Способ подготовки венозной крови крыс для проведения биохимического и протеомного анализа Российский патент 2025 года по МПК G01N33/50 A61B5/00 G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, физиологии и ветеринарии, а именно к клинической лабораторной диагностике и касается способа пробоподготовки венозной крови. Может быть использовано для проведения биохимического анализа крови и протеомного анализа у лабораторных белых, диких серых (Rattus norvegicus) и диких черных (Rattus rattus) крыс.

Протеомика - современное направление молекулярной биологии, изучающее белки, экспрессирующиеся в клетке, ткани или организме в определенный момент времени (протеом). А также исследование белков, обнаруживаемых в биологических жидкостях, в частности в плазме крови. Задача протеомики - это предсказание и определение функциональной роли конкретных белков на основе как качественного, так и количественного анализа их присутствия в разных клетках, установления взаимосвязи между структурой белка и его функциями. Следовательно, объектами исследований являются биологические жидкости и ткани человека, животных и микроорганизмов / Humphery-Smith I., Cordwell S.J., Blackstock W.P. Proteome research: complementarity and limitations with respect to the RNA and DNA worlds. // Tlectrophoresis/1997/1891217-1242/.

Протеомный анализ включает в себя подготовку проб, фракционирование и идентификацию белков. Как было показано исследователями / Говорун В.М. Арчаков А.И. / «Протеомные технологии в современной биомедицинской науке. Обзор // Биохимия, 2002, том 67, вып.10, с. 1341-1359 / первичная подготовка проб - одна из важнейших стадий протеомного анализа. От того, как проведена пробоподготовка, зависят все дальнейшие результаты, т.к. существует множество факторов, оказывающих влияние на последующее разделение белков и на интерпретацию результатов. Также методы протеомики могут быть использованы в медицине и ветеринарии с целью выявления тех или иных характеристик больного и здорового организма. Биохимический анализ крови можно рассматривать как частный случай протеомного анализа.

Поскольку основными модельными животными, как и прежде, являются грызуны, в частности мыши и крысы, в последние годы стало появляться все больше публикаций, посвященных результатам исследований с их использованием. Так, по мнению В.А. Кашкина с соавторами // Международный вестник ветеринарии, №4, 2013 г. УДК 615.273.5 «Особенности состояния гемостаза у крыс» В.А. Кашкин, А.П. Соколова, Т.В. Абрашова, М.Н. Макарова, В.Г. Макаров (СПб ИФ) ISSN 2072-2419, Санкт-Петербург – 2013, стр. 88-94 // большой интерес представляют тестовые системы, позволяющие изучать систему гемостаза человека, а также возможность применения современных лабораторных методов в эксперименте на животных.

В статье «Вестник экспериментальной и клинической хирургии» Том XI, №2 2018 А.А. Кинзерский, В.Т. Долгих, М.С. Коржук, Д.А. Кинзерская, В.Е. Зайцева «Особенности системы гемостаза крысы линии Wistar, важные для экспериментальной хирургии» стр. 125-132. ISSN 2070-478Х. (P)ISSN 2409-143X, описан сложный процесс остановки кровотечения, который условно разделили на 2 этапа:

- первичный, или сосудисто-тромбоцитарный процесс, характеризующийся спазмом сосудов и их механической закупоркой агрегатами тромбоцитов с образованием белого тромбоцитарного (первичного) тромба;

- вторичный, или коагуляционный процесс, протекающий с использованием многочисленных факторов свертывания крови и обеспечивающий плотную закупорку поврежденных сосудов фибриновым тромбом.

В патенте RU 2667964 С1 так же указывается, что коагуляция крови является результатом комплексного взаимодействия нескольких белковых факторов свертывания в рамках коагуляционного каскада. В целом, повреждение сосудистого эндотелия обнажает эндотелиальные структуры, которые привлекают тромбоциты и индуцируют их для обратной агрегации. Белок тромбин, формируемый в течение активации пути коагуляции, вырабатывает связанные между собой нерастворимые фибриллы белка фибрина и вызывает обратную агрегацию тромбоцитов. Образующийся в результате этого тромбоцитарно-фибриновый сгусток является эффективным барьером, предотвращающим потерю крови из сосудистой системы.

