Способ прогнозирования острых кишечных инфекций у мальчиков грудного возраста Российский патент 2025 года по МПК G01N33/50 G01N33/569 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области медицины, в частности педиатрии и гастроэнтерологии /инфекционным заболеваниям/, и может быть использовано для раннего прогнозирования острых кишечных инфекций (ОКИ) у детей первого года жизни в зависимости от полового диморфизма.

Острые кишечные инфекции (ОКИ) занимают лидирующее место в структуре инфекционной патологии детей и представляют одну из актуальных проблем здравоохранения и педиатрии. По данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируется около 1,7 млрд случаев диареи. При этом более половины случаев приходится на ранний детский возраст. В нашей стране в 2018 году было зарегистрировано более 816 тысяч случаев ОКИ, которые привели к 305 случаям детских смертей. [Диарея. Основные факты. 2017 // www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/diarrhoeal-disease (дата обращения 20.01.2020).].

Изменение микробиоценоза кишечника при ОКИ является одним из ключевых факторов патогенеза воспалительного процесса и может утяжелять течение заболевания и приводить к развитию осложнений. [Плоскирева А.А., Горелов А.В. Системный подход к оценке микробиоценоза желудочно-кишечного тракта при острых кишечных инфекциях у детей // Современные проблемы науки и образования. 2015. №5. С. 151].

Вместе с тем, исследования последних лет показали, что существенное неблагоприятное значение имеет не обнаружение конкретных видов бактерий в том или ином количестве, а нарушение пропорций, соотношения и распределения бактериальных популяций в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), причем нарушения в большей степени касаются мукозо-ассоциированных видов, ответственных за передачу и обмен генетической информацией между хозяином и его микрофлорой (Fallani М., Amarri S., Uusijarvi A. et al; INFABIO team. Determinants of the human infant intestinal microbiota after the introduction of first complementary foods in infant samples from five European centres. Microbiology. - 2011. - Vol. 157, №5. - P. 1385-1392).

Кроме того, большое значение имеет так называемый воспалительный потенциал микробиоты кишечника, то есть специфические изменения микробиоты задолго до развития ОКИ, изменяющие характер иммунных реакций в просвете кишечника и способствующие более быстрому и легкому наступлению патологического процесса [Корниенко Елена Александровна, Козырева Л.С., Нетребенко O.K. Микробный метаболизм и кишечное воспаление у детей первого полугодия жизни в зависимости от вида вскармливания // Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского. 2016. №6].

Из существующего уровня техники известен способ прогнозирования течения острых кишечных инфекций у детей путем исследования крови, отличающийся тем, что в мазках проб крови, окрашенных акридиновым оранжевым, рассчитывают коэффициент соотношения количества полиморфно-ядерных лейкоцитов с однонитевой РНК к количеству полиморфно-ядерных лейкоцитов с двуспиральной ДНК до (α^к) и после (α°) обработки эндотоксином определяют индекс соотношения α° к α^к и при его значении большем или равном единице прогнозируют затяжное течение острой кишечной инфекции, (патент РФ №2275634, опубл. 2006.04.27).

Его недостатки: трудоемкость, а также необходимость для его проведения наличия специального лабораторного оборудования и дополнительных диагностикумов, которыми не располагают лаборатории лечебно-профилактических учреждений и доступных населению диагностических центров.

Известен способ экспресс-диагностики острых кишечных инфекций (ОКИ), включающий выявление маркеров-индикаторов этиологии ОКИ, с использованием иммунологического лабораторного исследования, отличающийся тем, что этиологию ОКИ устанавливают у детей ранней возрастной категории, предпочтительно у новорожденных, при этом определяют концентрацию в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-10 и наличие хронической фетоплацентарной недостаточности (ХФПН), после чего рассчитывают вероятность бактериальной этиологии ОКИ с использованием выражения: Р=(е^у/(1+е^у))*100%, где Р - вероятность в % бактериальной этиологии ОКИ; у=11,4796-5,6647⋅X₁-1,251912⋅X₂; X₁ -наличие или отсутствие ХФПН, соответственно 1 или 0; Х₂ - концентрация в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-10, пг/мл, причем значение Р больше 50% свидетельствует о бактериальной этиологии ОКИ, а меньше 50% свидетельствует об отсутствии бактериальной этиологии ОКИ, и необходимости проведения второго этапа диагностики, на котором определяют концентрацию в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-4, выявляют срок прикладывания к груди, а также вид вскармливания, при этом рассчитывают вероятность вирусной либо вирусно-бактериальной этиологии ОКИ, для чего используют выражение: Р=(е^у/(1+е^у))*100%, где Р - вероятность в % вирусной или вирусно-бактериальной этиологии ОКИ; у=-43,95582+2,05532⋅Х₃-4,11453⋅Х₄+7,01455⋅Х₅; Х₃ - через какой срок от рождения ребенка прикладывали к груди, ч; Х₄ - вид вскармливания (или естественное, или смешанное, или искусственное), соответственно или 1, или 2, или 3; Х₅ - концентрация в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-4, пг/мл, причем значение Р больше 50% свидетельствует о вирусной этиологии ОКИ, а меньше 50% свидетельствует о вирусно-бактериальной ОКИ (патент РФ №2536243, опубл. 2014.12.20).

