Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к питательным средам и добавкам, оптимизированным для трансфекции и получения векторов и рекомбинантных белков. В частности, настоящее изобретение относится к комбинации питательных сред и питательных добавок, которая обеспечивает высокий уровень производства белка. Более конкретно, изобретение относится к композиции питательных сред и добавок для культивирования клеток СHO экспрессирующих моноклональное антитело пембролизумаб.
Белки все чаще разрабатываются в качестве новых фармацевтических продуктов. Сконструированные клетки, которые производят нетипично высокие содержания представляющего интерес белка, становятся критически важными для успешного коммерческого производства фармацевтических средств.
Поскольку спрос на большее количество терапевтических белков продолжает расти, прилагаются большие усилия для оптимизации процессов, в частности, способов и стратегий выращивания, кормления и поддержания клеточных культур, которые оказывают положительное влияние на жизнеспособность клеток и выход белка.
Из Европейского патента EP2970876 известна улучшенная, не содержащая сыворотки и гидролизата белков среда для культивирования клеток животных, содержащая 0,6±0,09 мМ орнитина, 0,714±0,11 мМ путресцина и смесь аминокислот или их солей, которая может быть использована в способе получения представляющего интерес белка. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка представляет собой клетку CHO, клетку HEK293 или клетку BHK. Использование указанной среды позволяет улучшить плотность жизнеспособных клеток, снизить время удвоения клеток и увеличить продукцию представляющего интерес белка. Максимальный титр белка по данному изобретению на седьмой день составил 1,07 г/л. Существует необходимость в дальнейшем улучшении технологии культивирования по данному направлению.
Из патента EP 2464725 известна готовая к использованию среда для культивирования клеток, не содержащая глутамин, для продукции полипептида в фазе продукции, где среда содержит аспарагин в концентрации 10 мМ. Кроме того, из изобретения известно, что рекомбинантные белки могут быть продуцированы в клетке-хозяине млекопитающего, используя питательную среду для продукции без глутамина без какого-либо значимого неблагоприятного эффекта, фактически использование питательной среды без глутамина в фазе продукции значительно увеличивают жизнеспособность клеток, продолжительность жизни культуры, специфическую продуктивность и/или конечный титр рекомбинантного белка. Культуральные среды, используемые в способе получения по настоящему изобретению, могут быть основаны на любой коммерчески доступной среде для рекомбинантного получения белков в клетках-хозяевах млекопитающего (клетки яичника китайского хомячка (СНО) и клеточные линии, полученные из различных других источников млекопитающих, таких как, например, миелома мыши (NS0), почки новорожденного хомяка (BHK), эмбриональная почка человека (HEK-293). Хотя этот способ был предметом значительной части исследований и усовершенствований, возможны дальнейшие улучшения технологического процесса клеточных культур, которые могут привести к повышению выхода продукта, тем самым снижая затраты, связанные с производством белковых лекарств.
Ближайшим аналогом изобретения является патент RU2804531, описывающий композицию питательных сред для культивирования клеток CHO экспрессирующих моноклональное антитело ритуксимаб, которая содержит BalanCDHEK293, CDM4HEK293, воду для инъекций. Существует потребность в оптимизации процессов, технологии культивирования, в частности, способов и стратегий выращивания, кормления и поддержания клеточной культуры.
Технической задачей, на решение которой направлено изобретение, является достижение значимого относительного увеличения титра белка (~1200 мг/л) с наибольшим сходством содержания вариантов заряда CQAs (CVCs), N-гликанового профиля и биологической потенции с эталонным стандартом Keytruda® в клеточной культуре путем создания комбинации питательных сред для культивирования клеток CHO в сочетании с добавкой определенного состава.
Технический результат от реализации изобретения заключается в создании композиции питательной среды для культивирования клеток CHO, представляющей собой комбинацию питательных сред.
BalanCD HEK293 - химически модифицированная питательная среда, не содержащая животных компонентов для суспензионного культивирования культуры клеток;
CDM4HEK293 - химически модифицированная питательная среда, не содержащая животных компонентов для суспензионного культивирования культуры клеток;
Feed BalanCD HEK293 - питательная добавка, разработанная для увеличения выхода белка в адаптированных к суспензии клеточных линиях.
