СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА (AAT) И КОМПОЗИЦИЙ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/81 C12N15/57 

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[1] Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей, который представлен в формате ASCII посредством EFS-Web и включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Копия указанного файла ASCII, созданная 23 января 2019 г., называется SEQ LIST_178225.01000.txt и имеет размер 39 килобайт.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[2] Данное изобретение в общем относится к рекомбинантному белку альфа-1-антитрипсину (AAT) человека, а также его вариантам, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим такой рекомбинантный AAT, и способам получения и применения таких продуктов AAT при лечении заболеваний, расстройств и патологических состояний, связанных с дефицитом AAT.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[3] Альфа-1-антитрипсин или α1-антитрипсин (AAT, A1AT, A1A) представляет собой гликопептид широкого спектра, белок острой фазы и ингибитор серинпротеаз, в том числе, например, ингибитор из суперсемейства ингибиторов серинпротеаз (серпин), который также обладает противовоспалительными функциями. У людей AAT кодируется геном SERPINA1 (член 1 семейства серпинов A). Зрелый гликопротеин AAT дикого типа содержит 394 аминокислоты и N-гликозилирован по аспарагину в положениях 46 (Asn 46), 83 (Asn 83) и 247 (Asn 247). AAT также относится к ингибитору альфа-1-протеазы (α1PI) вследствие его способности ингибировать различные протеазы, а не только трипсин. Он главным образом является ингибитором нейтрофил-эластазы, но также ингибирует катепсин G, химотрипсин, активатор плазминогена, протеиназу 3 и тому подобное (Janciauskiene S. Biochim Biophys Acta, 1535(3):221-235, 2001).

[4] AAT также характеризуется как противовоспалительный и иммунорегуляторный белок in vitro и in vivo (Janciauskiene S, et al. Resp. Med. 105:1129-1139, 2011). Большинство белков природным образом сворачиваются в свою наиболее стабильную форму. Однако главная функция AAT наблюдается вследствие его более высокой конформационной гибкости, которая облегчает его связывание с различными протеазами и другими веществами. AAT вырабатывается главным образом в печени и высвобождается в кровоток. По меньшей мере одна из наиболее известных функций этого белка заключается в защите легких от повреждения, вызванного активированными ферментами воспалительных клеток, такими как, например, нейтрофил-эластаза, ферментом, который высвобождается лейкоцитами организма, когда они отвечают на воспаление или инфекцию. Для защиты соединительной ткани в легком от деградации серинпротеазой важно равновесие между протеазами и антипротеазами, и это равновесие обеспечивается антипротеазной активностью AAT. В отсутствие необходимого количества или качества AAT ферменты нейтрофил-эластазы могут разрушать или расщеплять эластин, важный белок в соединительной ткани, который позволяет тканям принимать свою исходную форму после расширения или сжатия.

[5] Дефицит альфа-1-антитрпсина (AAT) наблюдается, когда организм не вырабатывает достаточное количество белка AAT для защиты тканей от протеолитического повреждения вследствие генетических дефектов в гене SERPINA1. Описано большое количество вариантов дефицита AAT, однако клинически наиболее значимый дефицит вызван вариантом Z (замена глутаминовой кислоты на лизин в положении 342; E342K) (Hag I, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 54(1):71-80, 2016).

[6] Сильный дефицит AAT у людей определяется уровнями AAT в плазме ниже 11 ммоль/л (т.е. около 0,5 г/л). Дефицит AAT может возникать вследствие нарушений в стабильности, секреции и функциональной активности белка. Например, неправильное сворачивание варианта AAT Z-типа связано с внутриклеточным накоплением молекул AAT посредством упорядоченной самоассоциации (или полимеризации). Поскольку печень является основным органом, продуцирующим AAT, удержание аномального белка AAT в печени может приводить к заболеванию печени (например, неонатальному холестазу, циррозу печени, раку печени и т.д.). С другой стороны уменьшенная секреция поврежденного белка AAT и его внешнеклеточная полимеризация дает недостаточные количества AAT для защиты легких и других органов при острых и хронических воспалительных процессах. Это состояние может приводить к заболеванию легких (например, эмфизема, астма, бронхоэктаз, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), хронический бронхит и т.д.) и другим расстройствам и патологическим состояниям, в том числе, но не ограничиваясь этим, например целлюлиту, гранулематозу Вегенера и васкулиту.

[7] Препараты белка AAT, выделенные из плазмы человека, повсеместно применяются при лечении людей (Lebing, W. “Alpha-1 Proteinase Inhibitor: The Disease, the Protein and Commercial Production.” В: Bertolini, J, Goss, N., Curling, J. (eds): Wiley and Sons, Inc. (2013) pp. 227-240; Lundblad, R.L. В: Lundblad Biotechnology of Plasma Proteins. Taylor and Francis Group 2013. pp. 285-323). В плазме крови здоровых людей AAT присутствует в концентрации около 1-2 г/л. Пациентов с тяжелым наследственным дефицитом AAT (AATD) как правило лечат белком AAT человека, полученным из плазмы человека. Тяжелый дефицит определяется наличием известного тяжелого дефицитного генотипа/фенотипа (например, PI*ZZ, PI*Z нуль, PI* нуль нуль и т.д.) и/или если имеющийся в сыворотке уровень AAT меньше 0,5 г/л. Пациенты с тяжелым дефицитом AAT в общем имеют концентрацию AAT около 0,1-0,25 г/л (Ferrarotti I, et al. Thorax, 67:669-674, 2012; Stoller J, et al. Ann Am Thorac Soc 12(12):1796-1804, Dec 2015). Один из наиболее распространенных тяжелых наследственных AATD представляет собой PiZZ, возникающий из гомозиготной мутации (замена глицина на лизин в положении 342; Gly342Lys) в гене SERPINA1. Мутация PiZZ приводит к внутриклеточной агрегации белка AAT, которая предотвращает его секрецию. Предложена механистическая связь между внутриклеточным накоплением неправильно свернутого белка Z-AAT (т.е. с усилением функции или протеотоксичностью) и снижением секреции белка Z-AAT (т.е. утратой функции), что приводит к повреждению ткани и в итоге к развитию хронического заболевания.

[8] Клинически, носители PiZZ сильно предрасположены к развитию эмфиземы легкого и заболевания печени. Заболевание легких, обычно в форме прогрессирующей эмфиземы, развивается в течение 4-ого или 5-ого десятилетия жизни человека, особенно у курящих. Мутация PiZZ могут приводить к развитию как острого повреждения печени у новорожденных, так и хронического прогрессирующего заболевания печени у взрослых. Кроме того, носители PiZZ демонстрируют повышенные воспалительные или иммунные ответы, которые делают их восприимчивыми к развитию целлюлита или гранулематоза с ангиопатией. У носителей PiZZ может присутствовать несколько других форм заболевания.

[9] Препараты AAT человека, полученные из плазмы, в качестве биологических продуктов, применяются для лечения пациентов с заболеванием легких с AATD с целью снижения прогрессирования заболевания. В группе патологических расстройств помимо эмфиземы легких, которые считают связанными со сниженными уровнями и/или сниженной функциональной активностью AAT, находятся инфекция HIV 1 типа, инфекция гепатит C, сахарный диабет, фибромиалгия, системный васкулит и некротизирующий целлюлит. Заместительная терапия AAT для сахарного диабета 1 типа, муковисцидоза и реакции «трансплантат против хозяина» оцениваются на данный момент в клинических исследованиях.

[10] Однако очищенные готовые препараты AAT, полученного из плазмы, имеют несколько недостатков, относящихся к качеству, поскольку эти продукты загрязнены другими белками, хотя и в небольших количествах. Кроме того, AAT, полученный из плазмы, получают из объединенной донорской крови, и таким образом представляет молекулы AAT, которые не являются идентичными по своей аминокислотной последовательности и характеристикам гликозилирования. Было идентифицировано более 100 молекулярных вариантов AAT, отличающихся от преобладающего AAT дикого типа, с использованием технологий секвенирования ДНК. Таким образом, доноры с различными мутациями в гене SERPINA1, но без клинического проявления заболевания, могут стать частью популяции, которая делает вклад в объединенную плазму, используемую в качестве субстрата для получения очищенных продуктов AAT из плазмы. Поскольку AAT, полученный из объединенной плазмы, получен от сотен доноров с различными генотипами (т.е. не все доноры имеют генотип MM), может существовать низкий процент мутаций, которые могут приводить к неправильному сворачиванию белков или иметь иммунологическое влияние на пациентов, которые получают AAT при многократной заместительной терапии. Более того, выделение AAT из плазмы человека является очень сложным и длительным процессом, который может модифицировать структуру природного белка AAT в плазме крови, например путем окисления, вызывая полимеризацию AAT и/или генерируя другие химические формы (которые обладают меньшим ингибирующим действием). Препараты AAT для клинического применения, полученные из плазмы человека различными производителями, отличаются методами очистки, концентрациями и лекарственными формами и являются дорогими.

[11] Сообщались различные подходы для экспрессии белков млекопитающего, в том числе AAT человека, в микроорганизмах. Они включают бактерии (EP0137633), дрожжи (патенты США № 4839283 и 4752576; EP0304971), растения (патент США № 6127145; Sudarshana MR, et al. Plant Biotechnol J. 4(5):551-9, 2006 Sep), насекомых (Chang CJ, et al. J Biotechnol. 102(1):61-71, 2003; Morifuji Y, et al. Mol Biotechnol. 60(12):924-934, 2018 (https://doi.org/10.1007/s12033-018-0127-y), клетки млекопитающих (патенты США № 5399684 и 5736379; Garver RI, et al. Proc Natl Acad Sci USA 84:1050-1054, 1987), в том числе клетки яичника китайского хомячка (CHO) (Paterson T, et al. Appl Microbiol Biotechnol. 40: 691-698, 1994; Lee KJ, et al. Glycoconj. J. 30, 537-547, 2013; Amann T, et al. Metab. Eng., 52:143-152, 2019 (epub 2018 Dec 1: https://doi.org/10.1016/j.ymben.2018.11.014)) и клеточную линию нейронов человека (AGE1.HN®) (Blanchard V, et al. Biotechnol. Bioeng. 108:2118-28, 2011). В качестве альтернативы рекомбинантный AAT может быть получен из молока трансгенных животных (Archibald AL, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5178-5182, July 1990; патент США № 5650503; Wright G, et al. Bio/Technology 9:830-834, 1991). Даже трансгенные шелкопряды недавно были использованы для получения AAT человека (Morifuji Y, et al. Mol. Biotech. 60(12):924-934, 2018).

[12] Рекомбинантные способы на основе бактериальных систем, клеток насекомых или технологии на основе растений приводили к материалам, которые отличались в основном вторичными модификациями от AAT человека, полученного из плазмы, и таким образом обладали недостаточно сложным, подобным человеческому гликозилированием, демонстрируя гликозилирование, отличное от человеческого, или не обладали им вообще. Эти признаки приводили, помимо других влияний на функциональность, к снижению периода полувыведения таких материалов из кровотока, при введении животным, что делает их не подходящими для терапии в большинстве случаев.

[13] Выведение трансгенных животных, таких как овцы или козы, которые продуцируют желаемые белки в молоке самок, является очень сложным, дорогим и длительным, чтобы собрать достаточно большую группу животных для «получения молока в промышленных масштабах». Кроме того, эти способы обладают недостатками, поскольку могут существовать некоторые риски загрязнения продукта известными и неизвестными патогенными агентами, так как животные не могут быть выращены в среде без вирусов, грибков и бактерий. Продукт AAT необходимо выделять из молока сотен животных, разведенных и выращенных на специализированных фермах. Несмотря на крупные инвестиции нескольких компаний, эти попытки были прекращены несколько десятилетий назад.

[14] Попытки экспрессировать рекомбинантный AAT человека в культивируемых клетках животных также были, но общий успех был ограниченным и очевидно недостаточным для дальнейших разработок. Использовали как клетки CHO, так и клеточные линии человека. Во всех случаях количества полученных материалов AAT было достаточно низким, несмотря на значительные усилия по увеличению продуктивности. В одном из наилучших случаев из клеточной линии человека, которая не используются широко в промышленности, было получено менее 3 г/л (Ross D, et al. J. Biotech. 162:262-273, 2012). Кроме того, остается вопрос о приемлемом качестве вследствие использования фетальной бычьей сыворотки (ФБС) во время процесса производства. ФБС, агент, стимулирующий рост в культуральной среде, т.е. добавка к среде, как правило исключена в данное время из крупномасштабного процесса производства вследствие возможных факторов риска, связанных с прионными болезнями крупного рогатого скота. В Amann T, et al. (Metab. Eng., 52:143-152, 2019 (epub 2018 Dec 1: https://doi.org/10.1016/j.ymben.2018.11.014)) раскрыта экспрессия AAT, полученного в гликоинженерных клеточных линиях CHO, однако снова выходы, полученные в «оптимизированном» процессе с подпиткой в течение 13 дней, едва ли достигали 150 мг/л (т.е. 0,15 г/л), что снова подтверждает недостаточную продуктивность для получения коммерчески ценной альтернативы AAT, полученному из плазмы. До 20 л такой клеточной культуры было бы необходимо, чтобы получить дозу AAT на 1 неделю для одного пациента. Все еще существует давно назревшая необходимость в получении AAT с высокими выходами (или рекомбинантного AAT, используемого взаимозаменяемо в данном документе) ввиду современных технологий, применяемых Lalonde et al., которые дают лишь 1 г/л рекомбинантного AAT в клетках CHO с использованием индуцируемой экспрессионной системы (см., например, Lalonde, et al., J. Biotechnology 307 (2020) 87-97, 2019, которая включена в данный документ посредством ссылки). Это количество все еще является слишком низким для коммерческого применения и достигается с производительностью, которая также является слишком низкой. Учитывая, что выходы продукта в клеточной культуре не отражают выход белка в составах и составах с высоким содержанием, можно предположить, что менее чем половина от этих выходов в культуре фактически дойдет до пациента.

[15] Количества 100-200 грамм AAT в год необходимо, чтобы обеспечивать одного пациента, которому необходима заместительная терапия AAT. Необходимые масштабы производства рекомбинантного продукта для будущего рынка при использовании любой из ранее описанных систем производства при выходах клеточной культуры 1-3 г/л будут чрезвычайно большими, и таким образом сделают рекомбинантный продукт очень дорогим.

[16] Наиболее важно то, что никакая из упомянутых технологий на основе клеточной культуры, применяемых в синтезе рекомбинантного аналогичного человеческому AAT не использовалась для получения материала, который дошел до конечного клинического использования. В результате пациенты, которым необходим для лечения AAT, продолжают зависеть от непостоянной или сокращающейся поставки продукта, полученного из объединенной и фракционированной плазмы человека. Таким образом, в данной области техники существует необходимость в улучшенных способах и приемах получения гликозилированного терапевтически эффективного AAT, и предпочтительно из производственной системы на основе организма-хозяина и с соответствующей технологией производства, которая, как было показано, неизменно является превосходным источником терапевтических белков в течение нескольких десятилетий.

[17] Известные способы лечения изменяются в зависимости от пациентов с дефицитом AAT, но большинство направлены на симптомы и физиологические результаты дефицита AAT. Эти способы лечения могут включать трансплантацию печени/легкого, заместительную терапию AAT (также называемую пополнением) для эмфиземы легкого и лечение симптомов с использованием, например, бронходилататоров, кортикостероидов, дополнительного кислорода, агентов для восстановления легких, антибиотиков и вакцин против штаммов вирусного гепатита и гриппа и снижение или устранение факторов экологического риска. Наиболее широко используемое лечение дефицита AAT у пациентов с легочной эмфиземой представляет собой заместительную терапию с использованием инъецируемых препаратов полученного из плазмы AAT. Эти препараты обеспечивают активность ингибирования протеазы для тех пациентов, которые являются носителями мутантных генов, отвечающих за варианты белков, которые не обладают или обладают небольшой активностью ингибирования. Некоторая степень ингибирования протеазы необходима для поддержания равновесия между протеазами и ингибиторами протеаз в некоторых тканях человека, таких как легкое. Отсутствие или недостаточное ингибирование протеаз приводит к процессам деградации ткани, усиливаемым воспалением. Кроме того, в этих воспалительных процессах функциональные уровни AAT помимо ингибирования протеаз обеспечивают противовоспалительную поддержку.

[18] Клинически наиболее важной целью для связанной с AAT болезнью легких является уменьшение или устранение прогрессирования повреждения легких путем усиления ингибирования протеазы функциональными белками AAT. Заместительная терапия представляет собой специфическую терапию для заболеваний, связанных с AAT, в которой как правило применяют AAT из плазмы крови здоровых доноров, чтобы повысить уровни белка AAT в кровотоке и других биологических жидкостях пациентов с врожденным и/или приобретенным дефицитом AAT. Заместительную терапию AAT в общем выполняют путем внутривенной инфузии полученного из плазмы и очищенного AAT человека. Для того чтобы достичь функционального уровня AAT от около 1 г/л до 2 г/л в крови этих пациентов с дефицитом AAT, пациенты могут подвергаться внутривенной инфузии. Показано, что период полувыведения эндогенного AAT из кровотока у людей составляет около пяти дней. Установлено, что эндогенный AAT в плазме человека находится в концентрации около 1-1,75 г/л.

[19] Для того чтобы обеспечить дозу AAT на одну неделю пациенту с дефицитом AAT, от донора необходимо получить от более чем половины литра до более 3 литров (например, более чем 0,5 л, 1 л, 1,25 л 1,5 л, 1,75 л, 2 л, 2,25 л, 2,5 л, 2,75 л, 3 л, 3,25 л, 3,5 л, 3,75 л, 4 л) плазмы человека. Таким образом существующее на данный момент обеспечение AAT, полученным из плазмы, является ограниченным и не может удовлетворять возрастающее применение и потребность. Несмотря на различные попытки в течение десятилетий получить безопасный и коммерчески доступный источник высококачественных препаратов AAT с помощью технологий рекомбинантной ДНК, никакой из хорошо известных подходов не является удовлетворительным или считается пригодным для производства клинически приемлемых количеств рекомбинантного AAT человека приемлемого качества для заместительной терапии.

[20] Заместительную терапию с AAT не рассматривают как излечение или решение для восстановления уже утерянной функции легких. Однако эта терапия может уменьшать частоту и тяжесть обострения болезни легких и снижать прогрессирование эмфиземы. Существует по меньшей мере четыре коммерчески доступных продукта для заместительной терапии, одобренных Управлением США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), которые доступны в Соединенных Штатах Америки. Эти одобренные продукты ингибиторы альфа-1-протеиназы включают Prolastin-C® (Grifols, S.A.), Aralast NP™ (Takeda Pharmaceutical), Zemaira® (CSL Behring LLC) и Glassia® (Kamada Ltd.). Однако эти продукты AAT, полученного из плазмы, не только ограничены по количеству, но также могут нести риск передачи инфекционных агентов, например вирусов, неизвестных или новых вирусов и других патогенов. Следовательно, существует необходимость в высококачественных продуктах рекомбинантного альфа-1-антитрипсина с высоким выходом с целесообразно долгим периодом полувыведения из кровотока и биодоступностью в качестве профилактического или терапевтического лечения дефицита AAT, которые можно вводить безопасно и которые получены в достаточно больших количествах с помощью рентабельного процесса.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[21] Как описано в данном документе, данное изобретение и его варианты осуществления описывают рекомбинантный белок AAT, в том числе его варианты, композиции, экспрессионные вектора, клетки-хозяева и эффективные способы производства белка AAT, включая его варианты, или кодирования белка AAT, включая его варианты, способы получения рекомбинантного белка AAT, включая его варианты, и способы лечения заболеваний, расстройств и патологических состояний, связанных с дефицитом AAT, у субъекта, нуждающегося в этом, с помощью композиций, содержащих рекомбинантный AAT, включая его варианты, описанных в данном документе. В одном аспекте предложен рекомбинантный белок AAT, включая его варианты, при этом рекомбинантный белок AAT происходит от любого вида, включая, но не ограничиваясь этим, человека. Термины «рекомбинантный AAT», «его вариант» или «варианты рекомбинантного AAT» используются в данном документе взаимозаменяемо, при этом упоминание «рекомбинантного белка AAT человека» также включает любые взаимозаменяемые термины, такие как, например, варианты рекомбинантного белка AAT человека.

[22] Аспект изобретения может относиться к экспрессионному вектору и способу включения фрагмента нуклеиновой кислоты, содержащего последовательность нуклеотидов или нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок AAT человека в экспрессионный вектор. В другом аспекте предложен мобилизирующий или хелперный вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу, при этом транспозаза представляет собой транспозазу типа «вырезать и вставить», такую как, но не ограничиваясь этим: piggyBac, Tol-2, «спящая красавица», Leap-In и любая другая транспозаза типа «вырезать и вставить», или тому подобное, используемые для транслокации нуклеотидной последовательности, кодирующей белок AAT человека, в по меньшей мере одну клетку-хозяина.

[23] Один аспект изобретения может относиться к способу получения рекомбинантного белка AAT человека, в том числе его вариантов, включающему: a) введение экспрессионного вектора, содержащего фрагмент нуклеионовой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует рекомбинантный белок AAT человека, в том числе его варианты, в клетку-хозяина, чтобы выделить трансформант, т.е. рекомбинантную клетку, экспрессирующую рекомбинантный белок AAT человека, в том числе его варианты; b) культивирование клеток-хозяев с трансформантом, рекомбинантных клеток или экспрессионного вектора, содержащего фрагмент нуклеиновой кислоты, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует рекомбинантный AAT, в условиях, которые делают возможной экспрессию рекомбинантного белка AAT человека; и c) выделение рекомбинантного белка AAT человека, в том числе его вариантов, из рекомбинантных клеток, получая таким образом рекомбинантный белок AAT человека или его варианты. Другой аспект может относиться к фрагменту нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный AAT человека, в том числе его варианты, т.е. кодон-оптимизированную для клеток CHO последовательность.

[24] Другой аспект может относиться к способу получения рекомбинантного белка AAT, включая его варианты, при этом стадия культивирования включает: отбор клетки-хозяина с фрагментом нуклеиновой кислоты, экспрессирующей белок AAT человека, причем отобранные клетки представляют собой полученные клональным способом клетки, экспрессирующие рекомбинантный белок AAT человека. Стадия отбора включает: a) выращивание или культивирование полученных клональным способом рекомбинантных клеток, экспрессирующих рекомбинантный белок AAT человека постоянно (непрерывно) в культуральную среду; b) подпитка полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный белок AAT человека, по меньшей мере одной питательной добавкой; c) выдерживание культуральной среды при температуре культивирования клеток, достаточной для поддержания или стимуляции нормальных жизнеспособных клеток; d) изменение или снижение температуры культивирования клеток; e) выращивание или культивирование полученных клональным способом клеток при сниженной температуре клеточной культуры до момента, пока клетки не станут экспрессировать рекомбинантный белок AAT, например рекомбинантный белок AAT человека, с титром около 1 г/л или более.

[25] Дополнительный аспект может относиться к способу получения рекомбинантного белка AAT человека, в том числе его вариантам, включающему: a) введение в клетку-хозяина, например эукариотическую, первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT, и по меньшей мере дополнительной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу; b) культивирование клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека, включая его варианты, при этом дополнительная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая, например, транспозазу, такую как, но не ограничиваясь этим, например, piggyBac, также может находиться в клеточной культуре и экспрессироваться, чтобы помочь включению гена, представляющего интерес, кодирующего, например, AAT человека, при этом клетку-хозяина изменяют с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей AAT человека; c) отбор клетки-хозяина с фрагментом нуклеиновой кислоты, экспрессирующим белок AAT человека, причем отобранные клетки представляют собой полученные клональным способом клетки, экспрессирующие рекомбинантный белок AAT человека; и d) выделение рекомбинантного белка AAT, включая его варианты, из клетки-хозяина или эукариотической клетки-хозяина, получая таким образом рекомбинантный белок AAT человека, при этом стадия выделения может включать очистку рекомбинантного белка AAT человека.

[26] Один аспект изобретения может относиться к экспрессионному вектору, содержащему: фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую белок AAT, причем белок AAT может представлять собой, например, белок AAT человека, в том числе его варианты, при этом фрагмент нуклеиновой кислоты расположен в сайте множественного клонирования; интрон выше фрагмента нуклеиновой кислоты; промотор цитомегаловируса (CMV) мыши или человека выше интрона; 5'-инвертированный концевой повтор (5' ITR) выше промотора CMV; поли-аденозиновую хвостовую сигнальную последовательность ниже фрагмента нуклеиновой кислоты; последовательность начала репликации E. coli ниже фрагмента нуклеиновой кислоты; селектируемую маркерную последовательность ниже последовательности начала репликации; 3'-инвертированный концевой повтор (3' ITR) ниже селектируемой маркерной последовательности, причем селектируемая маркерная последовательность может отличаться от последовательности устойчивости к антибиотикам или может альтернативно содержать последовательность устойчивости к антибиотикам.

[27] Другой аспект может относиться к рекомбинантному белку AAT человека, в том числе его вариантам, содержащему полипептидную последовательность, которая на около 75% или более идентична, около 80% или более идентична, около 85% или более идентична, около 90% или более идентична, около 95% или более идентична, около 96% или более идентична, около 97% или более идентична, около 98% или более идентична, около 99% или более идентична или около 100% идентична SEQ ID №: 1.

[28] Дополнительный аспект изобретения может относиться к рекомбинантному белку AAT человека, в том числе его вариантам, и способам получения рекомбинантного белка AAT человека, в том числе его вариантов, при этом выделенный рекомбинантный белок человека имеет чистоту около или выше чем около 90%, около или выше чем около 95%, около или выше чем около 97%, около или выше чем около 98%, около или выше чем около 99%, около или выше чем около 99,9% или любой процент чистоты, выше, чем тот, который может быть достигнут путем получения и выделения и/или очистки полученного из плазмы белка AAT.

[29] В одном аспекте изобретения предложена композиция, содержащая рекомбинантный белок AAT человека, в том числе его варианты, полученный с помощью любого из способов, описанных в данном документе. В дополнительном аспекте предложена фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный белок AAT человека, в том числе его варианты, описанные в данном документе или полученные с помощью способов, описанных в данном документе, при этом композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или среду.

[30] В другом аспекте изобретения способ лечения субъекта, страдающего от дефицита альфа-1-антитрипсина, включает введение рекомбинантного белка AAT человека или композиции, содержащей рекомбинантный белок AAT человека, в том числе его варианты, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или среду, причем если субъект представляет собой человека, то композиция содержит рекомбинантный белок AAT человека, в том числе его варианты, причем дефицит AAT может быть снижен или уменьшен после лечения путем введения рекомбинантного белка AAT человека. В другом аспекте предложен способ лечения субъекта, страдающего от вызванного протеазой повреждения тканей любого типа, которое вызвано различными основными заболеваниями, в том числе те, которые могут быть вызваны воспалением неустановленной природы, причем повреждение тканей может быть ослаблено или уменьшено после лечения путем введения рекомбинантного белка AAT.

[31] В другом аспекте изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка альфа-1-антитрипсина (AAT) человека, включающий: культивирование клетки-хозяина с первой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека, и по меньшей мере второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу, причем стадию культивирования осуществляют в первый период времени при первой температуре и во второй период времени при второй температуре и необязательно в третий период времени при третьей температуре.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[32] Характеристики и преимущества вариантов осуществления изобретения будут описаны подробно в сочетании с сопроводительными фигурами.

[33] Фиг. 1 иллюстрирует аминокислотную последовательность AAT человека «дикого типа» с предшествующей лидерной пептидной последовательностью, обозначенной жирным и подчеркнутым шрифтом, и соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты с сайтами рестрикционной эндонуклеазы (SpeI и EcoR1), обозначенными курсивом. Фиг. 1A иллюстрирует аминокислотную последовательность AAT человека дикого типа без лидерной пептидной последовательности (SEQ ID №:1). Фиг. 1B иллюстрирует нуклеотидную последовательность (SEQ ID №:2), включающую кодируемую белковую последовательность AAT человека с SEQ ID №:1. Различные лидерные пептидные сигнальные последовательности, указанные жирным подчеркнутым шрифтом, аминокислотных последовательностей AAT человека представлены на Фиг. 1C (SEQ ID №:3) для природной лидерной последовательности AAT человека (SEQ ID №:11) и на Фиг. 1D, нуклеотидная последовательность (SEQ ID №:4), включающая кодируемую белковую последовательность AAT человека с природной лидерной пептидной последовательностью AAT человека с SEQ ID №:3, на Фиг. 1E (SEQ ID №:5) с лидерной последовательностью тяжелой цепи IgG человека (SEQ ID №:12) и на Фиг. 1F, нуклеотидная последовательность (SEQ ID №:6), содержащая кодируемую белковую последовательность AAT человека с лидерной пептидной последовательностью тяжелой цепи IgG человека SEQ ID №:5, и на Фиг. 1G (SEQ ID №: 7) с лидерной последовательностью AAT шимпанзе (SEQ ID №:13), и на Фиг. 1H, нуклеотидная последовательность (SEQ ID №:8), включающая кодируемую белковую последовательность AAT человека с лидерной последовательностью AAT шимпанзе с SEQ ID №:7 представлены в качестве примеров лидерных последовательностей из различных источников.

[34] Фиг. 2 (Фиг. 2A, Фиг. 2B, Фиг. 2C, Фиг. 2D) иллюстрирует последовательность одноцепочечной нуклеиновой кислоты из 6504 нуклеотидов плазмиды pXLG6-AAT (размещена на 4 отдельных фигурах, но с непрерывной нумерацией нуклеотидной последовательности; SEQ ID №:9), содержащей последовательность, кодирующую последовательность белка AAT, кодон-оптимизированную для клеток CHO, которая напечатана прописными буквами и подчеркнута (положения 1948..3214, и фрагмент эндонуклеазы рестрикции, кодирующий последовательность белка AAT, вставлен в плазмидный вектор pXLG6 в сайтах распознавания эндонуклеазы рестрикции от SpeI до EcoR1, причем текст курсивом представляет сайты распознавания эндонуклеазы рестрикции (положения 1948..1953; положения 3209..3214, соответственно) в направлении от 5'-конца до 3'-конца.

[35] Фиг. 3 иллюстрирует плазмидную карту из 5268 пар оснований вектора pXLG6, используемого для экспрессии ДНК, представляющей интерес, как правило вставленной ниже интрона EF-1-альфа (998..1941 п.о.). Плазмидная карта также содержит концевые последовательности повтора ITR piggyBac (321…13 п.о./ 4050…4299 п.о.) и маркер устойчивости млекопитающего к пуромицину (Puro-r; 3834…3235 п.о.), а также бактериальный маркер устойчивости к ампициллину (Amp-r; 5251…4391 п.о.).

[36] Фиг. 4 иллюстрирует плазмидную карту (Фиг. 4A) вектора pXLG5, используемого в качестве «мобилизирующего» экспрессионного вектора в котрансфекциях, при этом кодирование гена для фермента транспозазы Piggy Bac (mPBase) (Фиг. 4B) указывает положение гена транспозазы (905…2686 п.о.), который запускается промотором цитомегаловируса (CMV) (209...863 п.о.). Этот вектор также содержит маркер устойчивости к зеоцину, включая его собственный промотор (Zeo; 3870…4244 п.о.). Фиг. 4B иллюстрирует аминокислотную последовательность PiggyBac, которая кодируется последовательностью в векторе pXLG5 (mPBase 905-2686) (SEQ ID №: 10).