В целях разработки эффективного способа подготовки проб венозной крови крыс для последующего биохимического и протеомного аналаза необходимо принимать во внимание различия в гемостазе человека и крыс. Как свидетельствуют результаты исследований Кашкина В.А. с соавторами (см. ссылку выше) по оценке сосудисто-тромбоцитарного (первичного) гемостаза, характеризующего агрегатное состояние крови и функциональную активность кровяных пластинок, общее количество тромбоцитов у крыс колеблется в пределах (620-690)×10⁹/л. У человека данные величины существенно ниже (150-450)×10⁹/л. Поскольку ключевая роль в запуске гемостатических реакций отводится тромбоцитам, то соответственно их большое количество должно свидетельствовать о повышенной свертываемости крови у крыс. При этом тромбоциты крыс и человека гетерогенны и существенно различаются по морфологии. Тромбокрит и широта распределения тромбоцитов по объему у крыс значительно выше, чем у человека, а средний объем клеток не превышает нижнюю границу показателя в популяции людей. При этом важный параметр коагуляционного гемостаза, характеризующий первую фазу свертывания крови - время образования протромбиназного комплекса (активированное парциальное тромбопластиновое время - АЧТВ), которое заканчивается образованием протромбина, у крыс значительно короче и составляет (17-22) сек., а у людей - (30-55) сек. Авторы делают вывод, что механизм образования протромбиназного комплекса (первой фазы свертывания крови) у крыс и человека различается, что, вероятно, связано с количеством факторов свертывания.

Сыворотка крови и без посторонних включений (содержимого разрушенных клеток крови, продуктов их лизиса и окисления, частиц фибрина и др.) очень трудный материал, который содержит большое количество высокомолекулярных белков, солей и липидов / Сорокина А.В., Радзинский В.Е. Поиск пептидных маркеров гинекологических заболеваний в сыворотке крови с использованием МАЛДИ-масс-спектрометрии // Вестник Российского университета дружбы народов. - Серия «Медицина. Акушерство и гинекология». - 2011. - No 6. - С. 122-130. / При проведении МС-исследования масс-спектры веществ, присутствовавшие в крови, могут интерферировать со спектрами анализируемых пептидов и искажать результаты протеомного анализа, в связи, с чем пробоподготовка биологического образца имеет огромное значение.

Из выше представленной информации следует два важных вывода:

1. Для получения чистой негемолизированной плазмы/сыворотки крови крыс необходимо максимально замедлить или вообще предотвратить процесс запуска коагуляционного каскада в отобранной пробе крови;

2. Все существующие способы и системы отбора проб крови у людей для последующего выделения плазмы/сыворотки не пригодны для этих целей у крыс.

Целью изобретения является разработка способа получения не гемолизированного биологического образца сыворотки крови диких и лабораторных крыс, что должно обеспечивать точность определения концентрации белков при проведении полноценного протеомного и биохимического анализа, снижать индивидуальную вариабельность показателей.

Известен способ подготовки пробы периферической крови для ИФА (Меньшиков В.В. Руководство по клинической лабораторной диагностике. - М.: Медицина, 1982. - 420 с.). В соответствии, с которым производят забор 5 мл периферической крови из локтевой вены человека. В пробирку с кровью добавляют антикоагулянт (гепарин) из расчета на 1 мл крови - 5 ед. гепарина. Тщательно перемешивают. Пробу центрифугируют в течение 5 мин со скоростью 3000 об/мин. После этого забирают 0,1 мл надосадочной жидкости и помещают в лунку планшета для определения содержания цитокинов с помощью ИФА по стандартной методике в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Недостатком способа является невозможность получения не окрашенной сыворотки (окраска является признаком начавшегося гемолиза), а также значительная вариабельность индивидуальных биохимических показателей у крыс, что влияет на точность результатов анализов.