Недостатками данного технического решения являются: необходимость проведения двухэтапного исследования больных, что требует большего количества биологического материала и времени для постановки реакций. Кроме того, необходимо уточнять дополнительный анамнез (наличие ХФПН, вида вскармливания, срока прикладывания к груди). Вместе с тем, предложенный способ не уточняет конкретный диапазон значений, соответствующий бактериальной или вирусной этиологии заболевания. Кроме того, представленные формулы вычисления вероятности бактериальной, вирусной или вирусно-бактериальной этиологии ОКИ являются громоздкими и сложно-применимыми в практической деятельности.

Известен способ прогнозирования неблагоприятного течения реабилитационного периода после острой кишечной инфекции у детей первого года жизни, включающий определение клинических признаков и интоксикационного синдрома, а также лабораторное исследование биологического материала, отличающийся тем, что в качестве биологического материала используют фекалии, в которых определяют общее содержание углеводов, масляной и валериановой кислот и при наличии эпизодов диареи в анамнезе, отсутствии признаков интоксикации, содержании углеводов более 0,5%, а концентраций масляной или валериановой кислот более 130% от нормы, устанавливают неблагоприятный прогноз течения реабилитационного периода с развитием волнообразного или затяжного течения диареи, (патент РФ №2465591, опубл. 2012.10.27).

Недостатками данного технического решения являются: низкая точность используемой методики, поскольку исследование уровня короткоцепочечных жирных кислот в кале методом газожидкостной хроматографии относится к методам диагностики метаболической активности микробиоты кишечника, а не самой микробиоты кишечника, поэтому не может в полной мере отражать весь воспалительный потенциал микробиоты кишечника, в отличие от генетических методов диагностики. Кроме того, в данной методике не учитывается половой диморфизм обследуемого.

Известен способ прогнозирования частоты развития у детей острых инфекционных заболеваний на первом году жизни, связанный с определением на первые и пятые сутки после рождения показателей иммунного статуса: абсолютного числа лимфоцитов, носителей маркеров дифференцировки CD3, CD4, CD8, CD 19, CD56, CD95, показателя спонтанного теста с нитросиним тетразолием (НСТсп), уровня фагоцитарного показателя (ФП), концентрации в сыворотке крови иммуноглобулинов классов А, М, G (IgA, IgM, IgG) и далее определением индекса прогнозирования (Ипр) с использованием определенного уравнения множественной линейной регрессии, если Ипр не превышает значение 3,2, судят о вероятности перенесения на первом году жизни не более одного острого инфекционного заболевания; если Ипр - в диапазоне 3,2-3,7, вероятно возникновение от 2-х до 5-ти острых инфекционных заболеваний на первом году жизни; если Ипр превышает значение 3,7, судят о вероятности возникновения более 5-ти острых инфекционных заболеваний на первом году жизни (Патент РФ №2431147, опубл. 2011.10.10).

Недостатком данного технического решения является инвазивность методики, связанная с необходимостью забора крови у новорожденных на первые и пятые сутки жизни. Кроме того, данный способ диагностики неспецифичен относительно ОКИ, а учитывает только все острые инфекционные заболевания на первом году жизни, независимо от вовлекаемой системы и характера возбудителя. Этот способ диагностики также не учитывает пол ребенка и микробиоту кишечника.