[37] Фиг. 5 демонстрирует характеристики культуры, выращиваемой в замкнутом объеме, (закрашенные кружки) и культуры с подпиткой (закрашенные треугольники) популяции клеток CHO-rAAT_c1 12, полученных клональным способом. Показаны, соответственно, кинетика роста клеток в плотностях жизнеспособных клеток/мл (верх) (VCD; 10⁶ клеток/мл) и жизнеспособность клеточной культуры (%) (низ) в течение 10 дней или 14 дней.

[38] Фиг. 6 иллюстрирует процесс культивирования клеток с подпиткой 2 клональных линий (№ 112 (светло-серый) и № 423 (темно-серый)) в течение 14 дней по отношению к росту клеток (VCD; клеток/мл) (верх) и кинетику продуцирования (титр AAT; мг/л) (низ).

[39] Фиг. 7 иллюстрирует сравнение средних титров AAT (мг/л), полученных с использованием различных сред в условиях, описанных на Фиг. 9, что измерено в дни 12 и 14 (n=4).

[40] Фиг. 8 иллюстрирует анализ продуцирования рекомбинантного AAT из пяти различных клональных клеточных линий, продуцирующих AAT (CHO-AAT № 112, 275, 423, 555, 585) в стационарных процессах (день 6) и стационарных процессах с подпиткой (день 14). Столбцы CDM (в клетку) обозначают культуру в 6 день с использованием коммерчески доступной среды с определенным химическим составом (CDM; HyClone™ CDM4CHO; GE Healthcare), столбцы XLG (серые) обозначают культуры в замкнутом объеме к 6 дню с использованием среды с химически определенным составом, столбцы XLG_E21_07 (ExcellGene S.A.) и XLG с подпиткой (XLG FB) (черные) обозначают культуры процесса с подпиткой к 14 дню с использованием среды с химически определенным составом, XLG_E21_07 (ExcellGene S.A.) и питательной добавки с химически определенным составом (питательная добавка A; ExcellGene S.A.).

[41] Фиг. 9 иллюстрирует пример эксперимента, в котором применяются условия высокопроизводительного культивирования с целью получить процесс культивирования с подпиткой с высокими выходами с использованием клеточной линии CHO-rAAT_c112, чтобы получить рекомбинантный AAT человека, при этом используя основную среду для продуцирования, среду с химически определенным составом XLG_E21_07 (ExcellGene S.A.).

[42] Фиг. 10 иллюстрирует профиль рекомбинантного AAT, выделенного из клеток CHO, продуцирующих AAT, который определен с помощью эксклюзионной хроматографии. Очищенный рекомбинантный белок AAT был собран из основного пика, который элюируется от около 12 минуты до около 14 минуты.

[43] Фиг. 11 иллюстрирует, что рекомбинантный AAT, полученный из рекомбинантных клеток CHO уменьшает активность эластазы in vitro и эффективно образует комплекс со своей мишенью эластазой. Конкретнее, Фиг. 11A иллюстрирует, что эластаза превращает субстрат (N-сукцинил-Ala-Ala-Ala-п-нитроанилид) с течением времени, что дает спектрофотометрически определяемое поглощение (закрашенные черные кружки) в двух повторениях. В присутствии рекомбинантного или полученного из плазмы AAT это превращение ингибируется в значительной степени (незакрашенные кружки, рекомбинантный AAT; черные треугольники, полученный из плазмы AAT). Фиг. 11B представляет данные Фиг. 11A в форме столбцовой диаграммы, что указывает на то, что в обоих случаях наличия AAT активность эластазы уменьшена на около 50%. Фиг. 11C иллюстрирует ингибирующую активность рекAAT или проластина (GRIFOLS) по отношению к эластазе другим способом, чем показанный на A и B, и определенную независимо от эксперимента A/B. Вкратце, 50 нг эластазы инкубировали с различными концентрациями рекAAT или проластина в течение 30 минут при комнатной температуре в 50 мМ Трис, 1M NaCl, 0,05% (мас./об.) Бридж 35, pH 7,5. После добавления субстрата нейтрофил-эластазы (MEOSUC Ala Ala Pro Val AMC, Bachem, № в каталоге I1270, 100 мМ) для анализов нейтрофил-эластазы человека и эластазы поджелудочной железы свиньи, эмиссию флуоресценции записывали при 460 нм (возбуждение при 380 нм) в кинетическом режиме в течение 10 минут при 37°C. Изменение относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) измеряли для каждой концентрации AAT путем вычитания ОЕФ из холостого для каждой точки. Результаты наносили на график с использованием Prism 5.0 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния). Фиг. 11D иллюстрирует изображение геля SDS PAGE (7,5% полиакриламида), в котором полученный из плазмы и рекомбинантный AAT, соответственно, проходят отдельно или после инкубации с эластазой, демонстрируя взаимодействие между двумя молекулами, приводящее к полосе с более высокой молекулярной массой для комплекса AAT с эластазой. Маркер; полоса 1: 5 мкг полученного из плазмы AAT (pAAT) (Zemaira) отдельно; полоса 2: 5 мкг pAAT с 2,35 мкг эластазы (pAAT+эластаза); полоса 3: 5 мкг рекомбинантного AAT (рекAAT); полоса 4: 5 мкг рекAAT с 2,35 мкг эластазы (рекAAT+эластаза); полоса 5: 2,35 мкг эластазы отдельно.

[44] Фиг. 12 иллюстрирует, что рекомбинантные AAT (рекAAT; ExcellGene; R&D Systems) и полученный из плазмы AAT (проластин), а также плазма мыши, содержащая AAT, ингибируют сильную протеазу трипсин в диапазоне концентраций AAT от низких нанограммов/мл до более чем 4 мкг/мл (т.е. 4000 нг/мл). Данные представлены в виде среднего трех экспериментов, и горизонтальные линии возле символов указывают отклонения от среднего значения.

[45] Фиг. 13 иллюстрирует, что увеличивающиеся количества рекомбинантного AAT (0 мг/мл-1 мг/мл) снижают эндотоксин (1 мкг/мл) (или вызванное липополисахаридом (LPS, ЛПС) высвобождение ФНО-альфа (ФНО-α) (пг/мл)).

[46] Фиг. 14 A и Фиг. 14 B иллюстрируют, что рекомбинантный AAT (1 мг/мл) ингибирует эндотоксин (1 мкг/мл), вызванную ЛПС экспрессию ФНО-α (верх; Фиг. 13A) и ИЛ-6 (низ; Фиг. 13B), соответственно, в адгезивных мононуклеарных клетках периферической крови человека (PBMC) по сравнению с конститутивным геном гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазой (HPRT). Каждый столбец представляет два независимых повтора.

[47] Фиг. 15 иллюстрирует, что рекомбинантный AAT, а также очищенный из плазмы AAT могут эффективно перемещаться через несколько слоев кожи, в in vitro модели кожи человека (epiCS®; CellSystems). Модель кожи epiCS® использовали для in vitro тестирования токсикологии и эффективности AAT при проникновении через кожу, при этом положительное окрашивание на AAT было продемонстрировано (окрашенные в более темный цвет области, обозначенные стрелками) на Фиг. 15 B в противоположность контролю без AAT на Фиг. 15 A. Фиг. 15 C иллюстрирует анализ супернатанта культуры epiCS® с помощью вестерн-блоттинга, который продемонстрировал зависимые от времени положительные пробы на AAT в коже epiCS®, обработанной как рекомбинантным AAT (рекAAT), так и AAT плазмы (pAAT), но не контролями без AAT (контроль). Фиг. 15 D иллюстрирует, что раздражение кожи, как установлено по общим уровням ИЛ-18 (пг/мл), провоспалительного цитокина и маркера раздражения кожи, ингибировалось как рекAAT (10 мг; светло-серый), так и pAAT (10 мг; темно-серый) через 6 часов по сравнению с контролем, который не содержал AAT (контроль с 0 мг AAT; черный).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[48] В данном документе раскрыты подробные варианты осуществления изобретения; однако, понятно, что раскрытые варианты осуществления являются лишь иллюстрацией изобретения, которое может воплощаться в различных формах. Кроме того, подразумевается, что каждый из примеров, приведенных в связи с различными вариантами осуществления изобретения, является иллюстративным, а не ограничивающим. Например, способы получения рекомбинантного альфа-1-антитрипсина человека можно применять для получения любого другого необходимого белка. Специалист в данной области техники поймет на основании идей данного документа и знаний из данной области техники, как получить экспрессионный вектор, который кодирует необходимый белок для введения в подходящую клетку-хозяина или популяцию клеток-хозяев, культивировать клетку-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию требуемого рекомбинантного белка, и выделить необходимый рекомбинантный белок для дальнейшего применения, в том числе, но не ограничиваясь этим, терапевтического, исследовательского или диагностического.

[49] Предполагается, что все термины, используемые в данном документе, имеют свое обычное значение в данной области техники, если не указано иное. Все концентрации приведены в процентах по массе конкретного компонента относительно общей массы композиции для местного применения, если не указано иное.

[50] При использовании в данном документе, единственное число означает один или более. При использовании в данном документе, когда используются в сочетании со словом «включающий», слова в единственном числе могут означать один или более одного. При использовании в данном документе, «другой» означает по меньшей мере второй или более.

[51] При использовании в данном документе все диапазоны численных величин включают конечные точки и все возможные значения, заключенные между раскрытыми значениями. Также предполагается, что точные значения всех полуцелых численных величин являются конкретно раскрытыми и являются граничными для всех подгрупп раскрытого диапазона. Например, диапазон от 0,1% до 3% конкретно раскрывает процентные значения 0,1%, 1%, 1,5%, 2,0%, 2,5% и 3% и все промежуточные процентные значения. Дополнительно, диапазон от 0,1% до 3% включает поддиапазоны исходного диапазона, в том числе, например, от 0,5% до 2,5%, от 1% до 3%, от 0,1% до 2,5% т.д. Понятно, что сумма всех массовых % отдельных компонентов не будет превышать 100%, если не указано иное.

[52] Понятно, что аспекты и варианты осуществления изобретения, описанные в данном документе, включают «содержащие», «состоящие из» и «состоящие по существу из» аспектов и вариантов осуществления.

[53] Упоминание «около» значения или параметра в данном документе включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся непосредственно к указанной величине или параметру. Например, описание с указанием «около X» включает описание «X». Численные диапазоны включают числа, определяющие диапазон.

[54] В данном изобретении предложен альтернативный источник альфа-1-антитрипсина человека (AAT), в том числе его вариантов, таких как, например, вариантов с различными аминокислотами в молекуле AAT человека, которые обладают отдельно введенными мутациями, полученными с помощью генной инженерии клеток-хозяев млекопитающего, что приводит к сильной и воспроизводимой выработке белка AAT. Варианты осуществления изобретения не обязательно являются исчерпывающими, но обеспечивают для специалиста в данной области техники достаточное ознакомление с тем, как осуществлять способы достижения или продуцирования экспрессии белка на высоких уровнях из высокопродуктивных клеток, таких как, но не ограничиваясь этим, клетки яичника китайского хомячка (CHO), чтобы получить рекомбинантный AAT (rAAT или рекAAT), в том числе его варианты, например рекомбинантный AAT человека. В вариантах осуществления изобретения субъект, страдающий от дефицита AAT, может включать любого человека или альтернативно любое животное, при этом животное может быть классифицировано как млекопитающее, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных и животных из зоопарков, животных для состязаний или домашних животных-компаньонов, таких как собаки, лошади, коты, крупный рогатый скот и т.д. Предпочтительно, млекопитающее представляет собой человека. Другие варианты осуществления изобретения относятся к рекомбинантному белку AAT, в том числе его вариантам, которые предназначены для тех же видов, к которым принадлежат субъекты с дефицитом AAT, которые страдают заболеванием и/или подлежат лечению.

[55] Варианты осуществления демонстрируют, что надежный крупномасштабный источник высококачественного AAT может быть обеспечен рекомбинантными клетками млекопитающих в биореакторах, которые оптимизированы на высокую производительность. Линии рекомбинантных клеток CHO или модифицированных клеток CHO, адаптированных к суспензионной культуре, описанные в данном документе, обеспечивают основу для крупномасштабного производства, поскольку высокопроизводительные мелко- и среднемасштабные процессы, разработанные в данном изобретении, возможно расширить до около 1000 л и 10000 л. Таким образом, производство сотен килограмм рекомбинантного AAT человека, в том числе его вариантов, с использованием модифицированных клеток CHO может стать реальностью; тогда как в последние десятилетия научно-исследовательской работы получение такого рекомбинантного AAT человека в больших количествах и высокого качества и чистоты не было осуществлено, возможно также по коммерческим причинам, вследствие отсутствия баланса между стоимостью производства и экономическими аспектами рынка.

[56] Проблема низкого выхода и низкого качества рекомбинантного продукта AAT и способов его получения решена вариантами осуществления данного изобретения, например теми вариантами осуществления, в которых предложены способы получения высокопроизводительных, полученных клональным способом клеточных линий из быстро растущей клетки-хозяина и ее производных, т.е. оптимизированных и таким образом модифицированных клеток CHO, адаптированных для суспензионной культуры, и применение подходов к разработке клеточных линий и условий процесса с использованием очень обогащенных сред и/или питательных добавок, не содержащих компонентов животного происхождения. Все вместе эти способы могут давать клеточные культуры, продуцирующие AAT человека, обеспечивающие объемные выходы рекомбинантного AAT в периодических процессах с подпиткой в диапазоне нескольких граммов/литр, например до и включая около 10 г/л или более. Кроме того, но не ограничиваясь конкретной характеристикой полученного рекомбинантного белка AAT, возможно изменять культуральную среду и некоторые условия процесса таким образом, чтобы получить рекомбинантный AAT человека, в том числе его варианты, с высоким уровнем концевых сиаловых кислот и другими вторичными модификациями, которые изменяют характеристики и состояние гликозилирования такого AAT, полученного с помощью CHO. Гликозилирование является эффективным для защиты белков, таких как AAT, от выведения из кровотока, что является одним фактором увеличения периода полужизни рекомбиннатного AAT в кровотоке субъектов, таким образом увеличивая время полужизни рекомбинантного AAT у субъектов с дефицитом AAT, которых лечат рекомбинантным AAT, в том числе его вариантами, при этом в одном варианте осуществления изобретения субъект представляет собой человека.

[57] Варианты осуществления изобретения относятся к веществам и способам получения или продуцирования рекомбинантных препаратов AAT, в том числе его вариантов, пригодных для лечения субъектов или пациентов, страдающих от дефицита AAT, с помощью, например, заместительной или пополняющей терапии, или которые можно использовать для ряда других раскрытых заболеваний, в которых AAT может быть неправильно процессирован или может быть полностью устранен из кровотока или иметь уменьшенный период полужизни у субъекта с дефицитом AAT. AAT, в том числе его варианты, полученный с помощью веществ и способов, описанных в данном документе, может включать рекомбинантный AAT, который является гликозилированным, с высоким уровнем сиаловых кислот, например концевых сиаловых кислот, что позволяет увеличить время полужизни AAT в кровотоке пациентов или субъектов, страдающих от дефицита AAT, которых лечили с помощью пополняющей или заместительной терапии. Вследствие биологической активности AAT и повышенной потребности в продуктах AAT, долгое время существует интерес в получении или продуцировании высококачественного рекомбинантного AAT, в том числе его вариантов, и в больших количествах для терапевтического применения для людей. Способы, описанные в данном документе, позволяют получать рекомбинантный AAT, в том числе его варианты, с чрезвычайно высокой чистотой, с помощью модифицированных клеток яичника китайского хомячка, которые культивируют в биореакторе, при этом можно осуществлять крупномасштабное производство, и применять полученный рекомбинантный AAT, в том числе его варианты, для лечения заболеваний или патологических состояний человека, при которых AAT находится в дефиците или отсутствует.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА (AAT) ЧЕЛОВЕКА

[58] В одном варианте осуществления изобретения последовательность AAT, представляющая интерес, идентична последовательности, опубликованной в Long GL, et al. (Biochemistry 23(21):4828-4837, 1984). Она представляет M-аллель, т.е. наиболее распространенный и функциональный альфа-1-антитрипсин человека. Аминокислотная последовательность AAT дикого типа полной длины содержит 394 аминокислоты, соответствующие M-аллели человека (Фиг. 1A; SEQ ID №:1). Однако, лидерная последовательность (т.е. последовательность секреторного сигнального пептида) последовательности AAT человека дикого типа может быть заменена другой лидерной последовательностью, такой как, но не ограничиваясь ими, лидерная последовательность последовательности тяжелой цепи IgG1 человека, лидерная последовательность сывороточного альбумина человека, лидерная последовательность AAT шимпанзе, лидерная последовательность легкой цепи каппа Ig мыши и другие. В Таблице 1 представлены альтернативные лидерные последовательности, которые можно включать в последовательность AAT. Другая лидерная последовательность представляет собой «природную» лидерную последовательность AAT (SEQ ID №: 10), которая также отщепляет лидерную пептидную последовательность от зрелого AAT. Наличие и местоположение отщепления сигнального пептида можно предсказать и сравнить с «природной» лидерной последовательностью AAT, а также с другими лидерными последовательностями с помощью программы SignalP 4.1 (H. Nielsen. Methods Mol. Biol. 1611:59-73, 2017. doi: 10.1007/978-1-4939-7015-5_6). В одном варианте осуществления изобретения предложен фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID №:4), содержащую аминокислотную последовательность AAT, содержащую природную лидерную последовательность AAT (SEQ ID №:3), при этом экспрессионный вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты, можно вводить в клетку-хозяина, чтобы получить рекомбинантный вектор AAT человека с использованием способов, описанных в данном документе.

Таблица 1 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ СИГНАЛЬНЫХ ПЕПТИДОВ БЕЛОК ВИД MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA
(SEQ ID №: 11) Природный AAT H. sapiens и Hylobates sp. MEFWLSWVFLVAILKGVQC
(SEQ ID №: 12) Тяжелая цепь IgG H. sapiens MLSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA
(SEQ ID №: 13) AAT Pan troglodytes (Шимпанзе) MKWVTFISLLFLFSSAYS
(SEQ ID №: 14) Сывороточный альбумин H. sapiens MTRLTVLALLAGLLASSRA
(SEQ ID №: 15) Азуроцидин H. sapiens METPAQLLFLLLLWLPVSDTTG
(SEQ ID №: 16) Легкая цепь каппа Ig H. sapiens METDTLLLWVLLLWVPGSTG
(SEQ ID №: 17) Легкая цепь каппа Ig Мышь и хомяк

[59] Лидерная последовательность или сигнальная последовательность может быть отщеплена перед секретированием з клеток. Включая лидерную пептидную последовательность природного AAT человека из 24 аминокислот, аминокислотная последовательность AAT может содержать 418 аминокислот. (См., Фиг. 1B; SEQ ID №:3). Альтернативно, в белковую последовательность AAT можно включать другие лидерные пептидные последовательности с различной длиной. В одном варианте осуществления изобретения лидерная последовательность содержит по меньшей мере около 10 остатков, по меньшей мере около 15 остатков, по меньшей мере около 19 остатков или по меньшей мере около 24 остатков. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к лидерной последовательности, которая происходит от того же вида, что и требуемый AAT, например лидерной последовательности человека и AAT человека. Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к лидерной последовательности, которая отщепляется перед секрецией.

[60] Понятно, что для поддержания правильной конформации, полезным фактором является гликозилирование. Отсутствие гликанов или гликозилирования может приводить в быстрому выведению из кровотока, уменьшению периода полувыведения, понижению стабильности и/или неправильному сворачиванию, что может вызывать агрегацию, или может легче агрегировать или деградировать, таким образом приводя к потере активности, причем любые их этих факторов могут влиять на стабильность белка. Действительно, полученный из плазмы AAT содержит в значительной степени различные количества гликанов, что является неблагоприятным, т.е. поскольку полученный из плазмы AAT выделяют из объединенной крови, высока вероятность того, что полипептиды AAT будут с неидентичными последовательностями. Молекулы AAT, полученные из плазмы, могут отражать как генетические, так и физиологические факторы (например, возраст или заболевание и т.д.) индивида, у которого была взята плазма. В то же время характеристики гликозилирования рекомбинантного AAT могут быть сконструированы более однородными, поскольку нет индивидуальной вариабельности каркаса полипептидной последовательности всех AAT, полученных с помощью рекомбинантной клетки-хозяина.

[61] В одном варианте осуществления изобретения рекомбинантный белок альфа-1-антитрипсин (AAT), в том числе его варианты, представляет собой активный, гликозилированный белок, который на от около 90% до около 100% не содержит загрязняющих примесей, таких как, но не ограничиваясь этим, компонентов нечеловеческого происхождения, компонентов животного происхождения или компонентов человеческого происхождения, которые вызывают нежелательный иммунный ответ. Рекомбинантный белок AAT, в том числе его варианты, описанный в данном документе, может иметь чистоту от около 90% до около 100%, от около 95% до около 99,9% или от около 98% до около 99%; чистоту более чем около 95%, более чем около 98%, более чем около 99% или более чем около 99,9%; или чистоту около 95%, около 98%, около 99%, около 99,9% или около 100%.

[62] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к активному рекомбинантному белку AAT, в том числе его вариантам, описанным в данном документе, который обладает активностью ингибирования протеазы, эквивалентной или большей чем активность ингибирования протеазы белка AAT, полученного из плазмы, при этом протеаза представляет собой, например, эластазу. В одном варианте осуществления изобретения активность ингибирования эластазы рекомбинантного белка AAT (recAAT), в том числе его вариантов, может быть практически такой же, как и у белка AAT, полученного из плазмы. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к активности ингибирования эластазы рекAAT, в том числе его вариантами, которая может быть выше чем от около 0% до около 20%, выше чем от около 5% до около 25% или выше чем от около 10% до около 30% активности ингибирования эластазы белком AAT, полученным из плазмы.

[63] Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к зависимости между эластазой и альфа-1-антитрипсином, при этом рекомбинантный AAT, описанный в данном документе, ингибирует активность эластазы. Фиг. 10A иллюстрирует, что поглощение при 405 нм возрастает тем больше, чем дольше субстрат эластазы подвергают действию этого фермента. В присутствии как полученного из плазмы, так и рекомбинантного AAT, добавленных в одинаковом количестве в реакцию, увеличение поглощения снижено на около 50%. Эти данные представлены в виде гистограммы (Фиг. 10B), указывающей на одинаковую степень ингибирования эластазы двумя AAT, т.е. рекомбинантным AAT и полученным из плазмы AAT. Фиг. 10C демонстрирует, что как полученный из плазмы AAT (pAAT), так и рекомбинантный AAT (рекAAT) образуют комплекс с эластазой в реакционной смеси, на что указывает полоса с более высокой молекулярной массой для дорожек 2 и 4 по сравнению с AAT без эластазы для дорожек 1 (pAAT) и 3 (рекAAT), когда реакционные смеси подвергали SDS-PAGE.

[64] Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к зависимости между трипсином и альфа-1-антитрипсином, при этом рекомбинантный AAT или его варианты, описанные в данном документе, ингибируют активность трипсина таким же или подобным образом, что и полученный из плазмы AAT человека, или неочищенный AAT из плазмы мыши, или другой рекомбинантный AAT (R&D systems), полученный из нейрональной клеточной линии человека. Фиг. 11 иллюстрирует активность ингибирования AAT по отношению к трипсину, другой сильной протеазе, в качестве примера. Флуорогенный пептид Mca-RPKVE-Nval-WRK(Dnp)-NH₂ (SEQ ID №:18) использовали в качестве субстрата для трипсина (Mca: (7-метоксикумарин-4-ил)ацетил; Nval: норвалин; Dnp: 2,4-динитрофенил), используя различные концентрации вышеупомянутых AAT от 0 нг/мл до около 4000 нг/мл. Сыворотка мыши содержала 1,2 мг/мл AAT.

[65] Дефицит AAT может быть связан с воспалительным патологическим состоянием. Следовательно, в дополнительном варианте осуществления изобретения , активный рекомбинантный белок AAT или его вариант, описанные в данном документе, могут обладать сильной противовоспалительной активностью широкого спектра, при этом противовоспалительная активность может быть выше, чем у полученного из плазмы белка AAT. AAT может предупреждать или уменьшать отрицательные эффекты ФНО-альфа, например апоптоз, вызванный ФНО-альфа, путем, например, блокирования рецептора ФНО-альфа. Фиг. 13 иллюстрирует, что мРНК в клетках периферической крови для ФНО-альфа (Фиг. 13A) и для ИЛ-6 (Фиг. 13B) снижены, когда эти клетки инкубируют с данным количеством ЛПС вместе с рекомбинантным AAT, но не в отсутствие рекомбинантного AAT. Варианты осуществления изобретения могут относиться к окисленному рекомбинантному AAT, в том числе его вариантам, которые могут блокировать эффекты ответа ФНО-альфа. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный белок AAT, в том числе его варианты, может снижать воспалительный ответ на от около 10% до около 100%, от около 15% до около 90%, от около 20% до около 80%, около 13%, около 18%, около 80%, около 81%, около 82%, около 83%, около 84%, около 85% или более чем около 10%, более чем около 11%, более чем около 12%, более чем около 13%, более чем около 14%, более чем около 15%, более чем около 16%, более чем около 17%, более чем около 18%, более чем около 19%, более чем около 20%, более чем около 50% или более чем около 80%.

[66] В дополнительном варианте осуществления изобретения может быть предложен рекомбинантный белок AAT человека, содержащий полипептидную последовательность с SEQ ID №: 1, причем мутация представляет собой по меньшей мере одну из: фенилаланин на лейцин в положении 51 (F51L), замена метионина на валин в положении 351 (M351V) или замена метионина на валин в положении 358 (M358V). Также подразумеваются другие мутации, которые будут заменять аминокислотные остатки, которые обычно являются окисленными или приводят к сниженной способности ингибировать нейтрофил-эластазу. В одном варианте осуществления изобретения любой метионин в SEQ ID №: 1, который может быть окисленным, вместо этого может быть заменен на, например, валин. Альтернативно, метионины могут быть заменены на изолейцины или комбинацию валинов и изолейцинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна мутация может быть выбрана из по меньшей мере одного аминокислотного остатка из: цистеинов, триптофанов, фенилаланинов, тирозинов и гистидинов, при этом мутация одного из этих остатков может предотвращать окисление этого конкретного положения. В дополнительном варианте осуществления изобретения может быть предложена по меньшей мере одна мутация, которая придает термическую стабильность. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна мутация может быть выбрана из по меньшей мере одного аминокислотного остатка из: остатков фенилаланина, аспарагина, треонина, аргинина и гистидина, при этом мутация одного из этих остатков может приводить к термической стабильности, большей чем без мутации. Например, фенилаланин может быть заменен на лейцин, аспарагин на серин, треонин на изолейцин, или любую другую аминокислоту, которая обладает большей термической стабильностью, чем исходная аминокислота.

[67] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к рекомбинантному белку AAT, в том числе его вариантам, таким как, например, рекомбинантный AAT человека, содержащему около 3 молей сиаловой кислоты или более на моль AAT, около 4 молей сиаловой кислоты или более на моль AAT, около 5 молей сиаловой кислоты или более на моль AAT, около 6 молей сиаловой кислоты или более на моль AAT, около 7 молей сиаловой кислоты или более на моль AAT, около 8 молей сиаловой кислоты или более на моль AAT, около 10 молей сиаловой кислоты или более на моль AAT или около 12 молей сиаловой кислоты или более на моль AAT. Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к рекомбинантному белку AAT, в том числе его вариантам, содержащему от около 3 молей сиаловой кислоты на моль AAT до около 12 молей сиаловой кислоты на моль AAT, от около 3 молей сиаловой кислоты на моль AAT до около 10 молей сиаловой кислоты на моль AAT, от около 5 молей сиаловой кислоты на моль AAT до около 8 молей сиаловой кислоты на моль AAT, от около 4 молей сиаловой кислоты на моль AAT до около 6 молей сиаловой кислоты на моль AAT и тому подобное. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к рекомбинантному белку AAT, в том числе его вариантам, содержащему более чем 3,5 молей сиаловой кислоты на моль AAT или около 5,5 молей сиаловой кислоты или более на моль AAT. Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к рекомбинантному белку AAT, в том числе его вариантам, содержащему по меньшей мере примерно такое количество молей сиаловой кислоты на моль AAT, что и полученный из плазмы AAT, или рекомбинантному белку AAT, в том числе его вариантам, с содержанием сиаловой кислоты по меньшей мере на от около 10% до около 80% выше чем или превосходящим содержание в полученном из плазмы AAT. В дополнительном варианте осуществления изобретения содержание сиаловой кислоты превышает таковое в белке AAT, полученном из плазмы, на по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20% или менее чем около 90%, менее чем около 85%, менее чем около 80%. Понятно, что молекулы сиаловой кислоты, имеющиеся на рекомбинантном AAT, в том числе его вариантах, стабилизируют белок и могут увеличивать период полувыведения белка, что особенно эффективно для поддержания уровней рекомбинантного белка AAT в кровотоке субъекта, страдающего от дефицита AAT.

[68] Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к препаратам рекомбинантного AAT, в том числе его вариантам, которые могут проходить через несколько слоев тканей человека, таких как кожа или другие материалы, отделяющие органы, такие как, не ограничиваясь этим, альвеолы, бронхи, бронхиолы, плевра и тому подобное. Фиг. 14 иллюстрирует результаты эксперимента, в котором небольшие количества препарата AAT наносили на «внешнюю» поверхность модели искусственной кожи. После инкубации AAT идентифицировали ниже слоев кожи этой системы in vitro для кожи человека с использованием вестерн-блоттинга, в котором AAT обнаруживают с помощью поликлонального антитела кролика к AAT человека. Не связываясь какой-либо теорией, рекомбинантный AAT, в том числе его варианты, можно доставить к сайтам, в которых наблюдается дефицит AAT или неправильно свернутый AAT, путем перемещения через внешние слои кожи, через эпидермис, соединение эпидермис-дерма, дерму или некоторые или все слои кожи. Рекомбинантный AAT можно вводить таким образом, чтобы в достаточной степени доставить рекомбинантный AAT в необходимые места, включая, но не ограничиваясь этим, кожу, ее слои, альвеолы, бронхи, бронхиолы, плевру, капилляры, сосуды крови, артерии и тому подобное.

[69] При условии что рекомбинантный белок AAT сохраняет свою активность в ингибировании активности протеазы, любую последовательность аминокислот, показанную в SEQ ID №: 1, можно модифицировать с помощью по меньшей мере одной замены, вставки или делеции составляющей аминокислоты для применения. Например, модифицированная последовательность может содержать аминокислотную последовательность, которая на около 70% или более, около 80% или более, около 90% или более, около 95% или более, около 98% или более или около 99% или более идентична аминокислотным последовательностям SEQ ID №: 1.

