Родственные заявки

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 62/964,565, поданной 22 января 2020. Все содержание вышеуказанной заявки включено в настоящий документ посредством ссылки, включая весь текст, таблицы, перечни последовательностей и чертежи.

Введение

Аденоассоциированный вирус (AAV) и другие вирусные векторы, а также подходы генной терапии на основе липидных, полимерных и белковых наночастиц могут таргетировать адаптивную иммунную систему, что приводит к притуплению эффективности и возможности того, что пациент станет полностью неподдающимся терапевтическому вмешательству. Адаптивная иммунная система основана на развитии антител к антигенспецифическим иммуноглобулинам (например, IgG), которые приводят к ингибированию или клиренсу молекулы-мишени.

Неонатальный Fc-рецептор (FcRn) играет центральную роль в рециркуляции иммуноглобулинов G типа (IgG) из лизосомального пути обратно в плазматическую мембрану и вне клетки, тем самым увеличивая время полужизни IgG в сыворотке (см. Sockolosky et al. 2015, Adv. Drug Deliv. Rev., 91:109-124). Агенты, уменьшающие взаимодействие IgG с FcRn, уменьшают рециркуляцию IgG, усиливают расщепление/катаболизм IgG и уменьшают время полужизни IgG в сыворотке. В клинических испытаниях на людях, многократное еженедельное введение анти-FcRn антитела приводило к среднему снижению IgG в сыворотке примерно на 85% с устойчивым снижением IgG в сыворотке на ≥75% на срок до 24 дней (Ling et al., 2019, Clin. Pharmacol. Ther., 105:1031-1039).

IdeS представляет собой встречающуюся в природе цистеиновую протеазу, в частности, эндопептидазу, экспрессируемую патогенными бактериями Streptococcus pyogenes, которая проявляет специфичность в отношении своей последовательности-мишени, обнаруженной в IgG человека, в дополнение к некоторым другим видам. IdeS способна расщеплять IgG ниже шарнирной области, что приводит к образованию F(ab')2 и Fc/2 фрагментов. IdeS способна расщеплять IgG в плазме человека и может снижать общий уровень IgG у людей в период от 4 часов до 7 дней после введения.

EndoS представляет собой встречающуюся в природе гликозидазу, в частности, эндогликозидазу, из S. pyogenes, которая специфически гидролизует гликаны IgG человека и изменяет эффекторные функции антител, включая связывание с Fc рецептором.

Нейтрализующие антитела к AAV капсиду являются основным препятствием для векторов генной терапии, оставляя некоторых пациентов без доступа к потенциально спасающим жизнь методам лечения. В настоящем документе описаны, среди прочего, способы лечения пациентов, у которых могут развиться или уже имеются ранее существовавшие нейтрализующие антитела к векторам генной терапии, путем введения агента, который уменьшает взаимодействие IgG с FcRn, тем самым снижая рециркуляцию IgG, повышая клиренс IgG, расщепление и катаболизм и уменьшение циркулирующего IgG или периода полужизни IgG in vivo. Кроме того, в настоящем документе описаны, помимо прочего, способы лечения пациентов, у которых могут развиться или уже имеются ранее существовавшие антитела, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом или белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, инкапсидированным вектором генной терапии, путем введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, тем самым уменьшая рециркуляцию IgG, усиливая клиренс, расщепление и катаболизм IgG и уменьшая циркулирующий IgG или период полужизни IgG in vivo.

Сущность

В настоящем документе описаны способы применения агента, который снижает взаимодействие иммуноглобулина G (IgG) с неонатальным Fc рецептором (FcRn) и FcRn-опосредованную рециркуляцию IgG для снижения циркулирующих уровней или титра антител (например, IgG у субъекта (например, человека-пациента), для улучшения или усиления генной терапии у субъекта. Способы по изобретению могут быть использованы, среди прочего, для лечения пациентов с ранее существовавшими нейтрализующими антителами к геннотерапевтическим векторам и для повторного дозирования пациентов, ранее получавших лечение вектором генной терапии.

В некоторых вариантах осуществления, способ повышения эффективности лечения генной терапией у субъекта, включающий (а) введение субъекту агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, и (b) введение субъекту рекомбинантного вирусного вектора, содержащего терапевтический гетерологичный полинуклеотид.

В некоторых вариантах осуществления, субъект нуждается в лечении заболевания, вызванного потерей функции или активности белка, и терапевтический гетерологичный полинуклеотид кодирует полипептид или пептид, который обеспечивает или дополняет функцию или активность белка, или субъект нуждается в лечении заболевания, вызванного усилением функции, активности или экспрессии белка, и гетерологичный полинуклеотид транскрибируется в нуклеиновую кислоту, которая ингибирует, снижает или уменьшает усиление функции, активности или экспрессии белка.

В некоторых вариантах осуществления, у субъекта снижена FcRn-опосредованная рециркуляция IgG.

В некоторых вариантах осуществления, у субъекта повышен клиренс IgG.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, выбран из группы, состоящей из анти-FcRn антитела, аффитела, связывающего FcRn, антитела, усиливающего расщепление IgG (ABDEG), пептида, связывающего FcRn (FcBP) и низкомолекулярного антагониста FcRn.

В некоторых вариантах осуществления, в способах лечения субъекта стадия (а) выполняется до выполнения стадии (b).

В некоторых вариантах осуществления, в способах лечения субъекта стадия (b) выполняется до выполнения стадии (a).

В некоторых вариантах осуществления, в способах лечения субъекта стадия (а) и стадия (b) выполняются примерно в одно и то же время.

В некоторых вариантах осуществления, в способах лечения субъекта стадию (а) выполняют два или более раз до или после выполнения стадии (b).

В некоторых вариантах осуществления, в способах лечения субъекта стадию (b) проводят в течение примерно 90 дней до или после выполнения стадии (a). В некоторых вариантах осуществления, стадию (b) проводят в течение примерно 60 дней до или после проведения стадии (а). В некоторых вариантах осуществления, стадию (b) проводят в течение примерно 45 дней до или после выполнения стадии (а). В некоторых вариантах осуществления, стадию (b) проводят в течение примерно 30 дней до или после выполнения стадии (а). В некоторых вариантах осуществления, стадию (b) проводят в течение примерно 21 дня до или после выполнения стадии (а). В некоторых вариантах осуществления, стадию (b) проводят в течение примерно 14 дней до или после выполнения стадии (а). В некоторых вариантах осуществления, стадию (b) проводят в течение примерно 7 дней до или после выполнения стадии (а). В некоторых вариантах осуществления, стадию (b) проводят в течение примерно 72 часов до или после выполнения стадии (а). В некоторых вариантах осуществления, стадию (b) проводят в течение примерно 48 часов до или после выполнения стадии (а). В некоторых вариантах осуществления, стадию (b) проводят в течение примерно 24 часов до или после выполнения стадии (а). В некоторых вариантах осуществления, стадию (b) проводят в течение примерно 12 часов до или после выполнения стадии (а). В некоторых вариантах осуществления, стадию (b) проводят в течение примерно 6 часов до или после выполнения стадии (а).

В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение субъекту количества протеазы или гликозидазы, эффективного для расщепления или перевара и/или ингибирования или снижения эффекторной функции антител, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором и/или полипептидом или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом и/или гетерологичным полинуклеотидом.

В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят до, после или примерно в то же время, что и стадию (а). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят до, после или примерно в то же время, что и стадию (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят два или несколько раз до, после или примерно в то же время, что и стадию (а). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят два или несколько раз до, после или примерно в то же время, что и стадию (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 90 дней до или после стадии (а) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 60 дней до или после стадии (а) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 45 дней до или после стадии (а) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 30 дней до или после стадии (а) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 21 день до или после стадии (а) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 14 дней до или после стадии (а) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 7 дней до или после стадии (а) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 72 часов до или после стадии (а) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 48 часов до или после стадии (а) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 24 часов до или после стадии (а) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 12 часов до или после стадии (а) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления, протеазу или гликозидазу вводят в течение примерно 6 часов до или после стадии (а) или стадии (b).

В некоторых вариантах осуществления, протеаза содержит цистеиновую протеазу или тиоловую протеазу.

В некоторых вариантах осуществления, протеаза содержит протеазу из Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi или Mycoplasma canis.

В некоторых вариантах осуществления, протеаза содержит IdeS или ее модифицированный вариант, указанные в любой из SEQ ID NO: 3-18, 23 или 48.

В некоторых вариантах осуществления, гликозидаза включает эндогликозидазу.

В некоторых вариантах осуществления, эндогликозидаза содержит последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 44-47.

В некоторых вариантах осуществления, протеаза или гликозидаза расщепляет или переваривает и/или ингибирует или снижает эффекторную функцию антител человека.

В некоторых вариантах осуществления, вирусный вектор содержит лентивирусный вектор, аденовирусный вектор или вектор аденоассоциированного вируса (AAV).

В некоторых вариантах осуществления, лентивирусный вектор содержит белки оболочки, с которыми связываются антитела или IgG.

В некоторых вариантах осуществления, вектор AAV содержит капсидные белки, с которыми связываются антитела или IgG.

В некоторых вариантах осуществления, вектор AAV содержит капсидные белки VP1, VP2 и/или VP3, с которыми связываются антитела или IgG.

В некоторых вариантах осуществления, вектор AAV содержит капсидный белок VP1, VP2 и/или VP3, имеющий 60% или более идентичность последовательности с капсидным белком VP1, VP2 и/или VP3, выбранным из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV3B, AAV-2i8, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 VP1, VP2 и/или VP3 капсидных белков.

В некоторых вариантах осуществления, вектор AAV содержит капсидный белок VP1, VP2 и/или VP3, имеющий 100% идентичность последовательности с капсидным белком VP1, VP2 и/или VP3, выбранным из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV3B, AAV-2i8, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 VP1, VP2 и/или VP3 капсидных белков.

В некоторых вариантах осуществления, у субъекта есть антитела или IgG, которые связываются с вирусным вектором.

В некоторых вариантах осуществления, антитела или IgG, которые связываются с вирусным вектором, у субъекта отсутствуют.

В некоторых вариантах осуществления, у субъекта есть антитела или IgG, которые связываются с полипептидом или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом.

В некоторых вариантах осуществления, антитела включают IgG, IgM, IgA, IgD и/или IgE.

В некоторых вариантах осуществления, способ включает определение наличия, количественное определение количества или эффекторной функции вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие у субъекта, перед выполнением стадии (а), после выполнения стадии (а), но перед выполнением стадии (b) и/или после выполнения стадий (а) и (b).

В некоторых вариантах осуществления, способ включает анализ биологического образца субъекта на наличие, количество или эффекторную функцию вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие в образце, перед выполнением стадии (а), после выполнения стадии (а), но перед выполнением стадии (b) и/или после выполнения стадий (a) и (b).

В некоторых вариантах осуществления, стадию определения и/или анализа проводят до и/или после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn или протеазой или гликозидазой.

В некоторых вариантах осуществления, биологический образец субъекта представляет собой продукт крови.

В некоторых вариантах осуществления, способ приводит к снижению на 20-50%, 50-75%, 75-90%, 90-95% или 95% или более антител или IgG, связывающих вирусный вектор.

В некоторых вариантах осуществления, вирусный вектор, связывающий антитела или IgG, присутствующие в биологическом образце или продукте крови субъекта, составляет менее примерно 1:100000, где 1 часть биологического образца или продукта крови, разведенного в 100000 частях буфера, дает 50% нейтрализации вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, содержание вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие в биологическом образце или продукте крови субъекта, составляет менее примерно 1:50000, где 1 часть биологического образца или продукта крови, разведенная в 50000 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, содержание вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие в биологическом образце или продукте крови субъекта, составляет менее примерно 1:10000, где 1 часть биологического образца или продукта крови, разведенная в 10000 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, содержание вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие в биологическом образце или продукте крови субъекта, составляет менее примерно 1:1000, где 1 часть биологического образца или продукта крови, разведенная в 1000 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, содержание вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие в биологическом образце или продукте крови субъекта, составляет менее примерно 1:100, где 1 часть биологического образца или продукта крови, разведенная в 100 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, содержание вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие в биологическом образце или продукте крови субъекта, составляет менее примерно 1:10, где 1 часть биологического образца или продукта крови, разведенная в 10 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, содержание вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие в биологическом образце или продукте крови субъекта, составляет менее примерно 1:5, где 1 часть биологического образца или продукта крови, разведенная в 5 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, содержание вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие в биологическом образце или продукте крови субъекта, составляет менее примерно 1:4, где 1 часть биологического образца или продукта крови, разведенная в 4 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, содержание вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие в биологическом образце или продукте крови субъекта, составляет менее примерно 1:3, где 1 часть биологического образца или продукта крови, разведенная в 3 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, содержание вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие в биологическом образце или продукте крови субъекта, составляет менее примерно 1:2, где 1 часть биологического образца или продукта крови, разведенная в 2 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, содержание вирусного вектора, связывающего антитела или IgG, присутствующие в биологическом образце или продукте крови субъекта, составляет менее примерно 1:1, где 1 часть биологического образца или продукта крови, разведенная в 1 части буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает определение наличия или количественное определение количества антител или IgG, которые связываются с полипептидом или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, после выполнения стадии (а), но до выполнения стадии (b) и/или после выполнение стадий (а) и (b).

В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает определение наличия или количественное определение количества антител или IgG, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом или нуклеиновой кислотой, после выполнения стадии (а), но до выполнения стадии (b) и/или после выполнения стадии (а) и (b).

Способы по изобретению могут также включать применение протеазы или гликозидазы, эффективной для расщепления или перевара и/или ингибирования или снижения эффекторной функции антител в сочетании с агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn.

В некоторых вариантах осуществления, субъект страдает заболеванием легких (например, муковисцидозом), нарушением свертываемости крови (например, гемофилией А или гемофилией В с ингибиторами или без них), талассемией, заболеванием крови (например, анемией), болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, болезнью Хантингтона, боковым амиотрофическим склерозом (ALS), эпилепсией, лизосомной болезнью накопления (например, аспартилглюкозаминурией, болезнью Баттена, поздним инфантильным нейрональным цероидным липофусцинозом типа 2 (CLN2), цистинозом, болезнью Фабри, болезнью Гоше I, II и III типов, болезнью накопления гликогена II (болезнью Помпе), GM2-ганглиозидозом I типа (болезнью Тея-Сакса), GM2-ганглиозидозом II типа (болезнью Сандхоффа), муколипидозом I типа (сиалидозами I и II типа), II типа (I-клеточной болезнью), III типа (псевдо-болезнью Гурлера) и IV типа, болезнями накопления мукополисахарида (болезнью Гурлера и ее вариантами, Хантера, Санфилиппо A, B, C, D типов, Моркио A и B типов, болезнью Марото-Лами и Слая), болезнью Ниманна-Пика A/B, C1 и C2 типов и болезнью Шиндлера I и II типов), наследственным ангионевротическим отеком (HAE), нарушением накопления меди или железа (например, болезнью Вильсона или Менкеса), дефицитом лизосомальной кислой липазы, неврологическим или нейродегенеративным заболеванием, раком, диабетом 1 или 2 типа, дефицитом аденозиндезаминазы, нарушением обмена веществ (например, болезнью накопления гликогена), заболеванием твердых органов (например, головного мозга, печени, почек, сердца) или инфекционным вирусным (например, гепатитами В и С, HIV и т. д.), бактериальной или грибковой болезнью. В некоторых вариантах осуществления, у субъекта имеется нарушение свертывания крови. В некоторых вариантах осуществления, субъект имеет гемофилию А, гемофилию А с ингибирующими антителами, гемофилию В, гемофилию В с ингибирующими антителами, дефицит любого фактора свертывания крови: VII, VIII, IX, X, XI, V, XII, II, фактором фон Виллебранда, или комбинированным дефицитом FV/FVIII, талассемией, дефицитом эпоксидредуктазы С1 витамина К или дефицитом гамма-карбоксилазы.

В некоторых вариантах осуществления, субъект страдает анемией, кровотечением, связанным с травмой, повреждением, тромбозом, тромбоцитопенией, инсультом, коагулопатией, синдромом диссеминированного внутрисосудистого свертывания (DIC); избыточной антикоагуляцией, связанной с гепарином, низкомолекулярным гепарином, пентасахаридом, варфарином, низкомолекулярными антитромботическими препаратами (например, ингибиторами FXa) или нарушением тромбоцитов, таким как синдром Бернара-Сулье, тромбастения Гланцмана или дефицит пула тромбоцитов.

В некоторых вариантах осуществления, субъект страдает заболеванием, которое поражает или возникает в центральной нервной системой (ЦНС). В некоторых вариантах осуществления, заболевание представляет собой нейродегенеративное заболевание. В некоторых вариантах осуществления, заболевание ЦНС или нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, ALS, наследственную спастическую гемиплегию, первичный латеральный склероз, спинальную мышечную атрофию, болезнь Кеннеди, повторное полиглутаминовое заболевание или болезнь Паркинсона. В некоторых вариантах осуществления, заболевание ЦНС или нейродегенеративное заболевание представляет собой повторное полиглутаминовое заболевание. В некоторых вариантах осуществления, повторное полиглутаминовое заболевание представляет собой спиноцеребеллярную атаксию (SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7 или SCA17).

В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, гормона роста (GH), гормона щитовидной железы (PTH), рилизинг-фактора гормона роста (GRF), фолликулостимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH), хорионического гонадотропина человека (hCG), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтинов, ангиостатина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), эритропоэтина (ЕРО), фактора роста соединительной ткани (CTGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), кислого фактора роста фибробластов (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста α (TGFα), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), инсулиновых факторов роста I и II (IGF-I и IGF-II), TGFβ, активинов, ингибинов, костного морфогенного белка (BMP), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофинов NT-3 и NT4/5, цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (GDNF), нейртурина, агрина, нетрина-1 и нетрина-2, фактора роста гепатоцитов (HGF), эфрина, ноггина, sonic hedgehog и тирозингидроксилазы.

В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО), интерлейкинов (IL1 - IL-36), моноцитарного хемоаттрактантного белка, фактора ингибирования лейкоза, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, Fas лиганда, факторов некроза опухоли α и β, интерферонов α, β и γ, фактора стволовых клеток, flk-2/flt3 лиганда, химерных иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, гуманизированных антител, одноцепочечных антител, Т-клеточных рецепторов, химерных Т-клеточных рецепторов, одноцепочечных Т-клеточных рецепторов, молекул МНС класса I и класса II.

В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид кодирует CFTR (трансмембранный белок-регулятор муковисцидоза), фактор свертывания крови (фактор XIII, фактор IX, фактор VIII, фактор X, фактор VII, фактор VIIa, белок C и т. д.) и усиление функции фактора свертывания крови, антитело, 65 кДа белок, специфичный к пигментному эпителию сетчатки (RPE65), эритропоэтин, рецептор LDL, липопротеинлипазу, орнитинтранскарбамилазу, β-глобин, α-глобин, спектрин, α-антитрипсин, аденозиндезаминазу (ADA), переносчик металлов (ATP7A или ATP7), сульфамидазу, фермент, участвующий в лизосомной болезни накопления (ARSA), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу, β-25 глюкоцереброзидазу, сфингомиелиназу, лизосомальную гексозаминидазу, дегидрогеназу кетокислот с разветвленной цепью, гормон, фактор роста, инсулиноподобный фактор роста 1 или 2, фактор роста тромбоцитов, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, нейротрофический фактор-3 и -4, нейротрофический фактор головного мозга, глиальный фактор роста, трансформирующий фактор роста α и β, цитокин, α-интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-12, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, лимфотоксин, продукт суицидного гена, тимидинкиназу вируса простого герпеса, цитозиндезаминазу, дифтерийный токсин, цитохром P450, дезоксицитидинкиназу, фактор некроза опухоли, белок лекарственной резистентности, белок-супрессор опухоли (например, p53, Rb, Wt-1, NF1, фон Хиппеля-Линдау (VHL), аденоматозный полипоз толстой кишки (APC)), пептид с иммуномодулирующими свойствами, толерогенный или иммуногенный пептид или белок Tregitop или hCDR1, инсулин, глюкокиназу, гуанилатциклазу 2D (LCA-GUCY2D), Rab-сопровождающий белок 1 (хороидеремия), LCA 5 (LCA-леберцилин), орнитинкетокислотную аминотрансферазу (гиратная атрофия), ретиношизин 1 (Х-сцепленный ретиношизис), USH1C (синдром Ашера 1C), Х-сцепленный пигментный ретинит, ГТФазу (XLRP), MERTK (AR формы RP: пигментный ретинит), DFNB1 (коннексиновая 26 глухота), ACHM 2, 3 и 4 (ахроматопсия), PKD-1 или PKD-2 (поликистоз почек), TPP1, CLN2, сульфатазу, N-ацетилглюкозамин-1-фосфаттрансферазу, катепсин A, GM2-AP, NPC1, VPC2, белок-активатор сфинголипидов, одну или несколько цинк-пальцев нуклеаз для редактирования генома, и одну или несколько донорных последовательностей, используемых в качестве шаблонов репарации для редактирования генома.

В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид кодирует ингибирующую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления, ингибирующая нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из киРНК, антисмысловой молекулы, миРНК, РНКи, рибозима и кшРНК. В некоторых вариантах осуществления, ингибирующая нуклеиновая кислота связывается с геном, транскриптом гена или транскриптом гена, связанным с болезнью полинуклеотидных повторов, выбранным из группы, состоящей из гена хантингтина (HTT), гена, ассоциированного с дентаторубропаллидолуизовой атрофией (атрофин 1, ATN1), андрогенного рецептора на Х-хромосоме при спинобульбарной мышечной атрофии, атаксина-1, -2, -3 и -7 человека, Cav2.1 P/Q потенциалозависимого кальциевого канала (CACNA1A), ТАТА-связывающего белка, противоположной цепи атаксина 8 (ATXN8OS), серин/треонин-протеинфосфатазы 2A, 55 кДа, регуляторной субъединицы B бета изоформы при спиноцеребеллярной атаксии (тип 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12 17), FMR1 (умственная отсталость, связанная с ломкой Х хромосомой 1) при синдроме ломкой Х хромосомы, FMR1 (умственная отсталость, связанная с ломкой Х хромосомой 1) при синдроме тремора/атаксии, ассоциированном с ломкой Х хромосомой, FMR1 (умственная отсталость, связанная с ломкой Х хромосомой 2) или член семейства AF4/FMR2 2 при умственной отсталости, ассоциированной с хрупкой XE; миотонин-протеинкиназы (МТ-РК) при миотонической дистрофии; фратаксина при атаксии Фридрейха; мутанта гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) при боковом амиотрофическом склерозе; гена, участвующего в патогенезе болезни Паркинсона и/или болезни Альцгеймера; аполипопротеина B (APOB) и пропротеинконвертазы субтилизина/кексина типа 9 (PCSK9), гиперхолестеринемии; HIV Tat, трансактиватора гена транскрипции вируса иммунодефицита человека, при HIV инфекции; HIV TAR, HIV TAR, гена ответного элемента трансактиватора вируса иммунодефицита человека при HIV инфекции; хемокинового рецептора C-C (CCR5) при HIV инфекции; нуклеокапсидного белка вируса саркомы Рауса (RSV) при инфекции RSV, специфичной для печени микроРНК (miR-122) при инфекции вирусом гепатита С; p53, при острой почечной недостаточности или острой почечной недостаточности трансплантата почки с задержкой функции трансплантата или острой почечной недостаточности; протеинкиназы N3 (PKN3) при заблаговременно рецидивирующих или метастатических солидных злокачественных опухолях; LMP2, LMP2, также известной как субъединица протеасомы бета-типа 9 (PSMB 9) при метастатической меланоме; LMP7, также известной как субъединица протеасомы бета-типа 8 (PSMB 8) при метастатической меланоме; MECL1, также известной как субъединица протеасомы бета-типа 10 (PSMB 10) при метастатической меланоме; фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) при солидных опухолях; кинезинового веретенообразного белка при солидных опухолях, супрессора апоптоза В-клеточного CLL/лимфомы (BCL-2) при хроническом миелоидном лейкозе; рибонуклеотидредуктазы М2 (RRM2) при солидных опухолях; фурина при солидных опухолях; полоподобной киназы 1 (PLK1) при опухолях печени, диацилглицеролацилтрансферазы 1 (DGAT1) при гепатите С, бета-катенина при семейном аденоматозном полипозе; бета2-адренорецептора при глаукоме; RTP801/Redd1, также известного как белок транскрипта 4, индуцируемый повреждением ДНК, при диабетическом макулярном отеке (DME) или возрастной дегенерации желтого пятна; рецептора I сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR1) при возрастной дегенерации желтого пятна или хориоидальной неоваскуляризации, каспазы 2 при неартериальной ишемической оптической нейропатии; мутантного белка кератина 6A N17K при врожденной пахионихии; последовательности генома/гена вируса гриппа А при инфекции гриппом; последовательности генома/гена коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) при инфекции SARS; последовательности генома/гена респираторно-синцитиального вируса при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции; последовательности генома/гена филовируса Эбола при инфекции Эбола; последовательности генома/гена вируса гепатита В и С при инфицировании гепатитом В и С; последовательности генома/гена вируса простого герпеса (HSV) при инфекции HSV, последовательности генома/гена вируса коксаки B3 при инфекции вирусом коксаки B3; сайленсинга патогенного аллеля гена (аллель-специфичного сайленсинга) типа торсина А (TOR1A) при первичной дистонии, пан-класса I и HLA-аллеля, специфичного для трансплантата; и мутантного гена родопсина (RHO) при аутосомно-доминантно наследуемом пигментном ретините (adRP).

В некоторых вариантах осуществления, белок, кодируемый гетерологичным полинуклеотидом, содержит нуклеазу для редактирования генов. В некоторых вариантах осуществления, нуклеаза для редактирования генов включает цинк-пальцевую нуклеазу (ZFN) или эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN). В некоторых вариантах осуществления, нуклеаза для редактирования генов содержит функциональную CRISPR-Cas9 типа II.

В некоторых вариантах осуществления, стадию (а) и/или стадию (b) способа по изобретению выполняют два или несколько раз.

В некоторых вариантах осуществления, субъект представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления, субъектом представляет собой человека.

Также в настоящем документе описаны композиции, например, но не ограничиваясь ими, упаковки и наборы, содержащие компоненты, которые можно использовать для осуществления способов по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, упаковка или набор содержат: (а) рекомбинантный вирусный вектор, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий белок или пептид; (b) агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn; (c) необязательно, протеазу или гликозидазу, которая расщепляет или переваривает антитела; и (d) этикетку с инструкциями по выполнению описанного в настоящем документе способа. В некоторых вариантах осуществления, (а), (b) и (в) находятся в разных или в одном и том же контейнере.

В некоторых вариантах осуществления, упаковка или набор содержат: (а) рекомбинантный вирусный вектор, содержащий гетерологичный полинуклеотид, который транскрибируется в нуклеиновую кислоту, которая ингибирует, снижает или уменьшает экспрессию белка; (b) агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn; (c) необязательно, протеазу или гликозидазу, которая расщепляет или переваривает антитела; и (d) этикетку с инструкциями по выполнению описанного в настоящем документе способа. В некоторых вариантах осуществления, (а), (b) и (с) находятся в разных или одном и том же контейнере.

Описание чертежей

Фигуры 1А, 1В и 1C показывают SDS-PAGE анализы расщепления IgG с помощью IdeS в образцах сыворотки пациентов (фигура 1A), плазмы приматов, отличных от человека (макаки-резуса) (фигура 1B) и плазмы хомяка (фигура 1C), инкубированных с возрастающими количествами IdeS. Образцы инкубируют без IdeS или с возрастающими концентрациями IdeS в течение 1 часа при 37°C. Реакции останавливают добавлением буфера для образцов. Образцы анализируют с помощью невосстанавливающего SDS-PAGE и окрашивания Coomassie.

Фигура 2 представляет собой график, показывающий уровни активности GAA в плазме мыши после инфузии вектора AAV-Spk1-GAA животным, иммунизированным различными количествами IVIg, предварительно обработанных с или без IdeZ. Вектор AAV-Spk1-GAA вводят через сутки после иммунизации IVIg. Активность трансгена оценивают с помощью анализа активности GAA через 2 недели после введения вектора. Активность GAA в нмоль/ч/мл наносят на график для каждой мыши в каждой группе. Контрольным мышам вводят только вектор в отсутствие IVIg.

Фигура 3 показывает уровни титра анти-Spk1 нейтрализующих антител (NAb) в плазме мыши до и после инфузии IdeS. Относительные уровни титра NAb в этом исследовании обозначены как низкий титр (<1:1, 1:1-1:2,5) (жирный шрифт), средний диапазон (1:2,5-1:5) (жирный курсив) и высокий (>1:5-1:10) (курсив).

Фигура 4 показывает уровни анти-Spk1 IgG NAb (нг/мл) в плазме мыши до и после инфузии IdeS. Животных отрицательного контроля не лечат ни IVIg, ни IdeS. IdeS низкий относится к 0,4 мг/кг IdeS, используемому в исследовании, и IdeS высокий относится к 4 мг/кг IdeS.

Фигура 5 показывает уровни активности GAA (нмоль/ч/мл) в плазме мыши после инфузии вектора AAV-Spk1-GAA животным, иммунизированным IVIg, и затем лечат IdeS. Все животные получают 2×10¹² гв/кг AAV-Spk1-GAA вектора. Активность трансгена измеряют в образцах плазмы мышей, иммунизированных IVIg, затем леченных с или без IdeS и, наконец, получивших вектор. Активность трансгена оценивают с помощью анализа активности GAA через 1 неделю после введения вектора. Активность GAA в нмоль/ч/мл наносят на график для каждой мыши в каждой группе.