В литературе описан способ получения нативной сыворотки крови животных, представленный в патенте RU 2716712 С1, включающий взятие крови в емкость, отслаивание при температуре 37-38°С с последующей ретракцией сгустка в холодильнике при температуре 4-6°С, отсос сыворотки, центрифугирование, консервирование. Метод взятия крови осуществляют после предварительного смачивания стенок емкости гипохлоритом натрия с концентрацией 300-350 мг/л из расчета 3,0-3,5 мл гипохлорита натрия на 1 л объема емкости, используемой для взятия крови, а процесс отслаивания проводят в течение 2-3 ч при последующей ретракции сгустка в холодильнике в течение 16-18 ч, и отсоса основной партии сыворотки. Данный способ является не приемлемым для пробоподготовки с целью определения биохимических показателей крови и протеомного анализа у лабораторных белых, диких серых и черных крыс, так как выдерживание отобранной крови при температуре 37-38°С в течение 2-3 ч для отслаивания, а также ретракция в холодильнике 16-18 ч, способствуют окислению белков крови, что отрицательно скажется на полученных результатах.

Способ пробоподготовки крови, представленный в патенте RU 2626515 С1, описывает определения ионов фтора в крови человека и животных. Для этого проводят отбор проб крови для анализа с последующей обработкой 10%-ным спиртовым раствором гидроксида натрия в соотношении 1:2 к пробе крови. Пробы перемешивают встряхиванием в течение 2 мин или обрабатывают в течение 2 мин ультразвуком. Затем пробы центрифугируют, отделяют полученный раствор и определяют содержание фторид-иона потенциометрическим методом с помощью фторид-селективного электрода. Изобретение обеспечивает способ количественного определения фтора в крови при воздействии фтористых соединений (органических и неорганических) на человека и животных. Недостатком этого метода является обработка крови 10%-ным спиртовым раствором, при которой происходит денатурация присутствующих в плазме белков.

В патенте RU 2372405 С1 описан другой метод обработки крови. Сущность способа выделения внеклеточных ДНК (внДНК) из крови заключается в добавлении Nonidet Р-40 или тритон Х-100 к исследуемой пробе крови до конечной концентрации 0,5-1,5%, инкубации смеси во льду в течение 1-15 мин, разделении лизированной крови на супернатант и ядерную фракцию клеток при помощи центрифугирования. Далее супернатант обрабатывают РНК-гидролизующим ферментом и из полученной фракции выделяют внДНК при помощи стекловолокнистого сорбента. Использование способа позволяет упростить процедуру выделения внДНК, одновременно выделять из лизата крови свободные и связанные с поверхностью клеток крови внДНК, что позволяет значительно повысить достоверность и чувствительность дальнейшего исследования при амплификационном анализе для ранней диагностики онкологических и других заболеваний. Однако, описанный метод неприменим, поскольку преследует целью максимальное лизирование крови, то есть решает задачи противоположные задачам, поставленным нами.

В 2020 году опубликована заявка на патент WO 2020140035 A1 в которой представлен способ подготовки образца белка из человеческой плазмы для протеомного анализа. Способ включает введение образца крови, содержащего белки, в пробирку ВСТ с защитным агентом, который состоит из имидазолидинилмочевины в количестве от 300 г/л до 700 г/л, глицина в концентрациях от 20 г/л до 60 г/л и ЭДТА в концентрации от 60 г/л до 100 г/л. Образец белка анализируют с помощью протеомных методов, основанных на масс-спектрометрии. Недостатком данного способа является его невозможность использования для биохимических исследований, так как защитный агент содержит имидазолидинилмочевину и глицин.

Известен также способ исследования крови, осуществляемый с помощью устройств, выполняющих, по меньшей мере, одно центрифугирование в процессе микро- и макро-иммуноферментного анализа (заявка на изобретение RU 2014149858 А от 24.05.2013 г.). Который характеризуется использованием пробирки с гелем и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислотой), обеспечивающей по утверждению авторов возможность анализа пробы крови в указанной пробирке в виде плазмы и исключение наличия в пробе сгустков фибрина. Данный способ имеет ряд существенных недостатков, а именно пробирки с гелем и ЭДТА разработаны для крови человека. Микрочастицы геля могут оставаться в сыворотке даже после центрифугирования, а концентрации 0,12-0,2% ЭДТА недостаточно для связывания ионов присутствующих в крови металлов и блокирования тем самым окислительных процессов. Сыворотка после центрифугирования имеет красный цвет (признак гемолиза), что ведет к искажению истинных значений биохимических и протеомных показателей.

