Композиция питательных сред для культивирования клеток СHO, экспрессирующих моноклональное антитело ритуксимаб Российский патент 2023 года по МПК A61K39/29 C12N5/10 C12N5/07 C07K14/47 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к питательным средам и добавкам, оптимизированным для трансфекции и получения векторов и рекомбинантных белков. В частности, настоящее изобретение относится к комбинации питательных сред, которая обеспечивает высокий уровень производства белка. Более конкретно, изобретение относится к композиции питательных сред для культивирования клеток CHO экспрессирующих моноклональное антитело ритуксимаб.

Белки все чаще разрабатываются в качестве новых фармацевтических продуктов. Сконструированные клетки, которые производят нетипично высокие содержания представляющего интерес белка, становятся критически важными для успешного коммерческого производства фармацевтических средств.

Поскольку спрос на большее количество терапевтических белков продолжает расти, прилагаются большие усилия для оптимизации процессов, в частности, способов и стратегий выращивания, кормления и поддержания клеточных культур, которые оказывают положительное влияние на жизнеспособность клеток и выход белка.

Из Европейского патента EP2970876 известна улучшенная, не содержащая сыворотки и гидролизата белков среда для культивирования клеток животных, содержащая 0,6±0,09 мМ орнитина, 0,714±0,11 мМ путресцина и смесь аминокислот или их солей, которая может быть использована в способе получения представляющего интерес белка. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка представляет собой клетку CHO, клетку HEK293 или клетку BHK. Использование указанной среды позволяет улучшить плотность жизнеспособных клеток, снизить время удвоения клеток и увеличить продукцию представляющего интерес белка. Максимальный титр белка по данному изобретению на седьмой день составил 1,07 г/л. Существует необходимость в дальнейшем улучшении технологии культивирования по данному направлению.

Из патента EP2464725 известна готовая к использованию среда для культивирования клеток, не содержащая глутамина, для продукции полипептида в фазе продукции, где среда содержит аспарагин в концентрации 10 мМ. Кроме того, из изобретения известно, что рекомбинантные белки могут быть продуцированы в клетке-хозяине млекопитающего, используя питательную среду для продукции без глутамина без какого-либо значимого неблагоприятного эффекта, фактически использование питательной среды без глутамина в фазе продукции значительно увеличивают жизнеспособность клеток, продолжительность жизни культуры, специфическую продуктивность и/или конечный титр рекомбинантного белка. Культуральные среды, используемые в способе получения по настоящему изобретению, могут быть основаны на любой коммерчески доступной среде для рекомбинантного получения белков в клетках-хозяевах млекопитающего (клетки яичника китайского хомячка (СНО) и клеточные линии, полученные из различных других источников млекопитающих, таких как, например, миелома мыши (NS0), почки новорожденного хомяка (BHK), эмбриональная почка человека (HEK-293). Хотя этот способ был предметом значительной части исследований и усовершенствований, возможны дальнейшие улучшения технологического процесса клеточных культур, которые могут привести к повышению выхода продукта, тем самым снижая затраты, связанные с производством белковых лекарств.

Технической задачей, на решение которой направлено изобретение, является достижение значимого увеличения титра белка в клеточной культуре путем создания комбинации питательных сред для культивирования клеток CHO в сочетании с добавкой определенного состава.

Технический результат от реализации изобретения заключается в создании композиции питательной среды для культивирования клеток CHO, представляющей собой комбинацию питательных сред.

BalanCD HEK293 - химически модифицированная питательная среда, не содержащая животных компонентов для суспензионного культивирования культуры клеток;

CDM4HEK293 - химически модифицированная питательная среда, не содержащая животных компонентов для суспензионного культивирования культуры клеток;

Feed BalanCD HEK293 - питательная добавка, разработанная для увеличения выхода белка в адаптированных к суспензии клеточных линиях.

CDM4HEK293 (×4) - питательная добавка, являющаяся четырёхкратным концентратом питательной среды CDM4HEK, использовавшаяся для градиентного смещения соотношения питательных сред и поддержания клеточной культуры

Комбинации питательных сред готовятся перед началом стадии получения целевого белка, согласно рассчитанных навесок исходя из требуемого объёма. В них клеточная культура находится на протяжении всего периода культивирования. Питательные добавки вносятся в ходе процесса культивирования порционно, в установленные даты, привязанные к дням с момента начала культивирования

Использование изобретения позволяет улучшить технологический процесс культивирования и снизить затраты на производство биотехнологических продуктов.