Известен способ дифференциальной диагностики бактериальных и вирусных кишечных инфекций у детей раннего возраста, включающий исследование показателя уровня неоптерина в сыворотке крови, отличающийся тем, что уровень неоптерина выше 10 нмоль/л указывает на бактериальную или вирусную кишечную инфекцию, при этом уровень неоптерина выше 25 нмоль/л увеличивает вероятность развития бактериальной диареи относительно вирусной в 3,1 раза, при значениях неоптерина, лежащих в диапазоне 10,49-16,2 нмоль/л, диагностируют вирусную кишечную инфекцию, а при значениях 22,54-35,52 нмоль/л - бактериальную кишечную инфекцию (патент РФ №2669404, опубл. 2018.10.11).

Недостатком данного технического решения является также инвазивность методики, связанная с необходимостью забора крови у ребенка. Кроме того, данный способ диагностики не является предиктивным, то есть не предсказывает вероятность или возможность наступления ОКИ, а устанавливает ее этиологию уже в момент наступления инфекции.

Прототипом заявленного технического решения нами выбрана работа Усенко Д.В. с соавт.[Усенко Д.В., Горелов А.В., Одинцова В.Е., Каштанова Д.А., Кошечкин С.И., Тяхт А.В., Крикун B.C. Нарушение микробиоты кишечника в остром периоде инфекционной диареи у детей и сравнительная оценка влияния последующей терапии нифуроксазидом и препаратами группы цефалоспоринов. Инфекционные болезни. 2020; 18(3): 88-96. DOI: 10.20953/1729-9225-2020-3-88-96], в которой у детей от 6 мес.до года и более, в остром периоде инвазивных ОКИ исследуют фекалии и методом секвенирования 16s генов рРНК проводят определение микроорганизмов рода Shigella, энтероинвазивных Escherichia coli, Salmonella и термофильных Campylobacter. Выполнялось также бактериологическое исследование на наличие патогенных энтеробактерий. Выявлено снижение альфа-разнообразия видов и повышение суммарной доли бактерий-оппортунистов в группе кишечных инфекций по сравнению со здоровыми детьми.

Недостатком данного метода является диагностика ОКИ по факту наступления острого периода инвазивных ОКИ, а не прогнозирование развития заболевания, как в заявляемом техническом решении. Кроме того, в прототипе обследуются дети возрастом от 6 месяцев жизни (в заявляемом способе от 4 недель) и исследуется несколько видов микроорганизмов (в заявляемом методе - весь видовой спектр биотопа). В способе прототипе обследуются дети без учета пола ребенка, в заявляемом нами методе только мальчики.

Недостатки прототипа устраняются в заявляемом изобретении.

Таким образом, анализ научно-медицинской и патентной литературы показал, насколько актуальной и своевременной является разработка и внедрение в повседневную практику современных прогностических методик, позволяющих осуществлять прогноз и течение той или иной нозологической формы ОКИ для выбора эффективной терапевтической тактики при ОКИ, обеспечивающей снижение количества назначаемого объема обследования и адекватного подбора терапии у детей раннего возраста.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение достоверности прогнозирования ОКИ у новорожденных, в зависимости от полового диморфизма.

Данная задача решается за счет того, что у младенцев мужского пола в 4-6 недель жизни исследуют в кале микробиоту кишечника с помощью метода секвенирования 16s генов рРНК, и при выявлении бактерий рода Escherichia/Shigella в относительной представленности более 1,5% в составе микробиоты кишечника прогнозируют высокий риск развития острых кишечных инфекций на первом году жизни.

Технический результат, получаемый при реализации предлагаемого изобретения:

- расширение арсенала диагностических средств, обеспечивающих возможность прогнозирования развития ОКИ у детей грудного возраста в зависимости от полового диморфизма;

- раннее прогнозирование развития ОКИ у детей в зависимости от полового диморфизма;

- повышение информативности и безопасности метода.

