрии по высвобожденному гемоглобину по формуле:

где А - оптическая плотность эритроцитов, инкубированных с наночастицами, А_- оптическая плотность эритроцитов в ФСБ, и A+ - оптическая плотность эритроцитов в воде (100% гемолиз) [Торопова, Я.Г. Влияние наночастиц на основе оксида железа, модифицированных различными оболочками, на генерацию активных форм кислорода стимулированными клетками крови человека в условиях in vitro / Я. Г. Торопова, М. Н. Горшкова, Д. С. Моторина, Д. В. Королев, Ю. А. Скорик, Г. А. Шульмейстер, Е. Ю. Подъячева, А. Я. Багров // Журнал эволюционной биохимии и физиологии.- 2021.- Т. 57, № 4.- с. 310-319].

Результат. В процессе воздействия наночастиц на эритроциты может происходить их разрушение, что приводит к высвобождению содержимого клеток, в частности гемоглобина, после инкубирования и центрифугирования, целые эритроциты оказываются на дне, соответственно с увеличением количества разрушенных эритроцитов, за счет большего освобождения гемоглобина, будет усиливаться окраска раствора над осадком (Фиг. 39). Оценен коэффициент гемолиза (в %), соответствущий биосовместимости нанокомпозитов CoNP-1-4 в диапазоне концентраций от 1 мкг/мл до 1000 мкг/мл (Табл. 3, Фиг. 40).

Считается, что вещества, обладающие КГ менее 20%, потенциально не опасны для организма и могут быть использованы для дальнейших разработок в области биомедицины и фармакологии. Значения КГ для металлополимерного композитного материала на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов CoNP-1-4 не превышают 9.35 % при концентрации до 1000 мкг/л. Это указывает на высокую биосовместимость нанокомпозитов CoNP.

Таблица 3. Значения коэффициента гемолиза в % в присутствии нанокомпозитов CoNP Концентрация |CoNP, мкг/мл CoNP-1 CoNP-2 CoNP-3 CoNP-4 1 0.29 5.10 3.63 6.37 10 0.51 5.69 5.94 7.90 50 3.93 6.60 5.64 7.40 100 7.30 5.36 5.67 7.72 200 6,84 9.45 5.96 7.03 500 8.20 7.38 6.15 8.70 1000 8.82 9.35 8.17 7.86

Изучение антимикотической активности металлополимерного композитного материала на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов CoNP

Метод. Для оценки фунгицидной активности соединений использовали штаммы дрожжевых и плесневых грибов, поддерживаемые в коллекции ФГУН «Казанского Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора РФ»: Candida albicans АТСС - 885653, Candida albicans РКПГ, Cryptococcus laurentii, Аspergillus fumigatus РКПГ, Аspergillus fumigatus F753, Аspergillus niger F1119.

Пробоподготовка дисперсии CoNP осуществлялась следующим образом: навеска (0.1 г или 0.2083 г) порошка нанкомпозита CoNP взвешивалась на аналитических весах с точностью 0.0001 г и диспергировалась в 5 мл этанола с помощью ультразвукового диспергатора SONICS MATERIAL Vibra-Cell VCX 750W зондовый (режим пульсации 2с:2с, амплитуда 70%, время диспергирования 10 мин). Концентрация нанокомпозита CoNP в дисперсии составляла 20 и 42 мг/мл для CoNP-1 и CoNP-2, 20 мг/мл для CoNP-3 и CoNP-4.

Для оценки данных характеристик использован диско-диффузионный метод: целлюлозные диски, пропитанные 10%-м раствором дисперсии нанокомпозита CoNP. помещали в центр чашки Петри, содержащей культуру геле агар-агара, высушивали до полного удаления растворителя, помещали в чашку с культурой и инкубировали в течение 2-4 суток при 28°С. Для контроля обрастания культуры с дисками выдерживали до 7 суток. Фунгицидная активность оценена по площади зоны лизиса, образующейся вокруг диска, пропитанного контрольным соединением. Для сопоставления были проведены аналогичные эксперимента с применением дисков, содержащих антифунгальные лекарственные препараты амфотерицин В, нистатин, клотримазол, кетоконазол, итраконазол.

Результат. Проведены скрининговые испытания по определению фунгицидных свойств серии дисперсий, содержащих металлополимерный композитный материал на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов CoNP (Табл. 4, Фиг. 41, 42, 43).