Фигура 6 показывает уровни активности GAA (нмоль/ч/мл) через две недели после инфузии вектора AAV-Spk1-GAA (2×10¹²гв/кг) у животных, ранее получавших внутривенный иммуноглобулин (0, 300, 800 или 1600 мг/кг) и леченных IdeS (0, 0,4, 1,0 или 2,0 мг/кг). Активность GAA наносят на график для каждой мыши в каждой группе. Мыши из групп, которым вводят IVIg, у которых не развился соответствующий титр анти-Spk1 NAb (т. е. имеющие титр NAb <1:1 или 1:1-1:2,5 до лечения IdeS), исключены.

Фигура 7 показывает уровни титра анти-Spk1 NAb в плазме мышей C57BL/6, имеющих искусственный титр антикапсид-нейтрализующего IgG человека, измеренные до и после инфузии различных препаратов IdeS (партия № 1 и партия № 2).

Фигура 8 показывают график, показывающий уровни фактора VIII человека в плазме мышей C57BL/6, имеющих искусственный титр антикапсидного нейтрализующего IgG человека, до введения дозы и через 1 и 2 недели после введения дозы AAV-Spk1-hFVIII.

Фигура 9 показывает график, показывающий уровни анти-Spk1 капсидного IgG (нг/мл) в плазме мыши до и после инфузии IdeS. Мышам C57BL/6 вводят IVIg для индукции искусственного титра антикапсидного нейтрализующего IgG человека. Животным отрицательного контроля не вводят ни IVIg, ни IdeS. Низкий IVIg означает 300 мг/кг IVIg, использованный в исследовании, средний IVIg означает 800 мг/кг, и высокий IVIg означает 1600 мг/кг. В каждой группе IVIg, животных лечат возрастающими дозами IdeS (0, 0,4, 1,0, 2,0 мг/кг IdeS). Животные, получающие внутривенный иммуноглобулин, но не демонстрирующие антикапсидный ответ IgG, исключены из графика.

Фигура 10 показывает график титров NAb, оцененных в плазме мыши в день 0 (D0) и день 2 (D2) для каждой из пяти групп мышей Tg32 исследования, описанного в примере 13. Верхняя и нижняя пунктирные линии обозначают верхний предел обнаружения (ULOD) и нижний предел обнаружения (LLOD), соответственно. Статистическая значимость определяется как p<0,0234=*, p<0,0039=** по парному непараметрическому t-критерию Wilcoxin и p<0,5 по непарному непараметрическому t-критерию Манна-Уитни.

Фигура 11 показывает график концентрации анти-Spk1 IgG, определенной с помощью ELISA, в плазме мышей в день 0 (D0) и день 2 (D2) для каждой из пяти групп мышей Tg32 исследования, описанного в примере 13. Анти-Spk1 IgG ELISA. Статистическая значимость определяется как p<0,0313=** по парному непараметрическому t-критерию Wilcoxin и p<0,0152=*, p<0,0022=** по непарному непараметрическому t-критерию Манна-Уитни.

Фигура 12 представляет графическое представление концепции комбинированного введения анти-FcRn-агента и IdeS для исключения нейтрализующих антител с высоким титром (NAb) у субъекта для обеспечения трансдукции AAV.

Фигура 13 показывает схему исследование повторной дозы у новозеландских белых кроликов.

Фигура 14 показывает схему исследования анти-FcRn у яванских макак.

Подробное описание

В настоящем документе предложены способы улучшения пользы или эффективности генной терапии, включающие введение агента, который ингибирует или уменьшает взаимодействие IgG с неонатальным Fc рецептором (FcRn). В настоящем документе также предложены способы снижения количества циркулирующих антител, которые связываются с вирусным вектором, таким как рекомбинантный вирусный вектор, или которые связываются с нуклеиновой кислотой или полипептидом, белком или пептидом, кодируемым терапевтическим гетерологичным полинуклеотидом, инкапсидированным рекомбинантным вирусным вектором, или которые связываются с терапевтическим гетерологичным полинуклеотидом. Также в настоящем документе предложены способы введения вектора генной терапии субъекту, имеющему антитела, которые связывают и/или нейтрализуют вектор генной терапии. В настоящем документе также предложены способы повторной дозы или повторного введения вектора генной терапии субъекту, которому ранее вводили вектор генной терапии, и где у субъекта выработались антитела, которые связывают и/или нейтрализуют вектор генной терапии.

В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение субъекту количества агента, эффективного для уменьшения взаимодействия IgG с FcRn. FcRn отвечает за увеличение периода полужизни иммуноглобулинов типа IgG в сыворотке посредством процесса, называемого рециркуляцией IgG. FcRn находится в эндосомальном компартменте многих типов клеток. Когда эндоцитозированный IgG перемещается по эндосомальному пути, часть Fc IgG связывается с FcRn в кислой ранней эндосоме с образованием комплекса FcRn-IgG. Комплекс FcRn-IgG перемещается от лизосомального пути (который обычно приводит к расщеплению или катаболизму IgG) обратно к плазматической мембране и клеточной поверхности. Повышенный внеклеточный рН приводит к диссоциации комплекса и высвобождению IgG из клетки и обратно в кровоток, таким образом увеличивая время полужизни IgG в сыворотке. Уменьшение или ингибирование взаимодействия IgG с FcRn уменьшит рециркуляцию IgG, увеличит или улучшит клиренс, расщепление и катаболизм IgG и приведет к снижению количества (снижению титра) IgG в кровотоке (измеряемому в крови, сыворотке или плазме). Более низкие титры циркулирующих IgG означают более низкие титры циркулирующих антител, которые связывают и/или нейтрализуют вектор для генной терапии. Введение агента, который может ингибировать или ослаблять взаимодействие между IgG и FcRn, уменьшит рециркуляцию IgG, увеличит или усилит клиренс, расщепление и катаболизм IgG и приведет к снижению количества (снижению титров) IgG в кровотоке, а также к улучшению или усилению эффективности лечения генной терапией.

Используемые в настоящем документе термины «снижение взаимодействия IgG с FcRn» и «снижение взаимодействия IgG с FcRn» включают любое снижение или ингибирование взаимодействия IgG с FcRn или связывания IgG-FcRn. Обзор агентов, уменьшающих взаимодействие IgG с FcRn и которые могут быть использованы в изобретении, представлен в Low et al., 2009, AAPS J., 11:432-434, Sockolosky et al., 2015, Adv. Drug Deliv. Rev., 91:109-124, Zuercher et al., 2019, Autoimm. Rev., doi.org/10.1016/j.autrev.2019.102366, и Pyzik et al., 2019, Frontiers Immunol., doi: 103389/fimmu.2019.01540. Сниженное, уменьшенное или ингибированное взаимодействие IgG с FcRn можно оценить путем обнаружения или измерения одной или нескольких сигнальных активностей или последующих показаний активности FcRn, включая уровни IgG в сыворотке или плазме. Агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, также упоминается в настоящем документе как «анти-FcRn агент» или «антагонист FcRn».

Примеры агентов, уменьшающих взаимодействие IgG и FcRn, которые могут быть использованы в изобретении, включают, например, но не ограничиваются ими, FcRn-связывающие антитела, ABDEG (антитела, усиливающие расщепление IgG), FcRn-связывающие пептиды (включая пептиды, имеющие GHFGGXY (SEQ ID NO: 57) консенсусный мотив, где X представляет собой гидрофобную аминокислоту, и мотив заключен в дисульфидную петлю), FcRn-связывающие аффитела и низкомолекулярные антагонисты FcRn.

Примером анти-FcRn антитела, которое можно использовать в изобретении, является M281 (нипокалимаб), полностью человеческое анти-FcRn антитело, которое ингибирует FcRn-опосредованную рециркуляцию и снижает патогенный IgG, сохраняя при этом продуцирование IgG (см. Ling et al. 2019). Другие анти-FcRn антитела, которые можно использовать в изобретении, включают, например, без ограничения, антитела, описанные в публикациях международных патентных заявок WO2018023136, WO2019118791 и WO2020018910, каждое из которых включено в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки, включая весь текст, таблицы, списки последовательностей и чертежи.

В некоторых вариантах осуществления, анти-FcRn антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь, и легкая цепь содержит последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94% по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100% идентичность последовательности SEQ ID NO:49; и тяжелая цепь содержит последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100% идентичность последовательности SEQ ID NO:50.

В некоторых вариантах осуществления, анти-FcRn антитело содержит легкую цепь и/или тяжелую цепь, и легкая цепь содержит последовательность, имеющую по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по крайней мере 95%, по крайней мере 96%, по крайней мере 97%, по крайней мере 98%, по крайней мере 99% или 100% идентичность последовательности SEQ ID NO:49; и тяжелая цепь содержит последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100% идентичность последовательности SEQ ID NO:50.

В некоторых вариантах осуществления, анти-FcRn антитело содержит легкую цепь и/или тяжелую цепь, и легкая цепь содержит, по меньшей мере, одну последовательность определяющей комплементарность области (CDR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52 и SEQ ID NO:53; и тяжелая цепь содержит, по меньшей мере, одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55 и SEQ ID NO:56.

В некоторых вариантах осуществления, анти-FcRn антитело содержит легкую цепь и/или тяжелую цепь, и легкая цепь содержит последовательности определяющей комплементарность области (CDR) SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52 и SEQ ID NO: 53; и тяжелая цепь содержит последовательности CDR SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55 и SEQ ID NO:56.

В некоторых вариантах осуществления, анти-FcRn антитело содержит легкую цепь, содержащую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100% идентичность последовательности SEQ ID NO:49.

В некоторых вариантах осуществления, анти-FcRn антитело содержит легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:49.

В некоторых вариантах осуществления, анти-FcRn антитело содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100% идентичности последовательности SEQ ID NO:50.

В некоторых вариантах осуществления, анти-FcRn антитело содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:50.

Примером FcRn-связывающего пептида, который можно использовать в изобретении, является SYN1436, который связывает FcRn и снижает общие уровни IgG в сыворотке (см. Mezo et al., 2008, Bioorg. Med. Chem., 16:6394-6405).

Молекулы аффитела представляют собой аффинные белковые домены длиной 58 аминокислот, имеющие структуру свернутого антипараллельного пучка из трех спиралей. Анти-FcRn аффитела, которые можно использовать в изобретении, включают, например, и без ограничения, ZFcRn и другие, описанные в Seijseng et al., 2018, Scientific Reports, 8:5141, doi:10.1038/s41598-018-23481-5.

Примеры низкомолекулярных антагонистов FcRn, которые уменьшают взаимодействие IgG с FcRn и которые могут быть использованы в изобретении, описаны в Wang et al., 2013, Bioorg. Med. Chem. Let., 23:1253-1256.

ABDEG представляют собой молекулы IgG, в которых Fc часть сконструирована так, чтобы связываться с высокой аффинностью с FcRn как при физиологическом, так и при эндосомальном рН.

Примеры композиций антагонистов FcRn, содержащих варианты Fc областей, которые связываются с FcRn с повышенной аффинностью, и которые можно использовать в изобретении, описаны в публикации международной патентной заявки WO 2015/100299.

Эфгартигимод представляет собой модифицированную (с помощью технологии ABDEG) Fc область, полученную из IgG1 человека, которая связывает FcRn с высокой аффинностью и предотвращает взаимодействие и рециркуляцию FcRn с циркулирующими IgG (Ulrichts et al., 2018, J. Clin. Invest., 128: 4372-4386).

Розаноликсизумаб представляет собой анти-FcRn моноклональное антитело изотипа IgG4P, которое снижает уровни IgG у людей примерно на 45% при введении в дозе 7 мг/кг (Kiessling et al., 2017, Sci. Transl. Med., 9:aan1208. doi: 10.1126/scitranslmed.aan1208).

SYNT001 представляет собой моноклональное антитело, блокирующее FcRn, которое снижает уровень всех циркулирующих подтипов IgG и иммунных комплексов IgG у людей (Blumberg et al., 2019, Sci. Adv., 5:eaax9586).

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, ингибирует передачу сигналов, опосредованную взаимодействием между FcRn и IgG.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, представляет собой пептид, белок, малую молекулу, нуклеиновую кислоту, аптамер, олигонуклеотид, аффитело, антитело или их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, выбран из эфгартигимода, M281, розаноликсизумаба, SYNT001 и IMVT-1401.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из моноклонального антитела или его фрагмента, поликлонального антитела или его фрагмента, химерного антитела, гуманизированного антитела и одноцепочечного антитела.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, представляет собой биспецифический агент, содержащий сайты связывания для IgG и FcRn.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, представляет собой рекомбинантную Fc часть IgG или его биологически активную часть, или его протеомиметик.

В некоторых вариантах осуществления, циркулирующий IgG снижается, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% при по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 99% или 100%.

Кроме того, в настоящем документе представлена композиция, представленная, например, в виде упаковки или набора, содержащего (а) рекомбинантный вирусный вектор, содержащий гетерологичный полинуклеотид, который кодирует белок, или пептид, или нуклеиновую кислоту; (b) средство, уменьшающее взаимодействие IgG с FcRn, (c) необязательно, протеазу или гликозидазу, которые расщепляют или переваривают антитела; и (d) этикетку с инструкциями по выполнению способа, описанного в настоящем документе, где (a), (b) и (c) поставляются в отдельных или одном и том же контейнере(ах).

В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение субъекту количества гликозидазы, эффективного для ингибирования или снижения эффекторной функции антител, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором, и/или нуклеиновой кислотой, и/или белком или пептидом, кодируемым гетерологичный полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение субъекту количества эндопептидазы, эффективного для расщепления или перевара антител, или эндогликозидазы, эффективного для ингибирования или снижения эффекторной функции антител, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором и/или нуклеиновой кислотой, и/или белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом.

В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение субъекту количества гликозидазы, эффективного для уменьшения связывания Fc рецептором антител, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором, и/или нуклеиновой кислотой, и/или белком или пептидом, кодируемым гетерологичный полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение субъекту количества эндогликозидазы, эффективного для уменьшения связывания Fc-рецептором антител, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором, и/или нуклеиновой кислотой, и/или белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом.

Способы по изобретению широко применимы для улучшения методов генной терапии. Например, преодоление NAb к капсиду AAV или другой способ доставки генной терапии путем введения агента, который снижает взаимодействие IgG с FcRn, может позволить лечить пациентов с ранее существовавшими титрами нейтрализующих AAV антител, а также сделать возможным повторение дозирования пациентов, которым ранее вводили продукт генной терапии AAV, где эффективные уровни либо не были достигнуты, либо были потеряны из-за времени или других вмешивающихся факторов. Введение агента, который уменьшает взаимодействие IgG с FcRn, в сочетании с введением IdeS, например, может дополнительно повысить эффективность лечения генной терапией пациентов с уже существующими NAb. Кроме того, способы, описанные в настоящем документе, обеспечивают перенос гена печени в педиатрическую популяцию, которая считается трудно поддающейся генной терапии из-за размножения гепатоцитов и потенциальной потери экспрессии трансгена во время развития. В другом примере, в способах по изобретению, введение агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, и, необязательно, в сочетании с введением протеазы (например, IdeS) или гликозидазы (например, EndoS), будет уменьшать или очистить нейтрализующие антитела против капсида AAV и обеспечивать лечение пациентов, ранее считавшихся неподходящими для генной терапии, или у которых вырабатываются антитела к AAV после генной терапии AAV.

В некоторых вариантах осуществления, вирусные векторы, которые можно использовать в изобретении, включают, например и без ограничения, частицы AAV. В некоторых вариантах осуществления, вирусные векторы, которые можно использовать в изобретении, включают, например и без ограничения, ретровирусный, аденовирусный, хелпер-зависимый аденовирусный, гибридный аденовирусный, вектор вируса простого герпеса, лентивирусный, векторы поксвируса, вируса Эпштейн-Барр, вируса коровьей оспы и цитомегаловируса человека, включая их рекомбинантные варианты.

Термин «рекомбинантный» в качестве модификатора вирусного вектора, такого как рекомбинантный вектор AAV (rAAV), а также модификатора последовательностей, таких как рекомбинантные полинуклеотиды и полипептиды, означает, что композиции были изменены (т.е. сконструированы) таким образом, который обычно не встречается в природе. Конкретным примером рекомбинантного вектора AAV может быть нуклеиновая кислота, которая обычно не присутствует в геноме AAV дикого типа (гетерологичном полинуклеотиде), вставленная в вирусный геном. Примером этого может быть клонирование нуклеиновой кислоты (например, гена), кодирующей терапевтический белок или полинуклеотидную последовательность, в вектор с 5', 3' и/или интронными областями или без них, с которыми ген обычно связан в AAV геноме. Хотя термин «рекомбинантный» не всегда используется в настоящем документе в отношении вектора AAV, а также последовательностей, таких как полинуклеотиды, рекомбинантные формы, включая векторы AAV, полинуклеотиды и т. д., прямо включены, несмотря на любое такое опущение.

«Вектор rAAV», например, получен из генома AAV дикого типа с использованием молекулярных способов для удаления всего или части генома AAV дикого типа и замены ненативной (гетерологичной) нуклеиновой кислотой, такой как нуклеиновая кислота, кодирующая терапевтический белок или полинуклеотидную последовательность. Как правило, для вектора rAAV сохраняется одна или обе последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) генома AAV. rAAV отличается от генома AAV, поскольку весь геном AAV или его часть заменены ненативной последовательностью по отношению к AAV геномной нуклеиновой кислоте, такой как гетерологичная нуклеиновая кислота, кодирующая терапевтический белок или полинуклеотидную последовательность. Таким образом, включение ненативной (гетерологичной) последовательности определяет AAV как «рекомбинантный» вектор AAV, который можно назвать «вектором rAAV».

Последовательность рекомбинантного вектора AAV может быть упакована, называемая в настоящем документе «частицей», для последующего инфицирования (трансдукции) клетки ex vivo, in vitro или in vivo. Если последовательность рекомбинантного вектора инкапсидирована или упакована в частицу AAV, частица также может называться «rAAV», «частица rAAV» и/или «вирион rAAV». Такие rAAV, частицы rAAV и вирионы rAAV включают белки, которые инкапсидируют или упаковывают геном вектора. Конкретные примеры включают, в случае AAV, капсидные белки.

«Геном вектора», который может быть сокращен как «гв», относится к части последовательности рекомбинантной плазмиды, которая, в конечном итоге, упакована или инкапсидирована с образованием частицы rAAV. В случаях, когда рекомбинантные плазмиды используются для конструирования или производства рекомбинантных векторов AAV, геном вектора AAV не включает часть «плазмиды», которая не соответствует последовательности векторного генома рекомбинантной плазмиды. Эта невекторная часть генома рекомбинантной плазмиды называется «остовом плазмиды», которая важна для клонирования и амплификации плазмиды, процесса, необходимого для размножения и продуцирования рекомбинантного вектора AAV, но сама по себе не упакована или не инкапсидирована в частицы rAAV. Таким образом, «геном вектора» относится к нуклеиновой кислоте, которая упакована или инкапсидирована rAAV.

Используемый в настоящем документе термин «серотип» в отношении вектора AAV означает капсид, который серологически отличается от других серотипов AAV. Серологическая различимость определяется на основании отсутствия перекрестной реактивности между антителами к одному AAV по сравнению с другим AAV. Различия в перекрестной реактивности обычно обусловлены различиями в последовательностях белков капсида/антигенных детерминант (например, из-за различий в последовательностях VP1, VP2 и/или VP3 серотипов AAV). Антитело к одному AAV может перекрестно реагировать с одним или несколькими другими серотипами AAV из-за гомологии последовательности капсидного белка.

Согласно традиционному определению, серотип означает, что представляющий интерес вирус был протестирован против сыворотки, специфичной для всех существующих и охарактеризованных серотипов, на нейтрализующую активность, и не было обнаружено антител, нейтрализующих представляющий интерес вирус. По мере того, как обнаруживается больше встречающихся в природе вирусных изолятов и/или генерируются капсидные мутанты, могут быть или не быть серологические различия с любым из существующих в настоящее время серотипов. Таким образом, в случаях, когда новый вирус (например, AAV) не имеет серологических отличий, этот новый вирус (например, AAV) будет подгруппой или вариантом соответствующего серотипа. Во многих случаях, еще предстоит провести серологическое тестирование нейтрализующей активности мутантных вирусов с модификациями капсидной последовательности, чтобы определить, относятся ли они к другому серотипу в соответствии с традиционным определением серотипа. Соответственно, для удобства и во избежание повторения, термин «серотип» в широком смысле относится как к серологически различным вирусам (например, AAV), так и к вирусам (например, AAV), серологически неотличимым, которые могут принадлежать к подгруппе или варианту данного серотипа.

Векторы rAAV включают любой вирусный штамм или серотип. Например, но не ограничиваясь ими, геном или частица вектора rAAV (капсид, такой как VP1, VP2 и/или VP3) может быть основан на любом серотипе AAV, таком как AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -rh74, -rh10, AAV3B или AAV-2i8, например. Такие векторы могут быть основаны на одном и том же штамме или серотипе (или подгруппе или варианте) или отличаться друг от друга. Например, но не ограничиваясь ими, геном или частица (капсид) плазмиды или вектора rAAV, основанные на геноме одного серотипа, могут быть идентичны одному или нескольким белкам капсида, которые упаковывают вектор. Кроме того, геном плазмиды или вектора rAAV может быть основан на геноме серотипа AAV, отличном от одного или нескольких белков капсида, которые упаковывают геном вектора, и в этом случае, по меньшей мере, один из трех белков капсида может быть другим серотипом AAV, например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV3B, AAV-2i8, SPK1 (SEQ ID NO:1), SPK2 (SEQ ID NO:2) или его вариантом, например. Более конкретно, геном вектора rAAV2 может содержать ITR AAV2, но капсиды другого серотипа, такие как AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV3B, AAV-2i8, SPK1 (SEQ ID NO:1), SPK2 (SEQ ID NO:2) или их вариант, например. Соответственно, векторы rAAV включают последовательности генов/белков, идентичные последовательностям генов/белков, характерным для определенного серотипа, а также «смешанные» серотипы, которые также можно назвать «псевдотипами».

В некоторых вариантах осуществления, геном или частица плазмиды или вектора rAAV основаны на вариантах AAV рептилий или беспозвоночных, таких как парвовирус змей и ящериц (Pénzes et al., 2015, J. Gen. Virol., 96:2769-2779) или насекомых, и парвовирус креветок (Roekring et al., 2002, Virus Res., 87:79-87).

В некоторых вариантах осуществления, геном или частица рекомбинантной плазмиды или вектора основаны на варианте бокавируса. Варианты бокавируса человека описаны, например, в Guido et al., 2016, World J. Gastroenterol., 22:8684-8697.

В некоторых вариантах осуществления, вектор rAAV включает или состоит из капсидной последовательности, по меньшей мере, на 70% или более (например, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% и т. д.), идентичной одному или нескольким AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV3B, AAV-2i8, SPK1 (SEQ ID NO:1), капсидным белкам SPK2 (SEQ ID NO:2) (последовательности VP1, VP2 и/или VP3). В некоторых вариантах осуществления, вектор rAAV включает или состоит из последовательности, по меньшей мере, на 70% или более (например, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% и т. д.), идентичной одному или нескольким AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10 или AAV3B, ITR.

В некоторых вариантах осуществления, векторы rAAV включают варианты AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV3B, Rh10, Rh74 и AAV-2i8 (например, варианты ITR и капсида, например, в виде аминокислотных вставок, добавлений, замен и делеций), например, как указано в WO 2013/158879 (международная заявка PCT/US2013/037170), WO 2015/013313 (международная заявка PCT/US2014/047670) и US 2013/0059732 (заявка США № 13/594,773).

rAAV, такие как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV3B, AAV-2i8, SPK1 (SEQ ID NO:1), SPK2 (SEQ ID NO:2) и варианты, гибриды и химерные последовательности могут быть сконструированы с использованием рекомбинантных методов, известных специалистам в данной области техники, для включения одной или нескольких гетерологичных полинуклеотидных последовательностей (трансгенов), фланкированных одной или несколькими функциональными последовательностями ITR AAV. Такие векторы AAV обычно сохраняют, по меньшей мере, одну функциональную(ые) фланкирующую(ие) последовательность(и) ITR, что необходимо для сохранения, репликации и упаковки рекомбинантного вектора в частицу вектора rAAV. Таким образом, геном вектора rAAV должен включать последовательности, необходимые в цис-положении для репликации и упаковки (например, функциональные последовательности ITR).

В некоторых вариантах осуществления, лентивирус, используемый в изобретении, может представлять собой вирус иммунодефицита человека-1 (HIV-1), иммунодефицита человека-2 (HIV-2), вирус иммунодефицита обезьян (SIV), вирус иммунодефицита кошек (FIV), вирус иммунодефицита крупного рогатого скота. (BIV), вирус болезни Джембрана (JDV), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV) или вирус артрита-энцефалита коз (CAEV). Лентивирусные векторы способны обеспечивать эффективную доставку, интеграцию и длительную экспрессию гетерологичных полинуклеотидных последовательностей в неделящихся клетках как in vitro, так и in vivo. В данной области техники известны различные лентивирусные векторы, см. Naldini et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:11382-11388 (1996); Science, 272: 263-267 (1996)), Zufferey et al., (Nat. Biotechnol., 15:871-875, 1997), Dull et al., (J Virol. 1998 Nov;72(11):8463-71, 1998), патенты США №№ 6,013,516 и 5,994,136, любой из которых может быть подходящим вирусным вектором для использования в изобретении.

Иммунный ответ, такой как гуморальный иммунитет, может развиться против вируса дикого типа у субъекта, подвергшегося воздействию вируса дикого типа. Такое воздействие может привести к образованию ранее существовавших у субъекта антител, которые связываются с вирусным вектором, основанным на вирусе дикого типа, даже до лечения методом генной терапии с использованием вирусного вектора.

Иммунный ответ, такой как гуморальный иммунитет, также может развиваться против рекомбинантного вирусного вектора и/или гетерологичного полинуклеотида или белка или пептида, кодируемого гетерологичным полинуклеотидом, инкапсидированным вирусным вектором, что приводит к ингибированию или уменьшению трансдукции клеток вирусного вектора, экспрессии или функции гетерологичного полинуклеотида, или функции или активности белка или пептида, кодируемого гетерологичным полинуклеотидом, у субъекта, которому вводят вирусный вектор.

Антитела, которые связываются с вирусным вектором, используемым в изобретении, таким как рекомбинантный вирусный вектор, который можно назвать «нейтрализующими» антителами, могут уменьшать или ингибировать клеточную трансдукцию вирусных векторов, пригодных для генной терапии. В результате, хотя это и не связано с теорией, клеточная трансдукция снижается или ингибируется, тем самым снижая введение вирусного упакованного гетерологичного полинуклеотида в клетки и последующую экспрессию и, при необходимости, последующую трансляцию в белок или пептид. Кроме того, антитела, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом или белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, инкапсидированным вирусным вектором, могут ингибировать экспрессию гетерологичного полинуклеотида, функцию или активность гетерологичного полинуклеотида или функцию или активность белка или пептида, кодируемого гетерологичным полинуклеотидом.

Соответственно, могут присутствовать антитела, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором (например, AAV), и/или могут присутствовать антитела, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом у субъекта. Кроме того, могут присутствовать антитела, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, инкапсидированным рекомбинантным вирусным вектором.

IgG антитела, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором (например, AAV) или которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, если они продуцируются, могут быть снижены у субъекта путем применения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, как указано в настоящем документе. Уменьшение взаимодействия IgG с FcRn приводит к уменьшению рециркуляции IgG (также называемому повышенным клиренсом IgG) и, таким образом, к снижению титра циркулирующих IgG (снижение уровней IgG в крови, плазме или сыворотке), который можно измерить стандартными анализами, известными в данной области техники.

Антитела, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором (например, AAV) или которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, если они продуцируются, могут быть дополнительно расщеплены или переварены протеазой, как указано в настоящем документе. Антитела, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором (например, AAV) или которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, если они продуцируются, также могут иметь сниженную или ингибированную эффекторную функцию, как указано в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин «эффекторная функция» по отношению к антителу означает нормальные функциональные свойства антитела. Неограничивающие примеры функциональных свойств антител включают, например, связывание с антигеном; активацию каскада комплемента (называемую комплементзависимой цитотоксичностью); связывание с рецептором Fc на эффекторных клетках, таких как макрофаги, моноциты, естественные киллеры и эозинофилы, для задействования антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC); и функционирование в качестве сигнала для поглощения связанного антигена/патогена иммунными клетками, такими как фагоциты и дендритные клетки. Таким образом, снижение или ингибирование эффекторной функции антитела может относиться к любому одному или нескольким из вышеперечисленных неограничивающих функциональных признаков. Анализы эффекторной функции известны в данной области техники, а также описаны, например, в WO 2016012285.

«Fc рецептор» относится к любому Fc рецептору. Помимо неонатального Fc рецептора (FcRn), неограничивающие примеры Fc рецепторов включают рецепторы Fc гамма иммуноглобулина (FcγR), которые присутствуют на клетках. У человека, FcγR относится к одному, некоторым или всему семейству Fc рецепторов, включающему FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) и FcγRIIIB (CD16b). FcγR включает встречающиеся в природе полиморфизмы FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) и FcγRIIIB (CD16b).