[70] В одном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность белка AAT может представлять собой нуклеотидную последовательность любого необходимого вида, такую как, например, белка AAT человека, или нуклеотидную последовательность, полученную путем оптимизации нуклеотидной последовательности так, чтобы она была пригодна для экспрессии в клетках-хозяевах. В другом варианте осуществления изобретения может быть предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая белок AAT, имеющий последовательность, соответствующую аминокислотным последовательностям, выбранным из последовательностей SEQ ID №:1, SEQ ID №:3, SEQ ID №:5 и SEQ ID №:7, или последовательность, идентичную на около 70% или более, около 80% или более, около 90% или более, около 95% или более, около 98% или более или около 99% или более по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из последовательностей SEQ ID №:1, SEQ ID №:3, SEQ ID №:5 и SEQ ID №:7. Конкретно, нуклеотидная последовательность может представлять собой любую, выбранную из последовательностей SEQ ID №:2, SEQ ID №:4, SEQ ID №:6 и SEQ ID №:8, или нуклеотидную последовательность с практически подобной гомологией последовательности. Практически подобная гомология последовательности означает любую нуклеотидную последовательность, которая может быть идентична на около 40% или более, около 50% или более, около 60% или более, около 70% или более, около 80% или более, около 90% или более, около 95% или более, около 98% или более или около 99% или более линейной последовательности по меньшей мере одной нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID №:2, SEQ ID №:4, SEQ ID №:6 и SEQ ID №:8.

СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ НА ОСНОВЕ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА

[71] В течение более трех десятков лет клетки яичников китайского хомячка (CHO) использовали для крупномасштабного производства белков, имеющих фармацевтическое значение, используя культивирование клеток в суспензии в биореакторах. Клетки CHO очень сильно различаются по своему фенотипическому потенциалу вследствие их происхождения в качестве иммортализованных клеток, которые постоянно эволюционируют, и было показано, что их возможно адаптировать к весьма различным режимам выращивания и продуцирования (Wurm F.M., Processes, 1:296-311, 2013; Wurm F.M., Nat Biotechnol. 22(11):1393-1398, 2004; Wurm F.M., and Wurm M.J., Processes, 5(2):20, 2017). В одном варианте осуществления изобретения клетки млекопитающих, которые используют в способах получения рекомбинантного AAT, включают эффективную рекомбинантную клеточную линию для экспрессии и масштабирования в биореакторах, полученную из нерекомбинантной линии клеток-хозяев с определенным фенотипом для производства, такой как, например, модифицированные клетки CHO (клетки CHOExpress™; ExcellGene SA). Эта нерекомбинантная линия клеток-хозяев имеет фенотипические признаки, которые заключаются в чрезвычайно высокой скорости роста, высокой максимальной плотности клеток в культурах в замкнутой среде и в культурах с подпиткой с определенными составами сред, а при трансфицировании пригодными векторами, рекомбинантное потомство наследует указанный фенотип с высокой точностью. При использовании экспрессионных векторов, подходящих для трансфекции, (например, векторов, которые запускают экспрессию гена, представляющего интерес, (GOI), перманентно-конститутивных экспрессионных векторов) и соответствующем отборе популяций клеток, полученных клональным способом, производные клеточные линии обладают высокой синтетической емкостью и высокой жизнеспособностью при периодическом культивировании с подпиткой, в процессе которого будет образовываться рекомбинантный продукт. В другом варианте осуществления изобретения рекомбинантные клетки млекопитающих являются быстро растущими, высокопроизводительными (> 5 г/л для многих белковых мишеней), стойкими при высоких плотностях (> 20 миллионов клеток/мл, вплоть до 50 миллионов клеток/мл в периодических процессах с подпиткой), с очень высоким отношением субкультивирования (> 1/30), с диапазоном отношений субкультивирования от 1 к 2 до 1 к 100, и обладают высочайшей синтетической емкостью и способность поддерживать высокую выживаемость (>90%) в течение большого количества дней, например 7 дней, 11 дней, 14 дней, 17 дней, более 7 дней, более 11 дней, более 14 дней и т.д. Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к рекомбинантным клеткам млекопитающего, которые представляют собой модифицированные клетки яичников китайского хомячка (CHO) с этими признаками, в том числе, например, CHO-rAAT, или такие как, но не ограничиваясь этим, полученные клональным способом клеточные популяции, такие как CHO-rAAT_c112, CHO-rAAT_c423 и тому подобное. Рекомбинантные клетки CHO, описанные в данном документе, могут быстро расти (20 часов/удвоение клеток) при использовании описанной программы культивирования, а более конкретно, при выращивании в среде без компонентов животного происхождения или в среде с химически определенным составом. Эти рекомбинантные клетки CHO были получены из нерекомбинантной линии клеток-хозяев CHOExpress™, выращиваемой в течение 3 десятилетий в среде без компонентов животного происхождения, которую можно проследить обратно до исходной клеточной линии, полученной в исследовательской лаборатории (Puck TT, et al. J Exp Med., 108(6):945-56, 1958).

[72] В одном варианте осуществления изобретения композиции и составы сред, т.е. среды для продуцирования и питательные добавки, используемые для культивирования клеток-хозяев млекопитающих, из которых происходит рекомбинантный AAT, в том числе его варианты, известны как в отношении названий компонентов, так и концентрации каждого компонента, так что могут быть изменены концентрации определенных компонентов сред или они могут быть полностью удалены. Также может быть осуществлено добавление определенных компонентов без отрицательного влияния на общие характеристики среды, но с увеличением продуктивности и/или качества необходимого AAT. Следовательно, такие изменения могут влиять на вторичные модификации молекул AAT, полученных из этих клеток во время периодического процесса с подпиткой.

СИСТЕМА ЭКСПРЕССИННОГО ВЕКТОРА ДЛЯ ТРАНСФЕКЦИИ И ОТБОРА ПОПУЛЯЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛЕТОК

[73] В другом варианте осуществления изобретения может быть предложена конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих необходимый белок AAT, в том числе его варианты, при этом необходимый белок AAT может включать белок AAT человека или любые его варианты. Конструкция может содержать экспрессионный вектор, в который вставлена последовательность, такая как кассета. Экспрессионный вектор может включать кодирующую последовательность для белка AAT, в том числе его вариантов и белка AAT человека. Например, экспрессионный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок AAT человека, и выбираемую маркерную последовательность, причем обе расположены в противоположных рамках считывания и между 5'-инвертированным концевым повтором (5' ITR) и 3'-инвертированным концевым повтором (3' ITR), может быть пригоден для трансформации клеток-хозяев, чтобы получить рекомбинантный белок AAT человека, при этом селектируемая маркерная последовательность содержит последовательность устойчивости гена к пуромицину. В дополнительном варианте осуществления изобретения предложен экспрессионный вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность AAT, идентичную на около 70% или более, около 75% или более, около 80% или более, около 85% или более, около 90% или более, около 95% или более по меньшей мере одной последовательности из: SEQ ID №:1, SEQ ID №:3, SEQ ID №:5 или SEQ ID №:7. В другом варианте осуществления изобретения предложен фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность AAT человека, при этом нуклеотидная последовательность идентична на около 70% или более, около 75% или более, около 80% или более, около 85% или более, около 90% или более, около 95% или более по меньшей мере одной последовательности из: SEQ ID №:2, SEQ ID №:4, SEQ ID №:6 или SEQ ID №:8.

[74] В одном варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор можно использовать для переноса последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей необходимый белок, например, но не ограничиваясь этим, белок AAT или белок AAT человека, или его варианты, в по меньшей мере одну клетку-хозяина (in vitro). Экспрессионные векторы могут быть оснащены последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей селектируемый маркер, сайты рестрикционной эндонуклеазы, соответствующие контрольные элементы, такие как промоторные последовательности и терминирующие кодоны, среди других компонентов. Экспрессионный вектор может также содержать регуляторные последовательности, в том числе, но не ограничиваясь этим, некодирующие последовательности, такие как, например, интроны и контрольные элементы, т.е. промоторные и терминирующие элементы или 5'- и/или 3'-нетранслируемые области, которые можно использовать для экспрессирования кодирующей последовательности в клетках-хозяевах. Пригодные векторы и промоторы известны специалистам в данной области техники, многие из которых являются коммерчески доступными.

[75] Неограничивающие примеры пригодных промоторов могут включать конститутивные промоторы и индуцируемые промоторы, такие как, например, промотор CMV, ранний промотор SV40, промотор HSV, промотор EF-1, промотор актина и тому подобное. Вкратце, для целей экспрессии клетка-хозяин может распознать промоторную последовательность, при этом промоторная последовательность представляет собой последовательность ДНК. Промотор может быть функционально связан с последовательностью ДНК, кодирующей белок, представляющий интерес, такой как, например, белок AAT или белок AAT человека или их варианты. Промотор может быть расположен по отношению к инициаторному кодону последовательности ДНК, кодирующей необходимый белок AAT, в экспрессионном векторе таким образом, чтобы промотор мог запускать транскрипцию или трансляцию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT. Промоторная последовательность может включать транскрипцию и трансляцию контрольной последовательности, которая опосредует экспрессию белка AAT.

[76] Соответствующий селектируемый маркер будет, как правило, зависеть от клетки-хозяина, и соответствующие маркеры для различных хозяев хорошо известны в данной области техники. Такие селектируемые маркеры могут придавать трансформантам способность утилизировать метаболит, который обычно не метаболизируется клеткой-хозяином. Селектируемый маркер может придавать трансформантам способность расти в присутствии антибиотика, такого как, например, пуромицин, при этом селектируемый маркер представляет собой ген устойчивости к пуромицину (Puro-r). Последовательность, кодирующую последовательность селектируемого маркера, можно клонировать в пригодную плазмиду с использованием способов, которые обычно используются в данной области техники. Примеры пригодных плазмид включают pXLG5 или pXLG6. Пригодные методы молекулярной биологии, рекомбинантной ДНК, иммунологии и тому подобного известны в данной области техники. После того как последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют белок AAT или другой белок, представляющий интерес, в том числе его варианты, клонировали в конструкцию или экспрессионный вектор, конструкцию или экспрессионный вектор можно использовать для трансформации по меньшей мере одной клетки-хозяина, чтобы экспрессировать рекомбинантный белок AAT, такой как, например, рекомбинантный белок AAT человека или его варианты. Клетку-хозяина, которую можно трансформировать с целью экспрессировать белок AAT в соответствии с вариантами осуществления изобретения, описанными в данном документе, можно выбрать из большого разнообразия клеток-хозяев. Различные примеры компонентов экспрессионных векторов и клеток-хозяев, представленных в данном документе, не подразумевают ограничения их по объему, но могут применяться при практическом осуществлении аспектов и вариантов осуществления, представленных в данном документе.

[77] В другом варианте осуществления может быть предложен экспрессионный вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую белок AAT человека, при этом фрагмент нуклеиновой кислоты расположен в нескольких сайтах клонирования; интрон выше фрагмента нуклеиновой кислоты; промотор цитомегаловируса (CMV) выше интрона; 5'-инвертированный концевой повтор (5' ITR) выше промотора CMV; поли-аденозиновую хвостовую сигнальную последовательность ниже фрагмента нуклеиновой кислоты; последовательность начала репликации ниже фрагмента нуклеиновой кислоты; селектируемую маркерную последовательность ниже последовательности начала репликации; и 3'-инвертированный концевой повтор (3' ITR) ниже селектируемой маркерной последовательности. Последовательность селектируемого маркера может содержать в одном варианте осуществления изобретения, например, последовательность нуклеиновой кислоты гена устойчивости к пуромицину, при этом специалист в данной области техники поймет, как выбрать подходящую последовательность селектируемого маркера и использовать ее родственный элемент, т.е. антибиотик, такой как пуромицин, чтобы отобрать полученные клональным способом клетки, содержащие представляющий интерес ген, например AAT человека, из клеточной культуры. Кроме того, специалист в данной области техники также поймет положение фрагмента нуклеиновой кислоты с геном, представляющим интерес, и последовательности селектируемого маркера в противоположных рамках считывания и между 5'-инвертированным концевым повтором (ITR) и 3' ITR.

[78] Другой вариант осуществления экспрессионного вектора может относиться к фрагменту нуклеиновой кислоты, содержащему последовательность кДНК, кодирующую белок AAT человека. Неограничивающие последовательности селектируемого маркера могут включать последовательность устойчивости к антибиотику, выбираемую последовательность тимидинкиназы, чувствительную к ганцикловиру, последовательность устойчивости к триклозану, выбираемую последовательность метаболизма, такую как, например, последовательность, содержащую ген дигидрофолатредуктазы и ген глутаминсинтетазы, и тому подобное или их комбинации. В одном варианте осуществления изобретения последовательность селектируемого маркера и/или ген устойчивости к антибиотику представляет собой ген устойчивости к пуромицину, ген устойчивости к ампициллину, ген устойчивости к зеоцину, ген устойчивости к генетицину, ген для любого другого необходимого селектируемого маркера, такого как, например, дигидрофолатредуктаза или глутаминсинтетаза, и тому подобное или их комбинации. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к экспрессионному вектору, в котором фрагмент нуклеиновой кислоты и последовательность селектируемого маркера расположены в противоположных рамках считывания и между 5' ITR и 3' ITR. В дополнительном варианте осуществления экспрессионного вектора предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептидную последовательность AAT человека любой одной или более из SEQ ID №: 1, SEQ ID №:3, SEQ ID №:5 и SEQ ID №:7 (Фиг. 1) или любую другую последовательность белка AAT человека, при этом нуклеотидная последовательность может быть выбрана из по меньшей мере одной из SEQ ID №:2, SEQ ID №:4, SEQ ID №:6 и SEQ ID №:8 (Фиг. 1). В другом варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая на около 40% или более идентична, около 50% или более идентична, около 60% или более идентична, около 70% или более идентична, около 75% или более идентична, около 80% или более идентична, около 85% или более идентична, около 90% или более идентична, около 95% или более идентична, около 99% или более идентична по меньшей мере одной из SEQ ID №: 9 (Фиг. 2), SEQ ID №:2, SEQ ID №:4, SEQ ID №:6, SEQ ID №:8, или нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере одну из SEQ ID №: 2, SEQ ID №:4, SEQ ID №:6, SEQ ID №:8 и SEQ ID №:9.

[79] В дополнительном варианте осуществления изобретения систему котрансфекции, содержащую донорный вектор, экспрессирующий ген, представляющий интерес (GOI), т.е. белок AAT, в том числе его варианты, и мобилизирующий вектор, экспрессирующий ген транспозазы, который распознает инвертированные концевые повторы (ITR), считывающие последовательность GOI, можно использовать, чтобы эффективно включать ген, представляющий интерес, например последовательность нуклеиновой кислоты AAT в по меньшей мере одну клетку-хозяина для получения рекомбинантного белка AAT, в том числе его вариантов. Как будет понятно специалисту в данной области техники способ котрансфекции донорного вектора, содержащего любой ген, представляющий интерес, а также другие способы, описанные в данном документе, можно применять, чтобы получить рекомбинантный белок, который кодируется соответствующим геном, представляющим интерес. Дополнительный вариант осуществления способа получения рекомбинантного белка AAT человека, в том числе его вариантов, может относиться к стадии введения, включающей котрансфекцию клетки-хозяина вектором, содержащим первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок AAT человека, и вектором, содержащим дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу. В дополнительном варианте осуществления способа может быть предложен хелперный вектор или экспрессионный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты или хелперную мРНК, кодирующую транспозазу, который вводят в клетку-хозяина или клеточную линию с вектором или экспрессионным вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок AAT человека, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая ген, представляющий интерес (например, белок AAT, белок AAT человека и т.д.) встраивается в геном клетки-хозяина в отличие от последовательности нуклеиновой кислоты мобилизирующего или хелперного вектора (например, применение транспозазы мРНК при трансфекции без использования плазмид, содержащих ДНК для транспозазы).

[80] Вкратце, транспозон представляет собой генетический элемент, который обеспечивает эффективное перемещение между векторами и хромосомами по механизму «вырезать и вставить». Поскольку транспозаза, которая экспрессируется мобилизирующим или хелперным вектором, распознает специфичные к транспозону ITR донорного вектора, содержащего ген, представляющий интерес, транспозаза может «вырезать» донорный вектор в ITR, а затем «вставлять» последовательность донорного вектора, содержащую ген, представляющий интерес, и последовательность селектируемого маркера в хромосомную ДНК клетки-хозяина, например в хромосомные сайты TTAA. Преимущества системы транспозона, например piggyBac, заключается в том, что размер последовательности для транслокации является по существу неограниченным, она не является вирусной, и является высокоэффективной. Неограничивающие примеры транспозазы, пригодной в вариантах осуществления изобретения, включают piggyBac, Tol-2, Sleeping Beauty («спящая красавица»), Leap-In и любые другие транспозазы типа «вырезать и вставить» или тому подобное. Экспрессионные векторы или хелперные векторы, содержащие транспозазу, могут включать векторы pD2500, особенно для транспозазы Leap-In (ATUM^SM; https://www.atum.bio/products/ expression-vectors/mammalian#3; Ньюарк, Калифорния) или векторы для трансфекций на основе Tol-2 или «спящей красавицы» (Balasubramanian S. Thesis No. 6563 (2015) “Study of Transposon-Mediated Cell Pool and Cell Line Generation in CHO Cells,” Швейцарский федеральный технологический институт (EPFL), Лозанна, Швейцария).

[81] В дополнительном варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор, который вводят в клетки, и последующая экспрессия GOI могут содержать дополнительные последовательности, такие как эндогенные ретровирусные последовательности, полученные из клеток CHO, которые могут облегчать интеграцию таких экспрессионных векторов в активный хроматин нерекомбинантной линии клеток-хозяев CHOExpress™. Такие эндогенные ретровирусные последовательности могут принадлежать к семейству ретровирусных последовательностей A-типа (Anderson K, et al. Virology 64,5, 2021-2032, 1990), семейству последовательностей C-типа (Anderson K, et al. Dev. Biol. Stand. 75:123-132, 1991), или любому другому семейству повторяющихся последовательностей в эукариотических геномах, которые объединены в группы предпочтительно в активных областях генома (Mager DL and Stoye JP. 2014. Microbiol. Spectr. 3(1):MDNA3-0009-2014). Эти дополнительные эндогенные ретровирусные последовательности ДНК могут или представлять ретровирусную последовательность полной длины (нефункциональную), или более короткие ее фрагменты. Этот подход может опосредовать гомологичные рекомбинантные события в клетке, которые приводят к интеграции последовательностей GOI в область генома, которая содержит эндогенную ретровирусную последовательность ДНК (Wurm FM, et al. “Retrotargeting: Use of defective retroviral DNA fragments to improve recombinant protein production in mammalian cells.” Animal Cell Technology: Products for Today, Prospects for Tomorrow, edited by R.E. Spier et al., Butterworth-Heinemann Ltd., 1994, pp. 24-29).

[82] В другом варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор для GOI, представляющего интерес, может быть сконструирован высокопроизводительным в рекомбинантных клетках путем объединения подхода переноса гена на основе транспозона с подходом гомологичной рекомбинации для интеграции в активный хроматин генома клеток, принимающих ДНК. Неограничивающие подходы к трансфекции клеток и отбору популяций рекомбинантных клеток включают те, в которых используется целевой перенос генов в клетки посредством нуклеаз «цинковые (Zn) пальцы» (Bibikova M, et al. Science. 300(5620):764, 2003), одноцепочечных хоминг-нуклеаз (Grizot S, et al. Nucleic Acids Research. 37(16):5405-5419, 2009) или процессов CRISPR/Cas 9 (Jinek M, et al. Science 337(6096):816-821, 2012).

[83] Другой вариант осуществления изобретения относится к конструкциям экспрессионных векторов, используемых для получения экспрессии AAT на высоком уровне из трансфицированных клеток млекопитающих (Фиг. 2, 3 и 4). Плазмидный вектор pXLGb-AAT содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полную последовательность белка AAT человека, описанную в данном документе, в том числе соответствующую лидерную последовательность, которая вставлена в сайт множественного клонирования (MCS) плазмидного вектора pXLGb. Также вариантом осуществления изобретения охвачен мобилизирующий или хелперный вектор, т.е. плазмида pXLG 5, содержащая транспозазу, такую как, но не ограничиваясь этим, транспозазу PiggyBac (mPBase) или другие транспозазы, в том числе, но не ограничиваясь этим, Tol-2, «спящая красавица», Leap-In, любая другая транспозаза типа «вырезать и вставить» и их оптимизированные варианты. pXLG 5 трансфицируют совместно с pXLGb-AAT в клетках-хозяевах млекопитающего, таких как, например, модифицированные клетки CHO (например, клетки CHOExpress™; ExcellGene S.A.) или тому подобное, при этом модификация дает возможность клеткам расти до высоких плотностей клеток, например, но не ограничиваясь этим, более 20 миллионов клеток/мл, высокого отношения субкультивирования, такого как, но не ограничиваясь этим, более чем 1/20, и высоких выходов процесса с рекомбинантными клетками CHO с уровнями экспрессии более 1 г/л, более 3 г/л, более 5 г/л, более 6 г/л или более 7 г/л, среди других преимуществ. Котрансфекция в клетки-хозяева млекопитающих может осуществляться в различных количествах, при этом экспрессионный вектор транспозазы в общем имеет низкое молярное соотношение по отношению к GOI (например, вектор, экспрессирующий AAT, описанный в данном документе), поскольку экспрессионный вектор транспозазы представляет собой мобилизирующий вектор или хелперный вектор, который помогает интеграции или включению GOI в геном клеток-хозяев, тогда как последовательность нуклеиновой кислоты транспозазы избегает интеграции. Неограничивающие массовые соотношения вектора транспозазы к вектору GOI могут включать, но не ограничиваясь этим, около 1:1, около 1:3, около 1:9, около 1:10, около 0,75:9,25, около 0,5:9,5, около 0,25:9,75, около 0,1:9,9, менее чем около 1:10, менее чем около 1:9, менее чем около 1:3, менее чем около 0,75:9,25, менее чем около 0,5:9,5, менее чем около 0,25:9,75, менее чем около 0,1:9,9, более чем около 0,1:9,9, более чем около 0,25:9,75, более чем около 0,5:9,5, более чем около 0,75:9,25, более чем около 0,9:9,1, более чем около 1:9, более чем около 1:10, от около 1:10 до около 0,1:9,9, от около 0,75:9,25 до около 0,25:9,75, около 0,5:9,5, а также любые промежуточные или дополнительные соотношения, которые делают возможным успешное включение GOI в геном клетки-хозяина. Поскольку вектор транспозазы не содержит ITR, транспозаза не будет интегрироваться в геном клетки-хозяина, однако со временем будет удаляться из клеток с помощью деградационных внутриклеточных процессов, и таким образом вектор транспозазы будет активным в этом протоколе котрансфекции лишь короткое время (временно), чтобы помочь включению или интеграции GOI (например, экспрессионной кассеты AAT) в геном клетки-хозяина. Такой же принцип применяют, когда используют мРНК, кодирующую транспозазу, при котрансфекции с экспрессионным вектором ДНК, кодирующим GOI.

[84] В одном варианте осуществления изобретения кассета экспрессионного вектора pXLG 6 для гена, представляющего интерес, (GOI) может содержать сильный конститутивный промотор/энхансер, полученный из последовательности цитомегаловируса мыши (mCMV) и других пригодных элементов, таких как последовательности доноров сплайсинга, и другую экспрессионную кассету для конститутивной экспрессии селектируемого маркера (например, гена, кодирующего устойчивость к пуромицину (Puro-r): PAC - пуромицин-N-ацетилтрансфераза), запускаемого промотором тимидинкиназы простого герпеса (HSV TK). Последовательность GOI, такая как, например, последовательность AAT человека по изобретению (см. Фиг. 1), может быть клонирована в сайт множественного клонирования (MCS) pXLG 6 (см., Фиг. 3). Кроме того, в другом варианте осуществления изобретения последовательность GOI может содержать последовательность AAT человека, направленную на аллель, отличную от M-аллели.

[85] Эти две экспрессионные кассеты могут быть ограничены с помощью последовательностей инвертированных концевых повторов, 5' ITR и 3' ITR. Эти два ITR или другие ITR распознаются белком транспозазой, в том числе, но не ограничиваясь этим, транспозоном PiggyBac металловидки серой (Trichoplusia ni), транспозоном Tol-2 (Kawakami K. Genome Biol. 8(Suppl 1):S7, 2007) или транспозоном «спящая красавица» (Aronovich EL, et al. Human Molecular Genetics, 20:R14-R20, 2011), транспозазой Leap-In (ATUM^SM; https://www.atum.bio/products/expression-vectors/mammalian#3; Ньюарк, Калифорния) или любой другой системой, мобилизирующей ДНК, с использованием транспозаз. Для того чтобы ввести белок транспозазу в клетки-хозяева, с плазмидным вектором, содержащим ген, представляющий интерес, можно котрансфицировать второй вектор, который экспрессирует, например, транспозазу PiggyBac или транспозазу «спящая красавица». Один вариант осуществления изобретения относится ко второму вектору, pXLG 5, содержащему транспозазу PiggyBac. (См., Фиг. 4). Плазмидный вектор pXLG 5 содержит соответствующую экспрессионную кассету, кодирующую транспозазу PiggyBac (mPBase). В варианте осуществления изобретения соотношение между плазмидной ДНК при котрансфекции клеток CHO вектором GOI (например, вектором pXLG6-AAT) и вектором транспозазы (вектор pXLG5-mPBase или хелперный вектор) составляет 9:1 (по массе). Таким образом 90% смеси для трансфекции содержит вектор GOI. Более высокие или более низкие соотношения хелперного вектора к вектору GOI не исключены и могут включать такие соотношения как, но не ограничиваясь этим, массовые процентные содержания от около 1% хелперного вектора до около 99% вектора GOI, от 5% хелперного вектора до 95% вектора GOI, от около 15% хелперного вектора до около 85% вектора GOI, от 20% хелперного вектора до 80% вектора GOI, и тому подобное, так что осуществляется успешная котрансфекция, которая приводит к продуцированию активного зрелого рекомбинантного AAT, включая его варианты.

[86] При трансфекции с использованием химического реагента для трансфекции (набор CHO4Tx®; ExcellGene SA) и следуя оптимизированной процедуре, сотни, если не тысячи плазмид, - в данном случае смесь двух различных векторов нуклеиновых кислот - можно трансфицировать в ядро клеток-хозяев. Вектор транспозазы может запускать транскрипцию гена транспозазы и синтез транспозазы. Белки транспозазы могут распознавать последовательности ITR в векторе GOI и вырезать их из плазмиды. Затем вырезанная кассета GOI может быть интегрирована в геном клетки-хозяина, опосредованный транспозазой (Matasci M, et al. Biotechnol Bioeng. 108(9):2141-50, 2011 Apr 25 Epub). Другой вариант осуществления изобретения относится к модифицированным клеткам-хозяевам с по меньшей мере одной кассетой GOI, кодирующей белок AAT человека, в том числе его варианты. В дополнительном варианте осуществления изобретения около 5-30 копий, около 5-15 копий или около 10-20 копий кассет GOI можно интегрировать в геном линий клонированных рекомбинантных клеток CHO, полученных вследствие таких трансфекций. Поскольку транспозаза PiggyBac имеет предпочтение интегрироваться в активный хроматин, установлено, что уровни экспрессии таких линий рекомбинантных клеток являются высокими.

ТРАНСФЕКЦИЯ И ОТБОР

[87] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к трансфекции и отбору клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT человека. Отбор модифицированных клеток CHO с устойчивостью к антибиотикам, трансфицированных совместно донорным плазмидным вектором, содержащим ген белка AAT, и мобилизирующим плазмидным вектором, содержащим ген транспозазы, таким как, но не ограничиваясь этим, ген транспозазы PiggyBac, свидетельствует, что выжившие клетки обладают как геном GOI, так и геном устойчивости к антибиотику, таким как, например, интегрированный или экспрессирующийся ген устойчивости к пуромицину, или любой другой устойчивостью, при условии, что ДНК в плазмидном векторе изменяет клетки-хозяева, тогда как ген транспозазы в мобилизирующем векторе не изменяет клетки-хозяева. Как трансфекцию, так и отбор можно осуществлять с клетками, которые растут быстро без какой-либо агрегации в суспензионной культуре в среде для культивирования клеток и без какого-либо воздействия веществ животного происхождения. Давление отбора в течение от около 7 дней до около 10 дней после трансфекции может поддерживаться в очень жестких условиях. Эти условия включают замену среды, содержащей агент, обеспечивающий отбор, каждый день. Когда клетки снова быстро растут и жизнеспособность клеток восстановилась до высоких значений, культуры можно субкультивировать с использованием обычных и распространенных способов. Следовательно, такую гетерогенную популяцию клеток после дополнительного выращивания и увеличения в отсутствие какого-либо агента, селективного к антибиотикам, считают рекомбинантной, и она экспрессирует белок AAT человека на очень высоких уровнях, таких как, но не ограничиваясь этим, от около 1 г/л до около 10 г/л, более чем около 2 г/л, более чем около 5 г/л, более чем около 6 г/л, более чем около 8 г/л, более чем около 9 г/л, около 2 г/л, около 3 г/л, около 4 г/л, около 5 г/л, около 6 г/л, около 7 г/л, около 8 г/л, около 9 г/л, около 10 г/л или любые промежуточные количества. Таким образом, вариант осуществления изобретения относится к рекомбинантным клеткам, экспрессирующим высокие уровни активного высокогликозилированного AAT человека, и их клональным клеточным линиям.

[88] В одном варианте осуществления изобретения модифицированные клетки CHO могут быть трансфицированы высокоэффективным экспрессионным вектором (например, с помощью транспозаза-опосредованной интеграции гена или другой известной методологии), содержащим ген AAT дикого типа. Могут быть выделены рекомбинантные пулы, экспрессирующие AAT, а затем полученные клональным способом клеточные линии могут быть отобраны с помощью клонирования одиночной клетки и увеличения количества. Вкратце, модифицированные клетки CHO могут быть трансфицированы одновременно донорным GOI или экспрессионным вектором AAT человека и мобилизирующим или хелперным вектором транспозазы в соотношении, в котором больше донорного вектора экспрессии GOI к вектору транспозазы или меньше вектора транспозазы по отношению к донорному вектору экспрессии GOI. Отношение донорного вектора AAT к хелперному вектору транспозазы может включать, но не ограничиваясь этим, 9:1 (мас./мас.), 9,25:0,75 (мас./мас.), 9,5:0,5 (мас./мас.), 9,75:0,25 (мас./мас.), 9,9:0,1 (мас./мас.) и 10:1 (мас./мас.) или промежуточные соотношения. Например, отношение вектора pXLG-6 AAT к вектору транспозазы pXLG-5 может включать, но не ограничиваясь этим, 9:1 (мас./мас.), 9,25:0,75 (мас./мас.), 9,5:0,5 (мас./мас.), 9,75:0,25 (мас./мас.) и 9,9:0,1 (мас./мас.). Трансфицированные клетки можно хранить в суспензионной культуре, при этом среда может быть дополнена селективным агентом, таким как, например, пуромицин при 50 мкг/мл, и заменять каждый день среду, дополненную пуромицином, в течение от около 7 дней до около 10 дней или до получения здоровой популяции клеток, демонстрирующей жизнеспособность клеток более чем или около 50%, более чем или около 60%, более чем или около 70%, более чем или около 80%, более чем или около 90%, более чем или около 95% или около 100%. Когда клетки достигли жизнеспособности, составляющей по меньшей мере около 90%, клетки можно дополнительно субкультивировать в среде без пуромицина, поскольку отбор был уже осуществлен. Типичный режим субкультивирования можно продолжать в течение от около 3 дней до около 4 дней. Субкультивированные клетки можно тестировать относительно успешной экспрессии рекомбинантного белка и можно клонировать с использованием подхода ограниченного разбавления, принтера единичной клетки (Cytena AG, Фрайбург, Германия) или с помощью обоих технологий. До около 1000 полученных клональным способом клеточных популяций можно увеличить и исследовать относительно продукции AAT.