Глюкозамин - основной строительный материал для соединительной ткани. Он участвует в образовании суставных хрящей, связок, сухожилий, присутствует в стенках сосудов, бронхов, коже и слизистых оболочках.
Acti PRO - среда была разработана для обеспечения высокого выхода рекомбинантных белков в биопроцессах с использованием линий клеток CHO. Культурная среда химически определена, не содержит компонентов животного происхождения и оптимизирована для высокопроизводительной экспрессии и производства белков в процессах серийного или порционного культивирования клеток CHO.
Cell Boost 7a - добавка, разработанная для поддержки современных производственных процессов, является химически определенной, не содержит компонентов животного происхождения и не содержит факторов роста (таких как инсулин), пептидов, гидролизатов, фенолового красного или 2-меркаптоэтанола.
Cell Boost 7b - добавка, разработанная для поддержки современных производственных процессов, представляет собой концентрированный раствор аминокислот со щелочным рН. Добавка имеет химический состав, не содержит компонентов животного происхождения, факторов роста (таких как инсулин), пептидов, гидролизатов, фенолового красного или 2-меркаптоэтанола.
BalanCD CHO growth A - это химически определенная среда для выращивания, не содержащая животных компонентов, разработанная для увеличения выхода антител и рекомбинантных белков в клетках CHO.
BalanCD CHO Feed 3 - это химически определенная питательная добавка, не содержащая животных компонентов, разработанная для повышения выхода антител и рекомбинантных белков в клетках CHO в режиме feed-batch.
BalanCD CHO Feed 4 - это химически определенная питательная добавка, не содержащая животных компонентов, разработанная для повышения выхода антител и рекомбинантных белков в клетках CHO в режиме feed-batch.
CD Opti CHO - специально разработанная среда для обеспечения высокой производительности и выхода рекомбинантных клеток CHO в химически определенной питательной среде. Среда не содержит белков животного происхождения, что обеспечивает постоянство и снижает необходимость скрининга на наличие вспомогательных агентов.
GlutaMax - Добавка GlutaMAX является альтернативой L-глутамину, обладая повышенной стабильностью, которая улучшает здоровье клеток. GlutaMAX подходит как для клеток млекопитающих, так и для суспензионных культур, без необходимости адаптации. Предлагается в виде дипептида L-аланил - L- глютамина 200 мМ в 0,85% NaCl.
Комбинации питательных сред готовятся перед началом стадии получения целевого белка, согласно рассчитанных навесок исходя из требуемого объёма. В них клеточная культура находится на протяжении всего периода культивирования. Питательные добавки вносятся в ходе процесса культивирования порционно, в установленные даты, привязанные к дням с момента начала культивирования.
Использование изобретения позволяет улучшить технологический процесс культивирования и снизить затраты на производство биотехнологических продуктов.
Более подробно изобретение представлено в нижеприведенных примерах. Примеры приведены для иллюстративных целей и не предполагают ограничения объема прав.
Коммерчески доступные реагенты, на которые ссылаются в примерах, были использованы в соответствии с инструкциями изготовителя, если не было указано иное.
Пример 1 Способ получения композиции питательной среды для продуктовой стадии культивирования
Были получены различные композиции питательных сред в различных качественных и количественных соотношениях. В процессе культивирования для различных комбинаций питательных сред использовались различные питательные добавки.
NaOH (10 M раствор)
NaHCO3
3,25 мл
1,80 г
Питательные среды использовалась для культивирования клеток CHO в конической колбе Эрленмейера общим объемом 1000 мл и с объемом клеточной культуры 300 мл. Для поддержания клеточной культуры CHO на стадии культивирования использовали питательные добавки.
В составе 1 использовалась питательная среда ActiPro, которая была приготовлена согласно инструкции производителя - 22,36 г сухой среды на 1 л воды для инъекций. В качестве питательных добавок использовали комбинацию Cell Boost 7a и 7b, приготовленную согласно инструкции от производителя. Питательную добавку вносили болюсно на 3, 5, 7, 9, 11,13 сутки культивирования в объеме 4 и 0,4 %, соответственно, от объема культуральной жидкости в сосуде.
В составе 2 использовалась питательная среда Balan CD CHO growth A - 23,72 г на 1 л готовой среды и питательная добавка BalanCD CHO Feed 3 - 65,96 г на 1 л воды для инъекций. Добавку вносили болюсно на 3,5,7,11,13 сутки культивирования в количестве 3% от объема культуральной жидкости.