Нельзя не учитывать тот факт, что современная медицина становится все более персонализированной и приближенной к пациенту. Значимым фактором риска развития тех или иных заболеваний является и половой диморфизм. Одни и те же заболевания являются более характерными для представителей одного пола и менее типичными для другого. Микробиота кишечника не является исключением и имеет характерный пейзаж в зависимости от полового диморфизма даже у детей раннего возраста. Так, показано, что микробиота кишечника недоношенных детей, находящихся в отделении интенсивной терапии, различалась в зависимости от пола. У недоношенных детей мужского и женского пола достоверно различались индексы В-разнообразия, а различия в составе микробиоты кишечника у новорожденных мальчиков и девочек особо ярко проявлялись на филогенетическом уровне микробных семейств [Chen, Jie PhD, RNa,b; Li, Hongfei BSc; Maas, Kendra PhDd; Starkweather, Angela PhD, RN, FAANe; Chen, Minghui PhDc; Cong, Xiaomei PhD, RN, FAANa,f,g. Sex-specific gut microbiome profiles among preterm infants during the neonatal intensive care hospitalization. Interdisciplinary Nursing Research 1(1):p 6-13, November 2022. | DOI: 10.1097/NR9.0000000000000004]. По данным другой группы ученых [Cong, X., Xu, W., Janton, S., Henderson, W. A., Matson, A., McGrath, J. M., et al. (2016a). Gut Microbiome Developmental Patterns in Early Life of Preterm Infants: Impacts of Feeding and Gender. PloS One 11, e0152751. doi: 10.1371/journal.pone.0152751], у недоношенных мальчиков было более низкое альфа-разнообразие микробиоты кишечника после рождения по сравнению с девочками, кроме того, именно у мальчиков доминировали бактерии семейства Enterobacteriales и в меньшей степени представлены Clostridiates, чем у девочек. Персонализированное прогнозирование вероятности развития ОКИ в зависимости от пола ребенка является малоизученным и перспективным направлением педиатрии, которое может оптимизировать профилактику заболеваемости ОКИ детей первого года жизни.

Функциональные особенности плода в значительной степени аранжированы характером плодо-материнских отношений, во-многом определяемых полом вынашиваемого плода [Боташева Т.Л., Андреева В.О., Рымашевский А.Н., Тезиков Ю.В., Липатов И.С., Фабрикант А.Д., Лебеденко Е.Ю., Железнякова Е.В. Роль половой принадлежности плода в патогенезе гестационного сахарного диабета и акушерских осложнений. -2022. - №9. - С. 33-41; Фабрикант А.Д., Боташева Т.Л., Рымашевский А.Н., Петров Ю.А., Палиева Н.В., Каушанская Л.В., Хлопонина А.В. Значимость половой принадлежности плода в структуре акушерской патологии у беременных с гестационным сахарным диабетом-2021. - Т. 12. - №4. - С. 20-26]. Поскольку характер течения гестационных процессов во многом модулируется полом вынашиваемого ребенка, это в равной степени формирует и предпосылки для отличий в составе микробиоты в постнатальном периоде у детей мужского и женского пола. Нельзя не учитывать тот факт, что современная медицина становится все более персонализированной и приближенной к пациенту. Значимым фактором риска развития тех или иных заболеваний является и половой диморфизм. Одни и те же заболевания являются более характерными для представителей одного пола и менее типичными для другого. Микробиота кишечника не является исключением и имеет характерный пейзаж в зависимости от полового диморфизма даже у детей раннего возраста. Так, показано, что микробиота кишечника недоношенных детей, находящихся в отделении интенсивной терапии, различалась в зависимости от пола. У недоношенных детей мужского и женского пола достоверно различались индексы В-разнообразия, а различия в составе микробиоты кишечника у новорожденных мальчиков и девочек особо ярко проявлялись на филогенетическом уровне микробных семейств [Chen, Jie PhD, RNa,b; Li, Hongfei BSc; Maas, Kendra PhDd; Starkweather, Angela PhD, RN, FAANe; Chen, Minghui PhDc; Cong, Xiaomei PhD, RN, FAANa,f,g. Sex-specific gut microbiome profiles among preterm infants during the neonatal intensive care hospitalization. Interdisciplinary Nursing Research 1(1):p 6-13, November 2022. | DOI: 10.1097/NR9.0000000000000004]. По данным другой группы ученых [Cong, X., Xu, W., Janton, S., Henderson, W. A., Matson, A., McGrath, J. M., et al. (2016a). Gut Microbiome Developmental Patterns in Early Life of Preterm Infants: Impacts of Feeding and Gender. PloS One 11, e0152751. doi: 10.1371/journal.pone.0152751].