[89] Один вариант осуществления изобретения может относиться к способу получения рекомбинантного белка AAT человека, в том числе его вариантов, включающему: a) введение экспрессионного вектора, содержащего фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок AAT человека, в том числе его варианты, в клетку-хозяина, чтобы выделить трансформант, т.е. рекомбинантную клетку, экспрессирующую рекомбинантный белок AAT человека, в том числе его варианты; b) культивирование клеток-хозяев с трансформантом, рекомбинантных клеток или экспрессионного вектора, содержащего фрагмент нуклеиновой кислоты, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует AAT, в условиях, которые делают возможной экспрессию рекомбинантного белка AAT человека; и c) выделение рекомбинантного белка AAT человека, в том числе его вариантов, из рекомбинантных клеток, получая таким образом рекомбинантный белок AAT человека или его варианты. Другой вариант осуществления способа, описанного в данном документе, может предусматривать фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую AAT человека, в том числе его варианты, т.е. кодон-оптимизированную для клеток CHO последовательность.

[90] В дополнительном варианте осуществления изобретения может быть предложена стадия введения способа, описанного в данном документе, включающая котрансфекцию экспрессионного вектора AAT человека или экспрессионного вектора, содержащего варианты AAT, и экспрессионного вектора, кодирующего транспозазу, при этом экспрессионный вектор транспозазы представляет собой хелперный или мобилизирующий вектор, который способствует включению гена, представляющего интерес, в геном по меньшей мере одной клетке-хозяина. Котрансфекция может приводить к доставке иссеченной плазмидой экспрессионной кассеты AAT в геном нерекомбинантных клеток-хозяев. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к транспозазе, которая, например, представляет собой транспозазу piggyBac, и мобилизирующему вектору, хелперному вектору или экспрессионному вектору, кодирующему, например, транспозазу piggyBac, при этом ген транспозазы вводят в клетку-хозяина или культуру клетки-хозяина и не вводят в геном клеток-хозяев. Экспрессионный вектор, кодирующий транспозазу, представляет собой «хелперный вектор» для введения представляющего интерес гена, т.е. в одном варианте осуществления изобретения, экспрессионной кассеты AAT, в геном клетки-хозяина. Другой вариант осуществления изобретения может представлять собой использование in-vitro синтезированного препарата мРНК, который кодирует транспозазу, вместо использования для транспозазы экспрессионного вектора.

[91] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к клетке-хозяину или популяции клеток-хозяев, которые представляют собой эукариотическую клетку или популяцию эукариотических клеток. В дополнительном варианте осуществления изобретения может быть предложена популяция нерекомбинантных клеток-хозяев, которая представляет собой клеточную линию яичника китайского хомячка (CHO). Другой вариант осуществления изобретения может относиться к клеточной линии CHO, при этом клетка CHO представляет собой рекомбинантную клеточную линию CHO. Клетка CHO или клеточная линия CHO может представлять собой клеточную линию CHO, которая была модифицирована, чтобы давать быстро растущие жизнеспособные или здоровые клетки с высокой плотностью, которые дают высокие выходы экспрессируемого белка. Эти модифицированные клетки CHO также можно легко масштабировать от мелкомасштабного получения до крупномасштабного производства.

[92] В дополнительном варианте осуществления изобретения нерекомбинантную и рекомбинантную клеточную линию CHO можно модифицировать, чтобы она быстро росла в культуральной среде, по существу не содержащей некоторых или каких-либо компонентов животного происхождения (т.е. в том числе компонентов, свойственных человеку, или компонентов от других животных) или по существу не содержащей некоторых или каких-либо компонентов, свойственных человеку, или компонентов от других животных, вызывающих иммунный ответ. В другом варианте осуществления изобретения предложены способы, описанные в данном документе, которые относятся к стадии культивирования рекомбинантных клеток CHO, которую осуществляют по существу без некоторых или каких-либо компонентов животного происхождения (т.е. человека или других животных). Стадию культивирования осуществляют в культуральной среде, при этом культуральная среда содержит менее чем около 5% (об./об.), менее чем около 4% (об./об.), менее чем около 3% (об./об.), менее чем около 2% (об./об.), менее чем около 1% (об./об.) каких-либо загрязняющих примесей, или не содержит или по существу не содержит загрязняющих примесей, при этом загрязняющие примеси могут включать компоненты животного происхождения, такие как, например, компоненты, полученные от человека и/или других животных, или любые компоненты животного происхождения, которые могут запускать иммунный ответ. Культуральная среда может содержать любые добавки, которые способствуют росту или увеличению количества измененных клеток-хозяев, в том числе, но не ограничиваясь этим, питательные добавки, аминокислоты и инсулин (например, рекомбинантный инсулин человека неживотного происхождения) в количестве, которое способствует экспрессии рекомбинантного белка, выделенного из клеток-хозяев, такого как, например, белка AAT человека.

[93] В другом варианте осуществления изобретения способ, описанный в данном документе, может относиться к стадии культивирования, которая вырабатывает или дает около 1 г/л или более, около 2 г/л или более, около 3 г/л или более, около 4 г/л или более, около 5 г/л или более, около 6 г/л или более, около 7 г/л или более, около 8 г/л или более, или около 10 г/л или более, или около 15 г/л или более рекомбинантного белка AAT человека, от около 1 г/л до около 10 г/л рекомбинантного белка AAT человека, от около 2 г/л до около 6 г/л рекомбинантного белка AAT человека, или от около 3 г/л до около 15 г/л рекомбинантного белка AAT человека, включая его варианты. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к стадии культивирования, которая дает от около 4 г/л до около 10 г/л рекомбинантного белка AAT человека, включая его варианты.

[94] В дополнительном варианте осуществления изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка AAT, включая его варианты, при этом стадия культивирования включает: отбор клетки-хозяина с фрагментом нуклеиновой кислоты, экспрессирующей белок AAT человека, причем отобранные клетки представляют собой полученные клональным способом клетки, экспрессирующие рекомбинантный белок AAT человека. Стадия отбора включает: a) выращивание или культивирование полученных клональным способом рекомбинантных клеток, экспрессирующих рекомбинантный белок AAT человека, в культуральной среде; b) введение в полученные клональным способом клетки, экспрессирующие рекомбинантный белок AAT человека, по меньшей мере одной питательной добавки; c) выдерживание культуральной среды при температуре культивирования клеток, достаточной для поддержания или стимулирования нормальных жизнеспособных клеток; d) изменение или уменьшение температуры культивирования клеток; e) выращивание или культивирование полученных клональным способом клеток при сниженной температуре культивирования клеток до экспрессии клетками рекомбинантного белка AAT, например рекомбинантного белка AAT человека, при титре около 1 г/л или более, около 2 г/л или более, около 3 г/л или более, около 4 г/л или более, около 5 г/л или более, около 6 г/л или более, около 8 г/л или более, или около 10 г/л или более, или около 15 г/л или более, или до того момента, когда полученные клональным способом клетки выращены в достаточной степени, чтобы экспрессировать рекомбинантный белок AAT человека, включая его варианты, при необходимом титре около 1 г/л или более. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к клеткам, которые экспрессируют рекомбинантный белок AAT человека при титре около или более чем около 2 г/л, около или более чем около 3 г/л, около или более чем около 4 г/л или около или более чем около 6 г/л, и в другом варианте осуществления изобретения достижению этих титров к или в 3 день, 5 день, 7 день, 10 день, 14 день или 17 день культивирования клеток. Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к клеткам-хозяевам, которые экспрессируют рекомбинантный белок AAT человека, включая его варианты, при титре около или более чем около 6 г/л в 17 день культивирования клеток. В дополнительном варианте осуществления изобретения температура культивирования клеток в процессе фазы продуцирования, т.е. культивирование клеток в биореакторах, которое заканчивается сбором клеток и культуральной среды, находится в диапазоне от около 35°C до около 38°C, или, например, около 37°C, в первые дни культивирования, или от 0 дня до 3 дня, или от 0 дня до 5 дня, или начиная от 0 дня культивирования клеток или используется взаимозаменяемо повсеместно в описании, где 0 день представляет собой первый день культивирования для продуцирования, или другой подходящий день или диапазон дней, которых достаточно для достижения необходимых уровней белков, кодируемых геном, представляющим интерес, в том числе, например, рекомбинантного белка AAT человека. Один вариант осуществления изобретения может относиться к смещенной, измененной или сниженной температуре культивирования клеток в диапазоне от около 25°C до около 34°C или, например, от около 31°C до около 33°C, около 31°C или около 33°C к, с или начиная с 3 дня или 5 дня культивирования клеток, или другой подходящий день или диапазон дней, которых достаточно для достижения необходимых уровней белков, кодируемых геном, представляющим интерес, в том числе, например, рекомбинантного белка AAT человека. Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к сниженной температуре культивирования клеток в диапазоне от около 31°C до около 33°C к, с или начиная с 3 дня или к, с или начиная с 5 дня культивирования клеток, или другой подходящий день или диапазон дней, которых достаточно для достижения необходимых уровней белков, кодируемых геном, представляющим интерес, в том числе, например, рекомбинантного белка AAT человека.

[95] В другом варианте осуществления изобретения стадия подпитки способов, описанных в данном документе, предусматривает по меньшей мере одну питательную добавку, выбранную из нейтральной питательной добавки, щелочной питательной добавки или другой питательной добавки, которой достаточно для поддержания или стимуляции нормальных жизнеспособных клеток для достижения необходимых уровней белка гена представляющего интерес, в том числе, например, рекомбинантного белка AAT человека. В дополнительном варианте осуществления изобретения предложена нейтральная питательная добавка, имеющая концентрацию в интервале от около 1% до около 10%, от около 1% до около 8%, от около 1% до около 6%, от около 1% до около 5% от общего объема клеточной культуры. Другой вариант осуществления изобретения может предусматривать по меньшей мере одну питательную добавку, содержащую щелочную питательную добавку. В дополнительном варианте осуществления изобретения щелочная питательная добавка может иметь концентрацию в интервале от около 0,1% до около 1%, от 0,1% до около 0,8%, от около 0,1% до около 0,6%, от около 0,1% до около 0,5% от общего объема клеточной культуры. Один вариант осуществления изобретения предусматривает по меньшей мере одну питательную добавку, содержащую нейтральную питательную добавку и щелочную питательную добавку. В дополнительном варианте осуществления изобретения предусмотрена питательная добавка, содержащая нейтральную питательную добавку и щелочную питательную добавку в количестве около одной пятнадцатой (1/15), одной десятой (1/10), около одной восьмой (1/8), около одной шестой (1/6), около одной пятой (1/5) от количества нейтральной питательной добавки в общем объеме клеточной культуры. В одном варианте осуществления изобретения стадию подпитки осуществляют каждый день или через день или в соответствии с любым другим режимом подпитки, который поддерживает или стимулирует нормальные жизнеспособные клетки достигать требуемых уровней белка гена представляющего интерес, в том числе, например, рекомбинантного белка AAT человека. В другом варианте осуществления изобретения подпитку осуществляют непрерывно с использованием контролируемых скоростей потока для нейтральной питательной добавки и/или щелочной питательной добавки.

[96] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к способам получения рекомбинантного белка AAT, при этом стадия культивирования во время фазы образования продукта включает осмолярность клеточной культуры в интервале от около 200 мОсм/кг до около 600 мОсм/кг, от около 250 мОсм/кг до около 400 мОсм/кг, от около 260 мОсм/кг до около 320 мОсм/кг, от около 450 мОсм/кг до около 600 мОсм/кг, около 500 мОсм/кг или выше, около 550 мОсм/кг или выше или любую подходящую осмолярность, которая поддерживает или стимулирует нормальные жизнеспособные клетки к достижению требуемых уровней белка представляющего интерес гена, в том числе, например, рекомбинантного белка AAT человека. В одном варианте осуществления изобретения осмолярность клеточной культуры может составлять около 550 мОсм/кг или выше к или в 5 день или позже или в любой другой подходящий день или диапазон дней, которых достаточно для достижения требуемых уровней белка, кодируемого представляющим интерес геном, в том числе, например, рекомбинантного белка AAT человека.

[97] В дополнительном варианте осуществления изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка AAT человека, включая его варианты, включающий: a) введение в клетку-хозяина или популяцию клеток-хозяев, например эукариотическую, первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT, и по меньшей мере дополнительной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу; b) культивирование клетки-хозяина или популяции клеток-хозяев в условиях, которые делают возможной экспрессию первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека, включая его варианты, при этом дополнительная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая, например, транспозазу, такая как, но не ограничиваясь этим, например, piggyBac, также может находиться в клеточной культуре и экспрессироваться, чтобы помочь включению гена, представляющего интерес, кодирующего, например, AAT человека, при этом клетку-хозяина изменяют с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей AAT человека; c) отбор клетки-хозяина с фрагментом нуклеиновой кислоты, экспрессирующим белок AAT человека, причем отобранные клетки представляют собой полученные клональным способом клетки, экспрессирующие рекомбинантный белок AAT человека; и d) выделение рекомбинантного белка AAT, включая его варианты, из клетки-хозяина или эукариотической клетки-хозяина, получая таким образом рекомбинантный белок AAT человека, при этом стадия выделения может включать очистку рекомбинантного белка AAT человека.

[98] В другом варианте осуществления изобретения может быть предусмотрена эукариотическая клетка-хозяин или популяция эукариотических клеток, модифицированные последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека. В другом варианте осуществления изобретения стадия введения включает совместную трансфекцию клетки-хозяина вектором, содержащим первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок AAT, включая его варианты, и вектором, содержащим дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу, такую как, но не ограничиваясь этим, piggyBac, Tol-2, «спящая красавица» (Sleeping Beauty), Leap-In и любую другую транспозазу типа «вырезать и вставить» или тому подобное. В дополнительном варианте осуществления стадии выделения может быть предложена стадия очистки необходимого рекомбинантного белка AAT. Стадию очистки можно выполнять по меньшей мере одним из, но не ограничиваясь ими, любым одним или несколькими методами из: аффинной хроматографии, в том числе, например, аффинной хроматографии по сродству к антителу или лиганду, эксклюзионной хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий, обратно-фазовой хроматографии, гель-фильтрации, разделения с помощью магнитных носителей, селективного осаждения, мембранного фильтрования или вытеснения в зависимости от молекулярной массы, замены буфера, фильтрации вирусов, pH-зависимой инактивации вирусов и тому подобного.

[99] Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к способу получения рекомбинантного белка AAT человека, включая его варианты, при этом способ включает стадию культивирования в культуральной среде, которая по существу не содержит компонентов животного происхождения (т.е. компонентов, полученных от людей или других животных) или белков, которые вызывают иммунный ответ, таких как, например, иммуноглобулины человека, человеческий сывороточный альбумин, белки других животных, иммуноглобулины других животных, сывороточный альбумин других животных, или любых других известных белков плазмы, которые могут рассматриваться как загрязняющая примесь. В дополнительном варианте осуществления изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка AAT человека, включая его варианты, при этом способ включает стадию культивирования в культуральной среде, которая содержит менее около 5% (об./об.) компонентов животного происхождения, менее около 4% (об./об.) компонентов животного происхождения, менее около 3% (об./об.) компонентов животного происхождения, менее около 2% (об./об.) компонентов животного происхождения, менее около 1% (об./об.) компонентов животного происхождения. Другой вариант осуществления изобретения относится к способу получения рекомбинантного белка AAT человека, включая его варианты, при этом способ включает стадию культивирования в культуральной среде, причем культуральная среда может содержать или не содержать рекомбинантный инсулин человека неживотного происхождения. В дополнительном варианте осуществления изобретения может быть предложен способ получения рекомбинантного белка AAT человека с чистотой около 95% или выше или около 98% или выше, при этом чистота рекомбинантного белка AAT человека может практически или по существу не содержать компонентов, которые обычно сопутствуют рекомбинантному белку AAT человека, используются для получения рекомбинантного белка AAT человека или являются продуктами деградации при получении рекомбинантного белка AAT человека. Загрязняющие компоненты могут представлять собой вещества, отличные от требуемого рекомбинантного белка AAT человека, или те обычно встречающиеся или присутствующие вещества, которые будут мешать исследовательскому, диагностическому или терапевтическому применениям белка, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковоподобные или небелковоподобные растворенные вещества. Чистоту рекомбинантного белка AAT человека можно определить с помощью любого признанного в данной области техники метода анализа (например, электрофорез в полиакриламидном геле, ВЭЖХ, гель, окрашенный серебром, и тому подобное). В общем, чистота рекомбинантного белка AAT человека означает, что чистота белка увеличилась, так что он существует в форме, которая чище, чем его природная окружающая среда и/или чем, когда он исходно получен и/или синтезирован. Чистота выделенного рекомбинантного белка AAT человека, как правило, может составлять около 60%, около 70%, около 80%, около 90%, около 95% или более чем около 90%, около 92%, около 94%, около 95%, около 96%, около 98% или около 100%.

КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ И ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА

[100] В одном варианте осуществления изобретения полученные клональным способом клеточные линии, содержащие требуемый рекомбинантный AAT, в том числе его варианты, можно культивировать в условиях высокой производительности. Например, полученные клональным способом клеточные линии, описанные в данном документе, включая, например, клеточные линии 30, 112 и 423, культивировали в различных условиях с использованием высокопроизводительной системы культивирования, при этом используя небольшие объемы (10 мл) культуры в пробирках для орбитального встряхивателя вместимостью 50 мл (например, пробирки для биореактора TPP® TubeSpin®, биореактор TubeSpin® 50, Тразадинген, Швейцария; или подобный продукт). Эти пробирки снабжены вентилируемыми крышками и их обычно встряхивают при 180 об/мин с радиусом смещения 50 мм в шейкере-инкубаторе с увлажнением и контролем CO₂ (шейкер Kuhner, Бирсфельден, Швецария). В одном варианте осуществления изобретения полученные клональным способом клеточные линии, содержащие полученные клональным способом клетки, можно культивировать в условиях высокой производительности, при этом жизнеспособность и рост клеток изучали при использовании различных композиций среды, композиции питательных добавок, режима добавления, объемов питательных добавок, сдвигов температуры и других условий процесса. В другом варианте осуществления изобретения полученные клональным способом клетки можно культивировать в условиях высокой производительности и обрабатывать в большем масштабе, причем понятно, что условия увеличения масштаба процесса от мелкомасштабного до крупномасштабного определены или по сути определены. Например, различные процедуры, пригодные для получения необходимого рекомбинантного AAT, в том числе его вариантов, можно найти на Фиг. 8, которая сравнивает использование различных подходов к введению питательных добавок, т.е. объемы питательных добавок, типы питательных добавок, режим добавления питательных добавок и т.д. и сдвиги температуры в периодическом процессе с подпиткой. Питательные добавки (7A и 7B; HyClone™ Cell Boost 7a, HyClone™ Cell Boost 7b, номера в каталоге SH31026.01 (RRG168030, SH31027.01)), показанные в примере, имеются в продаже, и приведены в объемах в процентах от общего эффективного объема клеточной культуры, и вводятся каждый день (ED) или через день (EOD). Каждое указанное условие культивирования выполнено трижды и над столбцами указаны погрешности в виде тонких линий. Вариант осуществления изобретения может относиться к титрам рекомбинантного AAT, в том числе его вариантов, полученным с помощью клеток, полученных клональным способом, в условиях процесса, таких как указанные на Фиг. 8, условия 1 и 3, так что титры AAT достигают более чем около 6 г/л к 17 дню. Например, полученная клональным способом клеточная линия 112 давала более чем 6 г/л в 17 день в условиях процесса 1 и 3.

[101] Еще один вариант осуществления изобретения может относиться к крупномасштабному культивированию клеток и оптимизации с использование биореактора. В одном варианте осуществления изобретения питательные добавки с определенным химическим составом, такие как питательная добавка, содержащая неорганические соли, аминокислоты и витамины (например, питательная добавка XLG A (питательная добавка A4CHO); ExcellGene S.A.; и т.д.), и питательная добавка, содержащая органические и другие полезные компоненты (например, питательная добавка XLG B (питательная добавка B4CHO); ExcellGene S.A. и т.д.), можно добавлять в биореактор в различные моменты времени в течение фазы образования продукта. Эти питательные добавки можно добавлять в одинаковых или различных объемах, т.е. доли рабочего объема биореактора, в котором образуется продукт. Специалист в данной области техники поймет, как модифицировать условия или количества процесса, чтобы получить определенное количество рекомбинантного AAT в большом количестве.

[102] В дополнительном варианте осуществления изобретения предложен способ получения рекомбинантного AAT, включающий культивирование или рост полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT; подпитку полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT по меньшей мере одной питательной добавкой, при этом подпитку осуществляют непрерывно или периодически, причем подпитку можно осуществлять с использованием контролируемых объемных скоростей потока; поддержание температуры клеточной культуры; сдвиг поддерживаемой температуры клеточной культуры до измененной температуры клеточной культуры; выращивание клеток при сниженной температуре клеточной культуры, пока клетки не станут экспрессировать рекомбинантный AAT с титром более чем около 1 г/л, более чем около 2 г/л, более чем около 3 г/л, более чем около 4 г/л, более чем около 5 г/л, более чем около 6 г/л, более чем около 7 г/л, более чем около 8 г/л, более чем около 9 г/л или более чем около 10 г/л; или по меньшей мере около 1,5 г/л, по меньшей мере около 2,5 г/л, по меньшей мере около 3,5 г/л, по меньшей мере около 4,5 г/л, по меньшей мере около 5,5 г/л, по меньшей мере около 6,5 г/л, по меньшей мере около 7,5 г/л, по меньшей мере около 8,5 г/л, по меньшей мере около 9,5 г/л или по меньшей мере около 10,5 г/л; или в интервале от около 1 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 2 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 3 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 4 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 5 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 6 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 7 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 8 г/л до около 10 г/л или в интервале от около 9 г/л до около 10 г/л. В дополнительном варианте осуществления изобретения полученные клональным способом клетки подпитывают каждый день. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к подпитке полученных клональным способом клеток через день. Дополнительный вариант осуществления может относиться к подпитке полученных клональным способом клеток каждые 3 дня или к любому другому режиму подпитки, который положительно влияет на состояние клеток и таким образом повышает титр конечного собранного продукта рекомбинантного AAT.

[103] Один вариант осуществления изобретения может относиться к выращиванию полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT в течение количества дней, достаточного для достижения титра рекомбинантного AAT более чем около 1 г/л, более чем около 2 г/л, более чем около 3 г/л, более чем около 4 г/л, более чем около 5 г/л, более чем около 6 г/л, более чем около 7 г/л, более чем около 8 г/л, более чем около 9 г/л или более чем около 10 г/л; или по меньшей мере около 1,5 г/л, по меньшей мере около 2,5 г/л, по меньшей мере около 3,5 г/л, по меньшей мере около 4,5 г/л, по меньшей мере около 5,5 г/л, по меньшей мере около 6,5 г/л, по меньшей мере около 7,5 г/л, по меньшей мере около 8,5 г/л, по меньшей мере около 9,5 г/л или по меньшей мере около 10,5 г/л; или в интервале от около 1 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 2 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 3 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 4 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 5 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 6 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 7 г/л до около 10 г/л, в интервале от около 8 г/л до около 10 г/л или в интервале от около 9 г/л до около 10 г/л. Количество дней, достаточное для получения титра рекомбинантного AAT выше около 1 г/л, может находиться в интервале от 7 дней до 21 дня, или количество дней может составлять по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере 11 дней, по меньшей мере 14 дней, по меньшей мере 17 дней или по меньшей мере 21 день.

[104] В дополнительном варианте осуществления изобретения температура клеточной культуры в течение фазы образования продукта может поддерживаться в интервале температур от около 35°C до около 38°C, в том числе, но не ограничиваясь этим, при около 35°C, при около 36°C, при около 37°C, при около 38°C или менее чем около 39°C. Другой вариант осуществления может относиться к измененной температуре клеточной культуры в интервале от около 24°C до около 34°C, или к любым температурам между ними, в том числе, но не ограничиваясь этим, при около 24°C, при около 25°C, при около 26°C, при около 27°C, при около 28°C, при около 29°C, при около 30°C, при около 31°C, при около 32°C, при около 33°C или при около 34°C. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к температуре клеточной культуры, которую поддерживают при около 37°C в течение первых 2 дней или первых 3 дней или в определенные моменты 3 дня. Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к сниженной температуре клеточной культуры, составляющей около 33°C, около 32°C, около 31°C, около 30°C, около 29°C, около 28°C, около 27°C, около 26°C, около 25°C или от около 24°C до около 25°C, при этом снижение температуры клеточной культуры осуществляют на 3 день или в определенный момент 3 дня. Кроме того, дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к снижению температуры клеточной культуры до около 31 °C, осуществляемому в 5 день или определенный момент 5 дня. В другом варианте осуществления изобретения снижение температуры клеточной культуры включает более одного снижения температуры клеточной культуры, при этом первое снижение температуры клеточной культуры до около 33 °C, около 32°C, около 31°C, около 30°C, около 29°C, около 28°C, около 27°C, около 26°C, около 25°C или от около 24°C до около 25°C происходит в 3 день или определенный момент 3 дня, а второе снижение температуры клеточной культуры происходит в 5 день или определенный момент 5 дня на от около 2°C до около 3°C ниже относительно ранее применяемой температуры после первого изменения температуры. Также подразумевается, что изменение температуры можно осуществлять в альтернативные дни, отличные от упомянутых в данном документе, при условии что полученные клональным способом клетки, экспрессирующие рекомбинантный AAT, являются жизнеспособными, т.е. не высохшими или мертвыми.

[105] В другом варианте осуществления изобретения клеточную культуру во время фазы образования продукта, содержащую клетки-хозяева с включенным rAAT, описанным в данном документе, можно поддерживать так, что она будет иметь осмолярность в интервале от около 200 мОсм/кг до около 600 мОсм/кг, от около 250 мОсм/кг до около 400 мОсм/кг, от около 260 мОсм/кг до около 320 мОсм/кг, от около 450 мОсм/кг до около 600 мОсм/кг, около 500 мОсм/кг или выше, около 550 мОсм/кг или выше или любую подходящую осмолярность, которая поддерживает или стимулирует нормальные жизнеспособные клетки к достижению требуемых уровней белка представляющего интерес гена, в том числе, например, рекомбинантного белка AAT человека. Также предполагается изменение осмолярности культуры в течение указанных дней, поскольку осмолярность увеличивается в клеточной культуре со временем, а питательные вещества в периодических культурах с подпиткой также увеличивают осмолярность. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к повышению осмолярности клеточной культуры до около 550 мОсм/кг или выше к или в 5 день или позже или в любой подходящий день, который дает возможность нормальным жизнеспособным клеткам достичь требуемых уровней белка представляющего интерес гена, в том числе, например, рекомбинантного белка AAT человека, как описано в данном документе.

[106] Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к питательной добавке, в которой не содержится компонентов животного происхождения или с химически определенным составом, оптимизированной для получения белков с высоким выходом, в том числе, но не ограничиваясь этим, в периодических процессах с подпиткой, не содержащей факторов роста, пептидов, полученных из тканей животных, гидролизатов, полученных из тканей животных, фенолового красного или 2-меркаптоэтанола. В другом варианте осуществления изобретения питательная добавка может иметь нейтральное или близкое к нейтральному рН, т.е. нейтральная питательная добавка, при этом нейтральная питательная добавка может в некоторых вариантах осуществления изобретения содержать аминокислоты, витамины, соли и глюкозу. В дополнительном варианте осуществления изобретения питательная добавка может иметь химически определенный состав или может содержать компоненты неживотного происхождения, такие как гидролизаты семян растений, полученные из некоторых зерновых культур (пшеница), из некоторых бобовых или гороха (соевый боб) и тому подобного. В дополнительном варианте осуществления изобретения питательная добавка может иметь щелочное pH, т.е. щелочная питательная добавка, при этом щелочная питательная добавка может в некоторых вариантах осуществления изобретения содержать концентрированный раствор аминокислот. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к подпитке полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT, комбинацией питательных добавок, при этом комбинация питательных добавок может содержать нейтральную питательную добавку и щелочную питательную добавку, которые вводят одновременно, по существу одновременно, последовательно или по существу последовательно. Более того, подпитку клеточной культуры добавками, включая, но не ограничиваясь этим, питательные добавки, нутриенты, аминокислоты и тому подобное, можно осуществлять непрерывно или периодически, при этом подпитку можно осуществлять с использованием контролируемых скоростей потока и по графику, включающему введение по меньшей мере одной питательной добавки каждый день или через день, или по любому другому графику подпитки, который поддерживает или стимулирует нормальные жизнеспособные клетки к достижению требуемых уровней белка гена, представляющего интерес, включая, например, рекомбинантный белок AAT человека.

[107] Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к комбинации питательных добавок, при этом нейтральная питательная добавка имеет концентрацию в интервале от около 1% до около 8% от общего объема клеточной культуры или любые проценты между ними, в том числе, но не ограничиваясь этим, около 1,8%, около 3,6% или около 7,1%; а щелочная питательная добавка имеет концентрацию в интервале от около 0,1% до около 0,8% от общего объема клеточной культуры или любые проценты между ними, в том числе, но не ограничиваясь этим, около 0,18%, около 0,36% или около 0,71%. Другой вариант осуществления изобретения относится к концентрациям питательной добавки, при этом количество щелочной питательной добавки составляет одну десятую (1/10) от количества нейтральной питательной добавки. Например, процентная доля нейтральной питательной добавки находится в диапазоне от около 1,8% до около 7,1%, а процентная доля щелочной питательной добавки находится в диапазоне от около 0,18% до около 0,71%, т.е. одна десятая от процентной доли нейтральной питательной добавки, при этом процентные доли питательных добавок относятся к общему объему клеточной культуры, который может включать по меньшей мере одно из следующего: клетки, культуральная среда, питательные добавки и любые другие нутриенты или добавки для культивирования клеток, чтобы поддерживать или продуцировать нормальные жизнеспособные клетки для достижения требуемых уровней белка гена, представляющего интерес, в том числе, например, рекомбинантного белка AAT человека.