Данный способ пробоподготовки является непригодными для крови лабораторных белых, диких серых (Rattus norvegicus) и диких черных (Rattus rattus) крыс из-за повышенной свертываемости крови у этого вида животных, как мы уже указывали выше.

Технический результат заявленного способа достигается путем получения не гемолизированного биологического образца сыворотки крови диких и лабораторных крыс, что обеспечивает точность определения концентрации белков при проведении полноценного протеомного и биохимического анализа, снижения индивидуальной вариабельности показателей.

Пробоподготовку образцов крови лабораторных белых, диких серых (Rattus norvegicus) и диких черных (Rattus rattus) крыс осуществляли по следующей методике. Забор крови у животных осуществляли самотеком в раствор при помощи иглы для переливания крови. Раствор содержал ЭДТА в концентрации 5-12%. Объемное соотношение раствора ЭДТА и цельной крови составляло 1:3 соответственно. Далее осуществляли перемешивание в течение 5-15 мин и центрифугирование при 800G в течение 15 мин при температуре не выше 5°С. Супернатант отделяли, осадок удаляли. Изолированный супернатант подвергали повторному центрифугированию при 3000G в течение 20 мин при температуре не выше 5°С. При необходимости полученную сыворотку аликвотили и замораживали при температуре минус 50°С.

Изобретение было проверено путем успешного проведения подготовки к биохимическому и протеомному анализу проб крови у диких серых крыс Rattus norvegicus, у диких черных крыс Rattus rattus и у белых лабораторных крыс линии Wistar разных возрастов и пола.

Результаты пробоподготовки крови крыс при различных концентрациях раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты приведены в таблице, из результатов анализа которой следует, что заявленный способ предотвращает гемолиз анализируемой крови, а лучшие пробы крови крыс, пригодные для последующего качественного анализа, могут быть получены при заявленном диапазоне концентраций ЭДТА. Снижение заявленного диапазона значений, как и превышение его, приводят к негодности анализируемой пробы для дальнейшего использования. Изменение объемного соотношения крови и ЭДТА при заборе крови животных в ту или иную сторону от указанного соотношения приводит к аналогичным результатам и искажениям данных исследований.

Таким образом, заявленный способ подготовки венозной крови крыс, включающий забор крови в емкость, содержащую раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты, в объемном соотношении 3:1 к раствору кислоты, перемешивание 5-15 мин, центрифугирование при 800G в течение 15 мин при температуре не выше 5°С, отделение супернатанта и его центрифугирование при 3000G в течение 20 мин при температуре не выше 5°С, обеспечивает получение качественных проб крови лабораторных белых, диких серых (Rattus norvegicus) и диких черных (Rattus rattus) крыс в указанном диапазоне значений концентрации ЭДТА (5-12%), что в соответствии с техническим результатом, обеспечивает точность определения концентрации белков при проведении полноценного протеомного и биохимического анализа, снижения индивидуальной вариабельности показателей.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, физиологии и ветеринарии, а именно к клинической лабораторной диагностике и касается способа подготовки венозной крови крыс для проведения биохимического и протеомного анализа. Забор крови осуществляют в емкость, содержащую 5-12% раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты, в объемном соотношении 3:1 к раствору кислоты. Перемешивают 5-15 мин, центрифугируют при 800G в течение 15 мин при температуре не выше 5°С. Отделяют супернатант и его центрифугируют при 3000G в течение 20 мин при температуре не выше 5°С. Изобретение позволяет получить негемолизированные биологические образцы сыворотки крови диких и лабораторных крыс, что обеспечивает точность определения концентрации белков при проведении полноценного протеомного и биохимического анализа, снижения индивидуальной вариабельности показателей. 1 табл.

Способ подготовки венозной крови крыс для проведения биохимического и протеомного анализа, включающий забор крови в емкость, содержащую 5-12% раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты, в объемном соотношении 3:1 к раствору кислоты, перемешивание 5-15 мин, центрифугирование при 800G в течение 15 мин при температуре не выше 5°С, отделение супернатанта и его центрифугирование при 3000G в течение 20 мин при температуре не выше 5°С.