У недоношенных мальчиков было более низкое альфа-разнообразие микробиоты кишечника после рождения по сравнению с девочками, кроме того, именно у мальчиков доминировали бактерии семейства Enterobacteriales и в меньшей степени представлены Clostridiates, чем у девочек. Персонализированное прогнозирование вероятности развития ОКИ в зависимости от пола ребенка является малоизученным и перспективным направлением педиатрии, которое может оптимизировать профилактику заболеваемости ОКИ детей первого года жизни.

В настоящее время выделяется понятие «воспалительного потенциала» микробиоты кишечника, то есть специфических изменений состава микробиоты, появляющихся задолго до наступления патологического процесса и изменяющих характер иммунных реакций в слизистой оболочке кишки, что в конечном итоге способствует более легкому и быстрому наступлению кишечной инфекции при внедрении патогенного фактора [Корниенко Елена Александровна, Козырева Л.С., Нетребенко О.К. Микробный метаболизм и кишечное воспаление у детей первого полугодия жизни в зависимости от вида вскармливания // Педиатрия. Журнал им. Г. Н. Сперанского. 2016. №6.].

Бактериологический посев на питательную среду позволяет выявить при диагностике только порядка 1% бактерий из всего состава микробиоты кишечника. Развитие и широкое внедрение в практику секвенирования нового поколения позволяет обнаружить весь спектр микроорганизмов, формирующих микробиоту того или иного биотопа. Дальнейшие исследования микробиома показали, что дисбиотические состояния в кишечнике появляются задолго до клинической манифестации заболевания, и могут использоваться в качестве ранних прогностических предикторов, что позволяет своевременно профилактировать дебют патологического состояния [Tumbaugh P.J., Ley R.E., Hamady М., Fraser-Liggett С.М., Knight R., Gordo J.I. The human microbiome project. Nature. 2007; 449: 804-810. DOI: 10,1038 / nature06244.; Methe B.A., Nelson K.E., Pop M., Creasy H.H., Giglio M.G., Huttenhower C. et al. A framework for human microbiome research. Nature. 2012; 486: 215-221. DOI: 10.1038 / nature 11209].

При анализе данных секвенирования гена 16s рРНК, нами было выявлено, что у мальчиков в возрасте 4-6 недель жизни уровень бактерий рода Escherichia и/или Shigella, являющихся условно-патогенными и предрасполагающих к развитию воспалительных заболеваний кишечника, был значимо выше, чем у девочек (14,32% и 0,2% соответственно, р=0,032). При анализе корреляционных матриц выявлено, что коэффициент корреляционной адаптометрии в группе мальчиков был практически в 4 раза выше, чем у девочек (9,5 и 2,4, соответственно). Кроме того, с помощью метода «деревьев решений» выявлено, что мужской пол ребенка ассоциирован с относительной представленностью бактерий рода Escherichia и/или Shigella >1,5% в составе микробиоты кишечника.

При анализе заболеваемости детей до года было выявлено, что эпизоды ОКИ на первом году жизни зарегистрированы у 10,5% мальчиков и только у 2,2% девочек (р=0,04). Это позволило нам сделать вывод, что половой диморфизм в микробиоте кишечника в постнатальной жизни может являться фактором риска развития соматических заболеваний, в том числе формировать предрасположенность к более легкому наступлению ОКИ. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что обнаружение бактерий рода Escherichia и/или Shigella в микробиоте кишечника у мальчиков в определенной относительной представленности в возрасте 4-6 недель жизни может являться ранним предиктором воспалительных заболеваний кишечника на первом году жизни.

Понимание факторов, влияющих на состав кишечной микробиоты в неонатальном периоде с учетом фактора «пол ребенка», может служить важным потенциалом для выявления механизмов патологии заболеваний, что может способствовать эффективному прогнозированию, лечению и профилактике целого ряда заболеваний в педиатрической практике.

Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения

На поликлиническом плановом приеме одновременно со стандартным обследованием по Приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 10.08.2017 №514н «О порядке проведения профилактических медицинских осмотров несовершеннолетних», отбирались дети для углубленного обследования. Обследование ребенка мужского пола для прогнозирования ОКИ в возрасте 4-6 недель жизни проводили по просьбе матери, с ее письменного согласия. Взятие биологического образца производят сухим стерильным зондом в пробирку со специальной стерильной транспортной средой. Забор материала осуществляют из подгузника после дефекации ребенка, используют кал, полученный в день исследования естественным путем, без применения слабительных и клизм. При заборе кала необходимо избегать касания стерильного зонда краев подгузника, контакт зонда возможен только непосредственно с каловыми массами, чтобы избежать контаминации микрофлорой окружающей среды.