[108] В одном варианте осуществления изобретения способ получения рекомбинантного AAT может относиться к: выращиванию полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT; подпитке полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT питательной добавкой, содержащей: нейтральную питательную добавку, такую как, например, питательная добавка 7A (HyClone™ Cell Boost 7a), и щелочную питательную добавку, такую как, например, питательная добавка 7B (HyClone™ Cell Boost 7b), через день; поддержание температуры культивирования 37°C от 0 дня до 3 дня, в том числе определенного момента 3 дня, т.е. от более чем 0 часов (день 0) до 72 часов, 78 часов или 84 часов или любого момента времени между представленными часами (день 3); изменение температуры культивирования до 33°C в 3 день, когда закончится указанное ранее время первого температурного режима, очистку рекомбинантного AAT от клеток; и сбор очищенного рекомбинантного AAT. В одном варианте осуществления изобретения концентрация нейтральной питательной добавки составляет около 7,1 % от общего объема клеточной культуры, а концентрация щелочной питательной добавки составляет около 0,71% от общего объема клеточной культуры. Вариант осуществления изобретения может относиться к подпитке питательной добавкой, содержащей комбинацию нейтральной питательной добавки и щелочной питательной добавки, при этом питательную добавку вводят в полученные клональным способом клетки, экспрессирующие рекомбинантный AAT, через день, при этом температуру культивирования клеток поддерживают при около 37 °C от 0 дня до 3 дня или определенного момента 3 дня, а сниженная температура культивирования клеток составляет около 33 °C начиная с 3 дня или определенного момента 3 дня. В другом варианте осуществления изобретения в добавок к режиму подпитки, описанному в данном документе, представлена среда, используемая для выращивания полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT, при этом среда обеспечивает дополнительные нутриенты, аминокислоты, металлы и тому подобное, которые улучшают условия культивирования клеток, и может включать, например, среду с химически определенным составом, такую как XLG_E21_07 (ExcellGene SA). Дополнительные варианты осуществления изобретения могут включать среду XLG_E21_07 путем модификации концентрации нескольких компонентов, например, увеличения концентрации глюкозы, цинка, аспарагина, глутаминовой кислоты и фосфата, просто, например, за счет добавления исходных растворов с более высокими концентрациями в небольших объемах для регулирования. Концентрации этих иллюстративных пяти компонентов можно модифицировать в соответствии со следующими диапазонами, представленными в Таблице 2:

Таблица 2 КОМПОНЕНТ КОНЦЕНТРАЦИЯ ОТ КОНЦЕНТРАЦИЯ ДО Глюкоза около 2 г/л около 30 г/л Цинк около 0,1 мг/л около 10 мг/л Аспарагин около 500 мг/л около 7000 мг/л Глутаминовая кислота около 100 мг/л около 3000 мг/л Фосфат около 100 мг/л около 3000 мг/л

[109] Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к способу получения рекомбинантного AAT, включающему: культивирование или выращивание полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT; подпитку полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT, по меньшей мере одной питательной добавкой, в том числе, но не ограничиваясь этим: нейтральной питательной добавкой, такой как, например, питательная добавка HyClone™ Cell Boost 7A, и щелочной питательной добавкой, такой как, например, питательная добавка HyClone™ Cell Boost 7B, каждый день, при этом щелочная питательная добавка присутствует в количестве, составляющем около 1/10 от количества нейтральной питательной добавки, и количество (об./об.) питательных добавок основано на общем объеме клеточной культуры; поддержание температуры культуры 37°C от 0 дня до 3 дня, причем посев свежих клеток в сосуд для получения продукта из биореактора «N-1» (биореактор для предварительного культивирования или выращивания посевного материала) определяют как начало 0 дня, а затем изменение температуры культивирования до 33°C в 3 день (т.е. 72 часа после начала выработки культуры); очищение рекомбинантного AAT, который был экспрессирован клетками; и сбор очищенного рекомбинантного AAT. В одном варианте осуществления изобретения концентрация нейтральной питательной добавки составляет около 3,6 % от общего объема клеточной культуры, а концентрация щелочной питательной добавки составляет около 0,36% от общего объема клеточной культуры. Вариант осуществления изобретения может относиться к подпитке питательной добавкой, содержащей комбинацию нейтральной питательной добавки и щелочной питательной добавки, при этом питательную добавку вводят в полученные клональным способом клетки, экспрессирующие рекомбинантный AAT, каждый день, при этом температуру культивирования клеток поддерживают при около 37°C от 0 дня до 3 дня или определенного момента 3 дня, а сниженная температура культивирования клеток составляет около 33°C начиная с 3 дня или определенного момента 3 дня. Питательная добавка, как отдельно, так и в комбинации, которую можно использовать в способах и процессах, описанных в данном документе, включает, но не ограничивается этим, те, которые представлены в таблице питательных добавок, Таблице 3.

Таблица 3 ПИТАТЕЛЬНАЯ ДОБАВКА ПРОИЗВОДИТЕЛЬ № В КАТАЛОГЕ HyClone™ Cell Boost 7a HyClone™ SH31026.01 (RRG168030) HyClone™ Cell Boost 7b HyClone™ SH31027.01 Питательная добавка-210 Cellvento™ Merck Millipore 1.02488.0005 Питательная добавка-220 Cellvento™ Merck Millipore 1.02578.0003 Питательная добавка-200 Cellvento™ Merck Millipore 1.01883.0003 Питательная добавка 4 Cellvento™ Merck Millipore 1.03796.0005 L-цистеин + L-тирозин (питательная добавка B) Merck Millipore 1.02735.0100 Питательная добавка 1 BalanCD CHO Irvine 91127 Питательная добавка 2 BalanCD CHO Irvine 91129 Питательная добавка 3 BalanCD CHO Irvine 99471 Питательная добавка 4 BalanCD CHO Irvine 94134 Efficient Feed ™ A + AGT (3X) Thermo Fisher A25023-04 Efficient Feed ™ B + AGT (3X) Thermo Fisher A25030-04 Efficient Feed ™ C + AGT (2X) Thermo Fisher A25031-04 PowerFeed A Sartorius BE 02-044Q CHO Xtreme Feed ™ Sartorius BE02-056Q PowerFeed дополненная Sartorius ° Питательная добавка 1 Ex-Cell CHO дополненная (с глюкозой) Sigma 24367-1L Питательная добавка Ex-Cell CHOZN Sigma 24331C-10L Гидролизат EX-Cell ™ Sigma 24700C-100G Cell Boost TM 1 (R05.2) GE SH30584.02 Cell Boost TM 2 (R15.4) GE SH30596.01 Cell Boost TM 3 (JM 3.5) GE SH30825.01 Cell Boost TM 4 (PS307) GE SH30857.01 Cell Boost TM 5 (CN-F) GE SH30865.01 Cell Boost TM 6 (CN-T) GE SH30866.01 Питательная добавка A4CHO (CDM) ExcellGene SA Питательная добавка B4CHO (CDM) ExcellGene SA Питательная добавка 3CHO (ACF) ExcellGene SA

[110] В другом варианте осуществления изобретения в добавок к режиму подпитки, описанному в данном документе, представлены среды, используемые для выращивания полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT, при этом среда может не содержать каких-либо компонентов, полученных от животных, таких как, но не ограничиваясь этим, фетальная бычья сыворотка (ФБС), например среда с химически определенным составом, такая как среда XLG_E21_07 (ExcellGene SA). Неограничивающие примеры среды, как отдельно, так и в комбинации, пригодные в способах и процессах получения рекомбинантного AAT, описанного в данном документе, включают также те, которые представлены в таблице сред, где указаны среды с определенным составом (CD) и не содержащие животных компонентов (ACF), т.е. Таблица 4.

Таблица 4 СРЕДА CD / ACF ПРОИЗВОДИТЕЛЬ № В КАТАЛОГЕ Среда CD CHO (1x), жидкая CD GIBCO (Invitrogen) 10743-011 CD FortiCHO CD GIBCO (Invitrogen) A11483-01 Среда CD OptiCHO™ CD GIBCO (Invitrogen) 12681-029 HyClone™ CDM4 PERMAb CD HyClone™ (GE Healthcare) SH30871.02 HyClone™ CDM4CHO CD HyClone™ (GE Healthcare) SH30558.02 HyClone™ CDM4MAb CD HyClone™ (GE Healthcare) SH30802.02 EX-CELL™ CD CHO со слиянием CD SAFC Biosc (SIGMA) 14365C ActiPro CD HyClone™ (GE Healthcare) SH31039.02 CD 293 CD GIBCO (Invitrogen) 11913-01 PowerCHO1 CD CD Lonza 12-770Q PowerCHO2 CD CD Lonza BE12-771Q PowerCHO3 CD CD Lonza 12-772Q ProNSO 1 CD Lonza 12-773 Q ProNSO 2 CD CD Lonza 12-774Q POWER CHO дополненная CD Lonza 12-927Q Среда CD DG 44 CD GIBCO (Invitrogen) 12610-010 Среда PeproGrow CD-CHO CD PEPROTECH AF-CD-CHO Среда EX-CELL™ CD CHO3 CD SAFC Biosc (SIGMA) C1490-1L Среда для периодического культивирования с подпиткой EX-CELL™ Advanced ™ CHO CD SAFC Biosciences (SIGMA) 14366C-1000 ML IS CHO CD XP CD Irvine 91120 BalanCD™ CHO GROWTH A CD Irvine 91128 Среда EX-CELL™ CHOZN Platform CD SAFC Biosci (SIGMA) 14330C-1L Среда Hycell CHO CD HyClone™ (GE Healthcare) SH30934.01 Среда Dynamis™ CD GiBCO (Invitrogen) A26615-01 Cellvento™ CHO-100 CD Merck Millipore 1.00899.0010 Cellvento™ CHO-200 CD Merck Millipore 1.01885.0010 Cellvento™ CHO-210 CD Merck Millipore 1.02485.0010 Cellvento™ CHO-220 CD Merck Millipore 1.02680.0500 Pro293s-CDM CD Lonza BE02-025Q Гибридома CD CD GIBCO (Invitrogen) 11279-023 Пригодная для гибридомы среда EX-CELL™ CD CD SAFC Biosciences (SIGMA) H4409-1L CHOMACS CD CD Miltenyi Biotec GmbH 170-077-001 Полная SHEFF-CHO CD CD Kerry S-870392 ASF CHO 3.2 CD AJINOMOTO EX-CELL™ 620-HSF, пригодная для гибридомы ACF SAFC Biosc (SIGMA) 14621C Среда EX-CELL™ ACF CHO ACF SAFC Bios (SIGMA) C5467 Среда EX-CELL™ CHO DHFR без компонентов животного происхождения ACF SAFC Biosc(SIGMA) C8862 EX-CELL™ 325 PF CHO ACF SAFC Biosc(SIGMA) 14340C EX-CELL™ 302 SF для CHO ACF SAFC Biosc(SIGMA) 14324C Среда для экспрессии аденовируса (AEM) ACF GIBCO (Invitrogen) 12582-011 FreeStyle CHO для экспрессии ACF GIBCO (Invitrogen) 12651-014 Гибридома-SFM без сыворотки ACF GIBCO (Invitrogen) 12045-084 Среда для экспрессии белка (PEM) ACF GIBCO (Invitrogen) 12661-013 HyQ ADCF MAB ACF HyClone™ (Socochim) SH 30349.02 ProCHO5 ACF Lonza 4SP144 PowerCHO -GS ACF Lonza BE12-776Q EX-CELL™ 293 ACF SAFC Biosc (SIGMA) 14571C Среда EX-CELL™ CHO5 ACF SAFC Biosc(SIGMA) C0363-1L EX-CELL™ GTM-3 ACF ACF SAFC Biosc(SIGMA) G9916 FreeStyle™ 293 для экспрессии ACF GIBCO (Invitrogen) 12338-018

[111] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к применению различных сред и/или композиций питательных добавок и любой их пригодной комбинации, а также комбинаций сред и комбинаций питательных добавок с любым другим условием процесса, в том числе, но не ограничиваясь этим, некоторые определенные величины pH, уровень кислорода и/или режим барботирования кислородом (обеспечения газом) (кислород и/или воздух, с или без подвода азота и/или CO2 одновременно), температура и осмолярность, которая может приводить к повышению объемной производительности рекомбинантного AAT в клеточной культуре до титра более чем или равного около 6 г/л, более чем или равного около 8 г/л или более чем или равного около 10 г/л.

[112] Вкратце, величина pH из условий культивирования во время фазы получения продукта может находиться в интервале от около pH 6,25 до около pH 7,5; от около pH 6,5 до около pH 7,3; от около pH 6,7 до около pH 7,3; от около pH 6,7 до около pH 7,1; от около pH 6,8 до около pH 7; более чем или равная около pH 6,5; более чем или равная около pH 6,7; более чем или равная около pH 6,8; менее чем или равная около pH 7,5; менее чем или равная около pH 7,3; менее чем или равная около pH 7,1; или менее чем или равная около pH 7. Уровень кислорода и/или режим барботирования из условий культивирования может находиться в интервале от около 20% кислорода относительно насыщения воздухом до около 60% кислорода относительно насыщения воздухом; от около 25% кислорода относительно насыщения воздухом до около 55% кислорода относительно насыщения воздухом; от около 20% кислорода относительно насыщения воздухом до около 60% кислорода относительно насыщения воздухом; более чем или равный около 20% кислорода относительно насыщения воздухом; более чем или равный около 25% кислорода относительно насыщения воздухом; более чем или равный около 30% кислорода относительно насыщения воздухом; более чем или равный около 35% кислорода относительно насыщения воздухом; более чем или равный около 40% кислорода относительно насыщения воздухом; более чем или равный около 45% кислорода относительно насыщения воздухом; более чем или равный около 50% кислорода относительно насыщения воздухом; более чем или равный около 55% кислорода относительно насыщения воздухом; менее чем или равный около 60% кислорода относительно насыщения воздухом; менее чем или равный около 55% кислорода относительно насыщения воздухом; менее чем или равный около 50% кислорода относительно насыщения воздухом; менее чем или равный около 45% кислорода относительно насыщения воздухом; менее чем или равный около 40% кислорода относительно насыщения воздухом; менее чем или равный около 35% кислорода относительно насыщения воздухом; менее чем или равный около 30% кислорода относительно насыщения воздухом; или менее чем или равный около 25% кислорода относительно насыщения воздухом. Температура из условий культивирования также может находиться в интервале от около 26°C до около 38°C; от около 28°C до около 38°C; от около 29°C до около 37°C; от около 31°C до около 37°C; от около 34°C до около 37°C; от около 31°C до около 33°C; более чем или равна около 26 °C; более чем или равна около 28°C; более чем или равна около 31°C; более чем или равна около 33 °C; более чем или равна около 34°C; более чем или равна около 37°C; менее чем или равна около 38°C; менее чем или равна около 37°C; менее чем или равна около 36°C; менее чем или равна около 34°C; менее чем или равна около 33°C; или менее чем или равна около 31°C.

[113] В одном варианте осуществления изобретения титры рекомбинантного AAT в клеточной культуре могут составлять: по меньшей мере около 1 г/л, по меньшей мере около 3 г/л, по меньшей мере около 4 г/л, по меньшей мере около 6 г/л, по меньшей мере около 8 г/л и по меньшей мере около 10 г/л; около 3 г/л, около 4 г/л, около 5 г/л, около 6 г/л, около 7 г/л, около 8 г/л, около 9 г/л и около 10 г/л; более чем или равный 1 г/л, более чем или равный около 2 г/л, более чем или равный около 2,5 г/л, более чем или равный около 3,5 г/л, более чем или равный около 4,5 г/л, более чем или равный около 5,5 г/л, более чем или равный около 6,5 г/л, более чем или равный около 7,5 г/л, более чем или равный около 8,5 г/л, более чем или равный около 9,5 г/л и более чем или равный около 10,5 г/л.

[114] Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к способу получения рекомбинантного AAT, при этом рекомбинантный AAT может иметь большое количество концевых сиаловых кислот, так что время полувыведения рекомбинантного AAT в кровотоке можно увеличить у субъекта, который получил дозу рекомбинантного AAT.

[115] В одном варианте осуществления изобретения способ получения рекомбинантного белка AAT человека включает культивирование клетки-хозяина с первой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека и по меньшей мере второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу, причем стадию культивирования осуществляют в первый период времени при первой температуре и во второй период времени при второй температуре и необязательно в третий период времени при третьей температуре. В другом варианте осуществления способа может быть предусмотрено, что вторая температура ниже первой температуры (например, ниже по меньшей мере на: около 1°C, около 2°C, около 3°C, около 4°C, около 5°C, около 6°C, около 8°C, около 10°C и т.д.). В дополнительном варианте осуществления способа может быть предусмотрено, что третья температура ниже или второй температуры, или первой температуры (например, ниже по меньшей мере на: около 1°C, около 2°C, около 3°C, около 4°C, около 5°C, около 6°C, около 8°C, около 10 °C и т.д.). В другом варианте осуществления способа может быть предусмотрено, что первая температура, вторая температура и/или третья температура выше комнатной температуры (например, около 15°C, около 20°C, около 21°C, около 22°C, около 23°C, около 24°C, около 25°C и т.д.). В другом варианте осуществления изобретения первый период культивирования может составлять по меньшей мере около 1 дня, около 2 дней, около 3 дней, около 4 дней, около 5 дней, около 6 дней, около 10 дней, около 15 дней, около 1-2 дней, около 1-3 дней, около 1-4 дней, около 1-5 дней, около 1-7 дней, около 1-10 дней, около 1-15 дней, около 1-16 дней, около 1-17 дней, около 1-18 дней, около 1-20 дней и т.д. В дополнительном варианте осуществления изобретения предложен второй период культивирования, при этом второй период может составлять по меньшей мере около 1 дня, около 2 дней, около 3 дней, около 4 дней, около 5 дней, около 6 дней, около 10 дней, около 15 дней, около 1-2 дней, около 1-3 дней, около 1-4 дней, около 1-5 дней, около 1-7 дней, около 1-10 дней, около 1-15 дней, около 1-16 дней, около 1-17 дней, около 1-18 дней, около 1-20 дней и т.д. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к третьему периоду культивирования, при этом третий период может составлять по меньшей мере около 1 дня, около 2 дней, около 3 дней, около 4 дней, около 5 дней, около 6 дней, около 10 дней, около 15 дней, около 1-2 дней, около 1-3 дней, около 1-4 дней, около 1-5 дней, около 1-7 дней, около 1-10 дней, около 1-15 дней, около 1-16 дней, около 1-17 дней, около 1-18 дней, около 1-20 дней и т.д. Дополнительный вариант осуществления может относиться к первому периоду, включающему около 1-20 дней, около 1-18 дней, около 1-17 дней, около 1-16 дней, около 1-15 дней, около 1-10 дней, около 1-6 дней, около 1-5 дней, около 1-4 дней, около 1-3 дней или около 1-2 дней; второму периоду, включающему около 1-20 дней, около 1-18 дней, около 1-17 дней, около 1-16 дней, около 1-15 дней, около 1-10 дней, около 1-6 дней, около 1-5 дней, около 1-4 дней, около 1-3 дней или около 1-2 дней; и необязательно третьему периоду, включающему около 1-20 дней, около 1-18 дней, около 1-17 дней, около 1-16 дней, около 1-15 дней, около 1-10 дней, около 1-6 дней, около 1-5 дней, около 1-4 дней, около 1-3 дней или около 1-2 дней.

[116] В дополнительном варианте осуществления изобретения может быть предложен способ получения рекомбинантного белка AAT человека, включающий культивирование клетки-хозяина с первой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека, и использование в первой фазе получения клетки-хозяина по меньшей мере второй последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу, при этом стадию культивирования осуществляют в первый период времени при первой температуре и во второй период времени при второй температуре, причем первую питательную добавку и вторую питательную добавку вводят через день или каждый день, первый период времени включает около 1-10 дней, около 1-6 дней, около 1-5 дней, около 1-4 дней, около 1-3 дней, около 1-2 дней при первой температуре в интервале от около 31°C до около 37°C, от около 33°C до около 37°C, а второй период времени включает около 1-20 дней, около 1-18 дней, около 1-17 дней, около 1-15 дней, около 1-10 дней, около 1-8 дней, около 1-7 дней, около 1-6 дней, около 1-5 дней, около 1-4 дней, около 1-3 дней, около 1-2 дней при второй температуре в интервале от около 31°C до около 37°C, от около 33°C до около 37°C, и если способ включает третий период времени при третьей температуре, указанный третий период времени включает около 1-20 дней, около 1-18 дней, около 1-17 дней, около 1-15 дней, около 1-10 дней, около 1-8 дней, около 1-7 дней, около 1-6 дней, около 1-5 дней, около 1-4 дней, около 1-3 дней, около 1-2 дней при третьей температуре в интервале от около 31°C до около 37°C, от около 33°C до около 37°C.

[117] Таким образом, одним решением проблемы недостаточного объема полученного из плазмы AAT было обозначенное в вариантах осуществления получение очень высоких выходов от рекомбинантных клеток млекопитающих, экспрессирующих рекомбинантный AAT. В вариантах осуществления изобретения были использованы условия процесса, обеспечивающие рост и продуктивность, принимая во внимание различный физиологический метаболизм полученных клональным способом популяций клеток, и были идентифицированы среды и композиции питательных добавок, которые поддерживают полезные фенотипы клеток для производства белков в биореакторах.

ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ И АКТИВНОСТЬ ПРОДУКТА AAT

[118] Рекомбинантный AAT очищали от собранной жидкости клеточной культуры с помощью 2-стадийной хроматографической методики с последующим анализом с помощью эксклюзионной хроматографии. Основной пик на Фиг. 9 иллюстрирует фракцию очищенного рекомбинантного AAT, которая элюируется при от около 12 минуты до около 14 минуты. Выполняли аналитическую ВЭЖХ, чтобы получить характеристики гликозилирования рекомбинантного AAT, полученного в одном из ранних циклов продуцирования (Фиг. 9). Также выполняли аналитическое ИЭФ с материалами, полученными при различных условиях процесса, чтобы выяснить, как такие условия процесса будут влиять на общее структурное представление гликозилирования AAT (данные не показаны). Сравнение между полученным из плазмы AAT и рекомбинантным AAT, полученным с помощью клеток CHO, касается окисленных метионинов. AAT дикого типа содержит 8 метионинов, которые могут представлять собой мишени окисления. В частности, сообщалось, что метионин 358 и метионин 351 являются подверженными окислению, и при окислении метионины, по видимому, обладают сильным влиянием на AAT, снижая его способность ингибировать эластазу и отвечать за провоспалительный ответ (Li Z, et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297(2):L388-400, 2009). Следовательно, окисление некоторых метиониновых остатков в AAT может приводить к снижению способности ингибировать нейтрофил-эластазу, таким образом давая вклад в патогенез заболеваний или патологических состояний, при которых наблюдается дефицит AAT. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения используются такие условия в биореакторе в фазе получения продукта, которые минимизируют окисление метионина, и таким образом активный гликозилированный рекомбинантный белок AAT или вариант рекомбинантного белка AAT могут содержать менее 8 метиониновых мишеней окисления, менее 6 метиониновых мишеней окисления, менее 4 метиониновых мишеней окисления, менее 3 метиониновых мишеней окисления, или вариант рекомбинантного белка AAT содержит менее 7 способных окисляться метионинов, менее 5 способных окисляться метионинов, менее 3 способных окисляться метионинов или менее 1 способного окисляться метионина. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к активному рекомбинантному AAT, содержащему меньше способных окисляться метионинов, чем полученный из плазмы AAT, или в котором уровень способных окисляться метионинов в полученном из плазмы AAT выше чем в рекомбинантном AAT, полученном в модифицированных клетках CHO, описанных в данном документе. Такой вариант осуществления изобретения может включать снабжение клеток в культуре кислородом, не используя при этом чистый газообразный кислород, а используя только очищенный воздух во время фазы получения клеточной культуры.

[119] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к рекомбинантному белку AAT человека, в том числе его вариантам, которые могут иметь преимущества по сравнению с белком AAT человека дикого типа. В одном варианте осуществления изобретения может быть предложен рекомбинантный белок AAT человека, содержащий полипептидную последовательность, которая на около 80%, около 85%, около 90% или около 95% идентична SEQ ID №:1. Рекомбинантный белок AAT по варианту осуществления может содержать последовательность, имеющую по меньшей мере одну мутацию в положении 51, 351 или 358 последовательности AAT дикого типа (SEQ ID №:1). В дополнительном варианте осуществления изобретения может быть предложен рекомбинантный белок AAT человека, содержащий полипептидную последовательность, имеющую мутацию в SEQ ID №:1, причем мутация включает по меньшей мере одну из: фенилаланин на лейцин в положении 51 (F51L), замена метионина на валин в положении 351 (M351V) или замена метионина на валин в положении 358 (M358V). Например, рекомбинантный белок AAT человека, в том числе его варианты, может иметь единичную мутацию, замену фенилаланина на лейцин в положении 51 (F51L) AAT дикого типа, при этом рекомбинантный вариант AAT обладает улучшенной термостабильностью по сравнению с AAT дикого типа. (Kwon KS, et al. JBC, 269(13):9627-9631, 1994; Kim J, et al. JBC, 270(15):8597-8601, 1995). Дополнительные рекомбинантные белки AAT и их варианты могут включать формы AAT с одной или двумя мутациями, такими как, но не ограничиваясь этим, замены метионина на валин в положениях 351 и 358 (M351V; M358V). (Taggart C, et al. JBC, 275(35):27258-65, 2000). Дополнительный вариант осуществления изобретения может включать рекомбинантный белок AAT или его варианты с единичной мутацией, двойной мутацией или множественными мутациями, в том числе, но не ограничиваясь этим, тройной мутацией, включающей F51L, M351V и M358V. (Zhu W, et al. FEBS Open Bio. 8(10):1711-1721, 2018; eCollection 2018 Oct.). В другом варианте осуществления изобретения может быть предложен рекомбинантный белок AAT человека, в том числе его варианты, содержащий полипептидную последовательность, имеющую мутацию в SEQ ID №:1, при этом мутация представляет собой фенилаланин на лейцин в положении 51 (F51L), замену метионина на валин в положении 351 (M351V) или замену метионина на валин в положении 358 (M358V) или любую их комбинацию. Мутации, которые предотвращают окисление некоторых метиониновых остатков, могут снижать активность ингибирования протеазы, в том числе, например, эластазы и тому подобного. Следовательно, варианты рекомбинантного белка AAT с аминокислотными мутациями, которые снижают активность ингибирования протеазы, являются эффективными в вариантах осуществления изобретения. Более того, варианты рекомбинантного белка AAT с какими-либо аминокислотными мутациями, которые повышают термическую стабильность, также полезны в вариантах осуществления изобретения, в том числе расположенные в гидрофобном ядре AAT. Способы получения рекомбинантного белка AAT человека или его варианта с термической стабильностью, а также улучшенной термической стабильностью по сравнению с полученным из плазмы AAT, могут представлять собой полезный тип рекомбинантного белка AAT.

[120] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к рекомбинантным белкам AAT человека, в том числе их вариантам, полученным с помощью способов получения этих соединений, при этом рекомбинантные белки AAT, в том числе их варианты, содержат мутации с устойчивостью к окислению. Эти мутации могут быть выбраны из цистеина, метионина или любой другой аминокислоты, которая может быть окислена, или множества аминокислотных мутаций. Неограничивающие примеры мутаций, которые придают устойчивость к окислению, включают метионин 351, метионин 358 или обе мутации, исходя из последовательности белка AAT дикого типа. Способы получения рекомбинантного белка AAT человека или его варианта могут давать рекомбинантный белок AAT или его вариант с повышенной термической стабильностью по сравнению с белком AAT, полученным из плазмы, при этом мутация представляет собой замену фенилаланина в положении 51 на лейцин. Дополнительные варианты осуществления изобретения могут относится к способам получения рекомбинантного белка AAT человека, в том числе его вариантов, с улучшенной термической стабильностью и устойчивостью к окислению, при этом метионины, подверженные окислению в белке AAT дикого типа, мутированы, модифицированы или изменены.

[121] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к способам получения рекомбинантных белков AAT человека, в том числе его вариантов, в которых они обладают повышенной активностью, периодом полужизни в кровотоке in vivo или в организме пациента, большим чем у AAT, полученного из плазмы, облегчают применение белка AAT в любом из путей введения, или их комбинация. Способы получения рекомбинантных белков AAT человека, в том числе их вариантов, в дополнительных вариантах осуществления изобретения могут представлять собой выращивание в среде для клеточной культуры, по существу не содержащей каких-либо компонентов животного происхождения, т.е. без каких-либо компонентов от животных или каких-либо загрязняющих белков человека или других животных, включая те, которые могут вызывать иммунный ответ. В одном варианте осуществления изобретения получение рекомбинантного белка AAT человека включает стадию культивирования, которую осуществляют в культуральной среде, и культуральная среда содержит менее около 5% (об./об.), менее около 4% (об./об.), менее около 3% (об./об.), менее около 2% (об./об.) или менее около 1% (об./об.) компонентов животного происхождения (человека или других животных), или культуральная среда по существу не содержит компонентов животного происхождения. В дополнительном варианте осуществления изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка AAT человека, включающий стадию культивирования, которую осуществляют в культуральной среде, при этом культуральная среда может содержать или не содержать рекомбинантный инсулин человека.

[122] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к рекомбинантному белку AAT человека, в том числе его вариантам, содержащему полипептидную последовательность, которая на около или по меньшей мере на около 95% идентична SEQ ID №:1, на около или по меньшей мере на около 97% идентична SEQ ID №:1, на около или по меньшей мере на около 98% идентична SEQ ID №:1, на около или по меньшей мере на около 99% идентична SEQ ID №:1. Рекомбинантные белки AAT человека могут быть получены с помощью какого-либо из способов получения рекомбинантного белка AAT.

[123] В дополнительном варианте осуществления изобретения рекомбинантный AAT, полученный с помощью модифицированных клеток CHO, трансфицированных и выращенных с помощью способов, описанных в данном документе, может уменьшать воспаление. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к активному рекомбинантному AAT, обладающему большей противовоспалительной активностью, чем активность полученного из плазмы AAT, причем, например, активный рекомбинантный AAT ингибирует экспрессию или высвобождение интерлейкина-6 (ИЛ-6) и фактора некроза опухоли (ФНО) при воздействии на мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) липополисахарида (ЛПС). Дополнительный вариант осуществления может относиться к активному рекомбинантному AAT, который защищает от заболевания или смерти, вызванных ФНО-альфа или эндотоксином. В другом варианте осуществления изобретения активный рекомбинантный AAT может проявлять противовоспалительную и иммунную модулирующие активности, а кроме того противоапоптическую активность. Например, рекомбинантный AAT, полученный из модифицированных клеток CHO, описанных в данном документе, может ингибировать апоптоз клеток печени, вызванный ацетаминофеном или парацетамолом, который, как правило, наблюдается при острой печеночной недостаточности у млекопитающих. Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к активному рекомбинантному AAT, имеющему большую антиапоптическую активность, чем активность полученного из плазмы AAT, при этом, например, активный рекомбинантный AAT ингибирует повреждение печени, вызванное ацетаминофеном.

[124] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к получению препарата рекомбинантного AAT с гликозилированием, свойственным человеку, и с большей чистотой и качеством, чем продукты AAT, полученные из плазмы. Дополнительный вариант осуществления изобретения охватывает получение препаратов рекомбинантного AAT в клетках-хозяевах млекопитающего, которые вырастают до очень высокой плотности и которые продуцируют очень высокие уровни рекомбинантного AAT, позволяя таким образом осуществлять рентабельное производство этих препаратов AAT. В другом варианте осуществления изобретения получение препаратов рекомбинантного AAT осуществляют в клетках-хозяевах CHO с высоким выходом, как описано в данном документе, и без каких-либо компонентов животного происхождения, таким образом обеспечивая лучший профиль безопасности, чем AAT человека, полученный из плазмы.

КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО AAT И ЛЕЧЕНИЕ ИМИ

[125] Варианты осуществления изобретения, описанные в данном документе, предполагают введение композиций субъектам, страдающим от дефицита AAT, биологически совместимой формы, которые также могут представлять собой терапевтическую композицию, пригодную для введения in vivo. Биологически совместимая форма содержит рекомбинантный AAT, который можно вводить, в которой какие-либо токсические эффекты перевешиваются терапевтическими эффектами активного рекомбинантного белка AAT. Количество эффективное в дозировках и в течение периодов времени для достижения требуемого результата можно использовать при введении терапевтически эффективного количества терапевтической композиции, содержащей рекомбинантный белок AAT, такой как, например, рекомбинантный белок AAT человека, как определено в данном документе. Для установления терапевтически эффективного количества активного ингредиента подразумеваются и рассматриваются такие факторы, как болезненное состояние, возраст, пол и масса субъекта или индивида, который может получать или которому может быть введена терапевтическая композиция, содержащая рекомбинантный AAT, и способность AAT вызывать требуемый ответ у индивида. Эти факторы можно также рассматривать для установления дозировок, а также режимы могут быть отрегулированы, таким образом обеспечивая оптимальный терапевтический ответ.

[126] Один вариант может относиться к композициям, в том числе фармацевтическим композициям, содержащим активный рекомбинантный AAT, в том числе его варианты, описанные в данном документе, в соответствующем фармацевтически приемлемом носителе, разбавителе или среде, в том числе, но не ограничиваясь этим, воде, растворе хлорида натрия, водном буферном растворе и тому подобном, которые являются достаточно стерильными для введения (например, внутривенного, подкожного и т.д.). В некоторых вариантах осуществления изобретения составы на основе гиалуронидазы могут представлять собой пригодный носитель для активного рекомбинантного AAT (например, герцептин). Субъекта, страдающего от дефицита альфа-1-антитрипсина, можно лечить путем введения субъекту эффективного количества рекомбинантного белка AAT, в том числе его вариантов, и в одном варианте осуществления изобретения, рекомбинантного белка AAT человека, причем количество является эффективным для ослабления или уменьшения дефицита альфа-1-антитрипсина у субъекта, таким образом осуществляя лечение субъекта и увеличивая уровень альфа-1-антитрипсина в плазме субъекта до такого уровня, что субъект более не страдает от дефицита AAT. В дополнительном варианте осуществления изобретения предложен способ лечения субъекта, страдающего от дефицита AAT, путем введения рекомбинантного белка AAT человека, в том числе его вариантов, или композиции, содержащей рекомбинантный белок AAT человека, в том числе его варианты, в количестве, эффективном для ослабления, улучшения или снижения дефицита AAT у субъекта, таким образом осуществляя лечение субъекта. Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения субъекта, страдающего от заболевания, которое приводит к вызванному протеазой повреждению тканей, включающему введение субъекту эффективного количества рекомбинантного белка AAT человека или композиции, содержащей рекомбинантный белок AAT человека, для ослабления вызванного протеазой повреждения тканей у субъекта, осуществляя таким образом лечение субъекта.

[127] Дозированные составы, дозировки и пути введения таких дозированных составов могут варьироваться в зависимости от природы и тяжести патологического состояния, подвергаемого лечению, возраста и массы субъекта и т.д. Вводимая доза около 60 мг/кг массы тела, например, один раз в неделю посредством внутривенной инфузии может представлять собой требуемый протокол пополнения с использованием рекомбинантного AAT у субъектов, например, пациентов с дефицитом AAT или тех, которые нуждаются в AAT. Альтернативно, дозу можно увеличивать или уменьшать на основании уровня, чтобы получить пользу для субъекта, страдающего от дефицита AAT. В другом варианте осуществления изобретения субъекту, нуждающемуся в этом, можно также вводить дозировку каждые две недели при 120 мг/кг, дозировку каждые три недели при 180 мг/кг или дозировку каждый месяц при 250 мг/кг. Композиции по изобретению, содержащие эффективное количество рекомбинантного AAT или его варианта, можно вводить людям или животным любым пригодным путем, который врачом считается подходящим. Понятно, что количество рекомбинантного AAT или его варианта в соответствии с этим изобретением, которое необходимо вводить пациенту и требуется для применения при лечении или профилактике в соответствии с данным изобретением будет зависеть от пути введения, природы и тяжести патологического состояния, для которого необходимо лечение или профилактика, возраста, массы и состояния пациента и будет в конечном итоге зависеть от решения лечащего врача. В целом, однако, пригодное количество является таким, что при введении фармацевтической композиции пациенту, подлежащему лечению, улучшаются уровни субъекта, у которого нет дефицита AAT. Например, фармацевтическая композиция и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или среду, которые содержат рекомбинантный AAT или его вариант, как описано в данном документе, можно вводить субъекту или пациенту, страдающему от дефицита AAT, любым подходящим путем в количестве, достаточном для повышения уровней AAT в плазме субъекта с дефицитом AAT до уровней AAT в плазме здорового субъекта, т.е. от около 1 г/л до около 2 г/л или более. Поскольку рекомбинантный AAT или вариант AAT по вариантам осуществления, описанным в данном документе, могут иметь больший период полувыведения, внутривенные введения один раз в неделю не являются необходимыми. Однако, за субъектами или индивидами можно наблюдать, и дозировки или режимы можно менять, чтобы получить наилучший результат для субъекта. Скорость инфузии также может изменяться; однако 0,08 мл/кг в минуту является хорошо установленной скоростью, которая может быть эффективна при введении композиций, содержащих рекомбинантный AAT, в том числе его варианты.

[128] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к композициям, в том числе фармацевтическим композициям, и фармацевтически приемлемым носителям, разбавителям или средам, при этом композиции могут содержать рекомбинантный AAT, в том числе варианты, описанные в данном документе, причем композиции можно применять внешне (т.е. местно) или внутренне (т.е. путем инъекций, инфузий, ингаляций) для заболеваний или патологических состояний, которые вызывают дефицит AAT, воспаление, индуцированное протеазой повреждение тканей и тому подобное, и можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, с помощью, например, парентерального введения, в том числе, но не ограничиваясь этим, внутривенного, внутрисердечного, интракоронарного, внутримышечного, путем ингаляции, бронхиальной/трахеальной инстилляции, дермально, интрадермально, трансдермально, интрамукозально, трансмукозально, интравагинально, местно, интраназально, ректально и тому подобным образом, и их комбинаций. Введение можно также осуществлять в ткани и полости с помощью такого пути, как, но не ограничиваясь этим, внутрибрюшинно, внутриплеврально, интратекально, интраартериально, парентерально и тому подобным образом, и их комбинаций. Интрамукозальное введение можно осуществлять через слизистые оболочки, такие как, но не ограничиваясь этим, губы, рот, носовые каналы, среднее ухо, слуховая труба, выстилка желудочно-кишечного тракта, выстилка мочеполового тракта (в том числе мочеиспускательный канал и влагалище), выстилка дыхательных путей и глаза (в том числе конъюнктивальные оболочки), которое может включать местное применение, а также, например, интравитреальную инъекцию. В зависимости от пути введения активный рекомбинантный AAT, в том числе его варианты, может быть покрыт материалом для защиты соединения от деградации ферментами, кислотами и другими природными условиями, которые могут инактивировать рекомбинантный AAT. В одном варианте осуществления изобретения активный рекомбинантный AAT, в том числе рекомбинантный AAT человека, его варианты или композиции, содержащие рекомбинантный AAT, можно вводить внутривенно. В другом варианте осуществления изобретения активный рекомбинантный AAT, в том числе рекомбинантный AAT человека, его варианты или композиции, содержащие рекомбинантный AAT, можно вводить интраназально или посредством прямой ингаляции в легкие. В дополнительном варианте осуществления изобретения активный рекомбинантный AAT, в том числе рекомбинантный AAT человека, его варианты или композиции, содержащие рекомбинантный AAT, можно применять местно.

[129] В варианте осуществления изобретения активный рекомбинантный белок AAT, в том числе его варианты, можно получить в композиции для местного применения. Неограничивающие примеры композиций, содержащих рекомбинантный AAT, в том числе его варианты, полученные из модифицированных клеток CHO, описанных в данном документе, включают раствор, спрей, лосьон, гель, крем, бальзам, пасту или мазь.

[130] В другом варианте осуществления изобретения субъектов с дефицитом AAT можно лечить рекомбинантным белком AAT, в том числе вариантами, описанными в данном документе. Другой вариант осуществления изобретения может относиться к лечению заболеваний или патологических состояний, которые вызваны воспалением, иммунными реакциями или апоптозом, при этом рекомбинантный белок AAT, в том числе его варианты, ингибируют воспаление, иммунные ответы и апоптоз.

[131] Заболевания, которые подлежат лечению рекомбинантными препаратами AAT, в том числе его вариантами, полученными из высокопроизводительных клеток млекопитающих, культивируемых в биореакторах, как продемонстрировано в данном документе, должны быть выбраны из группы заболеваний, которые вызваны каким-либо явлением снижения активности AAT у конкретного субъекта, и поэтому они представлены пациентами, которые страдают от, например, функционального дефицита AAT, от цирроза печени, от муковисцидоза, от воспалительных заболеваний печени, от вызванного диабетом недостаточного заживления ран, от вызванного протеазой повреждения тканей и от других заболеваний.

[132] Рекомбинантный AAT, в том числе его варианты, описанные в данном документе, можно также использовать при лечении субъектов, страдающих от вызванного протеазой повреждения тканей. Существует много различных заболеваний, которые могут начинаться как вызванное протеазой повреждение тканей. Неограничивающие примеры этих заболеваний включают те, которые могут быть вызваны любым злокачественным заболеванием, в том числе, но не ограничиваясь этим, раком (например, злокачественными образованиями из эпителиальной ткани и/или мезенхимы, саркомой, злокачественной мезотелиомой плевры), нейродегенеративными расстройствами и воспалительными и сердечно-сосудистыми заболеваниями. Заболевания могут также включать те, которые вызваны воспалением неустановленного или неизвестного происхождения.

[133] Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к лечению субъекта, страдающего от дефицита AAT или индуцированного протеазой повреждения тканей путем введения рекомбинантного белка AAT человека, в том числе его вариантов, или композиций, содержащих рекомбинантный белок AAT человека, в том числе его варианты, и фармацевтически приемлемые носители, разбавители или среды, в ткани или полости путем, выбранным из любого из: подкожного, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутриплеврального, интратекального, интрадермального, трансдермального, внутривенного, внутриартериального, парентерального, интрамукозального, местного, путем ингаляции и тому подобного и их комбинаций.

[134] Терапия альфа-1-антитрипсином может обеспечивать дополнительные применения, кроме противовоспалительного действия и ингибирования серинпротеазы. Они могут включать, в некоторых вариантах осуществления изобретения, иммуномодуляцию и антиапоптозное действие посредством ингибирования каспазой, такой как, но не ограничиваясь этим, каспаза-1, каспаза-3 и т.д. Эти эффекты могут присутствовать или сохранятся, даже если альфа-1-антитрипсин утратил свое антипротеазное действие. См., например, Wanner A. (2016) Alpha-1 Antitrypsin as a Therapeutic Agent for Conditions not Associated with Alpha-1 Antitrypsin Deficiency. В: Wanner A., Sandhaus R. (eds) Alpha-1 Antitrypsin. Respiratory Medicine. Humana Press, Cham; Siebers K, et al. “Alpha-1 Antitrypsin Inhibits ATP-Mediated Release of Interleukin-1β via CD36 and Nicotinic Acetylcholine Receptors.” Front Immunol. Apr 25, 9:877, 2018, обе из которых включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[135] Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к лечению субъекта, страдающего от деструкции клеток поджелудочной железы, вследствие, например, аутоиммунного заболевания, например у детей, подростков и взрослых, которые страдают от диабетического заболевания (например, сахарного диабета I типа, сахарного диабета взрослого типа у молодых (MODY)). Повышенный уровень AAT в кровотоке этих пациентов после введения рекомбинантного AAT человека может предотвращать деструкцию бета-клеток и вызывать обратное развитие гипергликемии.

[136] Другое применение рекомбинантного AAT может быть при трансплантации и хранении органов, что в результате может давать более безопасные и менее вредные техники, чем традиционные классические способы. Комбинированные терапии с иммунодепрессантами для пациентов, включая тех, кто затем приобрел иммунодефицит и накапливает наиболее сильные токсические вещества, чтобы устранить нарушение функции трансплантата. Реакция «трансплантат против хозяина» зачастую представляет собой осложнение, связанное с трансплантацией стволовых клеток. Перфузионные растворы, используемые в процессе забора органов, можно обрабатывать рекомбинантным AAT, например, в Perfadex® для трансплантации легких. Рекомбинантный AAT можно также использовать в процессе консервирования или хранения органов, и в результате может наблюдаться увеличение круга живых и мертвых доноров, что может представлять собой значительный сдерживающий фактор для трансплантации органов. Факторы могут включать более длительное хранение, лучшую защиту органа и тому подобное, так что пациент, которому производят трансплантацию, получает меньше вреда, в том числе, но не ограничиваясь этим, повреждения вследствие трансплантации самого органа, пациента (например, повреждение головного мозга) и менее частые эпизоды длительной недостаточности или отторжения трансплантата.

[137] В других вариантах осуществления изобретения рекомбинантный AAT может быть необходимым для защиты тканей при тяжелых и угрожающих жизни заболеваниях, не связанных с трансплантацией органов, с существенными компонентами ишемически-реперфузионного повреждения, такого как инфаркт миокарда, инсульт и тому подобное. (См., например, Abouzaki NA, et al. Inhibiting the Inflammatory Injury After Myocardial Ischemia Reperfusion With Plasma-Derived Alpha-1 Antitrypsin: A Post Hoc Analysis of the VCU-α1RT Study. J Cardiovasc Pharmacol. 2018 Jun;71(6):375-379; Mauro AG, et al. Preclinical Translational Study of the Cardioprotective Effects of Plasma-Derived Alpha-1 Anti-trypsin in Acute Myocardial Infarction. J Cardiovasc Pharmacol. 2017 May;69(5):273-278; Toldo S, et al. Recombinant Human Alpha-1 Antitrypsin-Fc Fusion Protein Reduces Mouse Myocardial Inflammatory Injury After Ischemia-Reperfusion Independent of Elastase Inhibition. J Cardiovasc Pharmacol. 2016 Jul;68(1):27-32; Toldo S, et al. Alpha-1 antitrypsin inhibits caspase-1 and protects from acute myocardial ischemia-reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 2011 Aug;51(2):244-51; Mollnes TE, et al. Acute phase reactants and complement activation in patients with acute myocardial infarction. Complement. 1988;5(1):33-9, все из которых включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки в свете их идей о применении терапии AAT)

[138] Дополнительное применение рекомбинантного AAT представляет собой применение при гемолитической анемии, сепсисе и других родственных заболеваниях, для профилактики или снижения вредного воздействия высвобождения свободного гема, особенно в процессе гемолиза эритроцитов. Более того, рекомбинантный AAT может играть важную роль в реакции «трансплантат против хозяина». (См., например, Janciauskiene, Sabina, and Tobias Welte. "Future directions: diagnostic approaches and therapy with AAT." Alpha-1-Antitrypsin Deficiency 85 (2019): 159; Geiger S, et al. Alpha-1 Antitrypsin-Expressing Mesenchymal Stromal Cells Confer a Long-Term Survival Benefit in a Mouse Model of Lethal GvHD. Mol Ther. 2019 Aug 7;27(8):1436-1451; Thangavelu G, Blazar BR. Achievement of Tolerance Induction to Prevent Acute Graft-vs.-Host Disease. Front Immunol. 2019 Mar 6;10:309; Baranovski BM, et al. Alpha-1 Antitrypsin Substitution for Extrapulmonary Conditions in Alpha-1 Antitrypsin Deficient Patients. Chronic Obstr Pulm Dis. 2018 Sep 19;5(4):267-276; Magenau JM, et al. α1-Antitrypsin infusion for treatment of steroid-resistant acute graft-versus-host disease. Blood. 2018 Mar 22;131(12):1372-1379; Jerkins JH, et al. Alpha-1-antitrypsin for the treatment of steroid-refractory acute gastrointestinal graft-versus-host disease. Am J Hematol. 2017 Oct;92(10):E610-E611; Lee S, et al. IL-32-induced Inflammatory Cytokines Are Selectively Suppressed by α1-antitrypsin in Mouse Bone Marrow Cells. Immune Netw. 2017 Apr;17(2):116-120; Gerner RR, et al. Treatment With α-1-Antitrypsin for Steroid-Refractory Acute Intestinal Graft-Versus-Host Disease: A Report of 2 Cases. Transplantation. 2016 Dec;100(12):e158-e159; Marcondes AM, et al. Response of Steroid-Refractory Acute GVHD to α1-Antitrypsin. Biol Blood Marrow Transplant. 2016 Sep;22(9):1596-1601; Kekre N, Antin JH. Emerging drugs for graft-versus-host disease. Expert Opin Emerg Drugs. 2016 Jun;21(2):209-18; Lior Y, et al. Therapeutic compositions and uses of alpha1-antitrypsin: a patent review (2012-2015). Expert Opin Ther Pat. 2016 May;26(5):581-9, все из которых включены в данный документ посредством ссылки в свете их идей о применениях терапии AAT).

[139] Центральную роль в тяжести заболевания может играть вирусное заболевание (например, у животных, животного происхождения, с возможностью передачи людям). Вирус гриппа A (и следует отметить, что эта инфекция гриппа стала наиболее важным инфекционным заболеванием в мире, учитывая ее распространенность, смертность и стоимость), коронавирусы с их специфическими эпидемическими или пандемическими опасностями и угрозами, а также вирус иммунодефицита 1 типа (HIV-1) используют серинпротеазы хозяина для вхождения в клетку и последующего инфицирования. Уровни альфа-1-антитрипсина могут играть роль в распространении и развитии заболевания (включая уменьшение распространения вируса, модуляция или снижение воспаления и профилактика смерти клеток), и таким образом потенциально также он может быть эффективен в пополняющей терапии. (См., например, Wanner A. Alpha-1 antitrypsin as a therapeutic agent for conditions not associated with alpha-1 antitrtrypsin deficiency. В: Wanner A, Sandhaus R.S. (eds): Alpha-an antrypsin. Role in health and disease. Humana Press 2016; Springer International Publishing, Cham, Heidelberg, New York, Dordrecht, London, pp. 141-55, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме).

[140] Кроме того, AAT может применяться при лечении муковисцидоза и хронической обструктивной болезни легких. Насыщение альфа-1-антитрипсином может иметь терапевтический потенциал по отношению к повышению его уровней не до нормальных значений, а сверх нормальных значений. Альфа-1-антитрипсин представляет собой сильный ингибитор нейтрофил-эластазы, который нацелен исключительно на потерю способности к прогрессирующему ремоделированию и деструкции легкого при муковисцидозе. Более того, поскольку нейтрофил-зависимое и нейтрофил-независимое воспаление, а также клеточная смерть посредством апоптоза являются ключевыми, альфа-1-антитрипсин можно использовать в способах защиты ткани. (См., например, McElvaney NG. Alpha-1 Antitrypsin Therapy in Cystic Fibrosis and the Lung Disease Associated with Alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Ann Am Thorac Soc. 2016 Apr;13 Suppl 2:S191-6; Janciauskiene S, Welte T. Future directions: diagnostic approaches and therapy with AAT. В: Strand P, Prantyl ML, Bals R, eds. α1-antitrypsin deficiency (монография ERS). Sheffield, European Respiratory Society, 2019: pp.158-78; Wanner A. Alpha-1 antitrypsin as a therapeutic agent for conditions not associated with alpha-1 antitrtrypsin deficiency. В: Wanner A, Sandhaus R.S. (eds): Alpha-an antrypsin. Role in health and disease. Humana Press 2016; Springer International Publishing, Cham, Heidelberg, New York, Dordrecht, London, pp. 141-55, все из которых включены в данный документ посредством ссылки).

[141] Другой вариант осуществления изобретения может относиться к введению активного рекомбинантного AAT, в том числе его вариантов, индивидам, страдающим от хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) или связанных заболеваний или патологических состояний, в том числе, но не ограничиваясь этим, заболевания печени, заболевания органов дыхания и тому подобного, при этом существует дефицит AAT, вызванный недостатком или дефицитом AAT в кровотоке или накоплением AAT в печени, поскольку он не секретируется должным образом. Неограничивающие примеры заболеваний, патологических состояний или расстройств, которые можно лечить с помощью рекомбинантного AAT, в том числе его вариантов, включают: эмфизему, цирроз, печеночную недостаточность, ХОБЛ, пневмоторакс, астму, гранулематоз с ангиопатией, панкреатит, бронхоэктаз, аутоиммунный гепатит и любое злокачественное заболевание, в том числе, но не ограничиваясь ими, некоторые раковые заболевания (например, злокачественные образования из эпителиальной ткани и/или мезенхимы, саркома, злокачественная мезотелиома плевры), и рак, например, легких, печени и мочевого пузыря.

[142] Один вариант осуществления изобретения может относиться к пополняющей или заместительной терапии с использованием активного гликозилированного рекомбинантного белка AAT, в том числе его вариантов, с помощью инфузии белка внутривенно субъекту, страдающему от дефицита AAT. Введение можно осуществлять традиционными способами за исключением того, что вместо инфузии белка AAT, полученного из плазмы, варианты осуществления изобретения могут относиться к введению активного рекомбинантного белка AAT, в том числе его вариантов, происходящих из модифицированных клеток CHO, полученных с помощью указанных способов и как описано в данном документе.

[143] Дополнительный вариант осуществления изобретения может относиться к введению рекомбинантного белка AAT, полученного из клеток CHO, эффективным образом через кожу или слизистую оболочку для доступа, например, в легкие, систему органов дыхания, кровоток и тому подобное. В одном варианте осуществления изобретения рекомбинантный AAT можно вдыхать и использовать в качестве местного лечения, например, эмфиземы легкого, вызванной дефицитом AAT. Рекомбинантный AAT может проходить через слои кожи более эффективным и улучшенным путем, чем полученный из плазмы AAT.

[144] Кроме того, указанная проблема решается вариантами осуществления данного изобретения, в которых предложен способ лечения заболевания, причем рекомбинантный AAT, полученный из культивируемых клеток млекопитающих, продуцируется в количествах и с качеством, пригодным для увеличения или повышения уровней AAT у субъектов с дефицитом AAT или тех субъектов, которые страдают от заболеваний, расстройств или патологических состояний, связанных с AAT, и нуждаются в нем.

[145] Иммунная терапия заняла важное место при лечении различных типов рака и в значительной степени изменяет прогноз некоторых злокачественных заболеваний, в том числе, но не ограничиваясь этим, раковых заболеваний (например, злокачественные новообразования из эпителия и/или мезенхимы, саркома, злокачественная мезотелиома плевры). Клиническое препятствие при таком лечении представляет собой возникновение аутоиммунных заболеваний вследствие сильного снижения аутоиммунитета. AAT может применяться при лечении аутоиммунных заболеваний в некоторых вариантах осуществления изобретения.

ПРИМЕРЫ

[146] Следующие примеры иллюстрируют конкретные аспекты настоящего описания. Примеры не следует рассматривать как ограничивающие, поскольку примеры лишь дают частное понимание и практическое осуществление вариантов осуществления изобретения и их различных аспектов.

ПРИМЕР 1: ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ БЕЛКА АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА (AAT)

[147] Наиболее распространенную аллель гена AAT (т.е. M-аллель) в форме синтезированной, кодон-оптимизированной для CHO ДНК клонировали в высокопроизводительный экспрессионный вектор. Необходимый белок, представляющий интерес (Фиг. 1A без лидерной последовательности; Фиг. 1B-1D с лидерными последовательностями), который кодируется геном, представляющим интерес, (GOI) экспрессировали с помощью экспрессионного вектора pXLG-6-AAT. См. Фиг. 2A-2C и Фиг. 3. Последовательность гена AAT дикого типа с 394 аминокислотами является у приматов высококонсервативной с различием только в одной аминокислоте у шимпанзе по сравнению с M-аллелью людей. Несмотря на это в человеческой популяции существует более 50 аллельных вариантов, большинство из которых дают вклад или являются причиной заболевания. Последовательность M-аллели можно найти в Long GL, et al. (Biochemistry 23(21): 4828-4837, 1984), но также доступна на платформах секвенирования генома человека (см. дополнение). Белок AAT демонстрирует три сайта N-сцепленного гликозилирования.

[148] Используемая последовательность альфа-1-антитрипсина (AAT) идентична последовательности, опубликованной в Long GL, et al. (Biochemistry 23(21):4828-4837, 1984); однако лидерная последовательность (т.е. секреторная сигнальная пептидная последовательность) исходной последовательности заменена лидерной последовательностью последовательности тяжелой цепи IgG1 человека. В соответствии с программой отщепления сигнального пептида такой же зрелый полипептид будет получен в клетках CHO, начинаясь с ожидаемых первых трех аминоконцевых аминокислот, которые представляют собой глутаминовую кислоту (E), аспарагиновую кислоту (D) и пролин (P). Ген SERPINA1 кодирует белок альфа-1-антитрипсин (AAT), который основан на последовательности гена, представленной M-аллелью, который считают наиболее распространенным и функциональным AAT человека. Секретируемая аминокислотная последовательность AAT дикого типа полной длины содержит 394 аминокислоты, как опубликовано в Long GL, et al. 1984.

[149] Последовательность, в том числе лидерная последовательность тяжелой цепи IgG1 человека (жирным и подчеркнутым шрифтом), представлена на Фиг. 1C в качестве аминокислотной последовательности рекомбинантного белка альфа-1-антитрипсина человека (M).

ПРИМЕР 2: СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ НА ОСНОВЕ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА ДЛЯ АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА

[150] Модифицированные клетки CHO, описанные в данном документе, (т.е. быстро растущие, с высоким выходом белка, стабильны при высокой плотности, масштабируемость в суспензионной культуре и т.д.) были разработаны для применения в биореакторе, т.е. для крупномасштабного производства, путем модификации и отбора конкретной линии клеток яичника китайского хомячка (CHO), которую изначально получили в исследовательской лаборатории (Puck TT, et al. J. Exptl. Med. 108(6):845-956, 1958) и которая была затем предоставлена многим исследователям, в том числе университетским научным группам, в течение десятилетий. Известно, что клетки CHO быстро меняют свои генетические характеристики и адаптируются к различным условиям культивирования способом, который очень схож с раковыми клетками у людей или животных. Клетки по изобретению получали из нерекомбинантной клетки-хозяина, значительно оптимизированной для быстрого устойчивого роста в суспензионной культуре в среде без компонентов животного происхождения. Эти фенотипические признаки наследовались после трансфекции в рекомбинантные клетки, которые экспрессируют AAT, и среди прочих характеристик позволяли эти клеткам расти до плотностей более 20 миллионов клеток/мл и со скоростью роста, приводящей к скорости удвоения, составляющей менее 20 часов/удвоение клеток, давая более около 5 г/л AAT, или более около 6 г/л, или более 7 г/л, или более 8 г/л AAT, что демонстрирует робастность и продуктивность крупномасштабного производства, при этом выращивание осуществляли в среде, не содержащей компонентов животного происхождения. Клональные линии клеток CHO, экспрессирующие рекомбинантный AAT человека, успешно получали с использованием высокоэффективной технологии переноса гена на основе транспозона, описанной в данном документе. Полная история клеток CHO и их неопределенные генетические характеристики описаны в публикации (Wurm, F.M. Processes 1(3):296-311, 2013). В литературе также сообщались уровни экспрессии AAT в клетках CHO только на уровне 100 мкг/л в сутки (Paterson T, et al. Applied Microbiol. Biotechnol. 40:691-698, 1994) и не так давно на уровне около 1 г/л в качестве конечного выхода (Lalone M-E et al. J. Biotechn. 307 (2020) 87-97, 2019), но в клеточной линии PerC6 ткани сетчатки человека AAT экспрессировался в количествах более 2,5 г/л в качестве конечного выхода (Ross D, et al. J. Biotech. 162(2-3):262-273, 2012).

ПРИМЕР 3: СИСТЕМА ЭКСПРЕССИОННОГО ВЕКТОРА ДЛЯ ТРАНСФЕКЦИИ

[151] Для трансфекции клеток CHO необходимым белком AAT, представляющим интерес, использовали подход котрансфекции с использованием двух векторов. Необходимый белок AAT кодировали с помощью вектора гена, представляющего интерес, (GOI), экспрессионного вектора pXLG-6-AAT (ExcellGene S.A.; Фиг. 2A, Фиг. 2B, Фиг. 2C, Фиг. 2D). Фиг. 3 иллюстрирует карту вектора pXLG-6, в который был клонирован ген AAT в сайте множественного клонирования (MCS). Второй плазмидный вектор, pXLG-5 (ExcellGene S.A.), который кодируется транспозазой PiggyBac (mPBase) (SEQ ID №:10) (Фиг. 4A, Фиг. 4B), использовали в подходе котрансфекции с использованием двух векторов.

[152] Наиболее распространенную аллель человека гена AAT (т.е. M-аллель) в форме ДНК без интрона клонировали в высокопроизводительный экспрессионный вектор, например экспрессионный вектор pXLGb. Последовательность гена AAT дикого типа с 394 аминокислотами является у приматов высококонсервативной с различием только в одной аминокислоте у шимпанзе по сравнению с M-аллелью людей. Несмотря на это в человеческой популяции существует более 50 аллельных вариантов, большинство из которых дают вклад или являются причиной заболевания. Последовательность M-аллели можно найти в Long GL, et al. Biochemistry 1984, 23, 4828-4837, но она также легко доступна на платформах секвенирования генома человека. Белок AAT человека дикого типа демонстрирует три сайта N-сцепленного гликозилирования. Рекомбинантный AAT по вариантам осуществления изобретения, описанным в данном документе, может обладать дополнительными сайтами гликозилирования.

ПРИМЕР 4: ТРАНСФЕКЦИЯ И ОТБОР РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛЕТОК CHO, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ AAT

[153] Нерекомбинантные клетки-хозяева, имеющие необходимый фенотип для быстрого роста, при этом в среде без компонентов животного происхождения, использовали при получении главного банка клеток (MCB), который был подтвержден как клетки яичника китайского хомячка. Описанную эффективную технологию переноса гена на основе транспозонов осуществляют с помощью контрансфекции клеток-хозяев донорным вектором, содержащим последовательность гена AAT и вторую транспозазу, экспрессирующую нуклеиновую кислоту, которая опосредует вставку гена AAT в геном клеток-хозяев с помощью транспозазы, которая кодируется геном транспозазы. Клетки, полученные из культуры посевных ферментеров при культивировании в суспензионной культуре в среде ProCH05 (Lonza) (полученные из вышеупомянутого главного банка клеток), центрифугировали и трансфицировали, строго придерживаясь инструкций, предоставленных в коммерческом наборе для трансфекции (CH04Tx®; ExcellGene SA), давая 5 мкг смеси экспрессионных векторов (содержащих два вышеупомянутых вектора) на объем клеточной культуры 10 мл. Затем, трансфицированные клетки культивировали в суспензионной культуре, встряхивая в шейкере-инкубаторе с CCE-контролем и увлажнением при 180 оборотах в минуту и 37°C. Каждый день клеточную культуру центрифугировали и осажденные клетки, образовавшие осадок в емкости, переносили в свежую предварительно подогретую среду, входящую в набор для трансфекции (CHO4Tx®), содержащую 50 мкг/мл пуромицина для отбора. Выживаемость и число клеток в культуре уменьшалось в течение около 4 дней после трансфекции, но затем популяция клеток начала восстанавливаться, и как выживаемость, так и количество клеток начали возрастать. Через 10 дней в селективных условиях была получена очень жизнеспособная популяция здоровых растущих клеток. Дальнейшего отбора на основе пуромицина в стабилизированной клеточной культуре не производили. Показано, что быстро растущая, рекомбинантная популяция клеток экспрессировала рекомбинантный AAT человека на высоких уровнях. Эту популяцию клеток считали «пулом» рекомбинантных клеток AAT, представляющим смесь нескольких и различных событий встраивания гена AAT в геном клеток CHO.