В некоторых вариантах осуществления, связывание антитела с вирусным вектором снижается или ингибируется агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn, протеазой или гликозидазой.

В некоторых вариантах осуществления, связывание антитела с рецептором Fc на эффекторных клетках, таких как макрофаги, моноциты, естественные киллеры или эозинофилы, снижается или ингибируется с помощью гликозидазы. В некоторых вариантах осуществления, эндогликозидаза гидролизует гликановую структуру на домене антитела, взаимодействующем с Fc. В некоторых вариантах осуществления, эндогликозидаза гидролизует гликановую структуру на взаимодействующем с Fc домене IgG, такую как N-связанный биантеннарный гликан в положении Asn-297 (нумерация Kabat).

В некоторых вариантах осуществления, активация каскада комплемента антителами снижается или ингибируется агентом, который снижает взаимодействие IgG с FcRn, протеазой или гликозидазой.

В некоторых вариантах осуществления, стимуляция антителами или снижение поглощения иммунными клетками, такими как фагоциты или дендритные клетки, снижается или ингибируется с помощью агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, протеазой или гликозидазой.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, вводят субъекту перед введением рекомбинантного вирусного (например, AAV) вектора. В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, вводят субъекту после введения рекомбинантного вирусного (например, AAV) вектора. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантный вирусный (например, AAV) вектор и агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, вводят по существу одновременно или примерно в одно и то же время.

В некоторых вариантах осуществления, в дополнение к агенту, уменьшающему взаимодействие IgG с FcRn, субъекту вводят протеазу и/или гликозидазу перед введением рекомбинантного вирусного (например, AAV) вектора. В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, вводят субъекту после введения протеазы и/или гликозидазы и/или после введения рекомбинантного вирусного (например, AAV) вектора. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантный вирусный (например, AAV) вектор и агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, вводят по существу одновременно или примерно в одном и то же время с введением агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn.

В некоторых вариантах осуществления, агент, который снижает взаимодействие IgG с FcRn, такой как, например и без ограничений, анти-FcRn антитело, вводят субъекту перед введением субъекту эндопептидазы, такой как и без ограничений, IdeS, с последующим введением субъекту рекомбинантного вирусного (например, AAV) вектора. В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, такой как, например и без ограничения, анти-FcRn антитело, вводят субъекту более чем один раз перед введением эндопептидазы, например и без ограничения, IdeS. В некоторых вариантах осуществления, агент который уменьшает взаимодействие IgG с FcRn, такой как, например и без ограничения, анти-FcRn антитело, вводят субъекту, по меньшей мере, два раза, по меньшей мере, три раза, по меньшей мере, 4 раза или по меньшей мере, 5 раз перед введением эндопептидазы, такой как и без ограничений, IdeS.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, вводят субъекту в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более недель до введения протеазы и/или гликозидазы, и после введения протеазы и/или гликозидазы субъекту вводят рекомбинантный вирусный (например, AAV) вектор.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, вводят субъекту в течение примерно 1 часа, примерно 2 часов, примерно 3 часов, примерно 4 часов, примерно 5 часов, примерно 6 часов, примерно 7 часов, примерно 8 часов, примерно 9 часов, примерно 10 часов, примерно 15 часов, примерно 20 часов, примерно одного дня, примерно 2 дней, примерно 3 дней, примерно 4 дней, примерно 5 дней, примерно 6 дней или примерно одной недели до введения субъекту протеазы и/или гликозидазы, и после введения протеазы и/или гликозидазы субъекту вводят рекомбинантный вирусный (например, AAV) вектор.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, такой как, например и без ограничения, анти-FcRn антитело, вводят субъекту в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более дней. за несколько недель до введения субъекту эндопептидазы, такой как, помимо прочего, IdeS, и после введения эндопептидазы субъекту вводят рекомбинантный вирусный (например, AAV) вектор.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, такой как, например и без ограничений, анти-FcRn антитело, вводят субъекту в течение примерно 1 часа, примерно 2 часов, примерно 3 часов, примерно 4 часов, примерно 5 часов, примерно 6 часов, примерно 7 часов, примерно 8 часов, примерно 9 часов, примерно 10 часов, примерно 15 часов, примерно 20 часов, примерно одного дня, примерно 2 дней, примерно 3 дней, примерно 4 дней, примерно 5 дней, примерно 6 дней или примерно одной недели до введения субъекту эндопептидазы, такой как и без ограничений, IdeS, и после введения эндопептидазы субъекту вводят рекомбинантный вирусный (например, AAV) вектор.

Антитела включают любые из IgG, IgM, IgA, IgD и/или IgE. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, изобретение направлено, среди прочего, на перевар, расщепление или снижение или ингибирование эффекторной функции любого из этих пяти классов антител, любых двух из этих пяти классов антител, любых трех из этих пяти классов антител, любых четырех из этих пяти классов антител или всех пяти из этих пяти классов антител.

Уровни антител у субъекта можно анализировать, измерять или определять до и/или после введения рекомбинантного вирусного вектора. Уровни антител у субъекта также можно анализировать, измерять или определять до и/или после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, или протеазы, или гликозидазы. Уровни антител у субъекта также можно анализировать или измерять несколько раз до и/или после введения рекомбинантного вирусного вектора, а также до и/или после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, или протеазы или гликозидазы.

Эффекторную функцию антител у субъекта можно анализировать, измерять или определять до и/или после введения рекомбинантного вирусного вектора. Эффекторная функция антител у субъекта также может быть проанализирована, измерена или определена до и/или после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, или протеазы или гликозидазы. Эффекторная функция антител у субъекта также может быть проанализирована или измерена несколько раз до и/или после введения рекомбинантного вирусного вектора, а также до и/или после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, или протеазы или гликозидазы.

Увеличение равновесной константы связывания соответствует уменьшению связывания между IgG и рецептором Fc. Соответственно, снижение связывания антитела с рецептором Fc вследствие действия агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn или активность протеазы или гликозидазы, может привести к увеличению равновесной константы связывания для взаимодействия IgG:FcR. Уменьшение связывания антитела с рецептором Fc может привести к увеличению равновесной константы связывания для взаимодействия IgG:FcR по меньшей мере, в 1, по меньшей мере, в 2, по меньшей мере, в 3, или, по меньшей мере, в 4, или, по меньшей мере, в 5, или, по меньшей мере, в 6, или, по меньшей мере, в 7, или, по меньшей мере, в 8 раз.

В некоторых вариантах осуществления, иммунный ответ (например, гуморальный иммунный ответ) у субъекта, вызванный воздействием вируса дикого типа, лечат путем введения агента, который уменьшает взаимодействие IgG с FcRn, и количества протеазы и/или гликозидазы, эффективного для расщепления или перевара антител, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором на основе вируса дикого типа перед введением рекомбинантного вирусного вектора субъекту.

В некоторых вариантах осуществления, иммунный ответ (например, гуморальный иммунный ответ), вызванный введением рекомбинантного вирусного вектора, такого как AAV, лечат путем введения агента, который снижает взаимодействие IgG с FcRn, и некоторого количества протеазы и/или гликозидазы, эффективного для расщепления или перевара антител, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором, или антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом или белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, инкапсидированным вирусным вектором.

В некоторых вариантах осуществления, введению рекомбинантного вирусного вектора субъекту предшествует введение агента, который снижает взаимодействие IgG с FcRn, и протеазы и/или гликозидазы для ингибирования или профилактики иммунного ответа (например, гуморального иммунного ответа) против рекомбинантного вирусного вектора или антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом или белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, инкапсидированным вирусным вектором.

В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, и протеазу и/или гликозидазу вводят субъекту перед иммунным ответом (например, гуморальным иммунным ответом), например, перед выработкой нейтрализующих антител или развитием антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом или белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, инкапсидированным вирусным вектором.

Известно применение протеаз и/или гликозидаз в способах повышения или усиления эффективности векторов генной терапии и повышения или усиления генной терапии у субъекта. См., например, WO2020016318, WO2020102740 и Leborgne et al., 2020, Nat. Med., 26:1096-1101 (2020), каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки, включая весь текст, таблицы, перечни последовательностей и чертежи.

Протеазы представляют собой ферменты, которые расщепляют или переваривают белки. Используемые в настоящем документе протеазы также обозначаются как пептидазы, протеиназы, пептидгидролазы или протеолитические ферменты.

Протеазы, которые можно использовать в изобретении, можно разделить на две широкие группы на основе их субстратной специфичности. Протеазы могут относиться к экзотипу, который гидролизует пептидные связи, расположенные ближе к N-концу или к С-концу (экзопротеазу или экзопептидазу). Примеры экзопротеаз или экзопептидаз включают, например, без ограничения, Флавозим (Novozymes), ProteaAX (Amano) и Панкреатин из поджелудочной железы свиньи.

Протеазы, которые можно использовать в изобретении, могут относиться к эндотипу, который гидролизует пептидные связи внутри полипептидных цепей (эндопротеазы или эндопептидазы). Примеры эндопротеаз включают, например и без ограничений, IdeS, IdeZ, IgdE, IdeMC, трипсин, химотрипсин, папаин и пепсин.

Примеры протеаз, которые можно использовать в изобретении, включают, например, без ограничения, цистеиновые протеазы из Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi, Mycoplasma canis, S. agalactiae или S. pseudoporcinus. В некоторых вариантах осуществления, протеаза включает эндопептидазу IdeS из Streptococcus pyogenes или ее модифицированный вариант, указанный в любой из SEQ ID NO:3-18. В некоторых вариантах осуществления, протеаза включает протеазу, указанную в SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20, или ее модифицированный вариант. В некоторых вариантах осуществления, протеаза включает эндопептидазу IdeZ из Streptococcus equi или ее модифицированный вариант, указанный в любой из SEQ ID NO: 21-43.

Другие протеазы, которые можно использовать в изобретении, включают, например и без ограничений, ферменты IgdE из S. suis, S. porcinus, S. equi, описанные в публикации международной патентной заявки WO 2017/134274. Другие протеазы, которые можно использовать в изобретении, включают, например и без ограничений, IdeMC и гомологи, описанные в публикации международной патентной заявки WO 2018/093868. Другие эндопептидазы, которые можно использовать в изобретении, включают, например и без ограничений, IdeZ с и без N-концевого метионина и сигнального пептида, и гибридные белки IdeS/IdeZ, описанные в публикации международной патентной заявки WO 2016/128559. Другие протеазы, которые можно использовать в изобретении, включают, например и без ограничений, протеазы, описанные в Jordan et al. (2017, N. Engl. J. Med., 377: 442-453), Lannergard and Guss (2006, FEMS Microbiol. Lett., 262:230-235) и Hulting et al., (2009, FEMS Microbiol. Lett., 298:44-50), например.

Гликозидазы представляют собой ферменты, гидролизующие гликозидные связи в сложных сахарах. Обычно выделяют две широкие группы, а именно экзогликозидазы и эндогликозидазы. Гликозидазы расщепляют и таким образом высвобождают гликаны/олигосахариды из гликопротеинов, таких как антитела.

Экзогликозидазы, которые можно использовать в изобретении, включают, например и без ограничений, N-ацетилглюкозаминидазу, фукозидазу, галактозидазу, глюкозидазу, маннозидазу, нейраминидазу и ксилозидазу. Эндогликозидазы, которые можно использовать в изобретении, включают, например и без ограничений, EndoS, Endo D, эндогликозидазу-H, Endo F1, Endo F2 и Endo F3.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, гликозидаза содержит эндогликозидазу. В некоторых вариантах осуществления, гликозидаза содержит экзогликозидазу.

Пример эндогликозидазы включает, например и без ограничений, EndoS. В некоторых вариантах осуществления, эндогликозидаза содержит последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 44-47, или ее модифицированный вариант.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид EndoS включает полипептид EndoS, фрагмент полипептида EndoS, вариант полипептида EndoS или вариант фрагмента полипептида EndoS при условии, что указанный полипептид, фрагмент, вариант или вариант фрагмента имеет эндогликозидазную активность иммуноглобулина (Ig).

В некоторых вариантах осуществления, полипептид EndoS представляет собой EndoS S. pyogenes. Вариант полипептида EndoS может быть полипептидом EndoS из другого организма, такого как другая бактерия. В некоторых вариантах осуществления, бактерия представляет собой Streptococcus, такой как Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus или Streptococcus pyogenes. Альтернативно, вариант может происходить от Corynebacterium pseudotuberculosis, например, белок CP40; Enterococcus faecalis, например белок EndoE; или Elizabethkingia meningoseptica (ранее Flavobacterium meningosepticum), например белок EndoF2.

Полипептид EndoS может содержать или состоять из (а) аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO:44-47; или (b) фрагмента (а), обладающего эндогликозидазной активностью Ig; или (c) варианта (а), имеющего, по меньшей мере, 50% идентичность аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 44-47, и обладающего эндогликозидазной активностью Ig; или (d) варианта (b), имеющего, по меньшей мере, 50% идентичность соответствующему участку аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 44-47, и обладающего эндогликозидазной активностью Ig.

В некоторых вариантах осуществления, вариант полипептида имеет, по меньшей мере, примерно 60% или более идентичность (например, 60-70%, 70-80% или 80-90% идентичность) аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO:44-47, или ее фрагменту, обладающему эндогликозидазной активностью Ig. В некоторых вариантах осуществления, вариант полипептида на 90-100% идентичен аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 44-47 или ее фрагменту, обладающему эндогликозидазной активностью Ig.

Протеаза может содержать или состоять из (а) аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO:3-43 или 48; или (b) фрагмента (а), обладающего протеазной активностью; или (c) варианта (а), имеющего, по меньшей мере, 50% идентичность аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 3-43 или 48, и обладающего протеазной активностью; или (d) варианта (b), имеющего, по меньшей мере, 50% идентичность соответствующему участку аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 3-43 или 48, и обладающего протеазной активностью. В некоторых вариантах осуществления, вариант полипептида имеет, по меньшей мере, примерно 60% или более идентичность (например, 60-70%, 70-80% или 80-90% идентичность) аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO:3-43 или 48 или ее фрагменту, обладающему протеазной активностью. В некоторых вариантах осуществления, вариант полипептида на 90-100% идентичен аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 3-43 или 48 или ее фрагменту, обладающему протеазной активностью.

В некоторых вариантах осуществления, протеаза или гликозидаза лишена своей нативной сигнальной последовательности и имеет дополнительный N-концевой метионин, такой как SEQ ID NO: 48, который представляет собой зрелую форму IdeS S. pyogenes (без сигнальной последовательности, но с добавленный N-концевого метионина. Любая протеаза или гликозидаза, используемые в соответствии со способами по изобретению, могут включать добавленный N-концевой метионин вместо нативной сигнальной последовательности.

Протеазу или гликозидазу можно вводить субъекту в любой подходящей дозе. Например, подходящая дозировка может составлять от примерно 0,05 мг/кг до примерно 5 мг/кг массы тела субъекта или от примерно 0,1 мг/кг до примерно 4 мг/кг массы тела субъекта.

В некоторых вариантах осуществления, IdeZ вводят в дозировке от примерно 0,01 мг/кг до примерно 10 мг/кг массы тела субъекта. Например, подходящая доза может составлять от примерно 0,05 мг/кг до примерно 5 мг/кг массы тела субъекта или от примерно 0,1 мг/кг до примерно 4 мг/кг массы тела субъекта.

В некоторых вариантах осуществления, IdeS вводят в дозировке от примерно 0,01 мг/кг до примерно 10 мг/кг массы тела субъекта. Например, подходящая дозировка может составлять от примерно 0,05 мг/кг до примерно 5 мг/кг массы тела субъекта или от примерно 0,1 мг/кг до примерно 4 мг/кг массы тела субъекта.

В некоторых вариантах осуществления, EndoS вводят в дозировке от примерно 0,01 мг/кг до примерно 10 мг/кг массы тела субъекта. Например, подходящая дозировка может составлять от примерно 0,05 мг/кг до примерно 5 мг/кг массы тела субъекта или от примерно 0,1 мг/кг до примерно 4 мг/кг массы тела субъекта.

Способы по изобретению можно осуществлять в любом подходящем порядке, если в настоящем документе не указано иное. В некоторых вариантах осуществления, способ может включать, во-первых, (а) введение субъекту количества агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, эффективного для снижения титров нейтрализующих антител; и затем (b) введение субъекту рекомбинантного вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления, (b) введение субъекту рекомбинантного вирусного вектора осуществляется в период от примерно 1 минуты до примерно 90 дней после (а) введения субъекту агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn. В некоторых вариантах осуществления, (а) введение субъекту агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, и (b) введение субъекту рекомбинантного вирусного вектора осуществляются примерно в одно и то же время.

В некоторых вариантах осуществления, способ может включать сначала (а) введение субъекту рекомбинантного вирусного вектора, несущего гетерологичный полинуклеотид, и затем (b) введение субъекту количества агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, эффективного для снижения циркулирующих уровней антител, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором и/или гетерологичным полинуклеотидом, или белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления, (b) введение субъекту количества агента, который снижает взаимодействие IgG с FcRn, эффективного для снижения уровней циркулирующих антител, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором и/или гетерологичным полинуклеотидом, или белком, или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, осуществляют в период от примерно 1 минуты до примерно 90 дней после (а) введения субъекту рекомбинантного вирусного вектора, несущего гетерологичный полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления, (а) введение субъекту рекомбинантного вирусного вектора, несущего гетерологичный полинуклеотид, и (b) введение субъекту количества агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, эффективного для снижения циркулирующих уровней антител, которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором и/или гетерологичным полинуклеотидом, или белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, проводят примерно в одно и то же время.

Способы по изобретению могут необязательно включать введение субъекту протеазы и/или гликозидазы до, после или примерно одновременно с введением агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, или введением рекомбинантного вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, способ может включать, сначала (а) введение субъекту агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn; и затем (b) введение субъекту протеазы и/или гликозидазы, эффективных для расщепления или перевара нейтрализующих антител; и затем (c) введение субъекту рекомбинантного вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, способ может включать, сначала (а) введение субъекту агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn; и затем (b) введение субъекту эндопептидазы, эффективной для расщепления или перевара нейтрализующих антител; и затем (c) введение субъекту рекомбинантного вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, способ может включать, сначала (а) введение субъекту анти-FcRn антитела; и затем (b) введение субъекту IdeS, эффективного для деградации или расщепления нейтрализующих антител; и затем (c) введение субъекту рекомбинантного вирусного вектора.

Антитела, такие как нейтрализующие антитела, могут быть уже существующими и могут присутствовать у субъекта даже до введения вирусного вектора в количествах, которые ингибируют или снижают рекомбинантную трансдукцию клеток вирусного вектора. Альтернативно, антитела могут развиваться у субъекта после воздействия вируса, на котором основан рекомбинантный вирусный вектор. Кроме того, антитела, такие как нейтрализующие антитела или антитела, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом или белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, инкапсидированным вирусным вектором, могут развиваться у субъекта после введения рекомбинантного вирусного вектора.

Соответственно, описанные в настоящем документе способы применимы к субъектам с уже существующими антителами и субъектам без уже существующих антител. Как указано в настоящем документе, такие субъекты включают субъектов, которые подвергались воздействию вируса дикого типа и у которых уже выработались антитела против вирусного вектора на основе вируса дикого типа, а также субъекты, которые прошли лечение генной терапией вирусным вектором и выработали антитела, и их можно впоследствии лечить одной или несколькими дополнительными дозами генной терапии тем вирусным вектором (называемыми повторной дозировкой) или лечить другой генной терапией (например, другим гетерологичным полинуклеотидом) с использованием того же вирусного вектора для проведения лечения генной терапией.

Субъекта можно протестировать на антитела перед введением вирусного вектора и/или перед введением агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, протеазой или гликозидазой. Неограничивающие примеры антител для тестирования включают нейтрализующие антитела, антитела, которые связываются с агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn, или протеазой, или гликозидазой, как указано в настоящем документе, антитела, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, и антитела, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом. Таким образом, субъекты могут быть проверены на наличие нейтрализующих антител, антител, которые связываются с агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn, или протеазой, или гликозидазой, как указано в настоящем документе, антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, или антител, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом перед введением рекомбинантного вирусного вектора и/или перед введением агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, или протеазой, или гликозидазой.

Субъекты, у которых уже есть антитела (например, IgG), которые связываются с агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn или протеазой, или гликозидазой, как указано в настоящем документе, могут быть необязательно исключены из начального лечения способом по изобретению. Однако не все субъекты, которые имеют или вырабатывают антитела, которые связываются с агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn или протеазой или гликозидазой, должны быть исключены из способов лечения по изобретению. Например, субъекта с обнаруживаемым анти-IdeS IgG, имеющим титр менее 15 мг/л, все же можно лечить с использованием способов по изобретению. Ожидается, что снижение циркулирующего IgG путем введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, также приведет к снижению количества антител, которые могут связывать агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn или IdeS.

Субъектов также можно подвергнуть скринингу на наличие нейтрализующих антител, антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, или антител, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, после введения рекомбинантного вирусного вектора. Такие субъекты могут необязательно находиться под наблюдением в течение некоторого времени после введения рекомбинантного вирусного вектора, чтобы определить, развиваются ли такие антитела или предотвращается ли их образование у субъекта, у которого уже существующие антитела не были обнаружены, или, для субъекта с уже существующими антителами, чтобы определить, уменьшает или устраняет ли такие уже существующие антитела агент, который уменьшает взаимодействие IgG с FcRn и протеазой и/или гликозидазой.

В некоторых вариантах осуществления, средство, уменьшающее взаимодействие IgG с FcRn, вводят субъекту после положительного результата теста на наличие нейтрализующих антител, антител, которые связываются с агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn, как указано в настоящем документе, антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, или антител, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, вводят субъекту до получения положительного результата теста на наличие нейтрализующих антител, антител, которые связываются с агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn, как указано в настоящем документе, антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, или антител, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом.

В некоторых вариантах осуществления, агент, который уменьшает взаимодействие IgG с FcRn и протеазой и/или гликозидазой, вводят субъекту после положительного результата теста на наличие нейтрализующих антител, антител, которые связываются с агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn, или протеазой или гликозидазой, как указано в настоящем документе, антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, или антител, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления, субъекту вводят агент, который уменьшает взаимодействие IgG с FcRn, и протеазу и/или гликозидазу, до положительного результата теста на наличие нейтрализующих антител, антител, которые связываются с агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn, протеазой или гликозидазой, как указано в настоящем документе, антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, или антител, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом.

В некоторых вариантах осуществления, субъектов не тестируют на антитела до или после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, или до или после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, и протеазы и/или гликозидазы. Соответственно, тестирование на нейтрализующие антитела, антитела, которые связываются с агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn, или протеазой, или гликозидазой, как указано в настоящем документе, антитела, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, или антитела, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, после введения протеазы и/или гликозидазы или введения рекомбинантного вирусного вектора, является необязательным в способах лечения по изобретению.

Агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, можно вводить субъекту любое количество раз. Например, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, можно вводить субъекту от 2 до 5 раз, от 2 до 10 раз, от 2 до 15 раз.

Агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, можно вводить субъекту в течение любого промежутка времени на регулярной основе, такой как несколько дней подряд или через день, или нерегулярно. В некоторых вариантах осуществления, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, вводят примерно от 1 до 12 недель, или примерно от 1 до 10 недель, или примерно от 1 до 8 недель, или примерно от 1 до 6 недель, или примерно от 1 до 4 недель, или примерно от 1 до 3 недель, или примерно от 1 до 2 недель, или примерно 2 недели до или после введения рекомбинантного вирусного вектора.

Протеазу или гликозидазу можно вводить субъекту любое количество раз. Например, протеазу и/или гликозидазу можно вводить субъекту от 2 до 5 раз, от 2 до 10 раз, от 2 до 15 раз.

Протеазу или гликозидазу можно вводить субъекту в течение любого промежутка времени на регулярной основе, такой как несколько дней подряд или через день, или нерегулярно. В некоторых вариантах осуществления, протеазу и/или гликозидазу вводят примерно от 1 до 12 недель, или примерно от 1 до 10 недель, или примерно от 1 до 8 недель, или примерно от 1 до 6 недель, или примерно от 1 до 4 недель, или примерно от 1 до 3 недель, или примерно от 1 до 2 недель, или примерно 2 недель до или после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, или введения рекомбинантного вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантный вирусный вектор вводят до или после агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, или до или после введения субъекту протеазы или гликозидазы. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантный вирусный вектор вводят субъекту, например, 1-12, 12-24 или 24-48 часов, или 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30, 30-50 или более 50 дней после введения субъекту агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn или протеазой или гликозидазой. В некоторых вариантах осуществления, субъекту вводят агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, протеазу или гликозидазу, например, через 1-12, 12-24 или 24-48 часов или через 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30, 30-50 или более 50 дней после введения субъекту рекомбинантного вирусного вектора.

Рекомбинантный вирусный вектор, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, протеаза и/или гликозидаза могут вводиться отдельно или в комбинации. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантный вирусный вектор вводят субъекту отдельно от агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, и/или протеазы, и/или гликозидазы. В некоторых вариантах осуществления, субъекту вводят рекомбинантный вирусный вектор в комбинации с агентом, уменьшающим взаимодействие IgG с FcRn, и/или протеазой, и/или гликозидазой.

В некоторых вариантах осуществления, субъекту один или несколько раз вводят смесь агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, и протеазы и/или гликозидазы. В некоторых вариантах осуществления, субъекту вводят два или несколько агентов, уменьшающих взаимодействие IgG с FcRn, или две или несколько протеаз и/или гликозидаз, один или несколько раз.

В некоторых вариантах осуществления, субъекту вводят, по меньшей мере, один иммунодепрессивный агент до, по существу одновременно с или после введения субъекту рекомбинантного вирусного вектора, средства, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, протеазы или гликозидазы. В некоторых вариантах осуществления, иммунодепрессивный агент представляет собой противовоспалительный агент, такой как стероид. В некоторых вариантах осуществления, иммунодепрессивный агент представляет собой преднизолон, циклоспорин (например, циклоспорин А), микофенолат, ритуксимаб, рапамицин или их производное.

Дополнительные стратегии снижения гуморального иммунитета включают способы удаления, истощения, захвата и/или инактивации антител, обычно называемые аферезом и, в частности, плазмаферезом, в котором задействованы продукты крови. Аферез или плазмаферез представляет собой процесс, при котором плазма человека циркулирует ex vivo (экстракорпорально) через устройство, которое модифицирует плазму путем добавления, удаления и/или замены компонентов перед ее возвращением пациенту. Плазмаферез можно использовать для удаления иммуноглобулинов человека (например, IgG, IgE, IgA, IgD) из продукта крови (например, плазмы). Эта процедура истощает, захватывает, инактивирует, уменьшает или удаляет иммуноглобулины (антитела), которые связываются с рекомбинантным вирусным вектором, связываются с гетерологичным полинуклеотидом, связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, связываются с агентом, который снижает взаимодействие IgG с FcRn связываются с протеазой и/или связываются с гликозидазой, тем самым снижая титр антител у субъекта, получающего лечение, что может способствовать, например, нейтрализации вирусного вектора. Примером является устройство, состоящее из колонки аффинной матрицы капсида AAV. Пропускание продукта крови (например, плазмы) через такую аффинную матрицу капсида AAV приведет к связыванию только антител AAV и всех изотипов (включая IgG, IgM и т.д.). Иммуноадсорбция (публикация заявки на патент США US 2018/0169273 A1) также может быть использована для истощения иммуноглобулинов и, в частности, анти-AAV антител. Аффинные лиганды (публикация международной патентной заявки WO/2018/158397) также можно использовать для истощения иммуноглобулинов и, в частности, анти-AAV антител. Любая из вышеупомянутых стратегий может быть использована до, по существу одновременно с или после введения субъекту рекомбинантного вирусного вектора, агента, который уменьшает взаимодействие IgG с FcRn, протеазы или гликозидазы.

В некоторых вариантах осуществления, плазмаферез проводят на продукте крови (например, плазме) субъекта в качестве дополнительной одной или нескольких стадий в способе по изобретению до или после введения субъекту агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn и/или до или после введения субъекту рекомбинантного вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, плазмаферез проводят на продукте крови (например, плазме) субъекта до или после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, а затем субъекту вводят рекомбинантный вирусный вектор.

В некоторых вариантах осуществления, плазмаферез проводят на продукте крови (например, плазме) субъекта до или после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, затем субъекту вводят протеазу или гликозидазу, и затем рекомбинантный вирусный вектор вводят субъекту.

В некоторых вариантах осуществления, плазмаферез проводят на продукте крови (например, плазме) субъекта после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, затем субъекту вводят IdeS или EndoS, и затем рекомбинантный вирусный вектор вводят субъекту.

В некоторых вариантах осуществления, плазмаферез проводят на продукте крови (например, плазме) субъекта после введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, затем субъекту вводят IdeS, и затем рекомбинантный вирусный вектор вводят субъекту.

Применение плазмафереза в дополнение к введению агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, и введению протеазы (например, IdeS) или гликозидазы (например, EndoS) в способах по изобретению может быть особенно полезным для повторного дозирования генной терапии, где может быть высокий титр циркулирующих нейтрализующих антител у субъекта.