В составе 3 была использована питательная среда Balan CD CHO growth A - 23,72 г на 1 л готовой среды и питательная добавка BalanCD CHO Feed 4 - 112,20 г на 1 воды для инъекций. Добавку вносили болюсно на 3,5,7,11,13 сутки культивирования в количестве 3% от объема культуральной жидкости.
В составе 4 была использована питательная среда Balan CD ОptiCHO - 19,32 г на 1 л готовой среды. В качестве питательных добавок использовали комбинацию Cell Boost 7a и 7b, приготовленную согласно инструкции от производителя. Питательную добавку вносили болюсно на 3, 5, 7, 9, 11, 13 сутки культивирования в объеме 4 и 0,4 %, соответственно, от объема культуральной жидкости в сосуде.
В составе 5 была использована питательная среда Balan CD ОptiCHO - 19,32 г на 1 л готовой среды. и питательная добавка BalanCD CHO Feed 3 - 65,96 г на 1 л воды для инъекций. Добавку вносили болюсно на 3,5,7,11,13 сутки культивирования в количестве 3% от объема культуральной жидкости.
В составе 6 была использована питательная среда ActiPro, которая была приготовлена согласно инструкции производителя - 22,36 г сухой среды на 1 л воды для инъекций. В качестве питательных добавок использовали комбинацию Cell Boost 7a и 7b, приготовленную согласно инструкции от производителя. Питательную добавку вносили болюсно на 3, 5, 7, 9, 11, 13 сутки культивирования в объеме 4 и 0,4 %, соответственно, от объема культуральной жидкости в сосуде. Кроме этого, на 8 сутки культивирования однократно добавляли раствор глюкозамина гидрохлорида в количестве 2 мМ (в молях от объема культуральной жидкости на момент добавления). Раствор глюкозамина гидрохлорида готовили из расчета 108 г на 1 л воды для инъекции.
В составе 7 была использована такая же питательная среда и такая же комбинация питательных добавок, что составе в 6, но глюкозамина гидрохлорид был добавлен до конечной концентрации 20 мМ. Питательную добавку вносили болюсно на 3, 5, 7, 9, 11, 13 сутки культивирования в объеме 4 и 0,4 %, соответственно, от объема культуральной жидкости в сосуде.
В составе 8 была использована комбинированная питательная среда, состоящая из питательной среды BalanCD HEK293 - 5,33 г и питательной среды CDM4HEK -14,62 г, а также 30 мл 200 мМ раствора GlutaMax в 1 литре готовой среды. В качестве питательной добавки была использована комбинированная добавка, состоящая из добавки Cell Boost 5 - 96,54 г и питательной добавки Feed BalanCD HEK293 - 82,78 г в 1 л воды для инъекции. Питательную добавку Cell Boost 5 добавляли в объеме 1 % от объема культуральной жидкости на 1, 5, 7, 9, 11, 13 сутки культивирования, питательную добавку Feed BalanCD HEK293 добавляли в объеме 5 % от объема культуральной жидкости на 3, 7, 9, 11 и 13 сутки культивирования. Кроме этого, на 8 сутки культивирования однократно добавляли раствор глюкозамина гидрохлорида в количестве 2 мМ (в молях от объема культуральной жидкости на момент добавления). Раствор глюкозамина гидрохлорида готовили из расчета 108 г на 1 л воды для инъекции.
В составе 9 была использована комбинированная питательная среда, содержащая в 1 л готовой среды 2,13 г среды BalanCD HEK293, 14,62 г среды CDM4HEK293, 4,14 г добавки Feed BalanCD HEK293, а также 30 мл 200 мМ раствора GlutaMax. В качестве питательной добавки была использована питательная добавка Feed BalanCD HEK293 - 82,78 г в 1 л воды для инъекции, которую добавляли в объеме 5 % от объема культуральной жидкости на 3, 7, 9, 11 и 13 сутки культивирования. Кроме этого, так же как в составах 6 и 8, на 8 сутки культивирования однократно добавляли раствор глюкозамина гидрохлорида в количестве 2 мМ (в молях от объема культуральной жидкости на момент добавления). Раствор глюкозамина гидрохлорида готовили из расчета 108 г на 1 л воды для инъекции.