Образец флоры помещают в пробирку Эппендорфа со специальной транспортной средой «транспортная среда с муколитиком» (ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия), среда сохранялась при температуре +4°С до выделения ДНК.

Тотальную ДНК выделяют из образцов кала, подвергнутых гомогенизации в лизирующем растворе. Гомогенизацию проводят вместе с шариками, с последующей экстракцией ДНК методом сорбентной колонки (Qiagen, Germantown, MD, USA) в соответствии с рекомендациями производителя.

Библиотеки для секвенирования 16S рРНК готовят в соответствии с протоколом Illumina по подготовке 16S метагеномных библиотек для секвенирования (Part #15044223 Rev. В). Наборы реагентов компании Illumina (Illumina, San Diego, CA, USA). Для амплификации целевого фрагмента гена 16S рРНК с помощью рекомендованных праймеров для области V3-V4 используют 5 нг общей ДНК на образец. Проводят 25 циклов ПЦР с использованием смеси КАРА HiFi HotStart ReadyMix (2х) (Roche Diagnostics, Цуг, Швейцария). Далее для запуска секвенирования на платформе BGI используют набор для конверсии библиотек Illumina MGIEasy Universal Library Conversion Kit (App-A).

При выявлении бактерий рода Escherichia и/или Shigella в микробиоте кишечника у мальчиков в относительной представленности более 1,5 % в возрасте 4-6 недель жизни прогнозируют у данного ребенка высокий риск развития ОКИ на первом году жизни.

Для объективизации способа прогнозирования параллельно с его применением проводилось клиническое наблюдение и обследование детей. До 1 года жизни оценивалась частота тех или иных заболеваний, с которыми родители обращались за консультацией к педиатрам. Дальнейшее клиническое наблюдение за детьми до года жизни показало, что ОКИ встречались практически в 5 раз чаще у мальчиков, чем у девочек (10,5% и 2,2% наблюдаемых, соответственно).

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами:

Пример 1.

Ребенок К., мужского пола, 4 нед., родился от первой беременности, протекавшей с осложнениями: в первой половине ретрохориальная гематома, во второй половине - рецидивирующий анаэробный дисбиоз влагалища, ОРВИ с повышением температуры тела. Роды I в срок 38-39 недель, осложненные преждевременным разрывом плодных оболочек, дородовым излитием вод на фоне незрелой шейки матки, оперативные роды путем кесарева сечения. Оценка новорожденного по шкале Апгар 8-9 баллов, в родильном зале проведено отсроченное пережатие пуповины, контакт «кожа- к-коже», раннее прикладывание к груди матери. Естественное вскармливание до 3 месяцев жизни. В возрасте 4-х недель жизни взят образец кала для исследования микробиоты кишечника методом секвенирования генов 16s рРНК. Выявлено наличие бактерий рода Escherichia и/или Shigella в относительной представленности 1,7% в составе микробиоты кишечника. Согласно заявляемому способу, прогнозировался высокий риск ОКИ на первом году жизни. При дальнейшем наблюдении за ребенком в возрасте 7 месяцев возникла ротавирусная инфекция, среднетяжелое течение. Прогноз подтвердился.

Пример 2.

Ребенок С., женского пола, 5 нед., родился от первой беременности. Беременность протекала без особенностей. Роды срочные в 41 неделю, через естественные родовые пути, с массой тела при рождении 3900 грамм, оценкой по шкале Апгар 10-10 баллов. Отказ матери от грудного вскармливания. Искусственное вскармливание смесью с первых дней жизни. В возрасте 5 недель жизни взят образец кала для исследования микробиоты кишечника методом секвенирования генов 16s рРНК. Выявлено наличие бактерий рода Escherichia и/или Shigella в относительной представленности 3,6% в составе микробиоты кишечника. Согласно заявляемому способу, у девочки прогнозировался низкий риск ОКИ на первом году жизни. До 1 года жизни ни одного эпизода ОКИ не зарегистрировано. Прогноз низкого риска развития ОКИ у ребенка женского пола подтвердился.

Пример 3.