Дополнительные стратегии снижения (преодоления) гуморального иммунитета к AAV при системном переносе генов включают использование пустых частиц капсида AAV и/или капсидных белков в качестве ловушек для адсорбции анти-AAV антител, введение иммунодепрессивных лекарственных средств для снижения, уменьшения, ингибирования, профилактики или искоренения гуморального иммунного ответа на AAV, изменение серотипа капсида AAV или конструирование капсида AAV так, чтобы он был менее восприимчив к нейтрализующим антителам (NAb), использование циклов плазмафереза для адсорбции анти-AAV иммуноглобулинов, тем самым снижая титр анти-AAV антител, и использование методов доставки, таких как баллонные катетеры с последующим промыванием солевым раствором. Дополнительные стратегии описаны в Mingozzi et al., 2013, Blood, 122:23-36. Дополнительные стратегии включают использование колонок для плазмафереза, специфичных для AAV, для селективного истощения анти-AAV антител без истощения общего пула иммуноглобулинов из плазмы, как описано у Bertin et al., 2020, Sci. Rep. 10:864. Стратегии афереза для удаления, истощения, захвата и/или инактивации антител AAV у субъектов описаны в WO2019018439.

В соответствии с изобретением, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, может быть инкапсидирован или составлен в комплексе с липосомами, наночастицами, липидными наночастицами, полимерами, микрочастицами, микрокапсулами, мицеллами или внеклеточными везикулами.

Также в соответствии с изобретением, вирусные частицы могут быть инкапсидированы или составлены в комплексе с липосомами, наночастицами, липидными наночастицами, полимерами, микрочастицами, микрокапсулами, мицеллами или внеклеточными везикулами.

Также в соответствии с изобретением, протеаза и/или гликозидаза могут быть инкапсидированы или составлены в комплексе с липосомами, наночастицами, липидными наночастицами, полимерами, микрочастицами, микрокапсулами, мицеллами или внеклеточными везикулами.

«Липидная наночастица» или «LNP» относится к везикуле на основе липида, пригодной для доставки рекомбинантного вирусного вектора и/или протеазы, и/или гликозидазы, и имеет размеры в наномасштабе, т.е. от примерно 10 нм до примерно 1000 нм, или от примерно 50 до примерно 500 нм или от примерно 75 до примерно 127 нм. Не ограничиваясь какой-либо теорией, считается, что LNP дает протеазу, гликозидазу или рекомбинантный вирусный вектор с частичной или полной защитой от иммунной системы. Защита позволяет доставлять протеазу, гликозидазу или рекомбинантный вирусный вектор в ткань или клетку, избегая при этом индукции значительного иммунного ответа против протеазы, гликозидазы или рекомбинантного вирусного вектора in vivo. Защита может также позволить повторное введение без индуцирования существенного иммунного ответа против протеазы, гликозидазы или рекомбинантного вирусного вектора in vivo (например, у субъекта, такого как человек). Защита также может улучшать или повышать эффективность доставки, продолжительность терапевтического эффекта и/или терапевтическую эффективность in vivo.

pI (изоэлектрическая точка) AAV находится в диапазоне от примерно 6 до примерно 6,5. Таким образом, поверхность ААВ несет небольшой отрицательный заряд. Таким образом, для LNP может быть выгодно включать катионный липид, такой как, например, аминолипид. Типовые аминолипиды описаны в патентах США №№ 9,352,042, 9,220,683, 9,186,325, 9,139,554, 9,126,966 9,018,187, 8,999,351, 8,722,082, 8,642,076, 8,569,256, 8,466,122 и 7,745,651 и публикациях патентов США №№ 2016/0213785, 2016/0199485, 2015/ 0265708, 2014/0288146, 2013/0123338, 2013/0116307, 2013/0064894, 2012/0172411 и 2010/0117125.

Термины «катионный липид» и «аминолипид» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и включают те липиды и их соли, которые имеют одну, две, три или более цепей жирных кислот или жирных алкилов и рН-титруемую аминогруппу (например, алкиламиногруппу или диалкиламиногруппу). Катионный липид обычно протонирован (т.е. положительно заряжен) при pH ниже pKa катионного липида и является по существу нейтральным при pH выше pKa. Катионные липиды также могут быть титруемыми катионными липидами. В некоторых вариантах осуществления, катионные липиды содержат: протонируемую группу третичного амина (например, рН-титруемую) группу; C18-алкильные цепи, где каждая алкильная цепь независимо содержит от 0 до 3 (например, 0, 1, 2 или 3) двойных связей; и эфирные, сложноэфирные или кетальные связи между головной группой и алкильными цепями.

Катионные липиды могут включать, без ограничения, 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA), 1,2-ди-γ-линоленилокси-N,N-диметиламинопропан (γ-DLenDMA), 2,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксолан (DLin-K-C2-DMA, также известный как DLin-C2K-DMA, XTC2, и C2K), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA), дилинолеилметил-3-диметиламинопропионат (DLin-M-C2-DMA, также известный как MC2), (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино)бутаноат (DLin-M-C3-DMA, также известный как MC3), их соли и их смеси. Другие катионные липиды также включают, но не ограничены ими, 1,2-дистеарилокси-N, N-диметил-3-аминопропан (DSDMA), 1,2-диолеилокси-N, N-диметил-3-аминопропан (DODMA), 2,2-дилинолеил-4-(3-диметиламинопропил)-[1,3]-диоксолан (DLin-K-C3-DMA), 2,2-дилинолеил-4-(3-диметиламинобутил)-[1,3]-диоксолан (DLin-K-C4-DMA), DLen-C2K-DMA, γ-DLen-C2K-DMA и (DLin-MP-DMA) (также известный как 1-B11).

Другие катионные липиды могут включать, без ограничения, 2,2-дилинолеил-5-диметиламинометил-[1,3]-диоксан (DLin-K6-DMA), 2,2-дилинолеил-4-N-метилпепиазино-[1,3]-диоксолан (DLin-K-MPZ), 1,2-дилинолеилкарбамоилокси-3-диметиламинопропан (DLin-C-DAP), 1,2-дилинолейокси-3-(диметиламино)ацетоксипропан (DLin-DAC), 1,2-дилинолеилокси-3-морфолинопропан (DLin-MA), 1,2-дилинолеоил-3-диметиламинопропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилтио-3-диметиламинопропан (DLin-S-DMA), 1-линолеоил-2-линолеилокси-3-диметиламинопропан (DLin-2-DMAP), хлорид 1,2-дилинолеилокси-3-триметиламинопропана (DLin-TMA.Cl), хлорид 1,2-дилинолеоил-3-триметиламинопропана (DLin-TAP.Cl), 1,2-дилинолеилокси-3-(N-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ), 3-(NN-дилиноиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(N, N-диолеиламино)-1,2-пропандио (DOAP), 1,2-дилинолеилоксо-3-(2-N,N-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA), хлорид N,N-диолеил-N,N-диметиламмония (DODAC), хлорид N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), бромид N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония (DDAB), хлорид N-(1-(2,3-диолеоилокси)пропил)-N, N,N-триметиламмония (DOTAP), 3-(N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил)холестерин (DC-Chol), бромид N-(1,2-димиристилоксипроп-3-ил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтиламмония (DMRIE), трифторацетат 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминия (DOSPA), диоктадециламидоглицилспермин (DOGS), 3-диметиламино-2-(холест-5-ен-3-бета-оксибутан-4-окси)-1-(цисцис-9,12-октадекадиенокси)пропан (CLinDMA), 2-[5'-(холест-5-ен-3-бета-окси)-3'-оксапентокси)-3-диметил-1-(цис,цис-9',1-2'-октадекадиенокси)пропан (CpLinDMA), N,N-диметил-3,4-диолеилоксибензиламин (DMOBA), 1,2-N,N'-диолеилкарбамил-3-диметиламинопропан (DOcarbDAP), 1,2-N,N'-дилинолеилкарбамил-3-диметиламинопропан (DLincarbDAP), дексаметазон-спиримин (DS) и дизамещенный спермин (D2S) или их смеси.

Можно использовать ряд коммерческих препаратов катионных липидов, таких как LIPOFECTIN® (включая DOTMA и DOPE, доступные от GIBCO/BRL) и LIPOFECTAMINE® (содержащие DOSPA и DOPE, доступные от GIBCO/BRL).

В некоторых вариантах осуществления, катионный липид может присутствовать в количестве от примерно 10% массовых LNP до примерно 85% массовых липидной наночастицы, или от примерно 50% массовых LNP до примерно 75% массовых LNP.

Стерины могут придавать текучесть LNP. Используемый в настоящем документе термин «стерин» относится к любому встречающемуся в природе стерину растительного (фитостерины) или животного (зоостерины) происхождения, а также к не встречающимся в природе синтетическим стеринам, каждый из которых характеризуется наличием гидроксильной группы в положении 3 А-кольца стероида. Стерин может быть любым стерином, обычно используемым в области липосом, липидных везикул или препаратов липидных частиц, чаще всего холестерином. Фитостерины могут включать кампестерин, ситостерин и стигмастерин. Стерины также включают липиды, модифицированные стеринами, такие как описаны в публикации заявки на патент США 2011/0177156. В некоторых вариантах осуществления, стерин может присутствовать в количестве от примерно 5% массовых LNP до примерно 50% массовых липидной наночастицы или от примерно 10% массовых LNP до примерно 25% массовых LNP.

LNP может содержать нейтральный липид. Нейтральные липиды могут включать любые виды липидов, которые существуют либо в незаряженной, либо в нейтральной цвиттерионной форме при физиологических значениях рН. Такие липиды включают, без ограничения, диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, церамид, сфингомиелин, дигидросфингомиелин, цефалин и цереброзиды. При выборе нейтральных липидов обычно руководствуются учетом, среди прочего, размера частиц и необходимой стабильности. В некоторых вариантах осуществления, нейтральный липидный компонент может представлять собой липид, содержащий две ацильные группы (например, диацилфосфатидилхолин и диацилфосфатидилэтаноламин).

Липиды, имеющие различные ацильные группы цепи с различной длиной цепи и степенью насыщения, доступны или могут быть выделены или синтезированы хорошо известными методами. В некоторых вариантах осуществления, можно использовать липиды, содержащие насыщенные жирные кислоты с длиной углеродной цепи в диапазоне от C14 до C22. В некоторых вариантах осуществления, используются липиды с моно- или диненасыщенными жирными кислотами с длиной углеродной цепи в диапазоне от C14 до C22. Кроме того, можно использовать липиды, имеющие смеси цепей насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. Примеры нейтральных липидов включают, без ограничения, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин (DOPE), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (POPC) или любой родственный фосфатидилхолин. Нейтральные липиды могут также состоять из сфингомиелина, дигидросфингомиелина или фосфолипидов с другими головными группами, такими как серин и инозит.

В некоторых вариантах осуществления, нейтральный липид может присутствовать в количестве от примерно 0,1% массовых липидной наночастицы до примерно 75% массовых LNP, или от примерно 5% массовых LNP до примерно 15% массовых LNP.

LNP-инкапсидированная протеаза, гликозидаза или рекомбинантный вирусный вектор могут быть включены в фармацевтические композиции, например, в виде фармацевтически приемлемого носителя или эксципиента. Такие фармацевтические композиции пригодны, среди прочего, для введения и доставки LNP-инкапсидированной протеазы, гликозидазы или рекомбинантного вирусного вектора субъекту in vivo или ex vivo.

Препараты LNP можно комбинировать с дополнительными компонентами, которые могут включать, например и без ограничения, полиэтиленгликоль (PEG) и стерины.

Термин «PEG» относится к полиэтиленгликолю, линейному водорастворимому полимеру повторяющихся единиц этилена PEG с двумя концевыми гидроксильными группами. PEG классифицируются по их молекулярной массе; например, PEG 2000 имеет среднюю молекулярную массу примерно 2000 дальтон, и PEG 5000 имеет среднюю молекулярную массу примерно 5000 дальтон. PEG коммерчески доступны от Sigma Chemical Co. и других компаний и включают, например, следующие функциональные PEG: монометоксиполиэтиленгликоль (MePEG-OH), монометоксиполиэтиленгликоль-сукцинат (MePEG-S), монометоксиполиэтиленгликоль-сукцинимидилсукцинат (MePEG-S-NHS), монометоксиполиэтиленгликоль-амин (MePEG-NH2), монометоксиполиэтиленгликоль-трезилат (MePEG-TRES) и монометоксиполиэтиленгликоль-имидазолилкарбонил (MePEG-IM).

В некоторых вариантах осуществления, PEG может представлять собой полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой от примерно 550 до примерно 10000 дальтон и необязательно замещен алкилом, алкокси, ацилом или арилом. В некоторых вариантах осуществления, PEG может быть замещен метилом в концевом гидроксильном положении. В некоторых вариантах осуществления, PEG может иметь среднюю молекулярную массу от примерно 750 до примерно 5000 дальтон, или от примерно 1000 до примерно 5000 дальтон, или от примерно 1500 до примерно 3000 дальтон, или от примерно 2000 дальтон, или примерно 750 дальтон. PEG может быть необязательно замещен алкилом, алкокси, ацилом или арилом. В некоторых вариантах осуществления, концевая гидроксильная группа может быть замещена метокси или метильной группой.

PEG-модифицированные липиды включают конъюгаты PEG-диалкилоксипропил (PEG-DAA), описанные в патентах США №№ 8,936,942 и 7,803,397. PEG-модифицированные липиды (или конъюгаты липид-полиоксиэтилен), которые можно использовать, могут иметь различные «заякоривающие» липидные части для закрепления PEG части на поверхности липидной везикулы. Примеры подходящих PEG-модифицированных липидов включают PEG-модифицированные фосфатидилэтаноламин и фосфатидную кислоту, конъюгаты PEG-церамид (например, PEG-CerC14 или PEG-CerC20), которые описаны в патенте США № 5,820,873, PEG-модифицированные диалкиламины и PEG-модифицированные 1,2-диацилоксипропан-3-амины. В некоторых вариантах осуществления, PEG-модифицированный липид может представлять собой PEG-модифицированные диацилглицерины и диалкилглицерины. В некоторых вариантах осуществления, PEG может находиться в количестве от примерно 0,5% массовых от LNP до примерно 20% массовых от LNP или от примерно 5% массовых от LNP до примерно 15% массовых от LNP.

Кроме того, LNP может быть PEG-модифицированным и стерин-модифицированной LNP. LNP в комбинации с дополнительными компонентами могут быть одинаковыми или отдельными LNP. Другими словами, один и тот же LNP может быть модифицирован PEG и модифицирован стерином или, альтернативно, первая LNP может быть модифицирована PEG, и вторая LNP может быть модифицирована стерином. Необязательно, первая и вторая модифицированные LNP могут быть скомбинированы.

В определенных вариантах осуществления, до инкапсидирования LNP могут иметь размер в диапазоне от примерно 10 нм до 500 нм, или от примерно 50 нм до примерно 200 нм, или от 75 нм до примерно 125 нм. В некоторых вариантах осуществления, LNP-инкапсидированная протеаза, гликозидаза или рекомбинантный вирусный вектор может иметь размер в диапазоне примерно от 10 до 500 нм.

Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения всех форм нуклеиновой кислоты, олигонуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Нуклеиновые кислоты включают геномную ДНК, кДНК и антисмысловую ДНК, и сплайсированную или не сплайсированную мРНК, рРНК, тРНК и ингибиторную ДНК или РНК (РНКи, например, малую или короткую шпилечную (кш)РНК, микроРНК (миРНК), малую или короткую интерферирующую (ки)РНК, транс-сплайсинговую РНК или антисмысловую РНК).

Нуклеиновые кислоты включают встречающиеся в природе, синтетические и преднамеренно модифицированные или измененные полинуклеотиды. Нуклеиновые кислоты могут быть одинарными, двойными или тройными, линейными или кольцевыми и могут иметь любую длину. При обсуждении нуклеиновых кислот в настоящем документе может быть описана последовательность или структура конкретного полинуклеотида в соответствии с соглашением о представлении последовательности в направлении от 5' к 3'.

«Гетерологичная» последовательность полинуклеотида или нуклеиновой кислоты относится к полинуклеотиду, встроенному в плазмиду или вектор для целей опосредованного вектором переноса/доставки полинуклеотида в клетку. Гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот отличаются от вирусных нуклеиновых кислот, т.е. являются не нативными по отношению к вирусным нуклеиновым кислотам. После переноса/доставки в клетку, гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащуюся в векторе, можно экспрессировать (например, транскрибировать и, при необходимости, транслировать). Альтернативно, переносимый/доставляемый гетерологичный полинуклеотид в клетку, содержащийся в векторе, не должен экспрессироваться. Хотя термин «гетерологичная» не всегда используется в настоящем документе в отношении последовательностей нуклеиновых кислот и полинуклеотидов, ссылка на последовательность нуклеиновой кислоты или полинуклеотид даже в отсутствие модификатора «гетерологичная» подразумевает включение гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот и полинуклеотидов, несмотря на опущения.

Термин «трансген» используется в настоящем документе для удобного обозначения нуклеиновой кислоты, которая предназначена или была введена в клетку или организм. Трансгены включают любую нуклеиновую кислоту, такую как гетерологичная полинуклеотидная последовательность или гетерологичная нуклеиновая кислота, кодирующая белок или пептид. Термины «трансген» и «гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты/полинуклеотида» используются в настоящем документе взаимозаменяемо.

В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из GAA (кислой альфа-глюкозидазы) для лечения болезни Помпе; ATP7B (медь-транспортирующей АТФазы 2) для лечения болезни Вильсона; альфа-галактозидазы для лечения болезни Фабри; ASS1 (аргиносукцинатсинтазы) для лечения цитруллинемии типа 1; бета-глюкоцереброзидазы для лечения болезни Гоше типа 1; бета-гексозаминидазы А для лечения болезни Тея-Сакса; SERPING1 (ингибитора протеазы C1 или ингибитора эстеразы C1) для лечения наследственного ангионевротического отека (HAE), также известного как дефицит ингибитора C1 типа I и типа II; и глюкозо-6-фосфатазы для лечения болезни накопления гликогена I типа (GSDI).

В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, гормона роста (GH), гормона щитовидной железы (PTH), рилизинг-фактора гормона роста (GRF), фолликулостимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH), хорионического гонадотропина человека (hCG), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтинов, ангиостатина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), эритропоэтина (ЕРО), фактора роста соединительной ткани (CTGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), кислого фактора роста фибробластов (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста α (TGFα), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), инсулинового фактора роста I и II (IGF-I и IGF-II), TGFβ, активинов, ингибинов, костного морфогенного белка (BMP), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофинов NT-3 и NT4/5, цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (GDNF), нейртурина, агрина, нетрина-1 и нетрина-2, фактора роста гепатоцитов (HGF), эфрина, ноггина, sonic hedgehog и тирозингидроксилазы.

В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид кодирует кислую α-глюкозидазу (GAA). Введение рекомбинантного вирусного вектора, содержащего гетерологичный полинуклеотид, кодирующий GAA, субъекту с болезнью Помпе или другой болезнью накопления гликогена может привести к экспрессии белка GAA. Экспрессия белка GAA у пациента может служить для подавления, ингибирования или уменьшения накопления гликогена, профилактики накопления гликогена или деградации гликогена, что, в свою очередь, может снизить или уменьшить один или несколько побочных эффектов болезни Помпе или другой болезни накопления гликогена.

В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО), интерлейкина (IL-1 - IL-36 и т.д.), моноцитарного хемоаттрактантного белка, фактора, ингибирующего лейкоз, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, лиганда Fas, факторов некроза опухоли α и β, интерферонов α, β и γ, фактора стволовых клеток, лиганда flk-2/flt3, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, химерных иммуноглобулинов, гуманизированных антител, одноцепочечных антител, Т-клеточных рецепторов, химерных Т-клеточных рецепторов, одноцепочечных Т-клеточных рецепторов, молекул МНС класса I и класса II.

В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид кодирует CFTR (трансмембранный белок-регулятор муковисцидоза), фактор коагуляции (свертывания) крови (фактор XIII, фактор IX, фактор VIII, фактор X, фактор VII, фактор VIIa, белок C и т. д.) и усиление функции фактора свертывания крови, антитело, 65 кДа белок, специфичный к пигментному эпителию сетчатки (RPE65), эритропоэтин, рецептор LDL, липопротеинлипазу, орнитинтранскарбамилазу, β-глобин, α-глобин, спектрин, α-антитрипсин, аденозиндезаминазу (ADA), переносчик металлов (ATP7A или ATP7), сульфамидазу, фермент, участвующий в лизосомной болезни накопления (ARSA), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу, β-25 глюкоцереброзидазу, сфингомиелиназу, лизосомальную гексозаминидазу, дегидрогеназу кетокислот с разветвленной цепью, гормон, фактор роста, инсулиноподобный фактор роста 1 или 2, фактор роста тромбоцитов, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, нейротрофический фактор-3 и -4, нейротрофический фактор головного мозга, глиальный фактор роста, трансформирующий фактор роста α и β, цитокин, α-интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-12, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, лимфотоксин, продукт суицидного гена, тимидинкиназу вируса простого герпеса, цитозиндезаминазу, дифтерийный токсин, цитохром P450, дезоксицитидинкиназу, фактор некроза опухоли, белок лекарственной резистентности, белок-супрессор опухоли (например, p53, Rb, Wt-1, NF1, фон Хиппеля-Линдау (VHL), аденоматозный полипоз толстой кишки (APC)), пептид с иммуномодулирующими свойствами, толерогенный или иммуногенный пептид или белок Tregitop или hCDR1, инсулин, глюкокиназу, гуанилатциклазу 2D (LCA-GUCY2D), Rab-сопровождающий белок 1 (хороидеремия), LCA 5 (LCA-леберцилин), орнитинкетокислотную аминотрансферазу (гиратная атрофия), ретиношизин 1 (Х-сцепленный ретиношизис), USH1C (синдром Ашера 1C), Х-сцепленный пигментный ретинит, ГТФазу (XLRP), MERTK (AR формы RP: пигментный ретинит), DFNB1 (коннексиновая 26 глухота), ACHM 2, 3 и 4 (ахроматопсия), PKD-1 или PKD-2 (поликистоз почек), TPP1, CLN2, сульфатазу, N-ацетилглюкозамин-1-фосфаттрансферазу, катепсин A, GM2-AP, NPC1, VPC2, белок-активатор сфинголипидов, одну или несколько цинк-пальцев нуклеаз для редактирования генома, и одну или несколько донорных последовательностей, используемых в качестве шаблонов репарации для редактирования генома.

В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид кодирует эритропоэтин (ЕРО) для лечения анемии; интерферон-альфа, интерферон-бета и интерферон-гамма для лечения различных иммунных нарушений, вирусных инфекций и рака; интерлейкин (IL), включая любой из IL-1 - IL-36, и соответствующие рецепторы для лечения различных воспалительных заболеваний или иммунодефицитов; хемокин, включая хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 5 (CXCL5) для лечения иммунных нарушений; гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) для лечения иммунных нарушений, таких как болезнь Крона; гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) для лечения различных воспалительных заболеваний человека; макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) для лечения различных воспалительных заболеваний человека; фактор роста кератиноцитов (KGF) для лечения повреждений эпителиальной ткани; хемокины, такие как моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (МСР-1) для лечения привычного невынашивания беременности, осложнений, связанных с HIV, и резистентности к инсулину; фактор некроза опухоли (TNF) и рецепторы для лечения различных иммунных нарушений; альфа1-антитрипсин для лечения эмфиземы или хронической обструктивной болезни легких (COPD); альфа-L-идуронидазу для лечения мукополисахаридоза I (MPS I); орнитинтранскарбамоилазу (OTC) для лечения дефицита OTC; фенилаланингидроксилазу (РАН) или фенилаланинаммиаклиазу (PAL) для лечения фенилкетонурии (PKU); липопротеинлипазу для лечения дефицита липопротеинлипазы; аполипопротеины для лечения дефицита аполипопротеина (Apo) AI; рецептор липопротеинов низкой плотности (LDL-R) для лечения семейной гиперхолестеринемии (FH); альбумин для лечения гипоальбуминемии; лецитинхолестерин-ацилтрансферазу (LCAT); карбамоилсинтетазу I; аргининсукцинатсинтетазу; аргининосукцинатлиазу; аргиназу; фумарилацетоацетатгидролазу; порфобилиногендезаминазу; цистатионин бета-синтазу для лечения гомоцистинурии; декарбоксилазу кетокислот с разветвленной цепью; изовалерил-CoA-дегидрогеназу; пропионил-CoA-карбоксилазу; метилмалонил-CoA мутазу; глутарил-CoA-дегидрогеназу; инсулин; пируваткарбоксилазу; печеночную фосфорилазу; киназу фосфорилазы; глициндекарбоксилазу; Н-белок; Т-белок; трансмембранный регулятор кистозного фиброза (CFTR); АТР-связывающую кассету, подсемейство A (ABC1), член 4 (ABCA4) для лечения болезни Штаргардта; или дистрофин.

Термины «полипептиды», «белки» и «пептиды» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. «Полипептиды», «белки» и «пептиды», кодируемые «полинуклеотидными последовательностями», включают полноразмерные нативные последовательности, как и в случае встречающихся в природе белков, а также функциональные субпоследовательности, модифицированные формы или варианты последовательности, если субпоследовательность, модифицированная форма или вариант сохраняет некоторую степень функциональности нативного полноразмерного белка. В изобретении, такие полипептиды, белки и пептиды, кодируемые полинуклеотидными последовательностями, могут быть, но не обязательно, идентичными эндогенному белку, который является дефектным или чья экспрессия недостаточна или является дефицитной у подвергаемого лечению млекопитающего.

В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид кодирует ингибиторную нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из киРНК, антисмысловой молекулы, миРНК, РНКи, рибозима и кшРНК.

В некоторых вариантах осуществления, ингибирующая нуклеиновая кислота связывается с геном, транскриптом гена или транскриптом гена, связанным с заболеванием полинуклеотидных повторов, выбранным из группы, состоящей из гена хантингтина (HTT), гена, ассоциированного с дентаторубропаллидолуизовой атрофией (атрофина 1, ATN1), андрогенного рецептора на Х-хромосоме при спинобульбарной мышечной атрофии, атаксина-1, -2, -3 и -7 человека, Cav2.1 P/Q потенциалозависимого кальциевого канала (CACNA1A), ТАТА-связывающего белка, противоположной цепи атаксина 8 (ATXN8OS), серин/треонин-протеинфосфатазы 2A, 55 кДа, регуляторной субъединицы B бета изоформы при спиноцеребеллярной атаксии (тип 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12 17), FMR1 (умственная отсталость, связанная с ломкой Х хромосомой 1) при синдроме ломкой Х хромосомы, FMR1 (умственная отсталость, связанная с ломкой Х хромосомой 1) при синдроме тремора/атаксии, ассоциированном с ломкой Х хромосомой, FMR1 (умственная отсталость, связанная с ломкой Х хромосомой 2) или член семейства AF4/FMR2 2 при умственной отсталости, ассоциированной с хрупкой XE; миотонин-протеинкиназы (МТ-РК) при миотонической дистрофии; фратаксина при атаксии Фридрейха; мутанта гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) при боковом амиотрофическом склерозе; гена, участвующего в патогенезе болезни Паркинсона и/или болезни Альцгеймера; аполипопротеина B (APOB) и пропротеинконвертазы субтилизина/кексина типа 9 (PCSK9), гиперхолестеринемии; HIV Tat, трансактиватора гена транскрипции вируса иммунодефицита человека, при HIV инфекции; HIV TAR, HIV TAR, гена ответного элемента трансактиватора вируса иммунодефицита человека при HIV инфекции; хемокинового рецептора C-C (CCR5) при HIV инфекции; нуклеокапсидного белка вируса саркомы Рауса (RSV) при инфекции RSV, специфичной для печени микроРНК (miR-122) при инфекции вирусом гепатита С; p53, при острой почечной недостаточности или острой почечной недостаточности трансплантата почки с задержкой функции трансплантата или острой почечной недостаточности; протеинкиназы N3 (PKN3) при заблаговременно рецидивирующих или метастатических солидных злокачественных опухолях; LMP2, LMP2, также известной как субъединица протеасомы бета-типа 9 (PSMB 9) при метастатической меланоме; LMP7, также известной как субъединица протеасомы бета-типа 8 (PSMB 8) при метастатической меланоме; MECL1, также известной как субъединица протеасомы бета-типа 10 (PSMB 10) при метастатической меланоме; фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) при солидных опухолях; кинезинового веретенообразного белка при солидных опухолях, супрессора апоптоза В-клеточного CLL/лимфомы (BCL-2) при хроническом миелоидном лейкозе; рибонуклеотидредуктазы М2 (RRM2) при солидных опухолях; фурина при солидных опухолях; полоподобной киназы 1 (PLK1) при опухолях печени, диацилглицеролацилтрансферазы 1 (DGAT1) при гепатите С, бета-катенина при семейном аденоматозном полипозе; бета2-адренорецептора при глаукоме; RTP801/Redd1, также известного как белок транскрипта 4, индуцируемый повреждением ДНК, при диабетическом макулярном отеке (DME) или возрастной дегенерации желтого пятна; рецептора I сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR1) при возрастной дегенерации желтого пятна или хориоидальной неоваскуляризации, каспазы 2 при неартериальной ишемической оптической нейропатии; мутантного белка кератина 6A N17K при врожденной пахионихии; последовательности генома/гена вируса гриппа А при инфекции гриппом; последовательности генома/гена коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) при инфекции SARS; последовательности генома/гена респираторно-синцитиального вируса при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции; последовательности генома/гена филовируса Эбола при инфекции Эбола; последовательности генома/гена вируса гепатита В и С при инфицировании гепатитом В и С; последовательности генома/гена вируса простого герпеса (HSV) при инфекции HSV, последовательности генома/гена вируса коксаки B3 при инфекции вирусом коксаки B3; сайленсинга патогенного аллеля гена (аллель-специфичного сайленсинга) типа торсина А (TOR1A) при первичной дистонии, пан-класса I и HLA-аллеля, специфичного для трансплантата; и мутантного гена родопсина (RHO) при аутосомно-доминантно наследуемом пигментном ретините (adRP).