Во всех экспериментах посевная клеточная плотность составляла 0,41 - 0,44 × 106 кл/мл. Культивирование проходило в инкубаторе с контролируемой подачей СО2 с установкой поддержания на уровне 6% и контролируемой влажностью, которая поддерживалась на уровне 85%, на орбитальном шейкере с радиусом орбитали 19 мм и поддерживаемом уровне вращения 120 об/мин. Контроль рН среды осуществляется за счет изменения процентного содержания СО2 в инкубаторе. Начальная установка температуры в инкубаторе составляла 37,0°C, и была снижена до 32,0°С на 4 день при достижении клеточной плотности выше 6×106 кл/мл. Питательные добавки вносили в виде растворов, на день 3, 5, 7, 9, 11 и 13. Культивирование было окончено на 14 день.
Пробы для определения титра белка отобраны на 14 день культивирования. Пробы до момента анализа хранились при температуре - 80°С.
Титр целевого белка на 14 день в эксперименте с составом 1 составил 2,16 мг/мл.
Титр целевого белка на 14 день в экспериментах с составами 2, 3 и 5 не определялся, так как процесс закончился ранее 12 дней из-за низкой клеточной плотности.
Титр целевого белка на 14 день в эксперименте с составом 4 составил 0,93 мг/мл
Титр целевого белка на 14 день в эксперименте с составом № 6 на 14 день составил 2,76 мг/мл.
Титр целевого белка на 14 день в эксперименте с составом 7 на 14 день составил 2,15 мг/мл.
Титр целевого белка на 14 день в эксперименте с составом 8 на 14 день титр целевого белка составил 1,72 мг/мл.
Титр целевого белка на 14 день в эксперименте с составом 9 на 14 день составил 1,13 мг/мл.
Пример 2 Подтверждение эффективности полученных композиций
В ходе исследований получены экспериментальные данные, которые графически представлены на графиках:
- на фиг. 1 представлен клеточный рост;
- на фиг. 2 представлена жизнеспособность культуры.
Биохимические показатели процесса представлены на следующих графических данных:
- на фиг. 3 представлены значения концентраций глюкозы;
- на фиг. 4 представлены значения концентраций лактата;
- на фиг. 5 представлены количественные данные по титру белка;
- на фиг. 6 представлены сравнительные данные по профилю гликози-лирования. Профили гликозилирования представлены для конечных продуктов, полученных в экспериментах с составами 1, 4, 6, 7, 8, 9 и оригинального препарата Кейтруда®, в качестве контрольного образца. В экспериментах с составами 2, 3 и 5 не были получены целевые продукты из-за низкой жизнеспособности или слабого роста культуры клеток.
Для обозначения профиля гликозилирования единого стандарта нет; в данной работе применяется наиболее распространенная Оксфордская схема, фиг. 7 (Symbol Nomenclature for Graphical Representation of Glycans, Glycobiology. 2015 Dec; 25(12):1323-4. doi: 10.1093/glycob/cwv091, Updates to the Symbol Nomenclature for Glycans guidelines, Glycobiology.2019 Aug 20;29(9):620-624.doi: 10.1093/glycob/cwz045).
Полученные данные позволяют утверждать, что культура, выращенная на варианте композиции питательной среды, соответствующей составу 8, показывает клеточную плотность и жизнеспособность выше, чем культура, выращенная на альтернативных вариантах сред, что представлено на фиг. 1 и фиг. 2 из кривых, обозначенных как состав 8.
Данные по биохимическим показателям, показывают, что различия в показателях биохимии несущественны, их различия не несут в себе разницы, влияющей на процесс культивирования.
Изучение титра белка показывает, что у варианта, соответствующего составу 6, титр белка наибольший, относительно других вариантов.
Результаты анализа профиля гликозилирования показывают, что у вариантов, соответствующих составу 8 и 9, профиль гликозилирования по основным значениям сигналов является наиболее схожим, относительно стандартного образца препарата пембролизумаб, чем у других вариантов.