Более подробно изобретение представлено в нижеприведенных примерах. Примеры приведены для иллюстративных целей и не предполагают ограничения объема прав.

Коммерчески доступные реагенты, на которые ссылаются в примерах, были использованы в соответствии с инструкциями изготовителя, если не было указано иное.

Пример 1 Способ получения композиции питательной среды для продуктовой стадии культивирования

Были получены различные композиции питательных сред в различных качественных и количественных соотношениях. В процессе культивирования для различных комбинаций питательных сред использовались различные питательные добавки.

Состав 1

Питательная среда: BalanCD HEK293 3,99 г CDM4HEK293 1,218 г Вода для инъекций 245 мл Питательная добавка, использованная на стадии культивирования: Feed BalanCD HEK293 4×1,034 г Вода для инъекций 46 мл Состав 2 Питательная среда: BalanCD HEK293 2,665 г CDM4HEK293 2,437 г Вода для инъекций 245 мл Питательная добавка, использованная на стадии культивирования: Feed BalanCD HEK293 4×1,034 г Вода для инъекций 46 мл

Состав 3

Питательная среда: BalanCD HEK293 1,33 г CDM4HEK293 3,656 г Вода для инъекций 245 мл Питательная добавка, использованная на стадии культивирования: Feed BalanCD HEK293 4×1,034 г Вода для инъекций 46 мл

Состав 4

Питательная среда: BalanCD HEK293 3,99 г CDM4HEK293 1,218 г Вода для инъекций 245 мл Питательная добавка, использованная на стадии культивирования: CDM4HEK293(×4) 4×0,975 г Вода для инъекций 46 мл

Состав 5

Питательная среда: BalanCD HEK293 2,665 г CDM4HEK293 2,437 г Вода для инъекций 245 мл Питательная добавка, использованная на стадии культивирования: CDM4HEK293(×4) 4×0,975 г Вода для инъекций 46 мл

Комбинация сред BalanCD HEK293 и CDM4HEK использовалась для культивирования клеток CHO в различном количественном соотношении в конических колбах Эрленмейера общим объёмом 1000 мл с объёмом клеточной культуры 250 мл. Для поддержания клеточной культуры CHO на этапе получения целевого белка использовались добавки, которые вносились на 3, 7, 9 и 11 день культивирования. Добавка Feed BalanCD HEK293 приготавливалась в объёме 100мл по рекомендации производителя 8,278 грамм на 100 мл и вносилась по 12,5 мл. Добавка CDM4HEK293 (×4) приготавливалась в объёме 100мл по расчёту 7, 8 грамм на 100 мл и вносилась по 12,5 мл. Титр белка в клеточной культуре при использовании технического решения составляет от 1,5 до 1,8 г/л (в зависимости от качественного и количественного состава композиции питательной среды).

В момент засева клеточная плотность во всех вариантах составляла 0,75×10⁶ кл/мл. Культивирование проходило в инкубаторе с контролируемой подачей СО₂ с установкой поддержания на уровне 6% и контролируемой влажностью, которая поддерживалась на уровне 85%, на орбитальном шейкере с радиусом орбитали 19мм и поддерживаемом уровне кручения 120 об/мин. Контроль рН среды осуществляется за счет изменения % содержания СО₂ в инкубаторе. Начальная установка температуры в инкубаторе составляла 37,0°C, и была снижена до 32,0°С на день 4 при достижении клеточной плотности выше 6×10⁶ кл/мл. Питательные добавки вносили в виде растворов, на день 3, 7, 9, и 11. Культивирование было окончено на 14 день.

Пробы для определения титра белка отобраны с дня 10, 12 и 14. Пробы до момента анализа хранились при температуре -80°С.

Для состава питательных сред №1 на 14 день титр целевого белка составил 1,62-1,85 мг/мл

Для состава питательных сред №2 на 14 день титр целевого белка составил 1,75-1,76 мг/мл

Для состава питательных сред №3 на 14 день титр целевого белка составил 1,65-1,77 мг/мл

Для состава питательных сред №4 на 14 день титр целевого белка составил 1,59-1,60 мг/мл.