Дозы рекомбинантного вирусного вектора можно вводить в любой подходящей дозе. Как правило, дозы варьируются от 1×10⁸или более, например, 1×10⁹, 1×10¹⁰, 1×10¹¹, 1×10¹², 1×10¹³ или 1×10¹⁴, или более геномов вектора на килограмм (гв/кг) веса субъекта для достижения терапевтического эффекта. Доза AAV в диапазоне 1×10¹⁰-1×10¹¹гв/кг у мышей и 1×10¹²-1×10¹³гв/кг у собак была эффективной. Более конкретно, доза от примерно 1×10¹¹гв/кг до примерно 5×10¹⁴гв/кг включительно, или от примерно 5×10¹¹гв/кг до примерно 1×10¹⁴гв/кг включительно, или от примерно 5×10¹¹гв/кг до примерно 5×10¹³гв/кг включительно, или от примерно 5×10¹¹гв/кг до примерно 1×10¹³гв/кг включительно, или от примерно 5×10¹¹гв/кг или примерно 5×10¹²гв/кг включительно, или от примерно 5×10¹¹гв/кг до примерно 1×10¹²г/кг включительно. Дозы могут составлять, например, примерно 5×10¹⁴гв/кг или менее примерно 5×10¹⁴гв/кг, например, дозу от примерно 2×10¹¹до примерно 2×10¹⁴гв/кг включительно, в частности, например, примерно 2×10¹²гв/кг, примерно 6×10¹²гв/кг или примерно 2×10¹³гв/кг.

В некоторых вариантах осуществления, введение субъекту агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, снижает дозу рекомбинантного вирусного вектора, содержащего терапевтический гетерологичный полинуклеотид, который необходим для эффективности генно-терапевтического лечения субъекта. В некоторых вариантах осуществления, введение субъекту агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, позволяет вводить повышенную дозу рекомбинантного вирусного вектора, содержащего терапевтический гетерологичный полинуклеотид.

В некоторых вариантах осуществления, введение субъекту протеазы и/или гликозидазы в дополнение к введению субъекту средства, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, снижает дозу рекомбинантного вирусного вектора, содержащего терапевтический гетерологичный полинуклеотид, необходимый для того, чтобы быть эффективным для лечения субъекта. В некоторых вариантах осуществления, введение субъекту протеазы и/или гликозидазы в дополнение к введению субъекту средства, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, позволяет вводить повышенную дозу рекомбинантного вирусного вектора, содержащего терапевтический гетерологичный полинуклеотид.

Дозы могут варьироваться и зависеть от типа, начала, прогрессирования, тяжести, частоты, продолжительности или вероятности заболевания, на которое направлено лечение, желаемой клинической конечной точки, предшествующего или одновременного лечения, общего состояния здоровья, возраста, пола, расы или иммунологической компетентности субъекта и других факторов, которые будут оценены специалистом в данной области техники. Величина дозы, количество, частота или продолжительность могут быть пропорционально увеличены или уменьшены, как указано любыми неблагоприятными побочными эффектами, осложнениями или другими факторами риска лечения или терапии и состоянием субъекта. Специалист в данной области техники оценит факторы, которые могут влиять на дозировку и время, необходимые для получения количества, достаточного для обеспечения терапевтического или профилактического эффекта.

Доза для достижения терапевтического эффекта, например, доза в векторных геномах/на килограмм массы тела (вг/кг), будет варьироваться в зависимости от нескольких факторов, включая, но не ограничиваясь ими: способ введения, уровень экспрессии гетерологичных полинуклеотидов, требуемый для достижения терапевтического эффекта, конкретное заболевание, которое лечат, любой иммунный ответ хозяина на рекомбинантный вирусный вектор, иммунный ответ хозяина на гетерологичный полинуклеотид или продукт экспрессии (белок, пептид или транскрибируемую нуклеиновую кислоту), а также стабильность белка или экспрессируемого пептида или транскрибируемой нуклеиновой кислоты. Специалист в данной области техники может определить диапазон доз генома рекомбинантного вирусного вектора для лечения пациента, страдающего конкретным заболеванием или нарушением, на основе вышеупомянутых факторов, а также других факторов.

«Эффективное количество» или «достаточное количество» относится к количеству, которое обеспечивает, при однократном или многократном приеме, отдельно или в комбинации с одной или несколькими другими композициями, методами лечения, протоколами или схемами лечения, поддающийся обнаружению ответ любой продолжительности по времени (долгосрочный или краткосрочный), ожидаемый или желаемый результат или пользу для субъекта в любой измеримой или обнаруживаемой степени или в течение любого периода времени (например, в течение минут, часов, дней, месяцев, лет или излечение). Дозы «эффективного количества» или «достаточного количества» для лечения (например, для облегчения или предоставления терапевтической пользы или улучшения) обычно эффективны для предоставления ответа на один, несколько или все неблагоприятные симптомы, последствия или осложнения заболевания, один или несколько неблагоприятных симптомов, нарушений, заболеваний, патологий или осложнений, например, вызванных или связанных с заболеванием, в измеримой степени, хотя и снижение, уменьшение, ингибирование, подавление, ограничение или контроль прогрессирования или ухудшения заболевания также является удовлетворительным исходом.

Эффективное количество или достаточное количество может, но не обязательно, быть обеспечено за одно введение, может потребовать многократных введений и может, но не обязательно, вводиться отдельно или в комбинации с другой композицией (например, агентом), лечением, протоколом или терапевтической схемой. Например, количество может быть пропорционально увеличено в соответствии с потребностью субъекта, типом, состоянием и тяжестью заболевания или побочными эффектами (если таковые имеются) лечения. Кроме того, эффективное количество или достаточное количество не обязательно должно быть эффективным или достаточным, если его вводят в виде однократной или многократной дозы без второй композиции (например, другого лекарственного средства или агента), лечения, протокола или терапевтической схемы, поскольку дополнительные дозы, количества или продолжительность сверх таких доз или дополнительных композиций (например, лекарственных средств или агентов), методов лечения, протоколов или терапевтических схем могут быть включены для того, чтобы считаться эффективными или достаточными для данного субъекта. Количества, считающиеся эффективными, также включают количества, которые приводят к сокращению использования другого лечения, терапевтической схемы или протокола, такого как введение рекомбинантной GAA для лечения лизосомной болезни накопления (например, болезни Помпе) или введение белка рекомбинантного фактора свертывания крови (например, FVIII или FIX) для лечения нарушения свертывания крови (например, гемофилии A (HemA) или гемофилии B (HemB)).

Для болезни Помпе эффективным количеством будет такое количество GAA, которое ингибирует или снижает продуцирование или накопление гликогена, усиливает или увеличивает расщепление или удаление гликогена, уменьшает лизосомальные изменения в тканях тела субъекта или улучшает мышечный тонус и/или мышечную силу и/или дыхательную функцию у субъекта, например. Эффективные количества можно определить, например, путем установления кинетики поглощения GAA миобластами из плазмы. Скорость поглощения GAA миобластами (K поглощение) примерно 141-147 нМ может оказаться эффективной (см., например, Maga et al., J. Biol. Chem. 2012). В моделях на животных, уровни активности GAA в плазме превышают примерно 1000 нмоль/час/мл, например, было обнаружено, что от примерно 1000 до примерно 2000 нмоль/ч/мл являются терапевтически эффективными.

Для HemA и HemB, вообще говоря, считается, что для достижения терапевтического эффекта необходима концентрация фактора свертывания крови, превышающая 1% от концентрации фактора, обнаруживаемой у нормального человека, чтобы изменить фенотип тяжелого заболевания на более умеренный. Тяжелый фенотип характеризуется поражением суставов и опасными для жизни кровотечениями. Считается, что для преобразования умеренного фенотипа заболевания в легкий необходима концентрация фактора свертывания крови более 5% от нормы.

Уровни FVIII и FIX у здоровых людей составляют примерно 150-200 нг/мл плазмы, но могут быть ниже (например, в диапазоне примерно 100-150 нг/мл) или выше (например, в диапазоне примерно 200-300 нг/мл) и по-прежнему считаются нормальными из-за функционального свертывания, определяемого, например, с помощью одностадийного анализа свертывания активированного частичного тромбопластинового времени (аРТТ). Таким образом, терапевтический эффект может быть достигнут таким образом, что общее количество FVIII или FIX у субъекта/человека превышает 1% FVIII или FIX, присутствующего у нормальных субъектов/людей, например, 1% от 100-300 нг/мл.

Композицию можно вводить субъекту в виде комбинированной композиции или вводить отдельно, например, одновременно или серией или последовательно (до или после) доставки или введения рекомбинантного вирусного вектора, содержащего гетерологичный полинуклеотид. Изобретение предлагает комбинации, в которых способ или применение изобретения представляет собой комбинацию с любым соединением, агентом, лекарственным средством, терапевтической схемой, протоколом лечения, процессом, лекарством или композицией, изложенными в настоящем документе или известными специалисту в данной области. Соединение, агент, лекарство, терапевтическая схема, протокол лечения, процесс, средство или композиция могут быть введены или предоставлены субъекту до, по существу одновременно с или после введения рекомбинантного вирусного вектора, содержащего гетерологичный полинуклеотид.

Соответственно, изобретение включает, среди прочего, способы и применения, которые приводят к уменьшению потребности или использования другого соединения, агента, лекарственного средства, терапевтической схемы, протокола лечения, процесса или средства. Например, для заболевания свертывания крови, способ лечения по изобретению имеет терапевтическую пользу, если у данного субъекта менее частая или уменьшенная доза или отмена введения рекомбинантного белка фактора свертывания крови в качестве дополнения для дефицитного или дефектного (аномального или мутантного) эндогенного фактора свертывания крови у субъекта. В другом примере, для лизосомной болезни накопления, такой как болезнь Помпе, способ лечения по изобретению имеет терапевтическую пользу, даже если ранее вводили менее частые или уменьшенные дозы рекомбинантного вирусного вектора, содержащего GAA, или продолжают вводить субъекту. Таким образом, в изобретение включено уменьшение потребности или использования другого лечения или терапии.

Эффективное количество или достаточное количество не обязательно должны быть эффективными для каждого субъекта, получающего лечение, или для большинства субъектов, получающих лечение, в данной группе или популяции. Эффективное количество или достаточное количество означает эффективность или достаточность у конкретного субъекта, а не у группы или популяции в целом. Как это типично для таких способов, некоторые субъекты будут демонстрировать больший ответ, меньший ответ или отсутствие ответа на данный способ лечения или использование.

Термин «улучшение» означает обнаруживаемое или измеримое улучшение заболевания субъекта или его симптома, или основного клеточного ответа. Поддающееся обнаружению или измерению улучшение включает субъективное или объективное снижение, уменьшение, ингибирование, подавление, ограничение или контроль возникновения, частоты, тяжести, прогрессирования или продолжительности заболевания или осложнения, вызванного заболеванием или связанного с ним, или улучшение в симптоме, или основной причине, или последствии болезни, или в изменении течения болезни. Для Помпе, эффективным количеством будет количество, которое ингибирует или снижает выработку или накопление гликогена, усиливает или увеличивает расщепление или удаление гликогена, улучшает мышечный тонус, и/или мышечную силу, и/или дыхательную функцию, например. Для HemA или HemB, эффективным количеством будет количество, которое снижает частоту или тяжесть эпизодов острого кровотечения у субъекта, например, или количество, которое уменьшает время свертывания крови, например, измеренное с помощью анализа свертывания крови.

Соответственно, фармацевтические композиции по изобретению включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения намеченной терапевтической цели. Определение терапевтически эффективной дозы находится в пределах возможностей квалифицированного практикующего врача с использованием методов и руководств, известных в данной области техники, и с использованием идей, представленных в настоящем документе.

Терапевтические дозы будут зависеть, среди прочих факторов, от возраста и общего состояния субъекта, тяжести аберрантного фенотипа и силы контрольных последовательностей, регулирующих уровни экспрессии. Таким образом, терапевтически эффективное количество для человека находится в относительно широком диапазоне, который может быть определен практикующим врачом на основании ответа отдельного пациента на лечение вектором. Такие дозы могут быть введены отдельно или в комбинации с иммунодепрессивным агентом или лекарственным средством.

Композиции, такие как фармацевтические композиции, могут быть доставлены субъекту, чтобы обеспечить экспрессию трансгена и, необязательно, продуцирование кодируемого белка. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции содержат достаточное количество генетического материала, чтобы позволить субъекту продуцировать терапевтически эффективное количество фактора свертывания крови для улучшения гемостаза у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции содержат достаточно гетерологичных полинуклеотидов, чтобы позволить субъекту продуцировать терапевтически эффективное количество GAA.

В некоторых вариантах осуществления, терапевтический эффект у субъекта сохраняется в течение периода времени, например, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30 или 30-50 дней и более, например, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200 дней и более. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, рекомбинантный вирусный вектор обеспечивает терапевтический эффект.

В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантный вирусный вектор обеспечивает терапевтический эффект без иммунодепрессивного агента. В некоторых вариантах осуществления, субъекту вводят, по меньшей мере, один иммунодепрессивный агент до, по существу одновременно или после введения субъекту рекомбинантного вирусного вектора.

В некоторых вариантах осуществления, иммунодепрессивный агент представляет собой противовоспалительный агент. В некоторых вариантах осуществления, имунодепрессивный агент представляет собой стероид. В некоторых вариантах осуществления, имунодепрессивный агент представляет собой преднизон, преднизолон, ингибитор кальциневрина, циклоспорин (например, циклоспорин А), такролимус, микофенолат, ингибитор CD52 (например, алемтузумаб), CTLA4-Ig (например, абатацепт, белатацепт), анти-CD3 mAb, анти-LFA-1 mAb (например, эфализумаб), анти-CD40 mAb (например, ASKP1240), анти-CD22 mAb (например, эпратузумаб), анти-CD20 mAb (например, ритуксимаб, орелизумаб, офатумумаб, вельтузумаб), рапамицин или его производное. Дополнительные конкретные агенты включают стабилизирующее соединение. Другие имунодепрессивные агенты, которые можно использовать в способах по изобретению, включают, например и без ограничений, TACI-Ig (например, атацицепт), анти-C5 mAb (например, экулизумаб), микофенолат, азатиоприн, сиролимус, эверолимус, TNFR-Ig (например, этанерцепт (Enbrel®), анти-TNF mAb (например, адалимумаб (Humira®), инфликсимаб (Remicade®; Avsola®)), тофацитиниб, анти-IL-2R (например, базиликсимаб), анти-IL-17 mAb (например, секукинумаб), анти-IL-6 mAb (например, анти-IL-6 антитело сирукумаб, анти-IL-6 рецептора антитело тоцилизумаб (Actemra®), ингибитор IL-10, ингибитор TGF-бета, антитело, таргетирующее В-клетку (например, ритуксимаб), ингибитор протеасомы (например, бортезомиб), ингибитор мишени рапамицина у млекопитающих (mTOR) (например, рапамицин), частица синтетической вакцины (SVP™)-рапамицин (рапамицин, инкапсидированный в биоразлагаемую наночастицу), внутривенный гамма-глобулин (IVIG), омализумаб, метотрексат, ингибитор тирозинкиназы (например, ибрутиниб), ингибитор фактора активации В-клеток (BAFF) (например, анти-BAFF mAb, например, белимумаб), ингибитор лиганда, индуцирующего пролиферацию (APRIL), анти-IL-1b mAb (например, канакинумаб (Haris®)), ингибитор C3a, Трегитоп (см., например, US 10,213,496) или их комбинацию и/или производное.

Композиции можно вводить в любом стерильном, биосовместимом фармацевтическом носителе, включая, но не ограничиваясь ими, солевой раствор, забуференный солевой раствор, декстрозу и воду. Композиции можно вводить пациенту отдельно или в комбинации с другими агентами, которые влияют на количество дозировок, частоту введения и/или терапевтическую эффективность.

Способы и применения по изобретению включают доставку и введение системно, регионарно или местно или любым путем, например путем инъекции или инфузии. Доставка фармацевтических композиций in vivo обычно может осуществляться путем инъекции с использованием обычного шприца, хотя предусмотрены и другие способы доставки, такие как доставка с усилением конвекции (см., например, патент США № 5,720,720). Например, композиции можно вводить подкожно, эпидермально, интрадермально, интратекально, внутриглазнично, интрамукозально, внутрибрюшинно, внутривенно, внутриплеврально, внутриартериально, перорально, внутрипеченочно, через воротную вену или внутримышечно. Другие способы введения включают пероральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальные применения. Клиницист, специализирующийся на лечении пациентов с нарушениями свертывания крови, может определить оптимальный путь введения аденовирус-ассоциированных векторов на основании ряда критериев, включая, но не ограничиваясь ими, состояние пациента и цель лечения (например, увеличение GAA, усиление свертывания крови и т.д.).

Способы лечения по изобретению включают комбинированную терапию, которая включает дополнительное применение любого соединения, агента, лекарственного средства, лечения или другой терапевтической схемы или протокола, обладающих желаемой терапевтической, полезной, аддитивной, синергетической или дополнительной активностью или эффектом. Примеры комбинированных композиций и способов лечения включают вторые активные вещества, такие как биологические препараты (белки), агенты (например, имунодепрессивные агенты) и лекарственные средства. Такие биологические препараты (белки), агенты, лекарственные средства, методы лечения и терапии можно вводить или проводить до, по существу одновременно или после любого другого способа лечения по изобретению, например, терапевтического способа лечения субъекта для болезни лизосомного накопления, такой как болезнь Помпе, или терапевтического способа лечения субъекта от заболевания свертывания крови, такого как HemA или HemB.

Соединение, агент, лекарственное средство, лечение или другую терапевтическую схему или протокол можно вводить в виде комбинированной композиции или вводить отдельно, например, одновременно или сериями или последовательно (до или после) доставки или введения нуклеиновой кислоты, вектора, рекомбинантного вектора (например, рекомбинантного вирусного вектора) или рекомбинантной вирусной частицы. Таким образом, изобретение предлагает комбинации, в которых способ лечения по изобретению представляет собой комбинацию с любым соединением, агентом, лекарственным средством, терапевтической схемой, протоколом лечения, процессом, лекарством или композицией, изложенными в настоящем документе или известными специалисту в данной области техники. Соединение, агент, лекарственное средство, терапевтическая схема, протокол лечения, процесс, лекарство или композиция могут быть введены или проведены до, по существу одновременно с или после введения нуклеиновой кислоты, вектора, рекомбинантного вектора (например, рекомбинантного вирусного вектора) или рекомбинантной вирусной частицы, вводимой пациенту или субъекту по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, введение субъекту агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, может привести к профилактике образования нейтрализующих антител, антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, и/или антител, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом. Как указано в настоящем документе, введение агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, такому субъекту может осуществляться до введения вирусного вектора, по существу одновременно с введением вирусного вектора или после введения вирусного вектора субъекту.

В некоторых вариантах осуществления, введение агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, субъекту с уже существующими антителами приводит к уменьшению количества нейтрализующих антител, антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, и/или антител, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом. После введения агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, таким субъектам можно затем вводить рекомбинантный вирусный вектор в соответствии с описанными в настоящем документе способами. Таких субъектов можно необязательно оценивать на наличие оставшихся ранее существовавших антител после введения рекомбинантного вирусного вектора. Альтернативно, таким субъектам можно вводить рекомбинантный вирусный вектор по прошествии заданного периода времени, в течение которого агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn, уменьшает или устраняет любые такие ранее существовавшие антитела у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления, введение субъекту агента, уменьшающего взаимодействие IgG с FcRn, может привести к снижению, деградации или перевару на, по меньшей мере, 20-50%, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 65%, при по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100% нейтрализующих антител, антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом и/или антител, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом, что отражается измерением таких антител в биологическом образце, полученном от субъекта, которому вводили рекомбинантный вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления, способ по изобретению уменьшает, расщепляет или переваривает, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100% нейтрализующих антител, и/или антител, которые связываются с гетерологичным полинуклеотидом, и/или антител, которые связываются с белком или пептидом, кодируемым гетерологичным полинуклеотидом.

Неограничивающие примеры биологического образца субъекта, который может быть проанализирован, включают цельную кровь, сыворотку, плазму и подобные, и их комбинацию. Биологический образец может не содержать клеток или может включать клетки (например, эритроциты, тромбоциты и/или лимфоциты).

В некоторых вариантах осуществления, нейтрализующие антитела, присутствующие в биологическом образце субъекта, могут быть понижены, расщеплены или переварены до менее чем примерно 1:25, где 1 часть биологического образца, разведенного в 25% буфера, приводит к 50% нейтрализации рекомбинантного вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления, нейтрализующие антитела, присутствующие в биологическом образце субъекта, могут быть понижены, расщеплены или переварены до соотношения менее примерно 1:20, менее примерно 1:15, менее примерно 1:10, менее примерно 1:5, менее примерно 1:4, менее примерно 1:3, менее примерно 1:2 или менее примерно 1:1, где 1 часть биологического образца разводят в 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 части соответственно буфера приводит к 50% нейтрализации рекомбинантного вирусного вектора.

Типовой анализ и измерение нейтрализующих антител AAV в биологическом образце описаны в настоящем документе, и также описаны в публикации заявки на патент США 2016/0123990. Связывание антитела с Fc рецептором можно измерить путем определения равновесной константы связывания. Снижение связывания антитела с Fc рецептором определяется увеличением константы равновесного связывания для взаимодействия IgG:FcR.

Способы по изобретению применимы как к потере функции, так и к увеличению и функции генетических дефектов. Термин «потеря функции» по отношению к генетическому дефекту, используемый в настоящем документе, относится к любой мутации в гене, при которой белок, кодируемый указанным геном (т. е. мутантный белок), демонстрирует либо частичную, либо полную потерю функции, которая обычно связана с белком дикого типа. Термин «мутация с приобретением функции» по отношению к генетическому дефекту, используемый в настоящем документе, относится к любой мутации в гене, при которой белок, кодируемый указанным геном (т.е. мутантный белок), приобретает функцию, обычно не связанную с белком (т. е. белком дикого типа), вызывает или способствует заболеванию или нарушению. Мутация с приобретением функции может быть делецией, добавлением или заменой нуклеотида или нуклеотидов в гене, что приводит к изменению функции кодируемого белка. В некоторых вариантах осуществления, мутация с приобретением функции изменяет функцию мутантного белка или вызывает взаимодействие с другими белками. В некоторых вариантах осуществления, мутация с приобретением функции вызывает уменьшение или удаление нормального белка дикого типа, например, путем взаимодействия измененного мутантного белка с указанным нормальным белком дикого типа.

Заболевания и нарушения, которые можно лечить способами по изобретению, включают, например и без ограничений, заболевание легких (например, кистозный фиброз), нарушение свертываемости крови (например, гемофилию А или гемофилию В с или без ингибиторов), талассемию, заболевание крови (например, анемию), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз (ALS), эпилепсию, лизосомную болезнь накопления (например, аспартилглюкозаминурию, болезнь Баттена, поздний инфантильный нейрональный цероидный липофусциноз 2 типа (CLN2), цистиноз, болезнь Фабри, болезнь Гоше I, II и III типов, болезнь накопления гликогена II (болезнь Помпе), GM2-ганглиозидоз I типа (болезнь Тея-Сакса), GM2-ганглиозидоз II типа (болезнь Сандхоффа), муколипидоз I (сиалидоз I и II типа), II (I-клеточную болезнь), III (псевдо-болезнь Гурлера) и IV типов, болезни накопления мукополисахарида (болезнь Гурлера и ее варианты, Хантер, Санфилиппо, A, B, C, D типов, Моркио A и B типов, Маро-Лами и Слая), болезнь Ниманна-Пика A/B, C1 и C2 типов и болезнь Шиндлера I и II типов), наследственный ангионевротический отек (HAE), нарушение накопления меди или железа (например, болезнь Вильсона или Менкеса), лизосомальный дефицит кислой липазы, неврологическое или нейродегенеративное заболевание, рак, диабет 1 или 2 типа, дефицит аденозиндезаминазы, метаболический дефект (например, болезни накопления гликогена), заболевание твердых органов (например, головного мозга, печени, почек, сердца), или инфекционное вирусное (напр., гепатиты В и С, HIV и др.), бактериальное или грибковое заболевание.

Болезнь накопления гликогена II типа, также называемую болезнью Помпе, можно лечить способами по изобретению. Болезнь Помпе является аутосомно-рецессивным заболеванием, вызванным мутациями в гене, кодирующем лизосомальный фермент кислую α-глюкозидазу (GAA), который катализирует расщепление гликогена. Возникающий в результате дефицит фермента приводит к патологическому накоплению гликогена и лизосомным изменениям во всех тканях организма, что приводит к дисфункции сердечной, дыхательной и скелетной мускулатуры (van der Ploeg et al., 2008, Lancet, 372:1342-1353).

Нарушения свертывания крови, которые можно лечить способами по изобретению, включают, например и без ограничений, гемофилию А, гемофилию А с ингибирующими антителами, гемофилию В, гемофилию В с ингибирующими антителами, дефицит любого фактора свертывания крови: VII, VIII, IX, X, XI, V, XII, II, фактора фон Виллебранда или комбинированный дефицит FV/FVIII, талассемию, дефицит витамина К эпоксидредуктазы С1 или дефицит гамма-карбоксилазы.

Другие заболевания и нарушения, которые можно лечить способами по изобретению, включают, например и без ограничений, анемию, кровотечение, связанное с травмой, повреждением, тромбозом, тромбоцитопенией, инсультом, коагулопатией, синдромом диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (DIC); избыточной антикоагуляцией, связанной с гепарином, низкомолекулярным гепарином, пентасахаридом, варфарином, низкомолекулярными антитромботическими препаратами (например, ингибиторами FXa) или нарушением тромбоцитов, таким как синдром Бернара-Сулье, тромбастенией Гланцмана или дефицитом пула тромбоцитов.

В некоторых вариантах осуществления, субъект имеет заболевание, которое поражает или возникает в центральной нервной системе (ЦНС), или нейродегенеративное заболевание, такое как, например и без ограничений, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, ALS, наследственная спастическая гемиплегия, первичный латеральный склероз, спинальная мышечная атрофия, болезнь Кеннеди, повторное полиглутаминовое заболевание или болезнь Паркинсона. В некоторых вариантах осуществления, ЦНС или нейродегенеративное заболевание представляет собой повторное полиглутаминовое заболевание, такую как, например и без ограничений, спиноцеребеллярная атаксия (SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7 или SCA17).

Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии. Таким образом, подходящие субъекты включают млекопитающих, таких как человек, а также млекопитающих, отличных от человека. Термин «субъект» относится к животному, обычно к млекопитающему, такому как человек, приматы, отличные от человека (обезьяны, гиббоны, гориллы, шимпанзе, орангутанги, макаки), домашнему животному (собаки и кошки), сельскохозяйственному животному (птице, такой как куры и утки, лошади, коровы, козы, овцы, свиньи) и экспериментальному животному (мыши, крысы, кролики, морские свинки). Субъекты-люди включают эмбрионов, новорожденных, младенцев, подростков и взрослых субъектов. Субъекты также включают модели болезней животных, например мышиные и другие животные модели дефицита белков/ферментов, такого как болезнь Помпе (потеря GAA) и болезни накопления гликогена (GSD) и другие, известные специалистам в данной области техники.

Изобретение предлагает композиции, такие как наборы, которые включают упаковочный материал и один или несколько его компонентов. Набор обычно включает этикетку или вкладыш в упаковку с описанием компонентов или инструкциями по применению содержащихся в них компонентов in vitro, in vivo или ex vivo. Набор может содержать набор таких компонентов, например, нуклеиновую кислоту, рекомбинантный вектор, вирусный (например, AAV, лентивирусный) вектор или вирусную частицу, агент, уменьшающий взаимодействие IgG с FcRn (например, анти-FcRn антитело, FcRn-связывающий пептид, FcRn-связывающее аффитело, низкомолекулярный антагонист FcRn) и, необязательно, протеазу и/или гликозидазу, которая расщепляет или переваривает антитела.

Набор относится к физической структуре, содержащей один или несколько компонентов набора. Упаковочный материал может поддерживать стерильность компонентов и может быть изготовлен из материала, обычно используемого для таких целей (например, из бумаги, гофрированного волокна, стекла, пластика, фольги, ампул, флаконов, пробирок и т. д.).

Этикетки или вкладыши могут включать идентифицирующую информацию об одном или нескольких компонентах, количестве доз, клинической фармакологии активного(ых) ингредиента(ов), включая механизм действия, фармакокинетику и фармакодинамику. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию, идентифицирующую производителя, номера партий, место и дату изготовления, сроки годности. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию, идентифицирующую информацию о производителе, номера партий, местонахождение производителя и дату. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию о заболевании, для лечения которого можно использовать компонент набора. Этикетки или вкладыши могут включать инструкции для врача или субъекта по использованию одного или нескольких компонентов набора в способе, применении или протоколе лечения или терапевтической схеме. Инструкции могут включать дозировку, частоту или продолжительность, а также инструкции по применению любых способов, применений, протоколов лечения или профилактических или терапевтических схем, описанных в настоящем документе.