Ребенок Т., мужского пола, 5 нед. Родился от первой беременности, первых срочных родов, от матери с ожирением 2 степени. Первая половина беременности протекала без особенностей, во второй половине беременности диагностирован гестационный сахарный диабет, контролируемый диетой. Общая прибавка массы тела при беременности у матери 4 кг. Роды в сроке 38-39 недель беременности, через естественные родовые пути, индуцированные, масса ребенка при рождении 3500 грамм, длина 50 см, оценка по шкале Апгар 9-10 баллов. В родильном зале раннее прикладывание к груди, отсроченное пересечение пуповины, совместное пребывание с первых минут жизни с матерью в родильном доме. Грудное вскармливание до 11 месяцев. В 5 недель жизни по данным исследования микробиома кишечника методом секвенирования генов 16s рРНК выявлено наличие бактерий рода Escherichia и/или Shigella в относительной представленности 1,49% в составе микробиоты кишечника. Согласно представленной модели, прогнозировался низкий риск развития ОКИ на первом году жизни. При наблюдении за ребенком мужского пола прогноз подтвердился, у ребенка не было зарегистрировано ни одного эпизода ОКИ с относительной представленностью Escherichia и/или Shigella менее 1,5%.

Пример 4.

Ребенок А., мужского пола, 6 нед. Родился от первой беременности, первых родов. Акушерско-гинекологический анамнез не отягощен. Беременность протекала на фоне гестационного сахарного диабета, компенсированного на диетотерапии. Общая прибавка веса за всю беременность составила 7 кг. Роды через естественные родовые пути в сроке 39 недель беременности. Масса ребенка при рождении 3100 грамм, длина 52 см, оценка по шкале Апгар 7-8 баллов. Практиковалось раннее прикладывание к груди, грудное вскармливание, совместное пребывание с первых часов жизни с матерью, ранняя выписка из родильного стационара. В возрасте 6 недель жизни взят образец кала для исследования микробиоты кишечника методом секвенирования генов 16s рРНК. Выявлено наличие бактерий рода Escherichia и/или Shigella в относительной представленности 0,34% в составе микробиоты кишечника. Согласно заявляемому способу, прогнозировался низкий риск ОКИ у ребенка мужского на первом году жизни. До 1 года жизни у мальчика не регистрировались эпизоды ОКИ. Прогноз подтвердился.

Пример 5.

Ребенок К., мужского пола, 5 недель. Родился от четвертой беременности, первых родов. В анамнезе у матери привычное невынашивание беременности, рецидивирующий кандидозный кольпит.

Беременность протекала на фоне угрозы прерывания в первом триместре, во втором триместре диагностирована истмико-цервикальная недостаточность, проведена хирургическая коррекция шейки матки. Роды ранние срочные, через естественные родовые пути, в 37 недель беременности, после снятия кругового подслизистого шва с шейки матки, на фоне дородового излития околоплодных вод и длительного безводного периода. Масса тела при рождении 2800 грамм, длина 48 см, оценка по Апгар 9-10 баллов. В роддоме практиковалось раннее прикладывание к груди матери, совместное пребывание с ребенком с первых минут жизни, ранняя выписка на вторые сутки после родов по желанию пациентки. В 5 недель жизни взят образец кала для исследования микробиоты кишечника методом секвенирования генов 16s рРНК. Выявлено наличие бактерий рода Escherichia и/или Shigella в относительной представленности 1,57% в составе микробиоты кишечника. В 4 месяца жизни у ребенка диагностирована тяжелая ОКИ, этиологическим фактором которой выступили бактерии рода Shigella, с госпитализацией в детское инфекционное отделение, с тяжелой дегидратацией и необходимостью проведения интенсивной терапии. Прогноз высокого риска развития ОКИ только у ребенка мужского пола подтвердился.

В наше исследование были включены 103 ребенка в возрасте 4-6 недель жизни (первая группа - 46 девочек, вторая группа - 57 мальчиков), обследованных в клинических условиях с 2022 по 2023 гг. Все дети были рождены через естественные родовые пути в доношенном сроке беременности и находились на грудном вскармливании. Каждому ребенку производился забор кала для проведения дальнейшего секвенирования 16s генов рРНК. Критерии включения в исследование: здоровые дети в 4-6 недель жизни, рожденные в доношенном сроке беременности через естественные родовые пути, выписанные из родильного стационара на 2-3 сутки после родов, находившиеся на исключительно грудном вскармливании. Критерии исключения: оперативное родоразрешение, преждевременные роды, искусственное или смешанное вскармливание ребенка, дети, рожденные от матерей с беременностью, протекавшей на фоне преэклампсии, фетоплацентарной недостаточности, задержки развития плода, тяжелой экстрагенитальной и акушерской патологии, дети, находившиеся после родоразрешения в условиях отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных.

