СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ И СПАЗМОЛИТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1997 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к области получения биологически активных природных соединений, в частности к способу получения флавоноидов, обладающих противовоспалительным и спазмолитическим действием.

Известен способ получения полифенольных соединений, обладающих противовоспалительным действием, по которому с целью расширения сырьевой базы соцветия календулы экстрагируют органическим растворителем, упаривают и очищают (см. авт.св. N 555888, 1977).

Hаиболее близким является способ получения суммы флавоноидов с противовоспалительной активностью. Согласно известному способу надземную часть бинерции окружнокрылой (Binertia cycloptera) обрабатывают хлороформом, экстрагируют метанолом, концентрируют и разбавляют водой, последовательно обрабатывают полученный раствор эфиром и бутанолом. Бутанол отгоняют полностью, растворяют в воде и хроматографируют на колонке с полиамидным сорбентом (см. авт.св. СССР N 1089789, 1980).

К недостаткам известного способа относится то, что он не обеспечивает полноту экстракции суммы флавоноидов из растительного сырья и ее сохранность в ходе очистки, не обеспечивает надежного отделения от фенолкарбоновых кислот.

Техническим результатом предлагаемого способа является увеличение выхода целевого продукта и расширение сырьевой базы.

Технический результат обеспечивается путем экстракции растительного сырья органическим растворителем, упаривания и очистки на колонке с полиамидным сорбентом.

Новым в достижении технического результата является то, что в качестве сырья используют надземную часть душицы обыкновенной (Origanum vulgare) и экстракцию осуществляют этиловым спиртом дробно, последовательно от 70 95%
Дробная экстракция 70, 80, 95% эталоном обеспечивает полноту экстракции и увеличивает выход флавоноидов. Сумма флавоноидов в растениях представлена гликозидами и агликонами. Гликозиды хорошо растворимы в 70 80% этаноле, а агликоны в 90 95% этаноле.

В траве душицы обыкновенной содержатся гликозиды флавоноидов - лютеолин-7-глюкуронозид, апигенин-7-глюкозид; агликоны флавоноидов лютеолин, апигенин, хризин, 5-оксифлавон.

Новым является и то, что водный экстракт выдерживают при температуре 2 - 4^oC. При этом происходит отделение хлорофилла и жирорастворимых веществ, что предотвращает потери агликонов хризина и 5-оксифлавона, которые растворимы в хлороформе, что, в свою очередь, увеличивает выход целевого продукта.

Новым является также и то, что водный экстракт очищают этилацетатом. Очистка этилацетатом позволяет отделить фенолкарбоновые кислоты, при этом гликозиды и агликоны флавоноидов не переходят в этилацетатный слой, что увеличивает содержание флавоноидов в продукте и увеличивает выход целевого продукта.

Новым является также то, что перед очисткой на полиамидном сорбенте, экстракт сгущают и вливают в подогретый до 70 75^oC 95% этанол. При этом фенольные соединения растворяются в подогретом этаноле, а водорастворимые сахароподобные вещества выпадают в осадок, т.к. при повышении температуры до 70 75^oC увеличивается растворимость флавоноидов и уменьшается растворимость сопутствующих веществ. При температуре нагревания этанола 60 - 70^oC осаждения углеводного комплекса не наблюдается.

Авторами были проведены исследования по количественному содержанию суммы флавоноидов в препаратах душицы обыкновенной, полученных по известному способу и по предлагаемому. Так, по известному способу содержание флавоноидов в целевом продукте составляет 27,07% а по предлагаемому способу содержание флавоноидов достигает 67,17% Выход целевого продукта по известному способу 0,057% по предлагаемому 0,8%
Сопоставительный анализ заявляемого решения и прототипа показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что в качестве сырья используют надземную часть душицы обыкновенной. Экстракцию проводят этиловым спиртом дробно, последовательно от 70 95% водный экстракт выдерживают при температуре 2 4^oC и очищают этилацетатом, и перед очисткой на полиамидном сорбенте экстракт сгущают, а сумму флавоноидов из экстракта растворяют в 95% этаноле, нагретом до температуры 70 75^oC, что соответствует критерию "новизна".

Новая совокупность существенных признаков обеспечивает увеличение выхода целевого продукта в 14 раз и расширение сырьевой базы за счет повсеместного произрастания душицы обыкновенной, что соответствует критерию "промышленная применимость".

При анализе известных способов было выявлено, что в них отсутствуют сведения о влиянии отличительных признаков заявляемого способа на достижение технического результата, следовательно, изобретение соответствует "изобретательскому уровню".

Способ осуществляют следующим образом. В качестве сырья используют надземную часть душицы обыкновенной (Origanum vulgare).

Пример. 2 кг надземной части душицы, измельченной до частиц размером 2 мм заливают 6 л 70% этилового спирта и нагревают на водяной бане при температуре 85 90^oC в течение 1,5 ч. Извлечение сливают и повторяют экстракцию 80% и 95% этиловым спиртом по 2 л, нагревая каждый раз по 1,5 ч. Из объединенных извлечений этиловый спирт отгоняют, оставшийся водный экстракт выдерживают 2 сут в холодильнике при температуре +4^oC.