Этикетки или вкладыши могут включать информацию о любом полезном эффекте, который может обеспечить компонент, таком как профилактический или терапевтический эффект. Этикетки или вкладыши могут включать информацию о потенциальных неблагоприятных побочных эффектах, осложнениях или реакциях, например, предупреждения для субъекта или клинициста в отношении ситуаций, в которых было бы нецелесообразно использовать конкретную композицию. Неблагоприятные побочные эффекты или осложнения также могут возникать, когда субъект принимал, будет или в настоящее время принимает одно или несколько других лекарственных средств, которые могут быть несовместимы с композицией, или если субъект прошел, будет или в настоящее время проходит другой протокол лечения или терапевтическую схему, которая будет несовместима с композицией, и поэтому инструкции могут включать информацию о такой несовместимости.

Этикетки или вкладыши включают «печатные материалы», например, бумагу или картон, либо отдельные или прикрепленные к компоненту, набору или упаковочному материалу (например, коробке), либо прикрепленные к ампуле, тубе или флакону, содержащему компонент набора.

Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут быть использованы при практическом применении или тестировании изобретения, в настоящем документе описаны подходящие способы и материалы.

Все патенты, патентные заявки, публикации и другие ссылки, цитаты из GenBank и цитаты из ATCC, цитируемые в настоящем документе, полностью включены посредством ссылки. В случае конфликта, спецификация, включая определения, будет иметь преимущественную силу.

Все признаки, описанные в настоящем документе, могут комбинироваться в любой комбинации. Каждый признак, описанный в спецификации, может быть заменен альтернативным признаком, служащим той же, эквивалентной или аналогичной цели. Таким образом, если прямо не указано иное, описанные признаки являются примером рода эквивалентных или подобных признаков.

Используемые в настоящем документе формы единственного числа «a», «and» и «the» включают ссылки во множественном числе, если в контексте явно не указано иное. Так, например, ссылка на «нуклеиновую кислоту» включает множество таких нуклеиновых кислот, ссылка на «вектор» включает множество таких векторов, и ссылка на «вирус» или «частицу» включает множество таких вирусов/частиц.

Используемый в настоящем документе термин «примерно» относится к значению в пределах 10% от основного параметра (т.е. плюс или минус 10%). Например, «примерно 1:10» означает 1,1:10,1 или 0,9:9,9, и «примерно 5 часов» означает 4,5 часа или 5,5 часа и т. д. Термин «примерно» в начале строки значений изменяет каждое из значений на 10%.

Все числовые значения или числовые диапазоны включают целые числа в пределах таких диапазонов и дроби значений или целые числа в пределах диапазонов, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на снижение на 95% или более включает 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% и т. д., а также 95,1%, 95,2%, 95,3%, 95,4%, 95,5% и т. д., 96,1%, 96,2%, 96,3%, 96,4%, 96,5% и т. д. и так далее. Таким образом, чтобы также проиллюстрировать, ссылка на числовой диапазон, такой как «1-4», включает 2, 3, а также 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 и т. д. и так далее. Например, «от 1 до 4 недель» включает 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 дней.

Кроме того, ссылка на числовой диапазон, такой как «от 0,01 до 10», включает 0,011, 0,012, 0,013 и т. д., а также 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 и т. д. и так далее. Например, дозировка от примерно «0,01 мг/кг до примерно 10 мг/кг» массы тела субъекта включает 0,011 мг/кг, 0,012 мг/кг, 0,013 мг/кг, 0,014 мг/кг, 0,015 мг/кг и т. д., а также 9,5 мг/кг, 9,6 мг/кг, 9,7 мг/кг, 9,8 мг/кг, 9,9 мг/кг и т.д. и так далее.

Ссылка на целое число более (больше) или меньше включает любое число, большее или меньшее, чем число ссылки, соответственно. Так, например, ссылка на более чем 2 включает 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и т. д. и так далее. Например, введение рекомбинантного вирусного вектора, протеазы и/или гликозидазы «два или несколько» раз включает 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более раз.

Кроме того, ссылка на числовой диапазон, такой как «от 1 до 90», включает 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т. д., а также 81, 82, 83, 84, 85 и т. д. и так далее. Например, «от примерно 1 минуты до примерно 90 дней» включает 1,1 минуты, 1,2 минуты, 1,3 минуты, 1,4 минуты, 1,5 минуты и т. д., а также один день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней…. 81 день, 82 дня, 83 дня, 84 дня, 85 дней и т. д. и так далее.

Изобретение в целом описано в настоящем документе с использованием утвердительного языка для описания многочисленных вариантов осуществления изобретения. Изобретение также конкретно включает варианты осуществления, в которых полностью или частично исключен конкретный объект, такой как вещества или материалы, стадии и условия способа, протоколы или процедуры. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, материалы и/или стадии способа исключены. Таким образом, даже несмотря на то, что изобретение в общем не выражено в настоящем документе в терминах того, что изобретение не включает, аспекты, которые явно не исключены в изобретении, тем не менее, описаны в настоящем документе.

Описаны несколько вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, специалист в данной области техники, не отступая от сущности и объема изобретения, может внести различные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его к различным применениям и условиям. Соответственно, следующие примеры предназначены для иллюстрации, но никоим образом не ограничивают объем заявленного изобретения.

Примеры

ПРИМЕР 1

Комбинированное лечение анти-FcRn антителами и эндопептидазой

Наличие и развитие IgG, специфичного к капсидному белку AAV (анти-капсидного IgG) представляет серьезную проблему для генной терапии AAV, поскольку антикапсидный IgG может ингибировать или нейтрализовать трансдукцию AAV в клетки и ткани. Стремясь улучшить генную терапию, желательно уменьшить и/или удалить циркулирующие IgG, чтобы позволить дозирование rAAV пациентам, которые уже имеют нейтрализующие AAV антитела (NAb) из-за естественного воздействия AAV или из-за предыдущего дозирования rAAV.

При двойном подходе к преодолению NAb, субъекту вводят начальную схему лечения антителами, которые связывают FcRn и ингибируют взаимодействие IgG с FcRn (анти-FcRn антителами), с последующим введением схемы IgG-специфической эндопептидазы, такой как как IdeS). Ранее было показано, что введение человеку 3 недельных доз анти-FcRn антитела, которое ингибирует FcRn-опосредованную рециркуляцию IgG (M281), может привести к снижению уровня IgG в плазме до 80% (Ling et al., 2019). Комбинация предварительного истощения IgG анти-FcRn антителами с расщеплением IgG введением IdeS потенциально может преодолеть значительно более высокие начальные титры NAb, чем любая схема лечения по отдельности.

Субъектов с титрами NAb 1:160 делят на четыре тестируемые группы: 1) не леченные; 2) лечение только анти-FcRn антителами; 3) лечение только IdeS; и 4) комбинированное лечение анти-FcRn антителом и IdeS. Анти-FcRn антитело вводят внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или другим способом с однократной или многократной возрастающей дозой 0, 0,3, 3, 10, 30 и 60 мг/кг (и более высокими дозами). Дозы анти-FcRn антитела вводят один раз в неделю (например) в течение 1, 2, 3 или 4 недель (или более) с последующей инфузией IdeS внутривенным, подкожным, внутрибрюшинным или другим способом введения с одной или несколькими возрастающими дозами 0, 0,5, 1 и 2 мг/кг (и более высокими дозами). Титры NAb оценивают до и после каждой обработки.

ПРИМЕР 2

Модель на кроликах повторного дозирования AAV

Кроликам вводят инфузией векторные частицы rAAV, несущие представляющий интерес трансген, для индуцирования анти-AAV NAb. После того как у кроликов разовьется титр анти-AAV NAb, им вводят анти-FcRn антитело, которое ингибирует взаимодействие IgG с FcRn. Дозирование анти-FcRn-антитела проводят в течение 2, 3, 4 или более недель, например, в однократных или многократных возрастающих дозах 0, 0,3, 3, 10, 30 и 60 мг/кг (и более высокие дозы). После курса дозирования анти-FcRn антитела, IdeS вводят в однократной или многократных возрастающих дозах 0, 0,5, 1 и 2 мг/кг (и более высокие дозы). Через 24-48 часов после введения IdeS, кроликам вводят дополнительные частицы rAAV, несущие другой трансген. Эта модель позволяет анализировать эффективность трансдукции на различных стадиях, в том числе до и после лечения анти-FcRn и IdeS, и до и после повторного введения rAAV.

ПРИМЕР 3

Способы

Расщепление иммуноглобулина G (IgG) эндопептидазой in vitro: Образцы сыворотки человека или плазмы приматов, отличных от человека (NHP), с или без нейтрализующих антител (NAb) к капсиду Spk2, инкубируют с увеличивающимися дозами расщепляющего иммуноглобулин фермента из Streptococcus pyogenes (IdeS; Promega) в течение 1 часа при 37°C. Согласно показаниям Promega, одна единица определяется как расщепление ≥95% 1 мкг рекомбинантного моноклонального IgG за 30 минут при 37°C. Объем реакции регулируют с помощью PBS. Расщепление общего IgG оценивают с помощью SDS-PAGE и окрашивания Coomassie.

SDS-PAGE анализ расщепленного IgG: Расщепленные образцы готовят для невосстанавливающего SDS-PAGE с буфером NuPAGE® LDS Sample Buffer (4X) (ThermoFisher Scientific) и нагревают до 70°C в течение 10 мин. Затем образцы анализируют с помощью геля NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris с использованием рабочего буфера MOPS SDS. Гели окрашивают Coomassie Blue.

Титр анти-AAV капсид-нейтрализующего антитела (NAb): Нейтрализующие антитела к капсиду AAV-Spk1 или AAV-Spk2 количественно определяют с использованием клеточного анализа in vitro, и либо AAV-Spk1, либо AAV-Spk2, соответственно, репортер-вектор, инкапсидирующий трансген люциферазы Renilla. Коротко, ранний пассаж (пассаж мене #26) клеток 293E4 размораживают и высевают в плоскодонный белый 96-луночный планшет в количестве 2х10⁴ клеток/200 мкл/лунку. В каждую лунку добавляют понастерон А (Invitrogen; кат. № H101-01) до конечной концентрации 1 мкг/мл, чтобы индуцировать экспрессию белка хелперного вируса, аденовируса человека Е4. Затем клетки культивируют в течение ночи в инкубаторе при 37°C/5% CO₂. На следующий день, образцы подвергают тепловой инактивации при 56°С в течение 30 мин, затем готовят 4-точечное разведение (от 1:1 до 1:5) с использованием фетальной бычьей сыворотки (FBS) в качестве разбавителя. Контрольную плазму для анализа фактора (FACT; King George Bio-Medical, Inc.) готовят в 3,16-кратном (полу-логарифмическом) серийном разведении для оценки эффективности анализа. Вектор AAV-люциферазы разводят до 7,5х10⁷ гв/мл в DMEM и затем добавляют к контролям FACT и образцам. Вектор и контроли/образцы инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Объемы 7,5 мкл на лунку «нейтрализованных» контролей/образцов переносят в каждую лунку планшета, засеянного клетками, и клетки возвращают в инкубатор для инкубации в течение ночи. На следующий день, клетки промывают один раз в PBS, лизируют в буфере Renilla Assay Lysis Buffer и измеряют активность люциферазы с помощью системы Renilla Luciferase Assay System (Promega) и считывают на микропланшет-ридере SpectraMax® L.

Модель искусственной иммунизации на мышах с использованием IVIg: для создания искусственного титра NAb у самцов мышей C57BL/6, внутривенный иммуноглобулин (IVIg; Gamunex), содержащий 10% иммуноглобулина G (IgG), очищенного из крови человека, вводят внутрибрюшинно (в/б) за один день до внутривенного (в/в) введения вектора. Чтобы определить, может ли расщепление IgG in vitro с помощью IdeS или IdeZ - аналогичной эндопептидазы из Streptococcus equi, обладающей улучшенной активностью в отношении IgG2a и IgG3 мыши по сравнению с IdeS - восстановить эффективность трансдукции in vivo, IVIg обрабатывают 125 единицами IdeZ (Promega) в течение ночи при 37°C перед в/б введением. Расщепление общего IgG оценивают с помощью SDS-PAGE и окрашивания Coomassie. Через один день после дозирования IVg вводят вектор (AAV-Spk1-GAA) в дозе 2х10¹² гв/кг. Образцы плазмы мышей собирают еженедельно, и образцы анализируют на активность трансгена (фермента GAA). Чтобы определить, может ли расщепление IgG in vivo с помощью IdeS восстановить эффективность трансдукции in vivo, 300 мг/кг IVIg вводят в/б инфузией. Через 24 часа, либо 0,4, либо 4 мг/кг IdeS вводят в/в инфузией. Затем, через 24 часа после инфузии IdeS, вводят вектор (AAV-Spk1-GAA) в дозе 2х10¹² гв/кг.

Анализ активности GAA: Активность GAA оценивают путем измерения расщепления субстрата 4-метилумбеллиферил-α-D-глюкозиды при pH 4 (Galjaard et al., Clin Chim Acta 1973; 49(3):361-75). Коротко, реакцию инициируют добавлением 20 мкл субстрата к 10 мкл образца плазмы, разведенного 1:250 в воде MilliQ. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 1 часа и затем останавливают карбонатным буфером при рН 10,5. После этого, стандартную кривую строят с 4-метилумбеллифероном, синим флуоресцентным красителем, высвобождаемым из 4-метилумбеллиферил-α-D-глюкозида, который дает флуоресцентное испускание при 440 нм при возбуждении при 370 нм.

Анти-AAV капсид IgG антитела: Общее образование IgG в анти-AAV капсида измеряют с помощью анализа захвата. Лунки планшета ELISA покрывают 50 мкл раствора, содержащего 1 мкг/мл частиц капсида AAV-Spk1. Общий IgG человека (Southern Biotech, 0150-01) разводят для получения стандартной 10-точечной кривой в диапазоне от 10000 нг/мл до 0,5 нг/мл и добавляют в планшет. Предел количественного определения анализа составляет 460 нг/мл после обратного расчета. Готовят три уровня образцов контроля качества и добавляют в каждый планшет для оценки эффективности анализа. Частицы капсида, стандарты и контроли качества (QC) инкубируют в течение ночи при 4°С. После промывки, лунки блокируют 2% BSA, 0,05% Tween-20 в PBS на 2 часа при комнатной температуре. Затем в планшет добавляют серийные разведения образцов в блокирующем буфере и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов. Античеловеческое IgG антитело овцы, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (GE Healthcare, кат. № NA933V), разведенное 1:5000 в блокирующем буфере, используют в качестве определяющего антитела и инкубируют на планшете в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывки, активность пероксидазы выявляют после 10-минутной инкубации при комнатной температуре с 3,3',5,5'-тетраметилбензидиновым субстратом (ТМВ). Реакцию останавливают 1М серной кислотой, и затем планшет считывают с помощью планшет-ридера абсорбции для оптической плотности (OD) при 450 нм. Концентрацию IgG определяют по стандартной кривой, построенной с помощью серийных разведений очищенного общего IgG человека.

ПРИМЕР 4

IdeS расщепляет IgG из образцов человека, NHP и хомяка in vitro

Фермент, расщепляющий иммуноглобулин G (IgG) из Streptococcus pyogenes (IdeS), представляет собой цистеиновую протеазу, которая с высокой специфичностью расщепляет все четыре подкласса IgG человека. IdeS гидролизует IgG человека по Gly236 в нижней шарнирной области тяжелых цепей IgG.

Для анализа способности IdeS расщеплять IgG в сыворотке, увеличивающиеся дозы IdeS (0-100 единиц; Promega) добавляют к образцам сыворотки человека и плазмы NHP (макак-резус) с или без титром анти-Spk2 NAb. В образцах человека, которые являются наивными (<1:1) или имеют относительно средние (1:5-1:10) или относительно высокие (1:20-1:40) титры NAb, самая низкая доза IdeS расщепляет все общие IgG (~150 кДа) для высвобождения Fc фрагмента (~25 кДа) (фигура 1А). В образцах NHP, IgG расщепляется аналогичным образом во всех группах титров NAb (<1:1, 1:50-1:100, >1:100, фигура 1B).

Ожидается, что хомяки предоставят лучшую модель, чем мыши, для изучения лечения IdeS при повторном дозировании AAV. IdeS тестируют на способность расщеплять IgG хомяка путем инкубации увеличивающихся количеств IdeS (от 0 до 50 единиц; Promega) с объединенной плазмой хомяка (и объединенной плазмой человека в качестве положительного контроля). Образцы анализируют с помощью невосстанавливающего SDS-PAGE и окрашивания Coomassie Blue. IdeS является эффективной для расщепления IgG в объединенной плазме хомяка и объединенной плазме человека in vitro (фигура 1C).

Эти результаты демонстрируют, что IdeS является высокоэффективной и специфичной протеазой IgG человека, IgG резуса и IgG хомяка.

ПРИМЕР 5

Расщепление IgG с помощью IdeS приводит к снижению титра NAb in vitro

Чтобы проанализировать, достаточно ли расщепления IgG с помощью IdeS для уменьшения нейтрализации, анализируют эффективность трансдукции вектора AAV in vitro. В этом анализе, образцы сыворотки или плазмы различных видов можно оценить на наличие нейтрализующих антител к капсиду AAV путем предварительной инкубации векторов AAV, кодирующих люциферазу Renilla, с плазмой или сывороткой, трансдукции клеток человека в культуре с этими смесями и последующей оценки уровня активности люциферазы.

Образцы сыворотки пациентов, которые являются наивными (<1:1) или имеют высокий титр анти-Spk2 NAb (1:10-1:20), предварительно обрабатывают с или без избытка IdeS (50 единиц), и затем оценивают титры NAb. Интересно, что образец пациента с ранее зарегистрированным титром NAb 1:10-1:20 показывает, по меньшей мере, двукратное снижение с предварительным лечением IdeS до титра NAb 1:5-1:10 в одном исследовании (таблица 1). Эти результаты демонстрируют, что трансдукция вектора AAV увеличивается, когда IgG антитела расщепляются IdeS.

Таблица 1 - Анализ титра анти-Spk2 NAb в сыворотке крови человека, инкубированной с избытком IdeS. Исследование 1 Образец # Spark ID IdeS Вектор Предыдущий титр Диапазон титров FACT Планшет 1 НД НД НД НД 1:100-1:316 S1 397 Нет Spk2 <1:1 <1:1 S2 427 Нет Spk2 1:10-1:20 1:10-1:20 S3 397 Да Spk2 <1:1 <1:1 S4 427 Да Spk2 1:10-1:20 1:5-1:10 Исследование 2 Образец # Spark ID IdeS Вектор Предыдущий титр Диапазон титров S1 FBS Нет Spk2 НД <1:1 S2 FBS Да Spk2 НД <1:1 S3 BRH1450399 Нет Spk2 1:2,5 1:2,5 S4 BRH1450399 Да Spk2 1:2,5 1:1 S5 BRH1450436 Нет Spk2 ~1:5 1:5 S6 BRH1450436 Да Spk2 ~1:5 1:1 S7 BRH1450427 Нет Spk2 1:10 1:10 S8 BRH1450427 Да Spk2 1:10 1:10

Анализ титра анти-Spk2 NAb после обработки эндопептидазой IdeS. Образцы пациентов-людей (обозначенные Spark ID) предварительно обрабатывают с и без IdeS. Позже титры NAb оценивают с помощью анализа векторной трансдукции in vitro.

ПРИМЕР 6

Расщепление IVIg с помощью IdeZ in vitro повышает эффективность трансдукции вектора in vivo.

Эффекторные функции антител IgG, такие как цитотоксичность и фиксация комплемента, опосредованы Fc частью. Нейтрализация зависит от специфичности вариабельных областей тяжелых и легких цепей к антигену. Хотя фрагмент F(ab')₂ все еще содержит интактные антигенсвязывающие области, данные свидетельствуют о том, что высвобождение фрагмента F(ab')₂ с помощью IdeS или IdeZ, аналогичной эндопептидазой в Streptococcus equi, которая обладает улучшенной активностью против IgG2a и IgG3 мыши, вызывает снижение стабильности без Fc части и, следовательно, более быстрый клиренс фрагмента F(ab')₂ из кровотока, чем интактного IgG. В этом анализе проверяют, должно ли введение нейтрализующих антител, предварительно расщепленных IdeS или IdeZ, приводить к снижению нейтрализующей активности AAV в условиях in vivo.

Мышей иммунизируют IVIg, пулом IgG человека, который включает антитела, нейтрализующие анти-AAV капсид, предварительно обработанные или нет 0,1 мг/кг IdeZ. Затем мышам вводят 2х10¹² гв/кг AAV-Spk1-GAA. У мышей, леченных 1,0 мг или 5,0 мг IVIg, наблюдается снижение уровня активности GAA в плазме (10951 ± 1554 нмоль/ч/мл и 1041±553 нмоль/ч/мл, соответственно) по сравнению с контрольными мышами (33551 ± 13635 нмоль/ч/мл), демонстрируя, что нейтрализация вектора с помощью IVg зависит от дозы (фигура 2).

Предварительная обработка 40 мг/кг IVIg с IdeZ восстанавливает эффективность трансдукции, что приводит к уровням активности GAA (37707 ± 11449 нмоль/ч/мл), которые сопоставимы с контролем. Предварительная обработка IdeZ 200 мг/кг IVIg частично облегчает нейтрализацию вектора (13440 нмоль/ч/мл ± 15543), при этом у одного животного активность полностью восстанавливается (41025 нмоль/ч/мл). Следует отметить, что сама IdeZ не влияет на эффективность трансдукции вектора AAV. Оставшуюся дозу IVIg анализируют с помощью SDS-PAGE с окрашиванием Coomassie для подтверждения расщепления IgG. Эти результаты показывают, что расщепление in vitro нейтрализующих антител к капсиду AAV с помощью IdeS/IdeZ может восстановить трансдукцию вектора AAV и экспрессию трансгена in vivo.

ПРИМЕР 7

Расщепление IVIg с помощью IdeS in vivo повышает эффективность трансдукции вектора in vivo.

Чтобы проанализировать, может ли расщепление IgG in vivo влиять на трансдукцию вектора и экспрессию/активность трансгена в плазме, мышам сначала вводят интактный IVIg для создания искусственного титра анти-капсидных нейтрализующих IgG человека. Через 24 часа мышам вводят IdeS в двух концентрациях (0,4 мг/кг или 4 мг/кг), и затем через 24 часа после введения IdeS, всем мышам вводят 2х10¹² гв/кг AAV-Spk1-GAA. Титры анти-Spk1 NAb и уровни IgG анализируют до инфузии IdeS и после инфузии IdeS (непосредственно перед введением вектора).

Инфузия IdeS вызывает дозозависимое снижение уровней NAb (фигура 3) и IgG (фигура 4). Самая высокая доза IdeS (4 мг/кг) способна снижать титры NAb, по меньшей мере, с 1:40 до <1:1.

При измерении активности GAA через неделю после инфузии вектора, контрольные мыши, которым вводили только вектор, продемонстрировали уровни активности GAA 49387 ± 7345 нмоль/ч/мл (фигура 5). Мыши, которым вводят 300 мг/кг IVIg, демонстрируют уровни трансгенной активности GAA в плазме (1702 ± 336 нмоль/ч/мл), что согласуется с почти полным ингибированием трансдукции. IdeS демонстрирует дозозависимое восстановление уровней активности трансгена; 0,4 мг/кг IdeS приводят к восстановлению активности GAA на 70% (34408 ± 10562 нмоль/ч/мл), в то время как 4 мг/кг IdeS восстанавливают активность GAA на 99% (48948 ± 5322 нмоль/ч/мл). Эти результаты демонстрируют, что обработка IdeS in vivo снижает титры нейтрализующих антител и позволяет дозировать и трансдуцировать векторы AAV у животных, трудно поддающихся лечению.

ПРИМЕР 8

Расщепление IVIg с помощью IdeS in vivo повышает эффективность трансдукции вектора in vivo.

IdeS оценивают на способность расщеплять более высокие титры анти-капсидного IgG in vivo и восстанавливать трансдукцию AAV в контексте более высокой степени нейтрализации вектора AAV. Мышам (самцам C57BL/6) вводят различные дозы интактного IVIg человека (300 мг/кг (низкая), 800 мг/кг (средняя) или 1600 мг/кг (высокая)) для создания искусственного титра анти-капсидного нейтрализующего IgG человека. Через 24 часа, мышам вводят IdeS в трех концентрациях (0,4 мг/кг (низкая), 1 мг/кг (средняя) или 2 мг/кг (высокая)). Через 24 часа после инфузии IdeS, мышам вводят AAV-Spk1-GAA в дозе 2х10¹² гв/кг. Титры анти-Spk1 NAb определяют как до инфузии IdeS, так и после инфузии IdeS (непосредственно перед введением вектора) с использованием анализа титра анти-AAV капсида NAb, описанного в примере 1. Трансдукцию AAV оценивают путем измерения продукта трансгена (активности GAA) в плазме с использованием анализа активности GAA, как описано в примере 1, через две недели после введения вектора.

Для всех доз IVIg, предварительная обработка IdeS приводит к дозозависимому снижению титра AAV NAb (таблица 2). В таблице 2 представлены титры нейтрализующих анти-Spk1 антител (NAb) до и после введения IdeS для каждого животного в каждой группе. Титры NAb AAV обозначаются как низкие (<1:1, 1:1-1:2,5), диапазон от низкого до среднего (1:2,5-1:5), диапазон от среднего до высокого (1:5-1:10) и высокие (>1:10-1:20). Самая высокая доза IdeS (2 мг/кг) способна снижать титры NAb >1:160 (созданные с 1600 мг/кг IVIg) до 1:1-1:2,5.

Таблица 2 - Титры анти-NAb в плазме мыши до и после инфузии IdeS. До IdeS После IdeS До IdeS После IdeS Отрицательный контроль <1:1 <1:1 Средний IVIg+без IdeS 1:40-1:80 1:20-1:40 0 мг/кг IVIg + <1:1 <1:1 800 мг/кг IVIg + 1:40-1:80 1:80-1:160 0 мг/кг IdeS <1:1 <1:1 0 мг/кг IdeS 1:40-1:80 1:40-1:80 <1:1 <1:1 1:40-1:80 1:40-1:80 <1:1 <1:1 1:40-1:80 1:40 <1:1 <1:1 Средний IVIg+Низкая IdeS 1:40-1:80 1:5-1:10 <1:1 <1:1 800 мг/кг IVIg +
0,4 мг/кг IdeS 1:40-1:80 1:5-1:10 Низкий IVIg+без IdeS 1:20-1:40 1:20-1:40 1:20-1:40 1:2,5 300 мг/кг IVIg + 1:40 1:10-1:20 1:20-1:40 1:2,5-1:5 0 мг/кг IdeS 1-20-1:40 1:20-1:40 1:40-1:80 1:5-1:10 1:40-1:80 1:10-1:20 Средний IVIg+средняя IdeS 1:80-1:160 1:2,5-1:5 1:10-1:20 1:20-1:40 800 мг/кг IVIg + 1:40-1:80 1:1-1:2,5 Низкий IVIg+Низкая IdeS 1:20-1:40 1:2,5-1:5 1,0 мг/кг IdeS 1:40-1:80 <1:1 300 мг/кг IVIg + 1:20-1:40 1:1-1:2,5 1:80-1:160 1:1-1:2,5 0,4 мг/кг IdeS 1:20-1:40 1:40-1:80 1:40-1:80 1:1-1:2,5 1:20-1:40 1:1-1:2,5 Средний IVIg+Высокая IdeS 1:40-1:80 <1:1 1:20-1:40 1:2,5 800 мг/кг IVIg + 1:40-1:80 <1:1 Низкий IVIg+средняя IdeS 1:40-1:80 1:1-1:2,5 2,0 мг/кг IdeS 1:80-1:160 <1:1 300 мг/кг IVIg + 1:80-1:160 <1:1 1:1-1:2,5 <1:1 1,0 мг/кг IdeS 1:80-1:160 1:1-1:2,5 1:20-1:40 <1:1 1:20-1:40 1:1-1:2,5 1:80 1:1-1:2,5 1:20-1:40 1:1-1:2,5 Высокий IVIg+без IdeS > 1:160 1:80-1:160 Низкий IVIg+высокая IdeS 1:20-1:40 <1:1 1600 мг/кг IVIg + > 1:160 1:40-1:80 300 мг/кг IVIg + 1:10-1:20 <1:1 0 мг/кг IdeS >1:160 1:40-1:80 2,0 мг/кг IdeS 1:20-1:40 <1:1 >1:160 1:40-1:80 1:20-1:40 <1:1 >1:160 1:40-1:80 1:20-1:40 <1:1 >1:160 1:40-1:80 Высокий IVIg+Низкая IdeS 1:1-1:2,5 1:1-1:2,5 1600 мг/кг IVIg + >1:160 1:5-1:10 0,4 мг/кг IdeS 1:20-1:40 1:2,5-1:5 >1:160 1:10-1:20 >1:160 1:10-1:20 Высокий IVIg+средняя IdeS 1:40-1:80 1:1-1:2,5 1600 мг/кг IVIg + >1:160 1:2,5-1:5 1,0 мг/кг IdeS >1:160 1:2,5-1:5 >1:160 1:2,5-1:5 >1:160 1:2,5-1:5 Высокий IVIg+высокая IdeS >1:160 1:2,5-1:5 1600 мг/кг IVIg + >1:160 1:1-1:2,5 2,0 мг/кг IdeS >1:160 1:1-1:2,5 >1:160 1:1-1:2,5 <1:1 <1:1

Результаты активности GAA, измеренные через две недели после введения вектора, показаны на фигуре 6. Плазма мышей отрицательного контроля (получивших только вектор) продемонстрировала уровни активности GAA 26689 ± 12420 нмоль/ч/мл. У мышей, которым вводили 300 мг/кг (и выше) IVIg и которые не получали IdeS, уровни активности GAA в плазме составляют всего 436 ± 41 нмоль/ч/мл, что согласуется с NAb ингибированием трансдукции вектора AAV. В соответствии с результатами, полученными в предыдущих примерах, предварительная обработка IdeS приводит к дозозависимому восстановлению трансдукции вектора AAV, что измеряется уровнями активности GAA в плазме: 0,4 мг/кг IdeS приводит к уровням активности GAA 7702 ± 4710 нмоль/ч/мл, 1 мг/кг IdeS приводит к уровням активности GAA 15444 ± 4226 нмоль/ч/мл, и 2 мг/кг IdeS приводят к уровням активности GAA 14375 ± 2572 нмоль/ч/мл.