Биоинформатическая обработка базы данных 16S рРНК проводилась с помощью собственного биоинформатического пайплана, реализованного на языках программирования R v.3.6 и Python3. Идентификация видов бактерий проводилась с помощью алгоритма точного совпадения в DADA2 по предварительно обработанным соответствующим образом последовательностям SILVA vl38 с помощью пользовательских скриптов.

Для статистической обработки данных использовался алгоритм «Деревья решений» или "Деревья классификации", а также «ROC - анализ», дающий дополнительные инструменты для анализа построенных моделей и их верификации.

Обработка исходных признаков осуществлялась с использованием пакетов прикладных программ Statistica версии 14.0.0.15, EXCEL 2019, IBM SPSS 27.0.0.1. Для визуализации непараметрических корреляций использовался пакет GVedit 2.39.

Анализ микробиомов кишечника проводился на таксономическом уровне микробных родов. Суммарно был диагностирован 81 род микроорганизмов, из которых, используя метод деревьев решений, был выявлен 21 род микроорганизмов, по относительной представленности которых различия между группами мальчиков и девочек были максимальными. В том числе, род бактерий Escherichia и/или Shigella, по относительной представленности которого различия риска развития ОКИ на первом году жизни между группами мальчиков и девочек были статистически значимыми.

Преимущества метода:

Заявленный способ прогнозирования ОКИ у детей первого года жизни отличают от известных:

1. Высокая точность результата и достоверность, за счет применения генетического метода диагностики - секвенирования генов 16s рРНК.

2. Неинвазивность и простота забора биологического материала. Это позволит внедрить в клинику методику отбора детей мужского пола первого года жизни, родившихся от матерей из группы риска, для наблюдения и дальнейшей профилактики развития ОКИ, что в свою очередь снизит частоту заболеваемости ОКИ.

3. Простой понятный алгоритм прогнозирования развития ОКИ у ребенка мужского пола на первом году жизни.

4. Персонализированный подход к выбору адекватной терапевтической тактики с учетом полового диморфизма. Возможность снизить заболеваемость детей из группы риска по развитию ОКИ на первом году жизни.

Заявленный способ позволяет своевременно определить риск развития ОКИ у мальчиков грудного возраста, что дает возможность проводить ранние профилактические мероприятия в виде персонализированного подхода к пробиотической поддержке детей первого года жизни с учетом полового диморфизма и, таким образом, предотвратить развитие или уменьшить тяжесть ОКИ.

Заявленный способ прогнозирования острых кишечных инфекций у детей первого года жизни апробирован на большом клиническом материале и может быть рекомендован к широкому применению в детских стационарах и поликлиниках для раннего выделения групп риска среди мальчиков по развитию острых кишечных инфекций во младенческом периоде жизни.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, гастроэнтерологии и инфектологии, и может быть использовано для прогнозирования острых кишечных инфекций у мальчиков грудного возраста. В 4-6 недель жизни в кале ребенка исследуют микробиоту кишечника методом секвенирования 16s генов рРНК. При выявлении бактерий рода Escherichia и/или Shigella в относительной представленности более 1,5% в составе микробиоты кишечника у мальчика грудного возраста прогнозируют высокий риск развития острых кишечных инфекций. Способ обеспечивает возможность прогнозирования развития острых кишечных инфекций у детей грудного возраста в зависимости от полового диморфизма, повышение информативности и безопасности метода за счет выявления бактерий рода Escherichia и/или Shigella в кале мальчика грудного возраста. 5 пр.

Способ прогнозирования острых кишечных инфекций у мальчиков грудного возраста, включающий исследование биологического материала, отличающийся тем, что у ребенка в 4-6 недель жизни исследуют в кале микробиоту кишечника с помощью метода секвенирования 16s генов рРНК и при выявлении бактерий рода Escherichia и/или Shigella в относительной представленности более 1,5% в составе микробиоты кишечника у мальчика грудного возраста прогнозируют высокий риск развития острых кишечных инфекций.