Выпавший в осадок хлорофилл отфильтровывают. Хлорофилл на фильтре промывают горячей дистиллированной водой для растворения адсорбировавшихся на осадке фенольных соединений. Промывные воды присоединяют к водному экстракту.

Для отделения фенолкарбоновых кислот водный экстракт обрабатывают этилацетатом по 0,5 л три раза.

Очищенный водный экстракт концентрируют отгонкой под вакуумом до объема 300 мл.

Для отделения водорастворимых сахароподобных веществ сконцентрированный экстракт тонкой струей вливают в подогретый до 70 75^oC 95% этанол при непрерывном встряхивании колбы с этанолом. Экстракт вливают из расчета 50 мл на 1 л 95% этанола.

Фенольные соединения растворяются в подогретом этаноле, водорастворимые сахароподобные вещества выпадают в осадок.

Этанольный раствор фенольных соединений концентрируют под вакуумом до объема 100 мл, смешивают с полиамидным сорбентом, высушивают и переносят в стеклянную колонку диаметром 3,5 см, заполненную на 25 28 см полиамидом.

Колонку промывают 70% этанолом (1 л). Из элюата после отгонки растворителя под вакуумом и высушивания получают 16 г порошка суммы флавоноидов.

Выход целевого продукта по отношению к исходному сырью составляет 0,8%
Полученная сумма флавоноидов представляет собой порошок желто-коричневого цвета, состоящий из веществ флавоноидной природы: лютеолин-7-глюкуронозида, апигенин-7-глюкопиранозида (космосеин), лютеолина, апигенина, хризина, 5-оксифлавона.

Преобладают в сумме флавоноидов лютеолин-7-глюкуронозид и космосеин. Порошок хорошо растворим в воде, этаноле низкой концентрации, не растворим в хлороформе, этилацетате. Количественное содержание преобладающих флавоноидов в препарате составляет 67,17%
Для установления фармакологической активности полученного продукта определяли его токсичность, противовоспалительные и спазмолитические свойства.

При внутрибрюшинном введении препарата мышам ЛД₅₀ составляла 3451 мг/кг; 5036 мг/кг, что свидетельствует о малой токсичности.

Для исследования противовоспалительного действия опыты проводились на 150 беспородных белых мышах массой 20 22 г. Испытаны 3 дозы препарата: 20, 10 и 5 мг/кг при двух контролях интактные животные и получавшие амидопирин в адекватных дозах. Препарат разводили дистиллированной водой и выпаивали мышам по 0,2 мл в течение 7 дней до начала опыта и одновременно с созданием очага воспаления. Для этого в подошвенную поверхность задней лапки мыши вводили по 0,01 мл скипидара.

Через 72 ч лапки отсекали в голеностопном суставе, в часть из которых вводили скипидар, а в часть не вводили. По разности веса лапок оценивали степень воспалительного процесса в опытах и контрольных группах животных. Результаты обрабатывали статистически.

Препарат, представляющий собой сумму флавоноидов, снижает воспалительную реакцию по отношению к интактному контролю у животных, получавших его одновременно с созданием очага воспаления в дозе 5, 10, 20 мг/кг. Амидопирин в этих дозах уступает по силе противовоспалительного эффекта полученному препарату (см. таблицу).

Таким образом, при введении препарата одновременно с созданием очага воспаления противовоспалительные свойства суммы флавоноидов превосходят действие амидопирина.

Спазмолитические свойства суммы флавоноидов исследовались на изолированном отрезке двенадцатиперстной кишки крыс в сравнении с папаверином гидрохлоридом.

Водные растворы суммы флавоноидов в концентрации 1 35000 понижают тонус и уменьшают амплитуду сокращений изолированного отрезка кишки. Тонус кишки возвращается к исходному уровню только через 20 мин.

Концентрации суммы флавоноидов 1 20000 и 1 15000 резко понижают тонус кишки и вызывают полное расслабление. Амплитуда сокращений возвращается к исходному уровню после промывания жидкостью Рингер-Локка, что аналогично для папаверина гидрохлорида в концентрации 1 75000.

Использование: изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения суммы флавоноидов, обладающих противовоспалительным и спазмолитическим действием. Сущность способа заключается в экстракции надземной части душицы обыкновенной последовательно, дробно 70 - 95% этиловым спиртом, упаривании спиртовых экстрактов, выдерживании на холоду, отделении осадка, очистке этилацетатом, сгущении, растворении фенольных соединений в подогретом 95% этаноле, их концентрировании, их очистке на полиамидном сорбенте. Технический результат заключается в получении вещества, обладающего двумя столь редко сочетающимися активностями, на уровне синтетических эталонных препаратов. 1 табл.

Способ получения суммы флавоноидов, обладающих противовоспалительным и спазмолитическим действием, включающий экстракцию надземной части душицы обыкновенной (Origanum Vulgare L.) последовательно, дробно 70 95%-ным этиловым спиртом, упаривание объединенных спиртовых экстрактов, выдерживание его при температуре 2 4^oС, отделение осадка, очистку надосадочной жидкости этилацетатом, ее сгущение, растворение фенольных соединений в подогретом до 70 75^oС 95%-ном этаноле, их концентрирование, очистку на полиамидном сорбенте, элюацию целевого продукта 70%-ным этанолом, удаление растворителя и высушивание.