Таблица 4. Антигрибковая активность дисперсий CoNP in vitro (концентрация нанокомпозита CoNP в дисперсии составляла 20 мг/мл и 42 мг/мл*) Образец CoNP Зона задержки роста, d (мм) Candida albicans АТСС Candida albicans РКПГ Cryptococcus laurentii Аspergillus fumigatus РКПГ Аspergillus fumigatus F753 Аspergillus niger F1119 CoNP-1 22 20 12 10 16 18 CoNP-2 16 16 2 0 10 12 CoNP-1* 23 26 21 17 14 11 CoNP-2* 19 24 15 16 13 11 CoNP-3 12 14 4 0 0 0 CoNP-4 12 12 6 4 2 10 Амфотерицин В 12 0 0 14 9 12 Нистатин 13 17 0 13 15 14 Клотримазол 20 15 0 16 12 11 Кетоконазол 20 25 0 14 0 0 Итраконазол 0 18 0 11 0 0

Установлено, что все металлополимерные композиты на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов СоNP-1, СоNP-2, СоNP-3, СоNP-4 обладают антимикотической активностью по отношению к культурам дрожжевых грибов Candida albicans АТСС - 885653 (Фиг. 41а), Candida albicans РКПГ (Фиг. 41б), Cryptococcus laurentii (Фиг. 41в), и плесневых грибов Аspergillus fumigatus РКПГ (Фиг. 41г), Аspergillus fumigatus F753 (Фиг. 41д), Аspergillus niger F1119 (Фиг. 41е). На примерах нанкомпозитов СоNP-1 СоNP-2 (табл.2 данные для СоNP*, фиг.42, 43) показано, что повышение концентрации наночастиц в дисперсии усиливает их антигрибковую активность. Этот эффект наиболее сильно проявляется относительно культуры Cryptococcus laurentii (Фиг 42в, 43в). По данным таблицы 4 образцы СоNP-1 СоNP-2 являются образцами - лидерами и проявляют антимикотическую активность в отношении Candida albicans, Cryptococcus laurentii, Аspergillus fumigatus превышающую эффективность коммерческих антигрибковых лекарственных средств.

Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что заявителем достигнут заявленный технический результат, а именно - разработан полимер-композитный состав, содержащий наночастицы кобальта, в среде сверхразветвленного полимера-стабилизатора для применения в области биотехнологии, диагностики, медицины и ветеринарии, обладающий следующими свойствами:

- диаметр частиц - не более 30 нм,

- форма частиц - сферическая или близкая к сферической,

- фазовое состояние - порошок,

- наличие магнитной активности,

- наличие биосовместимости в соответствии с величиной коэффициента гемолиза не превышающего 10 %,

- проявление антимикотической активности,

- проявление антипротеиназной активности,

и способ его (полимер-композитного состава) получения.

Изобретение относится к наноматериалам, а именно к магнитоактивным композитам, содержащим наноразмерные частицы металла, стабилизированные сверхразветвленной полимерной матрицей. Заявленный в изобретении композит состоит из ядра, представляющего собой наночастицы кобальта, оболочки – оксиды кобальта, которые находятся в матрице сверхразветвленного полиэфирополиола. Коэффициент полидисперсности полиэфирополиола не превышает 1,3. Индивидуальные частицы обладают сферической формой и имеют диаметр не более 30 нм. Предложенное изобретение позволяет получать полимер-композитный состав, содержащий наночастицы кобальта, обладающий биосовместимостью, антимикотической и антипротеазной активностью. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 43 ил., 4 табл., 4 пр.

1. Металлополимерный композитный материал в виде порошка для использования в биомедицине и ветеринарии, состоящий из наночастиц кобальта со структурой ядро Со⁰ – оболочка, состоящая из оксидов кобальта, в матрице сверхразветвленного полиэфирополиола, коэффициент полидисперсности которого не превышает 1,3; обладающий сферической формой индивидуальных частиц, диаметром частиц композита не более 30 нм.

2. Металлополимерный композитный материал по п. 1, отличающийся тем, что обладает магнитной активностью, биосовместимостью в соответствии с величиной коэффициента гемолиза, не превышающего 10%, свойствами модулятора активности протеиназы химозин, антигрибковой активностью против клеток дрожжевых грибов Candida albicans, Cryptococcus laurentii и плесневых грибов Аspergillus fumigatus, Аspergillus niger.

3. Способ получения металлополимерного композитного материала на основе наночастиц кобальта и сверхразветвленных полиолов по любому из пп. 1 и 2, заключающийся в том, что сверхразветвленный полиэфирополиол растворяют в 50 об.% водно-этанольном растворе, затем добавляют кобальтосодержащую соль-предшественник – хлорид или сульфат кобальта (II), растворенную в деионизированной воде; при этом соблюдают мольное соотношение: кобальтосодержащая соль-предшественник : ОН группы сверхразветвленного полиэфирополиола = 1:1, 1.3:1, 1:1.3, и перемешивают в течение 2 часов при температуре 50°С; затем при постоянном перемешивании и нагревании добавляют водный раствор борогидрида натрия NaBH₄ при мольном соотношении ν_Co2+ : ν_NaBH4 = от 1.5:1 до 3:1 и перемешивают при температуре 50°С со скоростью 500 об/мин до выпадения осадка – порошка полимер-композитного материала черного или черно-зелёного цвета, который отделяют от реакционной среды методом магнитной сепарации и промывают последовательно 2 раза деионизированной водой с температурой 2°С при перемешивании в течение 1 часа; затем порошок полимер-композитного материала промывают последовательно ацетоном и диэтиловым эфиром; промывку повторяют дважды; затем нанокомпозит осушают под вакуумом без нагревания в режиме: 30 минут при 850 мбар для удаления следов диэтилового эфира, 30 мин при 560 мбар для удаления следов ацетона, 1 час при 72 мбар для удаления следов воды.