В результате эксперимента получен белок со значениями основных сигналов гликанов, близкими к оригинальному препарату Кейтруда®. В качестве лучшего варианта получен продукт, произведенный на комбинации питательных сред и добавок, обозначенных как состав 9.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Композиция питательных сред для культивирования клеток СHO, экспрессирующих моноклональное антитело ритуксимаб | 2023 |
|
RU2804531C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ | 2021 |
|
RU2822202C1 |
| Способ получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, клеточная линия - продуцент и плазмидные экспрессионные векторы | 2019 |
|
RU2697273C1 |
| СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА (AAT) И КОМПОЗИЦИЙ НА ЕГО ОСНОВЕ | 2020 |
|
RU2817416C2 |
| ОПТИМИЗАЦИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ GL-2045 - МУЛЬТИМЕРИЗУЮЩЕГОСЯ СТРАДОМЕРА | 2017 |
|
RU2790232C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ С ПОМОЩЬЮ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК СНО | 2017 |
|
RU2672318C1 |
| СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК В ПРОДУЦИРОВАНИИ РЕКОМБИНАНТНОГО FVIII | 2012 |
|
RU2600886C2 |
| СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ, КОТОРЫЕ СОДЕРЖАТ НАДОСАДОЧНУЮ ЖИДКОСТЬ СТАДИЙ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ПО КОНУ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2010 |
|
RU2461629C2 |
| Способ культивирования первичной смешанной культуры нейронов для оценки митохондриального дыхания | 2022 |
|
RU2802254C1 |
| Синтетическая ДНК, кодирующая антимюллеров гормон человека, содержащий ее экспрессионный вектор pTVK4pu/MISOPT и штамм клеток яичников китайского хомячка CHO-MIS - продуцент рекомбинантного антимюллерового гормона человека | 2016 |
|
RU2616273C1 |
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена композиция питательных сред для культивирования клеток CHO, экспрессирующих моноклональное антитело пембролизумаб, которая содержит BalanCD HEK293, CDM4HEK293, питательную добавку Feed BalanCD HEK293, 200 мМ GlutaMax и воду для инъекций. Указанная композиция может быть использована в способе получения представляющего интерес белка. В процессе культивирования поддерживают в инкубаторе подачу углекислого газа на уровне 6%, влажность на уровне 85%, уровень кручения орбитального шейкера 120 об/мин; вносят питательную добавку Feed BalanCD HEK293 для поддержания клеточной культуры СHO на 3, 7, 9, 11 и 13 день культивирования в объеме 5% от объема культуральной жидкости; снижают начальную температуру в инкубаторе с 37 до 32 °С на четвертый день при достижении клеточной плотности выше 6×106 кл/мл, добавляют глюкозамина гидрохлорид на 8 день культивирования. Использование указанной композиции питательных сред позволяет увеличить продукцию представляющего интерес белка. 2 н.п. ф-лы, 7 ил., 2 пр.
1. Композиция питательных сред для культивирования клеток CHO, экспрессирующих моноклональное антитело пембролизумаб, включающая BalanCD HEK293, CDM4HEK293, Feed BalanCD HEK293, 200 мM GlutaMax и воду для инъекций при определенном количественном соотношении компонентов для получения композиции, мас. %:
2. Способ получения целевого белка при использовании композиции питательных сред для культивирования клеток CHO по п.1, включающий все перечисленные ниже этапы:
a) внесение компонентов композиции питательной среды BalanCD HEK293, CDM4HEK, Feed BalanCD HEK293 и 200 мM GlutaMax для культивирования клеток CHO в коническую колбу Эрленмейера общим объемом 1000 мл с объемом клеточной культуры 300 мл и помещение колбы в инкубатор;
b) поддержание в инкубаторе подачи углекислого газа на уровне 6%, влажности на уровне 85%, уровня кручения орбитального шейкера 120 об/мин;
c) внесение добавки Feed BalanCD HEK293 для поддержания клеточной культуры СHO на 3, 7, 9, 11 и 13 день культивирования в объеме 5% от объема культуральной жидкости;
d) снижение начальной температуры в инкубаторе с 37 до 32 °С на четвертый день при достижении клеточной плотности выше 6×106 кл/мл;
e) однократное внесение глюкозамина гидрохлорида на 8 сутки культивирования.
| Композиция питательных сред для культивирования клеток СHO, экспрессирующих моноклональное антитело ритуксимаб | 2023 |
|
RU2804531C1 |
| ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКОВ В КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СРЕДАХ БЕЗ ГЛУТАМИНА | 2010 |
|
RU2639288C2 |
| СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И НАБОРЫ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ НИХ | 2016 |
|
RU2778411C2 |
| EP 3431588 A1, 23.01.2019. | |||