В группах, получавших более высокие дозы IVIg (либо 800, либо 1600 мг/кг IVIg), наблюдаются сходные тенденции дозозависимого повышения уровней активности GAA с увеличением IdeS. При 800 мг/кг IVIg, 0,4 мг/кг IdeS приводит к уровням активности GAA 4188 ± 2549 нмоль/ч/мл, 1 мг/кг IdeS приводит к уровням активности GAA 17813 ± 11283 нмоль/ч/мл и 2 мг /кг IdeS приводят к уровням активности GAA 26846 ± 7354 нмоль/ч/мл. При 1600 мг/кг IVIg, 0,4 мг/кг IdeS приводит к уровням активности GAA 580 ± 217 нмоль/ч/мл, 1 мг/кг IdeS приводит к уровням активности GAA 12511 ± 1602 нмоль/ч/мл и 2 мг/кг IdeS приводят к уровням активности GAA 11573 ± 1313 нмоль/ч/мл. При самой высокой дозе IVIg (1600 мг/кг), самая низкая доза IdeS (0,4 мг/кг) не восстанавливает трансдукцию вектора. Однако при дозе IVIg 1600 мг/кг в кровотоке присутствуют супрафизиологические уровни общего IgG, что, вероятно, снижает эффективность IdeS при дозе 0,4 мг/кг из-за повышенного количества его субстрата.

Эти результаты показывают, что обработка IdeS in vivo снижает титры нейтрализующих антител и позволяет дозировать и трансдуцировать вирусные векторы у животных, которые трудно поддаются лечению методами генной терапии вирусными векторами.

ПРИМЕР 9

Модель на хомяках передозировки AAV

Хомякам вводят инфузией частицы вектора rAAV, несущие представляющий интерес трансген, дозу IdeS вводят после развития анти-AAV NAb (например, через 4 недели) и вводят инфузией дополнительные частицы rAAV, несущие другой трансген. Эта модель позволяет анализировать эффективность трансдукции на различных стадиях, в том числе до и после обработки IdeS, и до и после повторного введения rAAV.

Чтобы оценить способность IdeS расщеплять или снижать действие нейтрализующих антител на капсид AAV, исследование проводят на сирийских золотых хомяках, виде, IgG которого эффективно расщепляется эндопептидазой IdeS. Хомячкам сначала вводят 2х10¹² гв/кг Spk1-FVIII, Spk1-FIX или другого инкапсидированного вектора Spk1. Животных отслеживают на экспрессию продукта трансгена (т.е., FVIII, FIX и т.д.) в плазме, в дополнение к измерению развития NAb к капсиду Spk1 с помощью ELISA анти-Spk1 IgG или клеточного анализа нейтрализующих антител. После развития титра NAb в течение 3-5 недель после инфузии вектора, животным внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или другим путем вводят инфузией однократную или многократную восходящую дозу IdeS 0, 0,5, 1 и 2 мг/кг (и более высокие дозы). После введения IdeS, у животных измеряют анти-Spk1 капсидные IgG и/или NAb к Spk1. Когда у животных наблюдается достаточное снижение уровней NAb, им вводят 2х10¹² гв/кг Spk1-GAA. После трансдукции, экспрессию GAA измеряют в плазме с помощью анализа активности GAA и/или измерения уровня антигена GAA для определения достигнутого уровня трансдукции.

Эти исследования показывают, снижает ли IdeS специфические к капсиду AAV NAb in vivo до уровня, достаточно низкого для повторного дозирования. Измерение анти-FVIII IgG (если они развились in vivo) дает информацию об эффективности IdeS в снижении количества NAb, таргетирующих трансгенный продукт, а также о допустимом количестве повторных дозировок IdeS до потери эффективности.

ПРИМЕР 10

Модель на яванских макаках повторного дозирования AAV

Чтобы оценить способность IdeS расщеплять или уменьшать действие NAb против капсида AAV в модели крупных животных, проводят исследование на яванских макаках (Macaca fascicularis). Обезьян сначала проверяют на наличие уже существующих NAb к капсиду Spk1. NAb-положительные животные, вероятно, являются результатом воздействия встречающихся в природе AAV в дикой природе или при групповом содержании. Животных распределяют по группам на основе отрицательного или положительного титра NAb и, если он положительный, определяют, насколько высок уже существующий титр NAb.

В направлении исследования повторного дозирования, животным вводят 2х10¹² гв/кг Spk1-FIX или другого инкапсидированного вектора Spk1. Животных контролируют на предмет экспрессии продукта трансгена (т.е., FIX или другого) в плазме, в дополнение к измерению развития NAb к капсиду Spk1 с помощью анти-Spk1 IgG ELISA или клеточного анализа NAb. После развития титра NAb в течение 3-5 недель после введения вектора, животным внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или другим способом вводят инфузией однократную или многократную восходящую дозу IdeS 0, 0,5, 1 и 2 мг/кг и более высокие дозы. После введения IdeS, у животных измеряют анти-Spk1 капсидные IgG и/или NAb к Spk1. Когда у животных наблюдается достаточное снижение уровней NAb, им вводят 2х10¹² гв/кг Spk1-GAA. После трансдукции, экспрессию GAA измеряют в плазме с помощью анализа активности GAA и/или оценки уровня антигена GAA для определения достигнутого уровня трансдукции.

Отдельное направление исследования оценивает способность IdeS преодолевать уже существующие титры NAb. Животных с разными уровнями титра NAb группируют на основе титра и вводят инфузию внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или другим способом однократной или многократной возрастающей дозы IdeS 0, 0,5, 1 и 2 мг/кг (и более высокие дозы). После введения IdeS, у животных измеряют анти-Spk1 капсидные IgG и/или NAb к Spk1, и, когда животные демонстрируют достаточное снижение уровней NAb, им вливают 2х10¹² мкг/кг Spk1-GAA. После трансдукции, экспрессию GAA измеряют в плазме с помощью анализа активности GAA и/или измерения уровня антигена GAA для определения достигнутого уровня трансдукции.

Эти исследования показывают, снижает ли IdeS специфичные к капсиду AAV NAb in vivo до уровня, достаточно низкого для повторного введения дозы у яванских макаков, вида, который является отличной моделью введения AAV человеку. Эти исследования также показывают максимальный уже существующий титр NAb, который может быть преодолен введением IdeS. Измерение анти-FIX IgG (если они развились in vivo) дает информацию об эффективности IdeS в снижении количества NAb, таргетирующих трансгенный продукт, и о допустимом количестве повторных дозировок IdeS до потери эффективности.

ПРИМЕР 11

Исследование на мышах с IdeS и AAV-Spk1-hFVIII

Два разных препарата IdeS (партия 1 и партия 2) тестируют на мышах с искусственным титром анти-капсидных нейтрализующих IgG человека Мышам C57BL/6 вводят 300 мг/кг IVIg в день -2, затем 1 мг/кг IdeS в день -1 (предварительно дозируя AAV) и, наконец, 5х10¹⁰ векторных геномов вектора AAV-Spk1, кодирующего фактор VIII человека (AAV-Spk1-hFVIII) в день 0 (после дозирования). Животные отрицательного контроля не получают лечение IVIg или IdeS, и группа «без IdeS» получает только IVIg и вектор AAV-Spk1-hFVIII. Титры нейтрализующих антител в плазме определяют до и после введения IdeS с использованием анализа нейтрализации анти-AAV капсида, аналогичного описанному в примере 3, с использованием 8-точечного титра (от 1:1 до 1:160) в образцах, и люминесценцию считывают на ридере GloMax® Discover Microplate Reader (Promega). Титр определяют как максимальное разведение или диапазон, при котором люминесценция ингибируется более чем на 50%. Титры NAb до и после лечения IdeS показывают, что обе партии IdeS являются эффективными в снижении титра NAb у мышей (фигура 7).

Уровни антигена FVIII человека измеряют с помощью ELISA до введения вектора и через одну и две недели после введения вектора (фигура 8). Обработка обеими партиями IdeS in vivo снижает титры нейтрализующих антител и позволяет дозировать вектор AAV и экспрессию трансгена.

ПРИМЕР 12

Исследование на мышах с анти-AAV-Spk1 IgG

Мышам C57BL/6 вводят IVIg для индукции искусственного титра анти-капсидного нейтрализующего IgG человека. Используют три концентрации IVIg (300 мг/кг (низкая), 800 мг/кг (средняя) и 1600 мг/кг (высокая), и в каждой группе IVIg животных лечат возрастающими дозами IdeS (0, 0,4, 1,0, 2,0 мг/кг). Уровни анти-Spk1 капсида IgG оценивают с помощью ELISA. Коротко, 96-луночные планшеты покрывают пустым капсидом Spk1, затем блокируют BSA, промывают и инкубируют с плазмой, разведенной 1:100, в течение 2 часов. После инкубации, планшеты промывают и инкубируют с вторичным антителом, конъюгированным с HRP, в течение 1 часа. Затем планшеты снова промывают и проявляют с использованием субстрата ТМВ. Планшеты считывают на планшет-ридере абсорбции для оптической плотности (OD) при 450 нм. Люминесценцию сравнивают со стандартной кривой IgG человека для определения концентрации антител. Все три концентрации IdeS (0,4, 1,0, 2,0 мг/кг) устраняют или значительно снижают сывороточные уровни анти-Spk1 капсида IgG для всех трех концентраций (низкой, средней и высокой) IVIg (фигура 9).

ПРИМЕР 13

Исследование на мышах с анти-FcRn антителом и эндопептидазой

Проводят исследование на самцах мышей Tg32 для оценки способности анти-FcRn моноклонального M281 и IgG, расщепляющих эндопептидазу IdeS, отдельно и в комбинации, снижать нейтрализующие антитела к AAV.

Мышиный штамм Tg32 (также называемый hFcRn Tg32 или FcRn-/- hFcRn линия 32 Tg) является стандартом для оценки фармакокинетики и фармакодинамики терапевтических средств на основе IgG человека и Fc домена, и несет нокаутную мутацию гена и трансгена Fcgrt мыши (Fc рецептор, IgG, транспортер альфа-цепи), экспрессирующего ген FCGRT человека под контролем его собственного нативного промотора (hTg32), на фоне C57BL/6J (Jackson Laboratory; складской № 014565).

Одиннадцать самцов мышей Tg32 на группу предварительно иммунизируют IVIg (для введения нейтрализующих антител) или PBS Дульбекко (DPBS) посредством внутрибрюшинной инъекции (день -1). Мышам инъецируют M281 или PBS через 24 часа (день 0), IdeS (Promega) или PBS в день 1 и Spk1-FIX (кассету экспрессии Spk1 инкапсидированного печень-специфичного промотора экспрессии FIX) частицы AAV в день 2 (таблица 3). У мышей берут кровь для сбора плазмы через 0 и 2 дня после инъекции IVIg или PBS для анализа NAb и анти-Spk1 IgG. Подробную информацию о дозировании и графике сбора для исследования см. в таблице 4.

Таблица 3. Группы и лечение. Группа Доза IVIg N Лечение (путь) Доза (мг/кг) Вектор (путь) Доза 1 500 мг/кг 11 PBS (в/в) - Spk1-FIX (в/в) 5×10⁵гв/мышь 2 11 М281 (в/в) 20 3 11 IDES (р/о) 0,4 4 11 M281 (в/в) + IdeS (р/о) 20+0,4 5 PBS 11 PBS (в/в) - N=количество мышей в группе; в/в=внутривенно; р/о=ретроорбитально; гв=геномы вектора

Таблица 4. График дозирования и сбора. День исследования Задача День -1 • Измерение массы тела
• внутрибрюшинное (в/б) дозирование IVIg День 0 • Сбор крови
• Внутривенное (в/в) введение PBS и M281 в хвостовую вену День 1 • Ретроорбитальное в/в введение PBS и IdeS День 2 • Измерение массы тела
• Сбор крови
• В/в дозирование Spk1-FIX в хвостовую вену День 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 21 • Измерение массы тела День 9, 16 • Сбор крови День 23 • Измерение массы тела
Прекращение:
• Конечный сбор крови.
• Сбор цельной печени.
• Сбор периферических лимфатических узлов

Способы

Отбор проб крови: В дни 0, 2, 9 и 16: ~200 мкл цельной крови собирают через поднижнечелюстную вену и помещают на лед. Первую каплю крови отбрасывают, и 100 мкл образцы плазмы получают путем центрифугирования крови при 9800 g, 4°C в течение 10 минут, и аликвотируют супернатант в чистые пробирки. Образцы плазмы до анализа хранят при температуре -80°C.

Анализ нейтрализующих антител in vitro: Титры нейтрализующих антител к капсиду AAV-Spk1 определяют in vitro. Коротко, клетки HEK-293-E4 высевают на 96-луночные планшеты (Corning, кат. № 3595) по 20000 клеток на лунку. Клетки культивируют в течение ночи в 37°С инкубаторе с увлажненной атмосферой 5% CO₂ с использованием питательной среды (DMEM, 10% FBS, 2 мМ L-глютамина, 1x Pen/Strep) с добавлением 1 мкг/мл Ponasterone A (Fisher Scientific, кат. № H10101) для индуцирования экспрессии белка Е4 аденовируса человека. На следующий день, все образцы плазмы инактивируют нагреванием при 56°С в течение 30 минут на водяной бане. Образцы разводят и тестируют в инактивированной нагреванием FBS в 2-кратном серийном разведении для оценки ингибирующей активности в диапазоне разведения от 1:2,5 до 1:160. Контрольную плазму анализа фактора (FACT) используют для оценки эффективности анализа между прогонами. Образцы разведенной плазмы предварительно смешивают с репортерным вирусным Spk1-Renilla-люцифераза AAV в концентрации 1,5×10⁹ г/мл и инкубируют при 37°С в течение 1 часа (общий объем 80 мкл). После инкубации, 7,5 мкл предварительно смешанного раствора плазмы/AAV добавляют в тройные лунки с клетками HEK-293-E4 и инкубируют в течение ночи при 37°С/5% СО₂. На следующий день, к клеткам в каждую лунку добавляют 40 мкл буфера для лизиса люциферазы Renilla и анализируют люминесценцию с использованием люминометра GloMax®. Титры нейтрализующих антител показывают как самое низкое разведение плазмы, которое приводит к снижению люминесценции более чем на 50% по сравнению с наивной сывороткой (только FBS).

Анализ ELISA анти-SPK1 капсида IgG: Присутствие анти-капсидного IgG в плазме мыши оценивают с использованием анализа захвата анти-AAV Spk1 капсида IgG человека. Коротко, лунки планшета ELISA покрывают в течение ночи при 4°C стандартами IgG человека, образцами контроля качества (QC) или капсидом Spk1 (лунки с образцами плазмы). Стандартная кривая состоит из 10-точечной серии 3-кратных разведений в диапазоне от 10 мкг/мл до 4,57 нг/мл, где две верхние и две нижние точки служат опорными точками. Образцы контроля высокого качества (HQC), контроля среднего качества (MQC) и контроля низкого качества (LQC) состоят из IgG человека в концентрациях 800 нг/мл, 500 нг/мл и 12 нг/мл. После стадии покрытия в течение ночи, планшеты трижды промывают с помощью устройства для промывки планшетов с последующим блокированием буфером для разведения в течение 2 часов при комнатной температуре. Планшеты промывают, как указано выше, и образцы разведенной плазмы (1:100) добавляют в соответствующие лунки (в стандартные лунки и лунки для QC добавляют только буфер для разведения). Планшеты инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре и промывают, как и раньше. В лунки планшета добавляют конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) анти-человеческое IgG антитело овцы и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации, планшеты промывают, как и раньше. В планшеты добавляют ТМВ, уравновешенный до комнатной температуры, для обнаружения развития сигнала. После инкубации в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре, развитие сигнала останавливают добавлением 1М серной кислоты. Сигнал обнаруживают путем измерения поглощения при 450 нм с использованием планшет-ридера SpectraMax®. Критерии приемлемости анализа основаны на результатах стандартов и образцов QC. Уровни антикапсидного IgG в образцах плазмы интерполируют путем сравнения со стандартной кривой. Образцы, в которых измерено <457 нг/мл, определяют как находящиеся ниже предела количественного определения (BQL). Образцам ниже определяемого диапазона поглощения присваивают значение 152 нг/мл, что соответствует нижнему пределу обнаружения (LOD).

Анализ титров нейтрализующих антител

Результаты анализа NAb представлены на фигуре 10 и в таблице 5. Несколько мышей в группе PBS (группа 1) имеют повышенные титры NAb. Группа «только M281» (группа 2) значительно снизила титры NAb через два дня, в то время как группа «только IdeS» (группа 3) не показала значительного снижения титров NAb). Ячейки NAb отражают уровень разведения плазмы, который позволяет экспрессировать репортер, и являются способом классификации титров NAb, поскольку значения ингибирования в анализе могут находиться между определенными значениями. Поэтому заявлено, что титр NAb находится в пределах этих «ячеек» или уровней.

Как M281, так и IdeS снижают титры нейтрализующих антител, и комбинированная терапия уменьшает количество всех мышей до ячеек уровней ниже нижнего предела обнаружения. Один M281 способен снижать NAb более эффективно, чем IdeS.

Таблица 5. Изменение ячейки титров NAb Группа Медианное изменение ячейки NAb Диапазон изменения ячейки NAb 1 +1 от -1 до +2 2 -5 от -5 до -2,5 3 -4 от -5 до +1 4 -5 от -5 до -3 5 0 0

Анализ капсида анти-Spk1 IgG

ELISA уровни анти-Spk1 IgG не изменяются в группах «только PBS» и «без IVIg» между днем 0 и днем 2 (фигура 11). Уровни анти-Spk1 IgG в среднем снижаются с 5,21×10³ нг/мл (день 0) до 3,95×10³ нг/мл (день 2) у мышей, получавших только M281 (группа 2), и с 4,21×10³ нг/мл (день 0) до 3,95 х 10³ нг/мл (день 2) у мышей, получавших только IdeS (группа 3) (таблица 6). У мышей, получавших как M281, так и IdeS (группа 4), уровни анти-Spk1 IgG у всех снижены ниже предела обнаружения анализа, и им присвоено значение 152 нг/мл (фигура 11). Уровни анти-Spk1 IgG значительно снижены в группе 2 (M281) и группе 4 (M281+IdeS), но не в группе 3 (IdeS) с 0 по 2 день. Мыши, получавшие комбинацию M281 и IdeS, имеют значительно более низкие уровни анти-Spk1 IgG по сравнению с M281 или только IdeS на 2 день.

Таблица 6. Снижение анти-Spk1 IgG ELISA анти-Spk1 IgG человека Группа # День 0 (нг/мл) ^а День 2 (нг/мл) 1 5,21 х 10³ 3,95 х 10³ 2 1,23 х 10⁴ 5,31 х 10² 3 4,21 х 10³ 6,88 х 10² 4 5,01 х 10³ 1,52х 10^{2 b} 5 1,52х 10^{2 b} 1,52х 10^{2 b} ^а Среднее значение для всех тестируемых животных в группе
^bНеопределяемые уровни поглощения с помощью ELISA

Вывод

Таким образом, комбинация M281 и IdeS может снижать уровни нейтрализующих антител до самых низких уровней титра и снижать уровни анти-Spk1 капсида IgG ниже предела обнаружения. Эти результаты обеспечивают сильную поддержку комбинированной стратегии анти-FcRn агента (такого как анти-FcRn антитело) и IdeS для снижения уровней нейтрализующих антител у пациентов с высокими титрами NAb для улучшения генной терапии AAV.

Эти результаты показывают, что анти-FcRn моноклональное антитело (M281) и IdeS сопоставимы по эффективности снижения уровней анти-капсидного IgG в доклинической модели на мышах. Кроме того, продемонстрировано, что M281 можно использовать с IdeS в качестве комбинированной терапии для снижения уровня анти-капсидного IgG до неопределяемого уровня. Стратегия комбинированного лечения анти-FcRn агентом, таким как анти-FcRn моноклональное антитело M281, и IdeS может быть полезна для доставки трансгенов AAV субъектам или пациентам с уровнями анти-капсидного IgG, которые могут быть слишком высокими для эффективного снижения при лечении только IdeS.

ПРИМЕР 14

Исследование на мышах с более высокой дозой вектора AAV

Исследование примера 13 проводят с более высокой дозой геномов вектора AAV на мышь, как показано в таблице 7.

Таблица 7. Группы и лечение. Группа Доза IVIg N Лечение (путь) Доза (мг/кг) Вектор (путь) Доза 1 500 мг/кг 11 PBS (в/в) - Spk1-FIX (в/в) 5×10¹⁰гв/
мышь 2 11 М281 (в/в) 20 3 11 IDES (р/о) 0,4 4 11 M281 (в/в) + IdeS (р/о) 20+0,4 5 PBS 11 PBS (в/в) - N=количество мышей в группе; в/в=внутривенно; р/о=ретроорбитально; гв=геномы вектора

Дополнительные анализы включают количественный анализ геномов вектора в печени, количественный анализ экспрессии мРНК трансгена FIX в печени и количественный анализ антигена FIX в плазме.

ПРИМЕР 15

Использование анти-FcRn агентов для очистки NAb и проведения генной терапии на основе AAV

Лечение только IdeS может не устранить высокий титр NAb AAV или может не устранить или не уменьшить количество NAb AAV в достаточной степени для эффективной трансдукции AAV. В ситуациях, когда субъект может иметь высокий уровень NAb против AAV, например, когда субъекту уже была введена доза рекомбинантного вектора AAV, такой высокий уровень NAb не может быть полностью устранен путем лечения одной IdeS. Введение анти-FcRn-агента и IdeS может более эффективно устранять NAb с высоким титром и обеспечивать эффективную трансдукцию AAV. Например, анти-FcRn агент можно вводить несколько раз с последующим введением IdeS перед введением вектора AAV (см. фигуру 12).

ПРИМЕР 16

Исследование повторной дозировки у кроликов

Белым новозеландским кроликам сначала вводят вектор AAV, несущий трансген, кодирующий белок (например, Spk2-hFIX), и затем «повторно вводят» вектор AAV, имеющий тот же капсид, но несущий трансген, кодирующий другой белок (например, Spk2-hFVIII) (фигура 13). Альтернативы включают первоначальное введение пустого вектора AAV или какого-либо другого трансгена, отличного от трансгена в «повторном введении» вектора AAV. Анти-FcRn-агент (такой как анти-FcRn-антитело M281), IdeS и комбинации анти-FcRn-агента и IdeS вводят между первой дозой AAV и второй дозой AAV.

Таблица 8. Группы и лечение. Группа Доза Spk2-hFIX
(путь) Количество кроликов Лечение (путь) Доза (мг/кг) Доза Spk2-hFVIII (путь) 1 1×10¹³гв/кролик (в/в) 11 PBS (в/в) - 1×10¹³ гв/кролика (в/в) 2 11 Анти-кроличье FcRn антитело (в/в) 30 3 11 IdeS (в/в) 1 4 11 Анти-кроличье FcRn антитело (в/в) + IdeS (в/в) 30+1 5 - 11 PBS (в/в) -

Измеряют титры нейтрализующих антител, антикапсидный IgG на 28, 29 день.

Измеряют антигена hFIX, hFVIII и геномы вектора на 58 день.

ПРИМЕР 17

Исследование анти-FcRn - яванские макаки

Это исследование предназначено для определения того, может ли комбинированное лечение анти-FcRn и IdeS активировать трансдукцию AAV в печени у NAb-положительных яванских макаков с высоким титром. На схеме исследования (фигура 14) показано еженедельное введение анти-FcRn антитела (M281) в течение трех недель до введения IdeS с последующим введением вектора AAV.

Таблица 9. Группы и лечение. Группа Количество обезьян NAb Лечение Доза (мг/кг) Вектор (вг/кг) 1 4 <1:1 PBS - Spk2-FVIII (2х10¹²⁾ 2 3 >1:1000 PBS - 3 4 IdeS 1 4 4 М281 30 5 4 М281/IdeS 30/1

Конечные точки включают забор крови между днем -21 и днем 1 для измерения фармакокинетики (ФК) и фармакодинамики (ФД) M281 и IdeS, множественные заборы крови после введения AAV для анализа комплемента, еженедельные заборы крови для клинической патологии и экспрессии трансгена, РВМС для Т-клеточного ответа, замороженные ткани для анализа биораспределения; свежие ткани для иммунологических анализов и фиксированные ткани для стандартной гистопатологии.

ПРИМЕР 18

Spk1 (SEQ ID NO:1):

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

Spk2 (SEQ ID NO:2):

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL

Последовательность IdeS, включающая N-концевой метионин и сигнальную последовательность. (SEQ ID NO:3, эталонная последовательность NCBI № WP_010922160.1):

MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

Зрелая последовательность IdeS, лишенная N-концевого метионина и сигнальной последовательности. (SEQ ID NO:4, № доступа Genbank ADF13949.1):

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO:5-18 представляют собой последовательности типовых полипептидов IdeS из таблицы C из WO 2016/128558.

SEQ ID NO:5:

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO:6:

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKRGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO:7:

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO:8:

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLREHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELDEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO:9:

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLKEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELEEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO:10:

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEKNIGAQVLGLFTLSTGQKSWNQTN

SEQ ID NO:11:

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLKEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKSELENGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO:12:

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLKEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELEEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO:13:

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQKSWNQTN

SEQ ID NO:14:

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSW

SEQ ID NO:15:

SVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO:16:

SVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO:17:

SVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQKSWNQTN

SEQ ID NO:18:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQKSWNQTNGGGHHHHHH

IgdE S. agalactiae, специфичные в отношении IgG1 человека (SEQ ID NO:19, WO2017134274):

NQNNIQETNLVEKNSEDKFIQELNRYKTEIPNFKGFNVWILGDKGYYKNLINLEEIKNIQATLKKERNEEYVFVKLNGKIAHDTTVFLMNKKHKLLKNIEEFKTITQKRLTERGKFPYDTVHSTFEIKDENFIMERLKSSGLSMGKPVDYMGVNGIPIYTKTLSIDNKFAFENNSKDSSYSSNINISEDKIKENDQKILDLIVKSGANNQNLTDEEKVIAFTKYIGEITNYDNEAYRARNVDTEYYRASDLFSVTERKLAMCVGYSVTAARAFNIMGIPSYVVSGKSPQGISHAAVRAYYNRSWHIIDITASTYWKNGNYKTTYSDFIKEYCIDGYDVYDPAKTNNRFKVKYMESNEAFENWIHNNGSKSMLFINESAALKDKKPKDDFVPVTEKEKNELIDKYKKLLSQIPENTQNPGEKNIRDYLKNEYEEILKKDNLFEHEHAEFKESLNLNESFYLQLKKEEKKPSDNLKKEEKPRENSVKERETPAENNDFVSVTEKNNLIDKYKELLSKIPENTQNPGEKNIRNYLEKEYEELLQKDKLFKHEYTEFTKSLNLNETFYSQLKEGEMKLSENPEKGETNTN

IgdE S. pseudoporcinus расщепляет IgG1 человека и IgG свиньи (SEQ ID NO:20, WO2017134274):

RENENVRQLQSENKQMKAVNLQEFSEKLKGEIAENQQFHIFKLGLNNYYIGGVRINELSDLAKNHDFIMIDNRATHNKYGVPHIIIMNKDDVIVHNQEDYNKEMAELTFAGDKPIQSDSYLPQKKRIHALFEIGLDSNRRQLLNAAGLKTPENSVIELDTFKIYSHGLAVDNKYYDEYSHFNNNTNVNITKQRFTENDNLIHNLITTSTAKDQPTDRDKVKTFVMYVANHTIYDWNAANNAVSNISDVNYYLGSDLFSITERKKAMCVGFSTTAARAFNMLGIPAYVVEGKNAQGVDHATARVYYNGKWHTIDGTGFINGNRTRSTLYTESHFRSVGEDSYQLVGLNEDIPFDRNYMKIDKVYEEWAPKQKTADLLLVNKDKSLVGLDRVAYVEPVYVDKNRQDALTQIYKKLKETMESSSKKNPSSGGFSSLLGSASSDIAKLEGSSQLTQEEYDKIHRSMTSILTFFAQLDKDAAEAFEKGNDYKNYLATTKHAQ

Полная последовательность IdeZ, доступная как эталонная последовательность NCBI № WP 014622780.1 (SEQ ID NO:21). Эта последовательность включает N-концевой метионин, за которым следует сигнальная последовательность секреции из 33 аминокислот. N-концевой метионин и сигнальная последовательность (всего 34 аминокислоты на N-конце) обычно удаляются с образованием зрелого белка IdeZ:

MKTIAYPNKPHSLSAGLLTAIAIFSLASSNITYADDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

Последовательность IdeZ без 34 аминокислот с N-конца полной последовательности (SEQ ID NO:22):

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

Последовательность гибрида IdeS/Z, имеющего N-концевую часть на основе IdeZ, без N-концевого метионина и сигнальной последовательности (всего 34 аминокислоты на N-конце) (SEQ ID NO:23):

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVFHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGDNMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFNYFKEKAFPGLSARRIGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKQELTKGKALGLSHTYANVSINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLS

SEQ ID NO:24-43 соответствуют пептидам с модификациями относительно IdeZ SEQ ID NO:22.