Для состава питательных сред №5 на 14 день титр целевого белка составил 1,47-1,53 мг/мл.

Пример 2 Подтверждение эффективности полученных композиций

В ходе исследований получены экспериментальные данные, которые графически представлены на графиках:

- на фиг.1 представлен клеточный рост;

- на фиг. 2 представлена жизнеспособность культуры.

Биохимические показатели процесса представлены на следующих графических данных:

- на фиг. 3 представлены значения pH, полученные в разные дни эксперимента;

- на фиг. 4 представлены значения концентраций глюкозы;

- на фиг. 5 представлены значения концентраций лактата;

- на фиг. 6 представлены количественные данные по титру белка;

- на фиг. 7 представлены сравнительные данные по профилю гликозилирования.

Для обозначения профиля гликозилирования единого стандарта нет; в данной работе применяется наиболее распространенная Оксфордская схема, фиг. 8 (Symbol Nomenclature for Graphical Representation of Glycans, Glycobiology. 2015 Dec; 25(12):1323-4. doi: 10.1093/glycob/cwv091, Updates to the Symbol Nomenclature for Glycans guidelines, Glycobiology.2019 Aug 20;29(9):620-624.doi: 10.1093/glycob/cwz045).

Условные обозначения питательных сред, представленных на фигурах:

SF1, SF2 - Состав 1

SF3, SF4 - Состав 2

SF5, SF6 - Состав 3

SF7, SF8 - Состав 4

SF9, SF10 - Состав 5

Полученные данные позволяют утверждать, что культура, выращенная на варианте композиции питательной среды, соответствующей составу 1, показывает клеточную плотность и жизнеспособность выше, чем культура, выращенная на альтернативных вариантах сред, что представлено на фиг. 1 и фиг. 2 из кривых, обозначенных как SF1 и SF2.

Данные по биохимическим показателям, показывают, что различия в показателях биохимии несущественны, их различия не несут в себе разницы, влияющей на процесс культивирования.

Изучение титра белка показывает, что у варианта, соответствующего составу 1, титр белка наибольший, относительно других вариантов.

Результаты анализа профиля гликозилирования показывают, что у варианта, соответствующего составу 1, профиль гликозилирования по основным значениям сигналов является наиболее схожим, относительно стандартного образца препарата ритуксимаб, чем у других вариантов.

В результате эксперимента получен белок со значениями основных сигналов гликанов, близкими к оригинальному препарату ритуксимаб®. В качестве лучшего варианта получен продукт, произведенный на комбинации питательных сред, обозначенных как состав №1.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения целевого белка при использовании композиции питательных сред для культивирования клеток СНО, экспрессирующих моноклональное антитело ритуксимаб, включающей BalanCD HEK293, CDM4HEK293, воду для инъекций при определенном количественном соотношении компонентов. Изобретение может быть использовано для увеличения продукции представляющего интерес белка. 2 н.п. ф-лы, 8 ил.

1. Композиция питательных сред для культивирования клеток CHO, экспрессирующих моноклональное антитело ритуксимаб, включающая BalanCD HEK293, CDM4HEK293, воду для инъекций при определенном количественном соотношении компонентов для получения композиции (в мас.%):

BalanCD HEK293 0,5-1,6 CDM4HEK293 0,5-1,5 Вода для инъекций до 100

2. Способ получения целевого белка при использовании композиции питательных сред для культивирования клеток CHO по п.1, включающий все перечисленные ниже этапы:

a) внесение композиции питательных сред BalanCD HEK293 и CDM4HEK для культивирования клеток CHO в конические колбы Эрленмейера общим объёмом 1000 мл с объёмом клеточной культуры 250 мл и помещение их в инкубатор;

b) поддержание в инкубаторе подачи углекислого газа на уровне 6%, влажности на уровне 85%, уровня кручения орбитального шейкера 120 об/мин;

c) внесение добавки Feed BalanCD HEK293 или добавки CDM4HEK293 (×4) для поддержания клеточной культуры CHO на 3, 7, 9 и 11 день культивирования;

d) снижение начальной температура в инкубаторе с 37 до 32°С на четвертый день при достижении клеточной плотности выше 6×10⁶ кл./мл.