[154] Расширенную популяцию рекомбинантных клеток, т.е. рекомбинантный пул CHO-AAT, использовали для получения банка клеток для исследования (RCB-P- rAAT; 10 флаконов). Флакон с этой популяцией размораживали, увеличивали количество с использованием среды Lonza ProCHO 5, и единичную клетку клонировали, а затем клонировали еще раз с использованием подхода предельного разведения. Этот подход гарантировал клональное происхождение развивающихся клеточных популяций с вероятностью более 98%. Банк клеток для исследования «RCB-P 03-rAAT» использовали дважды в подходе предельного разведения отдельных клеток и получали 72 высокопродуктивных полученных клональным способом клеточных популяций, пять (5) из которых были далее изучены в долговременных культурах. Долговременные культуры получали из дополнительных банков клеток для исследований, полученных с помощью полученных клональным способом клеточных популяций, обозначенных как RCB-0 и RCB-1, соответственно, и соответствующего названия клона. Продуктивность субклонированных клеток этих 5 клеточных линий (из банка RCB-1) оставалась постоянной, и четыре (4) наилучших полученных клональным способом клеточных популяций обозначали как «клоны 112, 423, 555 и 585» и замораживали как RCB-2 с указанием соответствующего названия клона.

[155] Две из этих клеточных линий XLG-AAT № 112 и XLG-AAT № 423 получали из еще одного дополнительного банка клеток для исследования RCB-3, при исследовании в условиях стационарного культивирования и стационарного культивирования с подпиткой с использованием неоптимизированного процесса (Фиг. 5 и 6). В этих неоптимизированных условиях получения клеточной культуры эти две полученные клональным способом клеточные популяции продемонстрировали уровни экспрессии 4 г/л и 5 г/л, соответственно, после 14-дневного процесса, что было значительно выше, чем выходы, которые можно получить из плазмы человека (т.е. около 1-1,5 г/л).

[156] Другую клональную клеточную линию XLG-AAT № 30 получали с помощью трансфекции, выполненной в условиях, подобных описанным ранее. Условия продуцирования включали применения разнообразных сред и питательных добавок без оптимизации основательным образом в культурах по 10 мл, которые хранят в пробирках OrbShake™ вместимостью 50 мл. Как можно увидеть на Фиг. 7, при некоторых из этих исследуемых условий, были получены титры продукта 6-8 г/л в течение 14 дней. В соответствии со схемой, приведенной на Фиг. 9, в моменты времени 12 и 14 дней, сравнивали четыре различные среды (n=4). Черные столбцы (крайние левые) относятся к использованию среды ExcellGene (XLG_E21_7 CDM) в комбинации с питательными добавками 7A/7B (добавка HyClone™ Cell Boost 7a (SH31026.01); добавка HyClone™ Cell Boost 7b (SH31027.01); GE Healthcare Life Sciences); HyClone CDM4CHO с питательными добавками 7A/7B (GE Healthcare Life Sciences), среды для стационарного культивирования с подпиткой Ex-Cell® Advanced™ CHO производства Sigma-Aldrich, и среды BalanCD производства Irvine.

ПРИМЕР 5: БЕЛОК АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИН (AAT), ПОЛУЧЕННЫЙ В КЛЕТКАХ ЯИЧНИКА КИТАЙСКОГО ХОМЯЧКА (CHO)

[157] 10 мл культуры нерекомбинантных клеток CHOExpress™ (ExcellGene SA) при плотности 1 миллион клеток/мл котрансфицировали с использованием высокоэффективной системы переноса генов на основе транспозона, содержащей плазмидный вектор pXLG6-AAT, содержащий экспрессионную кассету для рекомбинантного AAT, и плазмидный вектор pXLG5, содержащий транспозазу piggyBac для встраивания гена, опосредованного транспозазой. Нерекомбинантные клетки CHOExpress™ могут служить в качестве высокопроизводительных продукционных систем-хозяев для крупномасштабного производства с использованием, например, биореактора с системой эффективного смешивания. Клетки-хозяев трансформировали с помощью нуклеотидной последовательности, кодирующей AAT человека, представляющий интерес (SEQ ID №: 5), при этом вектор, содержащий представляющую интерес нуклеотидную последовательность, представлял собой вектор pXLG6-AAT (SEQ ID №: 9), и выделяли трансформант (т.е. полученную клональным способом популяцию клеток), который экспрессирует рекомбинантный белок AAT (например, SEQ ID №: 1 или варианты SEQ ID №: 1). Полученные клональным способом клеточные линии отбирали путем клонирования единственной клетки и увеличения их количества. Среди различных других были собраны и далее изучены пять стабильных рекомбинантных клональных клеточных линий CHO (XLG AAT №112, XLG AAT № 275, XLG AAT № 423, XLG AAT № 555, XLG AAT № 585).

[158] Клеточный рост для каждой из стабильных клеточных линий изучали с помощью простых стационарных процессов с подпиткой (FB или F.B.), используя среду с химически определенным составом (например, XLG_E21_7; ExcellGene S.A.) и однократное добавление питательной добавки A (ExcellGene S.A.), и был продемонстрирован приемлемый клеточный рост и сохранение высоких уровней жизнеспособности клеток вплоть до 14 дней в этих условиях (данные не показаны). Наибольшие плотности клеток для некоторых клеточных линий, в том числе, но не ограничиваясь этим, культуры с подпиткой XLG 112, достигали наибольшего роста к около 9 дню, давая плотность жизнеспособных клеток около 18-19 x 10⁶ клеток/мл (VCD) (Фиг. 6). К 14 дню плотность клеток падала до около 10 x 10⁶ клеток/мл для культуры с подпиткой XLG 112.

[159] Продуцирование AAT в каждой из пяти клональных клеточных линий CHO, т.е. клоны AAT № 112, 275, 423, 555 и 585) (Фиг. 8) при различных условиях культивирования продемонстрировало, что применение среды (XLG_E21_7 CDM, ExcellGene S.A.) с питательной добавкой XLG (XLG FB; черный столбец) в 14 день превосходило коммерчески доступную среду с химически определенным составом (CDM) (например, безсывороточная PowerCHO™ 2 CDM; Lonza; #BE12-771Q) или только среду XLG (серый столбец, например, XLG_E21_7 CDM без питательной добавки XLG; ExcellGene S.A.) в 6 день. Все клеточные линии сравнивали в суспензионных культурах с использованием процесса, включающего плотность посева 0,5 x 10⁶ клеток/мл, время цикла продуцирования 14 дней, температурный сдвиг и стационарное культивирование с подпиткой некоторыми добавками (ExcellGene S.A.). Титры клеточной линии CHO XLG AAT № 112, которую культивировали в среде XLG, и процесс подпитки (FB) в 14 день составлял около 4,5 г/л титра AAT. Тогда как та же клеточная линия в 6 день в коммерчески доступной CDM и среде XLG без питательной добавки XLG (т.е. процесс в замкнутом объеме) давала около титр AAT 0,750 г/л и около 1,1 г/л, соответственно (p<0,05). Рекомбинантный AAT из различных культур CHO анализировали с помощью SDS-PAGE касательно экспрессии белка при различных процессах с подпиткой. Многократно установлено, что культура клональной клеточной линии CHO XLG AAT № 112 в высокой степени экспрессирует AAT при различных условиях.

[160] Дополнительное исследование культуры клональной клеточной линии CHO XLG AAT № 112, которую культивировали в 12 различных процессах с подпиткой, продемонстрировало, что два конкретных процесса с подпиткой (т.е. условия 1 и 3) давали титр более чем около 6 г/л AAT к 17 дню (Фиг. 9). Процесс с подпиткой в условиях 1 и 3 включал: плотность посева 0,5 x 10⁶ клеток/мл в CDM (например, XLG_E21_7; ExcellGene S.A.) и выращивание при температуре 37°C в день 0-день 3, температуре 33°C в день 3-день 17 и подпитку питательными добавками 7a и 7b (HyClone™ Cell Boost; GE Healthcare Life Sciences) через день (EOD) или каждый день (ED), соответственно для условий 1 и 3, как указано.

[161] Вставка-таблица на Фиг. 9 относится к добавкам сред с химически определенным составом 7a и 7b, а также к температурным сдвигам, которые выполняют во время процессов с подпиткой. Добавки для сред 7a и 7b являются коммерчески доступными (добавка HyClone™ Cell Boost 7a (SH31026.01); добавка HyClone™ Cell Boost 7b (SH31027.01); GE Healthcare Life Sciences) и вводятся в процесс продуцирования в определенных объемах, представленных в процентах от общего объема культуры (EOD: через день, ED: каждый день). Температуры культур для продуцирования даны для периодов времени, указанных как от 0 дня (д00) до 3 дня (д03); от дня 3 до дня 5 (д05) или дня 17 (д17); и от дня 5 до дня 17, как указано. Столбцы слева направо указывают количество дней, т.е. 7, 11, 14 и 17, соответственно, когда были отобраны образцы для определения концентрации продукта и проанализированы относительно титров AAT.

[162] В экспериментах, разработанных для оптимизации содержания сиаловой кислоты (SA) с использованием клеточной линии XLG AAT № 112, наблюдалось высокое содержание сиаловой кислоты (SA) около 5,5 молей сиаловой кислоты/моль AAT в 7 день. Напротив, было установлено, что в коммерчески доступном полученном из плазмы AAT (Prolastin®, Grifols) содержится 3,5 молей сиаловой кислоты на моль AAT. Таким образом, установлено, что клеточная линия CHO XLG AAT № 112 способна продуцировать рекомбинантный AAT с содержанием сиаловой кислоты более чем около 55%, и оно может составлять до на около 80% больше, чем таковое в AAT, полученном из плазмы, при определенных условиях. Клетки выращивали в среде (например, ExcellGene SA) и продуцирование начинали при плотности посева 1 x 10⁶ клеток/мл. Температуру поддерживали при 37°C от начала продуцирования до 3 дня, а затем изменяли до 33°C до конца продуцирования. Питательные добавки HyClone™ Cell Boost 7a и 7b использовали в объеме 7,1% и 0,71%, соответственно, и их добавляли через день, начиная с 3 дня в соответствии с условиями процесса № 1. Наряду с этим 7a и 7b использовали в объеме 3,6% и 0,36%, соответственно, и их добавляли каждый день, начиная с 3 дня в соответствии с условиями процесса № 3.

ПРИМЕР 6: РЕКОМБИНАНТНЫЙ AAT ИЗ КЛЕТОК CHO СНИЖАЕТ АКТИВНОСТЬ ЭЛАСТАЗЫ in vitro

[163] Для количественного определения ингибирующей способности эластазы, рекомбинантный AAT (рекAAT) или полученный из плазмы AAT (AAT плазмы) предварительно инкубировали с эластазой поджелудочной железы (E7885; Sigma Aldrich). После этого оставшуюся активность эластазы определяли спектрофотометрически. Более подробно, AAT разбавляли до 0,08 мг/мл буфером для анализа (0,1 M буфера трис, pH 8) и 5 мкл разбавленного AAT смешивали с 5 мкл эластазы (0,26 мкМ) в общем объеме 275 мкл. После 5 минут инкубации при 37°C, добавляли субстрат N-сукцинил-Ala-Ala-Ala-п-нитроанилид (S4760, Sigma Aldrich) и измеряли поглощение при 405 нм в течение 3 мин с использованием ридера для микропланшетов Infinite® M200 (Tecan). Образец, содержащий только субстрат и буфер, использовали для вычитания холостого, а другой образец с эластазой, субстратом и буферным раствором для определения 100% активности или 0% ингибирования. Все образцы анализировали дважды (Фиг. 11 A). Фиг. 11 B иллюстрирует процентное снижение активности эластазы с помощью рекомбинантного AAT и полученного из плазмы AAT в сравнении с контролем без AAT. Образование комплекса AAT с эластазой было продемонстрировано при проведении 7,5% SDS-PAGE с окрашиванием кумасси бриллиантовым синим R350 на образцах, которые содержали реакционные смеси эластазы и AAT.

ПРИМЕР 7: РЕКОМБИНАНТНЫЙ AAT СНИЖАЕТ АКТИВНОСТЬ ДРУГИХ ПРОТЕАЗ, ТАКИХ КАК ТРИПСИН, in vitro.

[164] Трипсин представляет собой широко используемую и сильную протеазу. Различные концентрации AAT различного происхождения, в том числе рекомбинантного AAT и его вариантов, которые описаны и получены с использованием способов, описанных в данном документе, добавляли к буферу, содержащему трипсин (0,25 мкг/мл), вместе с флуорогенным пептидом (Mca-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH2; SEQ ID №:17) в качестве субстрата. При концентрации 5 нг/мл рекомбинантный AAT, описанный и полученный с помощью способов, представленных в данном документе, (ExcellGene) существенно снижает активность трипсина таким же образом, как и полученный из плазмы AAT (проластин), другой рекомбинантный AAT (R&D systems) или плазма мыши, разбавленная из образца, который содержал около 1,2 г/л AAT мыши (Фиг. 11). Эксперименты повторяли трижды. Горизонтальные линии возле некоторых символов указывают на вариации от среднего значения.

ПРИМЕР 8: РЕКОМБИНАНТНЫЙ AAT СНИЖАЕТ ВЫСВОБОЖДЕНИЕ ФНО-АЛЬФА, ВЫЗВАННОЕ ЭНДОТОКСИНОМ (ИЛИ ЛИПОСАХАРИДОМ)

[165] Адгезивные мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) обрабатывали в течение 4 часов липополисахаридом (ЛПС, 1 мкг/мл). Затем ЛПС удаляли путем трехкратного (3) промывания, после чего в течение 10 часов добавляли различные количества рекомбинантного AAT (в диапазоне от 0 мг/мл до 1 мг/мл). Супернатанты анализировали с помощью иммуноанализа, специфичного к ФНО-α, с использованием ELISA Quantikine® для определения ФНО-α человека, разработанного чтобы измерять уровень ФНО-α человека в супернатантах клеточной культуры, сыворотке и плазме (R&D Systems; Миннеаполис, Миннесота, США). Результаты показаны на Фиг. 12. Двукратное измерение образцов показывает, что при от 0,5 мг/мл до 1 мг/мл рекомбинантного AAT наблюдалось уменьшение высвобождения ФНО-альфа при действии 1 мкг/мл липополисахарида.

[166] На Фиг. 13 мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) инкубировали отдельно, с липополисахаридом (ЛПС) (1 мкг/мл) или с ЛПС и рекомбинантным AAT (1 мг/мл) в течение 10 часов. мРНК (ФНО-α (Фиг. 13A) и ИЛ-6 (Фиг. 13B)) выделяли и анализировали относительно экспрессии гена. Общую РНК получали с использованием микронабора RNeasy® (QIAGEN). Для синтеза кДНК 1 мкг общей РНК транскрибировали с использованием высокопроизводительного набора для обратной транскрипции кДНК (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Уровни мРНК выбранных генов определяли с использованием анализа экспрессии гена TaqMan® (Applied Biosystems, Life Technologies) в системе для ПЦР в режиме реального времени StepOnePlus™ (Applied Biosystems) в сравнении с конститутивным геном гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT).

ПРИМЕР 9: АНАЛИЗ КОЖИ, ОБРАБОТАННОЙ AAT, in vitro

[167] AAT наносили (10 мг рекAAT) на «внешний» слой модели кожи человека (epiCS®; CellSystems) и инкубировали в течение нескольких часов (18 часов), как описано в данном документе. Затем AAT идентифицировали под слоями кожи посредством вестерн-блоттинга, устанавливая AAT с использованием специфических антител. Необработанная кожа epiCS®, окрашенная поликлональным антителом кролика к AAT человека (1:5000; DAKO; Дания), показала, что epiCS® не окрашивается реагентом к AAT (Фиг. 13A); тогда как кожа epiCS®, обработанная рекAAT (10 мг) в течение 18 часов, а затем окрашенная, продемонстрировала положительное окрашивание реагентом к AAT (более темные серые области и стрелки, Фиг. 14B). Анализ супернатанта культуры epiCS®, обработанного рекомбинантным AAT и AAT плазмы с помощью вестерн-блоттинга показала увеличение экспрессии AAT в течение 3 часов, 18 часов и 48 часов. (Фиг. 14C). Фиг. 14D иллюстрирует результаты анализа ELISA (R&D Systems, США) общих уровней IL-18, провоспалительного цитокина и маркера раздражения кожи в супернатанте кожи epiCS®. Раздражение кожи не вызывалось 10 мг рекAAT (светло-серый) и 10 мг AAT плазмы (темно-серый; pAAT; Prolastin®). Фактически к 6 часу как рекAAT, так и AAT плазмы показали ингибирующее влияние на высвобождение ИЛ-18 по сравнению с контролем без AAT (черный).

КОНКРЕТНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[168] Неограничивающие конкретные варианты осуществления изобретения описаны ниже, каждый из которых рассматривается как находящийся в рамках данного описания.

[169] Конкретный вариант осуществления 1) Способ получения рекомбинантного белка человека альфа-1-антитрипсина (AAT), включающий:

a) введение в клетку-хозяина экспрессионного вектора, содержащего фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий белок AAT человека;

b) культивирование клетки-хозяина в условиях, которые делают возможным экспрессию рекомбинантного белка AAT человека; и

c) выделение рекомбинантного белка AAT человека из культивируемой клетки-хозяина, таким образом продуцируя рекомбинантный белок AAT человека.

[170] Конкретный вариант осуществления 2) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 1, в котором фрагмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую кодон-оптимизированную для клеток CHO последовательность AAT человека (и запускается оптимизированным конститутивным промотором).

[171] Конкретный вариант осуществления 3) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 1 или конкретным вариантом осуществления 2, в котором стадия введения включает совместную трансфекцию экспрессионного вектора рекомбинантного AAT человека и экспрессионного вектора, кодирующего транспозазу.

[172] Конкретный вариант осуществления 4) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 3, в котором транспозаза представляет собой транспозазу piggyBac.

[173] Конкретный вариант осуществления 5) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-4, в котором клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.

[174] Конкретный вариант осуществления 6) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-5, в котором клетка-хозяин представляет собой клеточную линию яичника китайского хомячка (CHO).

[175] Конкретный вариант осуществления 7) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 6, в котором клеточная линия CHO представляет собой модифицированную клеточную линию CHO.

[176] Конкретный вариант осуществления 8) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-7, в котором стадию культивирования осуществляют в культуральной среде, и культуральная среда содержит менее около 5% (об./об.) компонентов животного происхождения.

[177] Конкретный вариант осуществления 9) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-8, в котором стадию культивирования осуществляют в культуральной среде, и культуральная среда содержит менее около 2% (об./об.) компонентов животного происхождения.

[178] Конкретный вариант осуществления 10) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-9, в котором стадию культивирования осуществляют в культуральной среде, и культуральная среда состоит из композиции с определенной химической структурой и не содержит рекомбинантный инсулин человека или любой другой белок.

[179] Конкретный вариант осуществления 11) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-10, в котором количество полученного рекомбинантного белка AAT человека составляет от около 1 г/л до около 10 г/л рекомбинантного белка AAT человека.

[180] Конкретный вариант осуществления 12) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-11, в котором количество полученного рекомбинантного белка AAT человека составляет от около 2 г/л до около 6 г/л рекомбинантного белка AAT человека.

[181] Конкретный вариант осуществления 13) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-12, в котором стадия культивирования включает:

отбор клетки-хозяина с фрагментом нуклеиновой кислоты, экспрессирующей рекомбинантный белок AAT человека, причем отобранные клетки представляют собой клетки, полученные клональным способом, экспрессирующие рекомбинантный AAT человека.

[182] Конкретный вариант осуществления 14) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 13, в котором стадия отбора включает:

a) культивирование клеток, полученных клональным способом, экспрессирующих рекомбинантный AAT человека, в культуральной среде;

b) подпитку полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT человека, по меньшей мере одной питательной добавкой;

c) выдерживание культуральной среды при температуре культивирования клеток;

d) снижение температуры культивирования клеток; и

e) культивирование полученных клональным способом клеток при сниженной температуре культивирования, при этом полученные клональным способом клетки экспрессируют рекомбинантный белок AAT человека с титром около 1 г/л или выше.

[183] Конкретный вариант осуществления 15) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 13-14, при этом полученные клональным способом клетки экспрессируют рекомбинантный белок AAT человека с титром выше чем около 4 г/л.

[184] Конкретный вариант осуществления 16) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 13-15, при этом полученные клональным способом клетки экспрессируют рекомбинантный белок AAT человека с титром выше чем около 6 г/л.

[185] Конкретный вариант осуществления 17) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 14-16, в котором температура культивирования клеток находится в интервале от около 35°C до около 38°C.

[186] Конкретный вариант осуществления 18) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 14-17, в котором указанная температура культивирования клеток поддерживается от 0 дня до 3 дня или от 0 дня до 5 дня.

[187] Конкретный вариант осуществления 19) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 14-18, в котором сниженная температура культивирования клеток находится в интервале от около 25°C до около 34°C.

[188] Конкретный вариант осуществления 20) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 14-19, в котором среду для культивирования клеток выдерживают при сниженной температуре культивирования клеток от 3 дня до 17 дня, от 3 дня до 5 дня или от 5 дня до 17 дня или их комбинация.

[189] Конкретный вариант осуществления 21) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 14-20, в котором по меньшей мере одна питательная добавка содержит нейтральную питательную добавку.

[190] Конкретный вариант осуществления 22) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 19, в котором нейтральная питательная добавка составляет по объему от около 1 % до около 8 % от общего объема клеточной культуры.

[191] Конкретный вариант осуществления 23) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 14-22, в котором по меньшей мере одна питательная добавка содержит щелочную питательную добавку.

[192] Конкретный вариант осуществления 24) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 23, в котором щелочная питательная добавка составляет по объему от около 0,1 % до около 0,8 % от общего объема клеточной культуры.

[193] Конкретный вариант осуществления 25) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 14-24, в котором по меньшей мере одна питательная добавка содержит нейтральную питательную добавку и щелочную питательную добавку.

[194] Конкретный вариант осуществления 26) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 25, в котором количество щелочной питательной добавки составляет одну десятую (1/10) от количества нейтральной питательной добавки.

[195] Конкретный вариант осуществления 27) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 14-26, в котором стадию подпитки осуществляют каждый день.

[196] Конкретный вариант осуществления 28) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 14-26, в котором стадию подпитки осуществляют через день.

[197] Конкретный вариант осуществления 29) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-28, в котором стадия культивирования включает осмолярность клеточной культуры около 550 мОсм/кг или более.

[198] Конкретный вариант осуществления 30) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-29, в котором стадия культивирования включает осмолярность клеточной культуры около 550 мОсм/кг или более в 5 день или позже.

[199] Конкретный вариант осуществления 31) Способ получения рекомбинантного белка человека альфа-1-антитрипсина (AAT), включающий:

a) введение в эукариотическую клетку-хозяина первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека, и по меньшей мере дополнительной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу;

b) культивирование эукариотической клетки-хозяина в условиях, которые делают возможным экспрессию первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека;

c) отбор эукариотической клетки-хозяина с фрагментом нуклеиновой кислоты, экспрессирующей белок AAT человека, причем отобранные клетки представляют собой клетки, полученные клональным способом, экспрессирующие рекомбинантный белок AAT человека; и

d) выделение рекомбинантного белка AAT человека из полученных клональным способом клеток, таким образом продуцируя рекомбинантный белок AAT человека.

[200] Конкретный вариант осуществления 32) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 31, в котором эукариотическую клетку-хозяина изменяют с помощью последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный белок AAT человека.

[201] Конкретный вариант осуществления 33) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 31 или конкретным вариантом осуществления 32, в котором стадия выделения включает очистку рекомбинантного белка AAT человека.

[202] Конкретный вариант осуществления изобретения 34) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 33, в котором стадию очистки осуществляют по меньшей мере одним из: эксклюзионной хроматографии, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий, обратно-фазовой хроматографии, гель-фильтрации, разделения с помощью магнитных носителей, селективного осаждения, мембранного фильтрования или вытеснения в зависимости от молекулярной массы, замены буфера, фильтрации вирусов, pH-зависимой инактивации вирусов и тому подобного.

[203] Конкретный вариант осуществления 35) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-34, в котором выделенный рекомбинантный белок человека имеет чистоту около или выше чем около 95%.

[204] Конкретный вариант осуществления 36) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 1-35, в котором выделенный рекомбинантный белок человека имеет чистоту около или выше чем около 98%.

[205] Конкретный вариант осуществления 37) Экспрессионный вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок AAT человека, при этом фрагмент нуклеиновой кислоты расположен в сайте множественного клонирования; интрон выше фрагмента нуклеиновой кислоты; промотор цитомегаловируса (CMV) выше интрона; 5'-инвертированный концевой повтор (5' ITR) выше промотора CMV; поли-аденозиновую хвостовую сигнальную последовательность ниже фрагмента нуклеиновой кислоты; последовательность начала репликации ниже фрагмента нуклеиновой кислоты; селектируемую маркерную последовательность ниже последовательности начала репликации; и 3'-инвертированный концевой повтор (3' ITR) ниже селектируемой маркерной последовательности.

[206] Конкретный вариант осуществления 38) Экспрессионный вектор в соответствии с конкретным вариантом осуществления 37, в котором последовательность селектируемого маркера представляет собой ген устойчивости к пуромицину.

[207] Конкретный вариант осуществления 39) Экспрессионный вектор в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 37-38, в котором фрагмент нуклеиновой кислоты и последовательность селектируемого маркера расположены в противоположных рамках считывания и между 5' ITR и 3' ITR.

[208] Конкретный вариант осуществления 40) Экспрессионный вектор в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 37-39, в котором нуклеотидная последовательность кодирует последовательность рекомбинантного полипептида AAT человека с по меньшей мере одной из: SEQ ID №:1, SEQ ID №:3, SEQ ID №:5 и SEQ ID №:6.

[209] Конкретный вариант осуществления 41) Экспрессионный вектор в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 37-40, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность рекомбинантного полипептида AAT человека, содержит последовательность с по меньшей мере одной из: SEQ ID №:2, SEQ ID №:4, SEQ ID №:6 и SEQ ID №:8.

[210] Конкретный вариант осуществления 42) Экспрессионный вектор в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 37-41, в котором экспрессионный вектор содержит SEQ ID №:9.

[211] Конкретный вариант осуществления 43) Рекомбинантный белок AAT человека, содержащий полипептидную последовательность, которая на около 99% идентична SEQ ID №: 1.

[212] Конкретный вариант осуществления 44) Рекомбинантный белок AAT человека в соответствии с конкретным вариантом осуществления 43, содержащий полипептидную последовательность, имеющую мутацию в SEQ ID №:1, при этом мутация представляет собой замену фенилаланина на лейцин в положении 51 (F51L), замену метионина на валин в положении 351 (M351V), замену метионина на валин в положении 358 (M358V) или любые их комбинации.

[213] Конкретный вариант осуществления 45) Рекомбинантный белок AAT человека в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 43-44, содержащий сиаловую кислоту в количестве в диапазоне от около 3 молей сиаловой кислоты на моль AAT до около 12 молей сиаловой кислоты на моль AAT.

[214] Конкретный вариант осуществления 46) Рекомбинантный белок AAT в соответствии с конкретным вариантом осуществления 45, в котором содержание сиаловой кислоты находится в диапазоне от около 4 молей сиаловой кислоты на моль AAT до около 6 молей сиаловой кислоты на моль AAT.

[215] Конкретный вариант осуществления 47) Рекомбинантный белок AAT в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 45-46, в котором содержание сиаловой кислоты превышает таковое в белке AAT, полученном из плазмы, по меньшей мере на 10%.

[216] Конкретный вариант осуществления 48) Композиция, содержащая рекомбинантный белок AAT человека, полученный с помощью способа по любому из конкретных вариантов осуществления 1-36, и фармацевтически приемлемый носитель.

[217] Конкретный вариант осуществления 49) Композиция, содержащая рекомбинантный белок AAT человека по любому из конкретных вариантов осуществления 43-47, и фармацевтически приемлемый носитель.

[218] Конкретный вариант осуществления 50) Способ лечения субъекта, страдающего от дефицита альфа-1-антитрипсина, включающий введение субъекту эффективного количества рекомбинантного белка AAT человека в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 43-47 для ослабления дефицита альфа-1-антитрипсина у субъекта, осуществляя таким образом лечение субъекта.

[219] Конкретный вариант осуществления 51) Способ лечения субъекта, страдающего от заболевания, которое приводит к вызванному протеазой повреждению тканей, включающий введение субъекту эффективного количества рекомбинантного белка AAT человека в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 43-47 для ослабления вызванного протеазой повреждения тканей у субъекта, осуществляя таким образом лечение субъекта.

[220] Конкретный вариант осуществления 52) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 50-51, в котором рекомбинантный белок AAT человека представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую рекомбинантный белок AAT человека и фармацевтически приемлемый носитель.

[221] Конкретный вариант осуществления 53) Способ в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 50-52, в котором введение осуществляют с помощью одного пути, выбранного из группы, состоящей из: внутривенного, парентерального, через слизистую, местного, трансдермального или путем ингаляции.

[222] Конкретный вариант осуществления 54) Способ получения рекомбинантного белка альфа-1-антитрипсина (AAT) человека, включающий: культивирование клетки-хозяина с первой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека, и по меньшей мере второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу, причем стадию культивирования осуществляют в первый период времени при первой температуре и во второй период времени при второй температуре и необязательно в третий период времени при третьей температуре.

[223] Конкретный вариант осуществления 55) Способ по конкретному варианту осуществления 54, в котором вторая температура меньше, чем первая температура.

[224] Конкретный вариант осуществления 56) Способ по конкретному варианту осуществления 55, в котором третья температура меньше, чем вторая температура.

[225] Конкретный вариант осуществления 57) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 56, в котором первая температура находится в диапазоне от около 31°C до около 37°C.

[226] Конкретный вариант осуществления 58) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 57, в котором вторая температура находится в интервале от около 31°C до около 37°C.

[227] Конкретный вариант осуществления 59) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 58, в котором третья температура находится в интервале от около 31°C до около 37°C.

[228] Конкретный вариант осуществления 60) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 59, в котором первый период времени находится в диапазоне около 1-20 дней.

[229] Конкретный вариант осуществления 61) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 60, в котором второй период времени находится в диапазоне около 1-20 дней.

[230] Конкретный вариант осуществления 62) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 61, в котором третий период времени находится в диапазоне около 1-20 дней.

[231] Конкретный вариант осуществления 63) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 62, в котором стадия культивирования дополнительно включает добавление первой питательной добавки и второй питательной добавки.

[232] Конкретный вариант осуществления 64) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 63, в котором стадию добавления осуществляют через день.

[233] Конкретный вариант осуществления 65) Способ в соответствии с конкретным вариантом осуществления 64, в котором стадию добавления осуществляют каждый день.

[234] Конкретный вариант осуществления 66) Способ по конкретному варианту осуществления 65, в котором культуру для продуцирования насыщают кислородом только в помощью воздуха, избегая чистый кислород.

[235] Конкретный вариант осуществления 67) Способ лечения субъекта, страдающего от чрезмерного продуцирования иммунных факторов, включающий введение субъекту эффективного количества рекомбинантного белка AAT человека в соответствии с любым из конкретных вариантов осуществления 43-47 для снижения чрезмерного продуцирования иммунных факторов у субъекта, осуществляя таким образом лечение субъекта.

[236] Конкретный вариант осуществления 68) Способ по конкретному варианту осуществления 67, в котором иммунный фактор выбран из ФНО, ИЛ-2 или тому подобного или их комбинаций.

[237] В вышеприведенном объекте изобретения можно выполнить различные изменения, не отклоняясь от объема и сущности данного изобретения, и предполагается, что весь материал, содержащийся в вышеприведенном описании или определенный в прилагаемой формуле изобретения, необходимо истолковывать как описывающий и иллюстрирующий данное изобретение. В свете вышеупомянутых идей возможно большое число модификаций и изменений данного изобретения. Следовательно, предполагается, что данное описание охватывает все такие альтернативы, модификации и варианты, которые находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ExcellGene SA

WURM, Maria J.

WURM, Florian M.

JANCIAUSKINE, Sabina

HAMACHER, Jurg

STAMMBERGER, Uz

<120> Способы получения и применения рекомбинантного

альфа-1-антитрипсина (AAT) и композиций на его основе

<130> 178225.10000

<160> 18

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 394

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His

1 5 10 15

Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu

20 25 30

Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr

35 40 45

Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu

65 70 75 80

Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe

85 90 95

Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu

100 105 110

Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp

115 120 125

Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr

130 135 140

Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr

145 150 155 160

Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu

165 170 175

Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly

180 185 190

Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe

195 200 205

His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu

210 215 220

Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu

225 230 235 240

Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp

245 250 255

Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile

260 265 270

Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu

275 280 285

Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly

290 295 300

Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly

305 310 315 320

Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala

325 330 335

Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe

340 345 350

Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys

355 360 365

Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe

370 375 380

Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys

385 390

<210> 2

<211> 1210

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> Последовательность распознавания эндонуклеазой рестрикции

<220>

<221> misc_feature

<222> (1205)..(1210)

<223> Последовательность распознавания эндонуклеазой рестрикции

<400> 2

actagtcacc gaagatcctc aaggtgacgc cgcccaaaag accgatacct cgcatcatga

60

ccaagaccac ccgaccttta acaagatcac tccaaacctg gccgagttcg cattctccct

120

ctacagacag ctggctcacc agtcaaactc aaccaacatc ttcttctccc ctgtgagcat

180

cgccactgcg ttcgccatgc tttcactggg caccaaagcc gatacgcacg acgagatcct

240

ggaggggctc aactttaacc ttaccgaaat cccggaagcg caaatccacg aaggattcca

300

agaacttctg cgcaccctca atcagccaga ctcgcagttg cagctgacta ccggcaacgg

360

actgtttctc tcggaagggc tgaaactcgt ggacaaattc ctcgaggacg tgaagaagct

420

gtaccattcg gaggcgttta ccgtcaattt cggagatacc gaagaagcta aaaagcaaat

480

caatgactac gtggagaagg gaacccaggg aaagatcgtg gacctcgtca aggaattgga

540

ccgggacacc gtgttcgccc tggtgaatta catcttcttt aaaggaaagt gggaaagacc

600

attcgaggtg aaggatactg aggaagaaga tttccacgtc gatcaggtga ctaccgtgaa

660

ggtccccatg atgaagcgcc tgggcatgtt caacatccag cactgtaaga agctgtcctc

720

gtgggtcctg ctcatgaagt acctgggaaa tgcaactgct attttcttcc tcccggatga

780

gggcaaactg cagcaccttg agaacgagct gactcatgat atcattacga agtttctgga

840

aaatgaggac aggcggagcg ccagcctcca tctcccaaag ctgtccatca cggggacgta

900

tgacctgaag tcagtccttg gacagctggg catcactaag gtgtttagca acggtgctga

960

cttgtccgga gtgactgaag aggcaccgct gaaactgtct aaggcggtcc acaaggccgt

1020

gctcaccatc gacgaaaagg gaactgaggc cgctggagca atgttcttgg aggcgatccc

1080

gatgtcgatc cctcccgaag tgaagttcaa taagccgttc gtgtttctga tgattgagca

1140

aaacactaaa agccctctgt tcatgggtaa agtggtgaac ccgactcaga agtagtgatg

1200

ataagaattc

1210

<210> 3

<211> 418

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1)..(24)

<223> Природная лидерная последовательность AAT человека

<400> 3

Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys

1 5 10 15

Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala

20 25 30

Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn

35 40 45

Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln

50 55 60

Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser

65 70 75 80

Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr

85 90 95

His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro

100 105 110

Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn

115 120 125

Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu

130 135 140

Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys

145 150 155 160

Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu

165 170 175

Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys

180 185 190

Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu

195 200 205

Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val

210 215 220

Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val

225 230 235 240

Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys

245 250 255

Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala

260 265 270

Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu

275 280 285

Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp

290 295 300

Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr

305 310 315 320

Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe

325 330 335

Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys

340 345 350

Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly

355 360 365

Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile

370 375 380

Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu

385 390 395 400

Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr

405 410 415

Gln Lys

<210> 4

<211> 1282

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> Сайт распознавания эндонуклеазой рестрикции

<220>

<221> misc_feature

<222> (1277)..(1282)

<223> Сайт распознавания эндонуклеазой рестрикции

<400> 4

actagtcacc atgccgagca gcgtgagctg gggcattctg ctgctggcgg gcctgtgctg

60

cctggtgccg gtgagcctgg cggaagatcc tcaaggtgac gccgcccaaa agaccgatac

120

ctcgcatcat gaccaagacc acccgacctt taacaagatc actccaaacc tggccgagtt

180

cgcattctcc ctctacagac agctggctca ccagtcaaac tcaaccaaca tcttcttctc

240

ccctgtgagc atcgccactg cgttcgccat gctttcactg ggcaccaaag ccgatacgca

300

cgacgagatc ctggaggggc tcaactttaa ccttaccgaa atcccggaag cgcaaatcca

360

cgaaggattc caagaacttc tgcgcaccct caatcagcca gactcgcagt tgcagctgac

420

taccggcaac ggactgtttc tctcggaagg gctgaaactc gtggacaaat tcctcgagga

480

cgtgaagaag ctgtaccatt cggaggcgtt taccgtcaat ttcggagata ccgaagaagc

540

taaaaagcaa atcaatgact acgtggagaa gggaacccag ggaaagatcg tggacctcgt

600

caaggaattg gaccgggaca ccgtgttcgc cctggtgaat tacatcttct ttaaaggaaa

660

gtgggaaaga ccattcgagg tgaaggatac tgaggaagaa gatttccacg tcgatcaggt

720

gactaccgtg aaggtcccca tgatgaagcg cctgggcatg ttcaacatcc agcactgtaa

780

gaagctgtcc tcgtgggtcc tgctcatgaa gtacctggga aatgcaactg ctattttctt

840

cctcccggat gagggcaaac tgcagcacct tgagaacgag ctgactcatg atatcattac

900

gaagtttctg gaaaatgagg acaggcggag cgccagcctc catctcccaa agctgtccat

960

cacggggacg tatgacctga agtcagtcct tggacagctg ggcatcacta aggtgtttag

1020

caacggtgct gacttgtccg gagtgactga agaggcaccg ctgaaactgt ctaaggcggt

1080

ccacaaggcc gtgctcacca tcgacgaaaa gggaactgag gccgctggag caatgttctt

1140

ggaggcgatc ccgatgtcga tccctcccga agtgaagttc aataagccgt tcgtgtttct

1200

gatgattgag caaaacacta aaagccctct gttcatgggt aaagtggtga acccgactca

1260

gaagtagtga tgataagaat tc

1282

<210> 5

<211> 413

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1)..(19)

<223> Лидерная последовательность тяжелой цепи IgG человека

<400> 5

Met Glu Phe Trp Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr

20 25 30

Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn

35 40 45

Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser

50 55 60

Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe

65 70 75 80

Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu

85 90 95

Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His

100 105 110

Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln

115 120 125

Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys

130 135 140

Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu

145 150 155 160

Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile

165 170 175

Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val

180 185 190

Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe

195 200 205

Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu

210 215 220

Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met

225 230 235 240

Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser

245 250 255

Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe

260 265 270

Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His

275 280 285

Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser

290 295 300

Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser

305 310 315 320

Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp

325 330 335

Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val

340 345 350

His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly

355 360 365

Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys

370 375 380

Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser

385 390 395 400

Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys

405 410

<210> 6

<211> 1267

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> Последовательность распознавания эндонуклеазой рестрикции

<220>

<221> misc_feature

<222> (1262)..(1267)

<223> Последовательность распознавания эндонуклеазой рестрикции

<400> 6

actagtcacc atggaatttt ggctgtcctg ggttttcctc gttgcaatct tgaaaggcgt

60

ccagtgcgaa gatcctcaag gtgacgccgc ccaaaagacc gatacctcgc atcatgacca

120

agaccacccg acctttaaca agatcactcc aaacctggcc gagttcgcat tctccctcta

180

cagacagctg gctcaccagt caaactcaac caacatcttc ttctcccctg tgagcatcgc

240

cactgcgttc gccatgcttt cactgggcac caaagccgat acgcacgacg agatcctgga

300

ggggctcaac tttaacctta ccgaaatccc ggaagcgcaa atccacgaag gattccaaga

360

acttctgcgc accctcaatc agccagactc gcagttgcag ctgactaccg gcaacggact

420

gtttctctcg gaagggctga aactcgtgga caaattcctc gaggacgtga agaagctgta

480

ccattcggag gcgtttaccg tcaatttcgg agataccgaa gaagctaaaa agcaaatcaa

540

tgactacgtg gagaagggaa cccagggaaa gatcgtggac ctcgtcaagg aattggaccg

600

ggacaccgtg ttcgccctgg tgaattacat cttctttaaa ggaaagtggg aaagaccatt

660

cgaggtgaag gatactgagg aagaagattt ccacgtcgat caggtgacta ccgtgaaggt

720

ccccatgatg aagcgcctgg gcatgttcaa catccagcac tgtaagaagc tgtcctcgtg

780

ggtcctgctc atgaagtacc tgggaaatgc aactgctatt ttcttcctcc cggatgaggg

840

caaactgcag caccttgaga acgagctgac tcatgatatc attacgaagt ttctggaaaa

900

tgaggacagg cggagcgcca gcctccatct cccaaagctg tccatcacgg ggacgtatga

960

cctgaagtca gtccttggac agctgggcat cactaaggtg tttagcaacg gtgctgactt

1020

gtccggagtg actgaagagg caccgctgaa actgtctaag gcggtccaca aggccgtgct

1080

caccatcgac gaaaagggaa ctgaggccgc tggagcaatg ttcttggagg cgatcccgat

1140

gtcgatccct cccgaagtga agttcaataa gccgttcgtg tttctgatga ttgagcaaaa

1200

cactaaaagc cctctgttca tgggtaaagt ggtgaacccg actcagaagt agtgatgata

1260

agaattc

1267

<210> 7

<211> 418

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1)..(24)

<223> Лидерная последовательность AAT шимпанзе

<400> 7

Met Leu Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys

1 5 10 15

Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala

20 25 30

Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn

35 40 45

Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln

50 55 60

Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser

65 70 75 80

Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr

85 90 95

His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro

100 105 110

Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn

115 120 125

Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu

130 135 140

Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys

145 150 155 160

Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu

165 170 175

Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys

180 185 190

Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu

195 200 205

Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val

210 215 220

Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val

225 230 235 240

Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys

245 250 255

Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala

260 265 270

Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu

275 280 285

Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp

290 295 300

Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr

305 310 315 320

Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe

325 330 335

Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys

340 345 350

Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly

355 360 365

Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile

370 375 380

Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu

385 390 395 400

Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr

405 410 415

Gln Lys

<210> 8

<211> 1282

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> Последовательность распознавания эндонуклеазой рестрикции

<220>

<221> misc_feature

<222> (1277)..(1282)

<223> Последовательность распознавания эндонуклеазой рестрикции

<400> 8

actagtcacc atgctgagca gcgtgagctg gggcattctg ctgctggcgg gcctgtgctg

60

cctggtgccg gtgagcctgg cggaagatcc tcaaggtgac gccgcccaaa agaccgatac

120

ctcgcatcat gaccaagacc acccgacctt taacaagatc actccaaacc tggccgagtt

180

cgcattctcc ctctacagac agctggctca ccagtcaaac tcaaccaaca tcttcttctc

240

ccctgtgagc atcgccactg cgttcgccat gctttcactg ggcaccaaag ccgatacgca

300

cgacgagatc ctggaggggc tcaactttaa ccttaccgaa atcccggaag cgcaaatcca

360

cgaaggattc caagaacttc tgcgcaccct caatcagcca gactcgcagt tgcagctgac

420

taccggcaac ggactgtttc tctcggaagg gctgaaactc gtggacaaat tcctcgagga

480

cgtgaagaag ctgtaccatt cggaggcgtt taccgtcaat ttcggagata ccgaagaagc

540

taaaaagcaa atcaatgact acgtggagaa gggaacccag ggaaagatcg tggacctcgt

600

caaggaattg gaccgggaca ccgtgttcgc cctggtgaat tacatcttct ttaaaggaaa

660

gtgggaaaga ccattcgagg tgaaggatac tgaggaagaa gatttccacg tcgatcaggt

720

gactaccgtg aaggtcccca tgatgaagcg cctgggcatg ttcaacatcc agcactgtaa

780

gaagctgtcc tcgtgggtcc tgctcatgaa gtacctggga aatgcaactg ctattttctt

840

cctcccggat gagggcaaac tgcagcacct tgagaacgag ctgactcatg atatcattac

900

gaagtttctg gaaaatgagg acaggcggag cgccagcctc catctcccaa agctgtccat

960

cacggggacg tatgacctga agtcagtcct tggacagctg ggcatcacta aggtgtttag

1020

caacggtgct gacttgtccg gagtgactga agaggcaccg ctgaaactgt ctaaggcggt

1080

ccacaaggcc gtgctcacca tcgacgaaaa gggaactgag gccgctggag caatgttctt

1140

ggaggcgatc ccgatgtcga tccctcccga agtgaagttc aataagccgt tcgtgtttct

1200

gatgattgag caaaacacta aaagccctct gttcatgggt aaagtggtga acccgactca

1260

gaagtagtga tgataagaat tc

1282

<210> 9

<211> 6504

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1948)..(1953)

<223> Последовательность распознавания эндонуклеазой рестрикции

<220>

<221> misc_feature

<222> (2015)..(3196)

<223> Кодон-оптимизированная последовательность белка AAT для клеток

CHO

<220>

<221> misc_feature

<222> (3209)..(3214)

<223> Последовательность распознавания эндонуклеазой рестрикции

<400> 9

ggcgcgcctt aaccctagaa agatagtctg cgtaaaattg acgcatgcat tcttgaaata

60

ttgctctctc tttctaaata gcgcgaatcc gtcgctgtgc atttaggaca tctcagtcgc

120

cgcttggagc tcccgtgagg cgtgcttgtc aatgcggtaa gtgtcactga ttttgaacta

180

taacgaccgc gtgagtcaaa atgacgcatg attatctttt acgtgacttt taagatttaa

240

ctcatacgat aattatattg ttatttcatg ttctacttac gtgataactt attatatata

300

tattttcttg ttatagatat catcgataac aggaaagttc cattggagcc aagtacattg

360

agtcaatagg gactttccaa tgggttttgc ccagtacata aggtcaatgg gaggtaagcc

420

aatgggtttt tcccattact ggcacgtata ctgagtcatt agggactttc caatgggttt

480

tgcccagtac ataaggtcaa taggggtgaa tcaacaggaa agttccattg gagccaagta

540

cactgagtca atagggactt tccattgggt tttgcccagt acaaaaggtc aatagggggt

600

gagtcaatgg gtttttccca ttattggcac gtacataagg tcaatagggg tgagtcattg

660

ggtttttcca gccaatttaa ttaaaacgcc atgtactttc ccaccattga cgtcaatggg

720

ctattgaaac taatgcaacg tgacctttaa acggtacttt cccatagctg attaatggga

780

aagtaccgtt ctcgagccaa tacacgtcaa tgggaagtga aagggcagcc aaaacgtaac

840

accgccccgg ttttcccctg gaaattccat attggcacgc attctattgg ctgagctgcg

900

ttctacgtgg gtataagagg cgcgaccagc gtcggtaccg tcgcagtctt cggtctgacc

960

accgtagaac gcagagctcc tcgctgcagg caagcttggt aagtgccgtg tgtggttccc

1020

gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc cttgcgtgcc ttgaattact tccacgcccc

1080

tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg

1140

aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc

1200

tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag

1260

tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt

1320

cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc

1380

gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca

1440

ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg

1500

ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga

1560

gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc

1620

tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc

1680

gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg

1740

agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc

1800

cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg

1860

gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa

1920

agtttttttc ttccatttca gggatccact agtcaccatg gaattttggc tgtcctgggt

1980

tttcctcgtt gcaatcttga aaggcgtcca gtgcgaagat cctcaaggtg acgccgccca

2040

aaagaccgat acctcgcatc atgaccaaga ccacccgacc tttaacaaga tcactccaaa

2100

cctggccgag ttcgcattct ccctctacag acagctggct caccagtcaa actcaaccaa

2160

catcttcttc tcccctgtga gcatcgccac tgcgttcgcc atgctttcac tgggcaccaa

2220

agccgatacg cacgacgaga tcctggaggg gctcaacttt aaccttaccg aaatcccgga

2280

agcgcaaatc cacgaaggat tccaagaact tctgcgcacc ctcaatcagc cagactcgca

2340

gttgcagctg actaccggca acggactgtt tctctcggaa gggctgaaac tcgtggacaa

2400

attcctcgag gacgtgaaga agctgtacca ttcggaggcg tttaccgtca atttcggaga

2460

taccgaagaa gctaaaaagc aaatcaatga ctacgtggag aagggaaccc agggaaagat

2520

cgtggacctc gtcaaggaat tggaccggga caccgtgttc gccctggtga attacatctt

2580

ctttaaagga aagtgggaaa gaccattcga ggtgaaggat actgaggaag aagatttcca

2640

cgtcgatcag gtgactaccg tgaaggtccc catgatgaag cgcctgggca tgttcaacat

2700

ccagcactgt aagaagctgt cctcgtgggt cctgctcatg aagtacctgg gaaatgcaac

2760

tgctattttc ttcctcccgg atgagggcaa actgcagcac cttgagaacg agctgactca

2820

tgatatcatt acgaagtttc tggaaaatga ggacaggcgg agcgccagcc tccatctccc

2880

aaagctgtcc atcacgggga cgtatgacct gaagtcagtc cttggacagc tgggcatcac

2940

taaggtgttt agcaacggtg ctgacttgtc cggagtgact gaagaggcac cgctgaaact

3000

gtctaaggcg gtccacaagg ccgtgctcac catcgacgaa aagggaactg aggccgctgg

3060

agcaatgttc ttggaggcga tcccgatgtc gatccctccc gaagtgaagt tcaataagcc

3120

gttcgtgttt ctgatgattg agcaaaacac taaaagccct ctgttcatgg gtaaagtggt

3180

gaacccgact cagaagtagt gatgataaga attctgcaga tatccatcac actggcggcc

3240

gctcgagcat gcatctagag ggccctattc tatagtgtca cctaaatgct agagctcgct

3300

gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc

3360

cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg

3420

catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca

3480

agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt

3540

ctgaggcgga aagaaccagt ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca

3600

ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg

3660

ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt

3720

cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc

3780

ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct

3840

tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc

3900

gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta

3960

tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca

4020

gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag

4080

tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag

4140

ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt

4200

agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa

4260

gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg

4320

attttggtca taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca

4380

caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca

4440

tcaatgtatc ttatcatgtc tggatccgct tcaggcaccg ggcttgcggg tcatgcacca

4500

ggtgcgcggt ccttcgggca cctcgacgtc ggcggtgacg gtgaagccga gccgctcgta

4560

gaaggggagg ttgcggggcg cggaggtctc caggaaggcg ggcaccccgg cgcgctcggc

4620

cgcctccact ccggggagca cgacggcgct gcccagaccc ttgccctggt ggtcgggcga

4680

gacgccgacg gtggccagga accacgcggg ctccttgggc cggtgcggcg ccaggaggcc

4740

ttccatctgt tgctgcgcgg ccagcctgga accgctcaac tcggccatgc gcgggccgat

4800

ctcggcgaac accgcccccg cttcgacgct ctccggcgtg gtccagaccg ccaccgcggc

4860

gccgtcgtcc gcgacccaca ccttgccgat gtcgagcccg acgcgcgtga ggaagagttc

4920

ttgcagctcg gtgacccgct cgatgtggcg gtccgggtcg acggtgtggc gcgtggcggg

4980

gtagtcggcg aacgcggcgg cgagggtgcg tacggcccgg gggacgtcgt cgcgggtggc

5040

gaggcgcacc gtgggcttgt actcggtcat ggtggcctgc agagtcgctc tgtgttcgag

5100

gccacacgcg tcaccttaat atgcgaagtg gacctgggac cgcgccgccc cgactgcatc

5160

tgcgtgtttt cgccaatgac aagacgctgg gcggggtttg tgtcatcata gaactaaaga

5220

catgcaaata tatttcttcc ggggacaccg ccagcaaacg cgagcaacgg gccacgggga

5280

tgaagcagct ggctagctaa aagttttgtt actttataga agaaattttg agtttttgtt

5340

tttttttaat aaataaataa acataaataa attgtttgtt gaatttatta ttagtatgta

5400

agtgtaaata taataaaact taatatctat tcaaattaat aaataaacct cgatatacag

5460

accgataaaa cacatgcgtc aattttacgc atgattatct ttaacgtacg tcacaatatg

5520

attatctttc tagggttaat tcgaacagct ggttctttcc gcctcaggac tcttcctttt

5580

tcaataaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa

5640

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc

5700

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga

5760

taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa

5820

gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt

5880

gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg

5940

ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc

6000

aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg

6060

gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag

6120

cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt

6180

actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt

6240

caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac

6300

gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac

6360

ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag

6420

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa

6480

tactcatact cttccttttt caat

6504

<210> 10

<211> 594

<212> Белок

<213> Trichoplusia ni

<400> 10

Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln

1 5 10 15

Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp

20 25 30

His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile

35 40 45

Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu

50 55 60

Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn

65 70 75 80

Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His

85 90 95

Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu

100 105 110

Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile

115 120 125

Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile

130 135 140

Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg

145 150 155 160

Glu Ser Met Thr Gly Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile

165 170 175

Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn

180 185 190

His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr

195 200 205

Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu

210 215 220

Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val

225 230 235 240

Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile

245 250 255

Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu

260 265 270

Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Met Tyr Ile Pro Asn Lys Pro

275 280 285

Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys

290 295 300

Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn

305 310 315 320

Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val

325 330 335

His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile

340 345 350

Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val

355 360 365

Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn

370 375 380

Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro

385 390 395 400

Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu

405 410 415

Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys

420 425 430

Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr

435 440 445

Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg

450 455 460

Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn

465 470 475 480

Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val

485 490 495

Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser

500 505 510

Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu

515 520 525

Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Asn Glu Val Pro Gly Thr Ser

530 535 540

Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr

545 550 555 560

Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys

565 570 575

Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser

580 585 590

Cys Phe

<210> 11

<211> 24

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1)..(24)

<223> Природная лидерная последовательность AAT H. sapiens и

Hylobates sp.

<400> 11

Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys

1 5 10 15

Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala

20

<210> 12

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Signal

<222> (1)..(19)

<223> Лидерная последовательность тяжелой цепи IgG H. sapiens

<400> 12

Met Glu Phe Trp Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 13

<211> 24

<212> Белок

<213> Pan troglodytes

<220>

<221> Signal

<222> (1)..(24)

<223> Лидерная последовательность AAT Pan troglodytes (шимпанзе)

<400> 13

Met Leu Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys

1 5 10 15

Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala

20

<210> 14

<211> 18

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Signal

<222> (1)..(18)

<223> Лидерная последовательность сывороточного альбумина H. sapiens

<400> 14

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser

<210> 15

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Signal

<222> (1)..(19)

<223> Лидерная последовательность азуроцидина H. sapiens

<400> 15

Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser

1 5 10 15

Ser Arg Ala

<210> 16

<211> 22

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Signal

<222> (1)..(22)

<223> Лидерная последовательность легкой каппа-цепи Ig H. sapiens

<400> 16

Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Val Ser Asp Thr Thr Gly

20

<210> 17

<211> 20

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<221> Signal

<222> (1)..(20)

<223> Легкая каппа-цепь Ig мыши и хомяка

<400> 17

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 18

<211> 9

<212> Белок

<213> Синтетический

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> (7-Метоксикумарин-4-ил)ацетил (Mca), присоединенный перед

остатком в

положении 1

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = Норвалин (Nva)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 2,4-Динитрофенил (Dnp), присоединенный после остатка в

положении 9

<400> 18

Arg Pro Lys Val Glu Xaa Trp Arg Lys

1 5

<---

Изобретение относится к биотехнологии и представляет способ получения рекомбинантного белка альфа-1-антитрипсина человека (AAT), включающий следующие стадии: a) введение в эукариотическую клетку-хозяина последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека, и по меньшей мере дополнительной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу, выбранную из группы, состоящей из piggyBac, Tol-2, Sleeping Beauty и Leap-In; b) культивирование эукариотической клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека; c) отбор эукариотической клетки-хозяина с фрагментом нуклеиновой кислоты, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок AAT человека, причем отобранные клетки представляют собой клетки, полученные клональным способом, экспрессирующие рекомбинантный белок AAT человека; и d) выделение рекомбинантного белка AAT человека из полученных клональным способом клеток, где указанная эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клеточную линию яичника китайского хомячка (CHO). Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный альфа-1-антитрипсин с высоким выходом и биодоступностью для лечения дефицита AAT. 22 з.п. ф-лы, 15 ил., 4 табл., 9 пр.

1. Способ получения рекомбинантного белка альфа-1-антитрипсина человека (AAT), включающий:

a) введение в эукариотическую клетку-хозяина последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека, и по меньшей мере дополнительной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу,

где указанная транспозаза выбрана из группы, состоящей из piggyBac, Tol-2, Sleeping Beauty и Leap-In;

b) культивирование эукариотической клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека;

c) отбор эукариотической клетки-хозяина с фрагментом нуклеиновой кислоты, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок AAT человека, причем отобранные клетки представляют собой клетки, полученные клональным способом, экспрессирующие рекомбинантный белок AAT человека; и

d) выделение рекомбинантного белка AAT человека из полученных клональным способом клеток, где указанная эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клеточную линию яичника китайского хомячка (CHO),

таким образом продуцируя рекомбинантный белок AAT человека.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фрагмент нуклеиновой кислоты кодирует кодон-оптимизированную для клетки CHO последовательность AAT человека.

3. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что введение (а) включает котрансфекцию экспрессионного вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую AAT человека, и дополнительной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу, где указанная дополнительная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой мРНК.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что эукариотическую клетку-хозяина трансформируют последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный белок AAT человека.

5. Способ по п. 1 или п. 4, отличающийся тем, что выделение (d) включает очистку рекомбинантного белка AAT человека.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что очистку осуществляют по меньшей мере одним из: эксклюзионной хроматографии, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий, обращенно-фазовой хроматографии, гель-фильтрации, разделения с помощью магнитных носителей, селективного осаждения, мембранного фильтрования или вытеснения в зависимости от молекулярной массы, замены буфера, фильтрации вирусов, инактивации вирусов в зависимости от pH и тому подобного.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что выделенный рекомбинантный белок человека имеет чистоту, составляющую около или выше чем около 95%.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отбор (с) включает:

i) культивирование клеток, полученных клональным способом, экспрессирующих рекомбинантный AAT человека, в культуральной среде;

ii) подпитку полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT человека, по меньшей мере одной питательной добавкой;

iii) выдерживание культуральной среды при температуре культивирования клеток;

iv) снижение температуры культивирования клеток; и

v) культивирование полученных клональным способом клеток при сниженной температуре культивирования клеток, при этом полученные клональным способом клетки экспрессируют рекомбинантный белок AAT человека с титром около 1 г/л или выше.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что температура культивирования клеток находится в интервале от около 35 °C до около 38 °C.

10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что сниженная температура культивирования клеток находится в интервале от около 25 °C до около 34 °C.

11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что по меньшей мере одна питательная добавка содержит нейтральную питательную добавку.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что нейтральная питательная добавка составляет по объему от около 1 % до около 8 % от общего объема клеточной культуры.

13. Способ по п. 8, отличающийся тем, что по меньшей мере одна питательная добавка содержит щелочную питательную добавку.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что щелочная питательная добавка составляет по объему от около 0,1 % до около 0,8 % от общего объема клеточной культуры.

15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадия культивирования включает осмолярность клеточной культуры около 550 мОсм/кг или более.

16. Способ по любому из пп. 8-15, отличающийся тем, что по меньшей мере одна питательная добавка содержит нейтральную питательную добавку и щелочную питательную добавку.

17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок AAT человека, включен в экспрессионный вектор, и по меньшей мере дополнительная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу, представляет собой мРНК,

причем указанный экспрессионный вектор содержит:

фрагмент нуклеиновой кислоты, расположенный в сайте множественного клонирования;

интрон выше фрагмента нуклеиновой кислоты;

промотор цитомегаловируса (CMV) выше интрона;

5'-инвертированный концевой повтор (5' ITR) выше промотора CMV;

поли-аденозиновую хвостовую сигнальную последовательность ниже фрагмента нуклеиновой кислоты;

последовательность начала репликации ниже фрагмента нуклеиновой кислоты;

селектируемую маркерную последовательность ниже последовательности начала репликации;

и 3'-инвертированный концевой повтор (3' ITR) ниже селектируемой маркерной последовательности.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что последовательность селектируемого маркера представляет собой ген устойчивости к пуромицину.

19. Способ по любому из пп. 17-18, отличающийся тем, что фрагмент нуклеиновой кислоты и последовательность селектируемого маркера расположены в противоположных рамках считывания и между 5' ITR и 3' ITR.

20. Способ по любому из пп. 17-19, отличающийся тем, что белок AAT человека содержит полипептидную последовательность согласно по меньшей мере одной из: SEQ ID №:1, SEQ ID №:3, SEQ ID №:5 и SEQ ID №:6.

21. Способ по любому из пп. 17-20, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность рекомбинантного полипептида AAT человека, содержит последовательность согласно по меньшей мере одной из: SEQ ID №:2, SEQ ID №:4, SEQ ID №:6 и SEQ ID №:8.

22. Способ по любому из пп. 17-21, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит SEQ ID №: 9.

23. Способ по п. 17, отличающийся тем, что белок AAT человека содержит полипептидную последовательность, которая на около 99% идентична SEQ ID №: 1, при этом полипептидная последовательность содержит мутацию в SEQ ID №: 1, при этом мутация выбрана из группы, состоящей из замены фенилаланина на лейцин в положении 51 (F51L), замены метионина на валин в положении 351 (M351V), замены метионина на валин в положении 358 (M358V) и любой их комбинации.