SEQ ID NO:24:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKEAIRTKDSQTNSQLFEYFRDKAFPYLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVKRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKEELTKGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINKHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLN

SEQ ID NO:25:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKTFNGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNEELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFKEKAFPNLSTRQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDFKEKGLKDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFDAEGNLKAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGKVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQQLS

SEQ ID NO:26:

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:27:

SVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:28:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:29:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:30:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:31:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIINNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:32:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:33:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIIRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:34:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKEAIRTKDSQTNSQLFEYFRDKAFPYLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVKRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKEELTKGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINKHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLN

SEQ ID NO:35:

SVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:36:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGADNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:37:

SVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGADNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:38:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

SEQ ID NO:39:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGENMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFNYFKEKAFPYLSAKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKQELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLS

SEQ ID NO:40:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGENMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSAKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKSELTNGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLN

SEQ ID NO:41:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKQELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDAEGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAAGKVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTS

SEQ ID NO:42:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDAEGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO:43:

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFNYFKEKAFPGLSARRIGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKQELTKGKALGLSHTYANVSINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLS

Белковая последовательность эндогликозидазы EndoS49 из Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO:44, US 9,493,752):

MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQTGKTDQQVGAKLVQEIREGKRGPLYAGYFRTWHDRASTGIDGKQQHPENTMAEVPKEVDILFVFHDHTASDSPFWSELKDSYVHKLHQQGTALVQTIGVNELNGRTGLSKDYPDTPEGNKALAAAIVKAFVTDRGVDGLDIDIEHEFTNKRTPEEDARALNVFKEIAQLIGKNGSDKSKLLIMDTTLSVENNPIFKGIAEDLDYLLRQYYGSQGGEAEVDTINSDWNQYQNYIDASQFMIGFSFFEESASKGNLWFDVNEYDPNNPEKGKDIEGTRAKKYAEWQPSTGGLKAGIFSYAIDRDGVAHVPSTYKNRTSTNLQRHEVDNISHTDYTVSRKLKTLMTEDKRYDVIDQKDIPDPALREQIIQQVGQYKGDLERYNKTLVLTGDKIQNLKGLEKLSKLQKLELRQLSNVKEITPELLPESMKKDAELVMVGMTGLEKLNLSGLNRQTLDGIDVNSITHLTSFDISHNSLDLSEKSEDRKLLMTLMEQVSNHQKITVKNTAFENQKPKGYYPQTYDTKEGHYDVDNAEHDILTDFVFGTVTKRNTFIGDEEAFAIYKEGAVDGRQYVSKDYTYEAFRKDYKGYKVHLTASNLGETVTSKVTATTDETYLVDVSDGEKVVHHMKLNIGSGAIMMENLAKGAKVIGTSGDFEQAKKIFDGEKSDRFFTWGQTNWIAFDLGEINLAKEWRLFNAETNTEIKTDSSLNVAKGRLQILKDTTIDLEKMDIKNRKEYLSNDENWTDVAQMDDAKAIFNSKLSNVLSRYWRFCVDGGASSYYPQYTELQILGQRLSNDVANTLKD

Белковая последовательность зрелой эндогликозидазы S (EndoS) из S. pyogenes. (SEQ ID NO: 45, 15/328,879, патенты США №№ 8,889,128 и 9,707,279):

EEKTVQVQKGLPSIDSLHYLSENSKKEFKEELSKAGQESQKVKEILAKAQQADKQAQELAKMKIPEKIPMKPLHGPLYGGYFRTWHDKTSDPTEKDKVNSMGELPKEVDLAFIFHDWTKDYSLFWKELATKHVPKLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDNSGIAEDTSKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDVEHDSIPKVDKKEDTAGVERSIQVFEEIGKLIGPKGVDKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYINLLLVQVYGSQGEKGGWEPVSNRPEKTMEERWQGYSKYIRPEQYMIGFSFYEENAQEGNLWYDINSRKDEDKANGINTDITGTRAERYARWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKYAKQKEFKDATDNIFHSDYSVSKALKTVMLKDKSYDLIDEKDFPDKALREAVMAQVGTRKGDLERFNGTLRLDNPAIQSLEGLNKFKKLAQLDLIGLSRITKLDRSVLPANMKPGKDTLETVLETYKKDNKEEPATIPPVSLKVSGLTGLKELDLSGFDRETLAGLDAATLTSLEKVDISGNKLDLAPGTENRQIFDTMLSTISNHVGSNEQTVKFDKQKPTGHYPDTYGKTSLRLPVANEKVDLQSQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQNHKIAGRSFVDSNYHYNNFKVSYENYTVKVTDSTLGTTTDKTLATDKEETYKVDFFSPADKTKAVHTAKVIVGDEKTMMVNLAEGATVIGGSADPVNARKVFDGQLGSETDNISLGWDSKQSIIFKLKEDGLIKHWRFFNDSARNPETTNKPIQEASLQIFNIKDYNLDNLLENPNKFDDEKYWITVDTYSAQGERATAFSNTLNNITSKYWRVVFDTKGDRYSSPVVPELQILGYPLPNADTIMKTVTTAKELSQQKDKFSQKMLDELKIKEMALETSLNSKIFDVTAINANAGVLKDCIEKRQLLKK

Полная последовательность, включающая сигнал секреции эндогликозидазы EndoS из Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO:46, AAK00850.1):

MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQVQKGLPSIDSLHYLSENSKKEFKEELSKAGQESQKVKEILAKAQQADKQAQELAKMKIPEKIPMKPLHGPLYGGYFRTWHDKTSDPTEKDKVNSMGELPKEVDLAFIFHDWTKDYSLFWKELATKHVPKLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDNSGIAEDTSKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDVEHDSIPKVDKKEDTAGVERSIQVFEEIGKLIGPKGVDKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYINLLLVQVYGSQGEKGGWEPVSNRPEKTMEERWQGYSKYIRPEQYMIGFSFYEENAQEGNLWYDINSRKDEDKANGINTDITGTRAERYARWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKYAKQKEFKDATDNIFHSDYSVSKALKTVMLKDKSYDLIDEKDFPDKALREAVMAQVGTRKGDLERFNGTLRLDNPAIQSLEGLNKFKKLAQLDLIGLSRITKLDRSVLPANMKPGKDTLETVLETYKKDNKEEPATIPPVSLKVSGLTGLKELDLSGFDRETLAGLDAATLTSLEKVDISGNKLDLAPGTENRQIFDTMLSTISNHVGSNEQTVKFDKQKPTGHYPDTYGKTSLRLPVANEKVDLQSQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQNHKIAGRSFVDSNYHYNNFKVSYENYTVKVTDSTLGTTTDKTLATDKEETYKVDFFSPADKTKAVHTAKVIVGDEKTMMVNLAEGATVIGGSADPVNARKVFDGQLGSETDNISLGWDSKQSIIFKLKEDGLIKHWRFFNDSARNPETTNKPIQEASLQIFNIKDYNLDNLLENPNKFDDEKYWITVDTYSAQGERATAFSNTLNNITSKYWRVVFDTKGDRYSSPVVPELQILGYPLPNADTIMKTVTTAKELSQQKDKFSQKMLDELKIKEMALETSLNSKIFDVTAINANAGVLKDCIEKRQLLKK

Белковая последовательность EndoS, выделенная из S. pyogenes AP1, включая сигнальную последовательность. (SEQ ID NO:47, патенты США №№ 8,889,128 и 9,707,279):

MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQVQKGLPSIDSLHYLSENSKKEFKEELSKAGQESQKVKEILAKAQQADKQAQELAKMKIPEKIPMKPLHGPLYGGYFRTWHDKTSDPTEKDKVNSMGELPKEVDLAFIFHDWTKDYSLFWKELATKHVPKLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDNSGIAEDTSKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDVEHDSIPKVDKKEDTAGVERSIQVFEEIGKLIGPKGVDKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYINLLLVQVYGSQGEKGGWEPVSNRPEKTMEERWQGYSKYIRPEQYMIGFSFYEENAQEGNLWYDINSRKDEDKANGINTDITGTRAERYARWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKYAKQKEFKDATDNIFHSDYSVSKALKTVMLKDKSYDLIDEKDFPDKALREAVMAQVGTRKGDLERFNGTLRLDNPAIQSLEGLNKFKKLAQLDLIGLSRITKLDRSVLPANMKPGKDTLETVLETYKKDNKEEPATIPPVSLKVSGLTGLKELDLSGFDRETLAGLDAATLTSLEKVDISGNKLDLAPGTENRQIFDTMLSTISNHVGSNEQTVKFDKQKPTGHYPDTYGKTSLRLPVANEKVDLQSQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQNHKIAGRSFVDSNYHYNNFKVSYENYTVKVTDSTLGTTTDKTLATDKEETYKVDFFSPADKTKAVHTAKVIVGDEKTMMVNLAEGATVIGGSADPVNARKVFDGQLGSETDNISLGWDSKQSIIFKLKEDGLIKHWRFFNDSARNPETTNKPIQEASLQIFNIKDYNLDNLLENPNKFDDEKYWITVDTYSAQGERATAFSNTLNNITSKYWRVVFDTKGDRYSSPVVPELQILGYPLPNADTIMKTVTTAKELSQQKDKFSQKMLDELKIKEMALETSLNSKIFDVTAINANAGVLKDCIEKRQLLKK

Зрелая последовательность IdeS с добавленным N-концевым метионином (SEQ ID NO:48):

MDSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

ПРИМЕР 19

SEQ ID NO для анти-FcRn антител Аминокислотная последовательность Описание
(часть M281 антитела) SEQ ID NO:49 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Gly Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Ile Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser VL цепь SEQ ID NO:50 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Gly Ala Ser Gly Ser Gln Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ala Ile Gly Asp Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly VH цепь SEQ ID NO:51 Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser VL CDR1 SEQ ID NO:52 Gly Asp Ser Glu Arg Pro Ser VL CDR2 SEQ ID NO:53 Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Ile Tyr Val VL CDR3 SEQ ID NO:54 Thr Tyr Ala Met Gly VH CDR1 SEQ ID NO:55 Ser Ile Gly Ala Ser Gly Ser Gln Thr Arg Tyr Ala Asp Ser VH CDR2 SEQ ID NO:56 Leu Ala Ile Gly Asp Ser Tyr VH CDR3

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SPARK THERAPEUTICS, INC.

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИЛИ УСИЛЕНИЯ ТРАНСДУКЦИИ

ВЕКТОРОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ И ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ИЛИ СНИЖЕНИЯ

ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

<130> 023637-0559397

<140> PCT/US2021/014770

<141> 2021-01-22

<150> 62/964,565

<151> 2020-01-22

<160> 57

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 738

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 1

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala

580 585 590

Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 2

<211> 736

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 2

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr

435 440 445

Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser

450 455 460

Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln

565 570 575

Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr

580 585 590

Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu

725 730 735

<210> 3

<211> 339

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus pyogenes

<400> 3

Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val

1 5 10 15

Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe

20 25 30

Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val

35 40 45

Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln

50 55 60

Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala

85 90 95

Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp

100 105 110

Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn

115 120 125

Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys

130 135 140

Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala

145 150 155 160

Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val

165 170 175

Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly

180 185 190

Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe

195 200 205

Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg

210 215 220

His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys

225 230 235 240

Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala

245 250 255

Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp

260 265 270

Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn

275 280 285

Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly

290 295 300

Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala

305 310 315 320

Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn

325 330 335

Gln Thr Asn

<210> 4

<211> 310

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus pyogenes

<400> 4

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 5

<211> 310

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 5

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 6

<211> 310

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 6

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Lys Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Arg Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 7

<211> 310

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 7

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Lys Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Lys Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 8

<211> 310

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 8

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Arg Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Lys Glu Leu Asp Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 9

<211> 310

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 9

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Arg Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Lys Glu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Lys Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 10

<211> 310

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 10

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Glu Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Glu Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Lys Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Lys

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 11

<211> 310

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 11

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Arg Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Ser Glu Leu Glu Asn Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Lys Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 12

<211> 310

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 12

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Arg Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Lys Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Lys Glu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 13

<211> 310

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 13

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Glu Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Lys Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Glu Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Lys

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 14

<211> 306

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 14

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp

290 295 300

Ser Trp

305

<210> 15

<211> 290

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 15

Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln Gly

1 5 10 15

Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr Asp

20 25 30

Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala Ala

35 40 45

Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp Gln

50 55 60

Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn Phe

65 70 75 80

Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys Asn

85 90 95

His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala Phe

100 105 110

Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val Ile

115 120 125

Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly Pro

130 135 140

Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe Asp

145 150 155 160

Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg His

165 170 175

Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys Lys

180 185 190

Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn

195 200 205

Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp Ser

210 215 220

Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn Ala

225 230 235 240

Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly Lys

245 250 255

Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala Gln

260 265 270

Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn Gln

275 280 285

Thr Asn

290

<210> 16

<211> 290

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 16

Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln Gly

1 5 10 15

Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr Asp

20 25 30

Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala Ala

35 40 45

Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp Gln

50 55 60

Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn Phe

65 70 75 80

Lys Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys Asn

85 90 95

His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala Phe

100 105 110

Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val Ile

115 120 125

Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly Pro

130 135 140

Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe Asp

145 150 155 160

Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg His

165 170 175

Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys Lys

180 185 190

Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn

195 200 205

Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp Ser

210 215 220

Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn Ala

225 230 235 240

Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly Lys

245 250 255

Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala Gln

260 265 270

Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn Gln

275 280 285

Thr Asn

290

<210> 17

<211> 290

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 17

Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln Gly

1 5 10 15

Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr Asp

20 25 30

Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala Ala

35 40 45

Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp Gln

50 55 60

Ile Glu Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn Phe

65 70 75 80

Lys Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Lys Ala Ile Asp Thr Lys Asn

85 90 95

His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala Phe

100 105 110

Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val Ile

115 120 125

Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly Pro

130 135 140

Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe Asp

145 150 155 160

Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg His

165 170 175

Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys Glu

180 185 190

Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn

195 200 205

Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp Ser

210 215 220

Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn Ala

225 230 235 240

Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly Lys

245 250 255

Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala Gln

260 265 270

Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Lys Ser Trp Asn Gln

275 280 285

Thr Asn

290

<210> 18

<211> 319

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 18

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Glu Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Lys Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Lys Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Glu Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Lys

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn Gly Gly Gly His His His His His His

305 310 315

<210> 19

<211> 586

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus agalactiae

<400> 19

Asn Gln Asn Asn Ile Gln Glu Thr Asn Leu Val Glu Lys Asn Ser Glu

1 5 10 15

Asp Lys Phe Ile Gln Glu Leu Asn Arg Tyr Lys Thr Glu Ile Pro Asn

20 25 30

Phe Lys Gly Phe Asn Val Trp Ile Leu Gly Asp Lys Gly Tyr Tyr Lys

35 40 45

Asn Leu Ile Asn Leu Glu Glu Ile Lys Asn Ile Gln Ala Thr Leu Lys

50 55 60

Lys Glu Arg Asn Glu Glu Tyr Val Phe Val Lys Leu Asn Gly Lys Ile

65 70 75 80

Ala His Asp Thr Thr Val Phe Leu Met Asn Lys Lys His Lys Leu Leu

85 90 95

Lys Asn Ile Glu Glu Phe Lys Thr Ile Thr Gln Lys Arg Leu Thr Glu

100 105 110

Arg Gly Lys Phe Pro Tyr Asp Thr Val His Ser Thr Phe Glu Ile Lys

115 120 125

Asp Glu Asn Phe Ile Met Glu Arg Leu Lys Ser Ser Gly Leu Ser Met

130 135 140

Gly Lys Pro Val Asp Tyr Met Gly Val Asn Gly Ile Pro Ile Tyr Thr

145 150 155 160

Lys Thr Leu Ser Ile Asp Asn Lys Phe Ala Phe Glu Asn Asn Ser Lys

165 170 175

Asp Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Ile Asn Ile Ser Glu Asp Lys Ile Lys

180 185 190

Glu Asn Asp Gln Lys Ile Leu Asp Leu Ile Val Lys Ser Gly Ala Asn

195 200 205

Asn Gln Asn Leu Thr Asp Glu Glu Lys Val Ile Ala Phe Thr Lys Tyr

210 215 220

Ile Gly Glu Ile Thr Asn Tyr Asp Asn Glu Ala Tyr Arg Ala Arg Asn

225 230 235 240

Val Asp Thr Glu Tyr Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Phe Ser Val Thr Glu

245 250 255

Arg Lys Leu Ala Met Cys Val Gly Tyr Ser Val Thr Ala Ala Arg Ala

260 265 270

Phe Asn Ile Met Gly Ile Pro Ser Tyr Val Val Ser Gly Lys Ser Pro

275 280 285

Gln Gly Ile Ser His Ala Ala Val Arg Ala Tyr Tyr Asn Arg Ser Trp

290 295 300

His Ile Ile Asp Ile Thr Ala Ser Thr Tyr Trp Lys Asn Gly Asn Tyr

305 310 315 320

Lys Thr Thr Tyr Ser Asp Phe Ile Lys Glu Tyr Cys Ile Asp Gly Tyr

325 330 335

Asp Val Tyr Asp Pro Ala Lys Thr Asn Asn Arg Phe Lys Val Lys Tyr

340 345 350

Met Glu Ser Asn Glu Ala Phe Glu Asn Trp Ile His Asn Asn Gly Ser

355 360 365

Lys Ser Met Leu Phe Ile Asn Glu Ser Ala Ala Leu Lys Asp Lys Lys

370 375 380

Pro Lys Asp Asp Phe Val Pro Val Thr Glu Lys Glu Lys Asn Glu Leu

385 390 395 400

Ile Asp Lys Tyr Lys Lys Leu Leu Ser Gln Ile Pro Glu Asn Thr Gln

405 410 415

Asn Pro Gly Glu Lys Asn Ile Arg Asp Tyr Leu Lys Asn Glu Tyr Glu

420 425 430

Glu Ile Leu Lys Lys Asp Asn Leu Phe Glu His Glu His Ala Glu Phe

435 440 445

Lys Glu Ser Leu Asn Leu Asn Glu Ser Phe Tyr Leu Gln Leu Lys Lys

450 455 460

Glu Glu Lys Lys Pro Ser Asp Asn Leu Lys Lys Glu Glu Lys Pro Arg

465 470 475 480

Glu Asn Ser Val Lys Glu Arg Glu Thr Pro Ala Glu Asn Asn Asp Phe

485 490 495

Val Ser Val Thr Glu Lys Asn Asn Leu Ile Asp Lys Tyr Lys Glu Leu

500 505 510

Leu Ser Lys Ile Pro Glu Asn Thr Gln Asn Pro Gly Glu Lys Asn Ile

515 520 525

Arg Asn Tyr Leu Glu Lys Glu Tyr Glu Glu Leu Leu Gln Lys Asp Lys

530 535 540

Leu Phe Lys His Glu Tyr Thr Glu Phe Thr Lys Ser Leu Asn Leu Asn

545 550 555 560

Glu Thr Phe Tyr Ser Gln Leu Lys Glu Gly Glu Met Lys Leu Ser Glu

565 570 575

Asn Pro Glu Lys Gly Glu Thr Asn Thr Asn

580 585

<210> 20

<211> 497

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus pseudoporcinus

<400> 20

Arg Glu Asn Glu Asn Val Arg Gln Leu Gln Ser Glu Asn Lys Gln Met

1 5 10 15

Lys Ala Val Asn Leu Gln Glu Phe Ser Glu Lys Leu Lys Gly Glu Ile

20 25 30

Ala Glu Asn Gln Gln Phe His Ile Phe Lys Leu Gly Leu Asn Asn Tyr

35 40 45

Tyr Ile Gly Gly Val Arg Ile Asn Glu Leu Ser Asp Leu Ala Lys Asn

50 55 60

His Asp Phe Ile Met Ile Asp Asn Arg Ala Thr His Asn Lys Tyr Gly

65 70 75 80

Val Pro His Ile Ile Ile Met Asn Lys Asp Asp Val Ile Val His Asn

85 90 95

Gln Glu Asp Tyr Asn Lys Glu Met Ala Glu Leu Thr Phe Ala Gly Asp

100 105 110

Lys Pro Ile Gln Ser Asp Ser Tyr Leu Pro Gln Lys Lys Arg Ile His

115 120 125

Ala Leu Phe Glu Ile Gly Leu Asp Ser Asn Arg Arg Gln Leu Leu Asn

130 135 140

Ala Ala Gly Leu Lys Thr Pro Glu Asn Ser Val Ile Glu Leu Asp Thr

145 150 155 160

Phe Lys Ile Tyr Ser His Gly Leu Ala Val Asp Asn Lys Tyr Tyr Asp

165 170 175

Glu Tyr Ser His Phe Asn Asn Asn Thr Asn Val Asn Ile Thr Lys Gln

180 185 190

Arg Phe Thr Glu Asn Asp Asn Leu Ile His Asn Leu Ile Thr Thr Ser

195 200 205

Thr Ala Lys Asp Gln Pro Thr Asp Arg Asp Lys Val Lys Thr Phe Val

210 215 220

Met Tyr Val Ala Asn His Thr Ile Tyr Asp Trp Asn Ala Ala Asn Asn

225 230 235 240

Ala Val Ser Asn Ile Ser Asp Val Asn Tyr Tyr Leu Gly Ser Asp Leu

245 250 255

Phe Ser Ile Thr Glu Arg Lys Lys Ala Met Cys Val Gly Phe Ser Thr

260 265 270

Thr Ala Ala Arg Ala Phe Asn Met Leu Gly Ile Pro Ala Tyr Val Val

275 280 285

Glu Gly Lys Asn Ala Gln Gly Val Asp His Ala Thr Ala Arg Val Tyr

290 295 300

Tyr Asn Gly Lys Trp His Thr Ile Asp Gly Thr Gly Phe Ile Asn Gly

305 310 315 320

Asn Arg Thr Arg Ser Thr Leu Tyr Thr Glu Ser His Phe Arg Ser Val

325 330 335

Gly Glu Asp Ser Tyr Gln Leu Val Gly Leu Asn Glu Asp Ile Pro Phe

340 345 350

Asp Arg Asn Tyr Met Lys Ile Asp Lys Val Tyr Glu Glu Trp Ala Pro

355 360 365

Lys Gln Lys Thr Ala Asp Leu Leu Leu Val Asn Lys Asp Lys Ser Leu

370 375 380

Val Gly Leu Asp Arg Val Ala Tyr Val Glu Pro Val Tyr Val Asp Lys

385 390 395 400

Asn Arg Gln Asp Ala Leu Thr Gln Ile Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Thr

405 410 415

Met Glu Ser Ser Ser Lys Lys Asn Pro Ser Ser Gly Gly Phe Ser Ser

420 425 430

Leu Leu Gly Ser Ala Ser Ser Asp Ile Ala Lys Leu Glu Gly Ser Ser

435 440 445

Gln Leu Thr Gln Glu Glu Tyr Asp Lys Ile His Arg Ser Met Thr Ser

450 455 460

Ile Leu Thr Phe Phe Ala Gln Leu Asp Lys Asp Ala Ala Glu Ala Phe

465 470 475 480

Glu Lys Gly Asn Asp Tyr Lys Asn Tyr Leu Ala Thr Thr Lys His Ala

485 490 495

Gln

<210> 21

<211> 349

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus equi

<400> 21

Met Lys Thr Ile Ala Tyr Pro Asn Lys Pro His Ser Leu Ser Ala Gly

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Ile Ala Ile Phe Ser Leu Ala Ser Ser Asn Ile Thr

20 25 30

Tyr Ala Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu

35 40 45

Val Pro His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu

50 55 60

Thr Pro Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro

65 70 75 80

Tyr Leu Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly

85 90 95

Lys Asp Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His

100 105 110

Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys

115 120 125

His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp

130 135 140

Leu Lys Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu

145 150 155 160

Phe Asn Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln

165 170 175

Leu Gly Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr

180 185 190

Tyr Leu Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr

195 200 205

Gln Asp Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg

210 215 220

Gly Asp Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys

225 230 235 240

Gly Leu Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly

245 250 255

Arg Ala Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His

260 265 270

Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu

275 280 285

Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys

290 295 300

Lys Tyr Phe Val Gly Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala

305 310 315 320

Lys Lys Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe

325 330 335

Thr Leu Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

340 345

<210> 22

<211> 315

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus equi

<400> 22

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro

20 25 30

Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu

35 40 45

Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp

50 55 60

Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp

65 70 75 80

Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro

85 90 95

Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys

100 105 110

Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn

115 120 125

Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly

130 135 140

Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu

145 150 155 160

Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp

165 170 175

Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp

180 185 190

Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala

210 215 220

Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile

225 230 235 240

Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile

245 250 255

Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr

260 265 270

Phe Val Gly Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys

275 280 285

Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu

290 295 300

Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

305 310 315

<210> 23

<211> 313

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 23

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro

20 25 30

Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val

35 40 45

Ala Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp

50 55 60

Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp

65 70 75 80

Phe Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro

85 90 95

Glu Lys Gln Lys Ile Asn Phe Asn Gly Asp Asn Met Phe Asp Val Lys

100 105 110

Lys Ala Ile Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Asn

115 120 125

Tyr Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Gly Leu Ser Ala Arg Arg Ile Gly

130 135 140

Val Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu

145 150 155 160

Ser Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp

165 170 175

Pro Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser

180 185 190

Lys Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Asn Lys Asn Leu Asn Asp

195 200 205

Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly

210 215 220

Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Asn His Val Ile Asn Leu

225 230 235 240

Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val

245 250 255

Thr Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val

260 265 270

Gly Val Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu

275 280 285

Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr

290 295 300

Gly Gln Asp Ser Trp Gln Lys Leu Ser

305 310

<210> 24

<211> 315

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 24

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro

20 25 30

Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu

35 40 45

Ala Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp

50 55 60

Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp

65 70 75 80

Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro

85 90 95

Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Arg Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys

100 105 110

Glu Ala Ile Arg Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Glu

115 120 125

Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly

130 135 140

Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu

145 150 155 160

Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Lys Arg Pro Tyr Gln Asp

165 170 175

Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn

180 185 190

Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Glu Glu Leu Thr Lys Gly Arg Ala

210 215 220

Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile

225 230 235 240

Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile

245 250 255

Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr

260 265 270

Phe Val Gly Ile Asn Lys His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys

275 280 285

Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu

290 295 300

Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Asn

305 310 315

<210> 25

<211> 315

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 25

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro

20 25 30

Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu

35 40 45

Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp

50 55 60

Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp

65 70 75 80

Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro

85 90 95

Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Glu Glu Leu Phe Asp Leu Lys

100 105 110

Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn

115 120 125

Tyr Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Thr Arg Gln Leu Gly

130 135 140

Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu

145 150 155 160

Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp

165 170 175

Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn

180 185 190

Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Gly Leu

195 200 205

Lys Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala

210 215 220

Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile

225 230 235 240

Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp Ala Glu Gly Asn Leu Lys Ala Ile

245 250 255

Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr

260 265 270

Phe Val Gly Ile Asn Ala His Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys

275 280 285

Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu

290 295 300

Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Gln Leu Ser

305 310 315

<210> 26

<211> 315

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 26

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro

20 25 30

Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu

35 40 45

Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp

50 55 60

Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp

65 70 75 80

Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro

85 90 95

Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys

100 105 110

Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn

115 120 125

Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly

130 135 140

Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu

145 150 155 160

Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp

165 170 175

Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp

180 185 190

Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala

210 215 220

Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile

225 230 235 240

Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile

245 250 255

Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr

260 265 270

Phe Val Gly Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys

275 280 285

Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu

290 295 300

Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

305 310 315

<210> 27

<211> 295

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 27

Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro Glu Gln Phe Arg

1 5 10 15

Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln Gly

20 25 30

Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu Cys

35 40 45

Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn

50 55 60

Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile Asp

85 90 95

Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg Asp

100 105 110

Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro Asp

115 120 125

Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe Lys

130 135 140

Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys Arg

145 150 155 160

Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Thr Thr Leu

165 170 175

Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile Ser

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu Ser

195 200 205

His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp Gly

210 215 220

Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr Asp

225 230 235 240

Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Ile

245 250 255

Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly Glu

260 265 270

Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly Lys

275 280 285

Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

290 295

<210> 28

<211> 314

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 28

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro

20 25 30

Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala

35 40 45

His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn

50 55 60

Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe

65 70 75 80

Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu

85 90 95

Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala

100 105 110

Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr

115 120 125

Phe Arg Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val

130 135 140

Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn

145 150 155 160

Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys

165 170 175

Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln

180 185 190

Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn

195 200 205

Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu

210 215 220

Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn

225 230 235 240

Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr

245 250 255

Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe

260 265 270

Val Gly Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile

275 280 285

Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser

290 295 300

Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

305 310

<210> 29

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 29

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg

115 120 125

Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro

130 135 140

Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe

145 150 155 160

Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys

165 170 175

Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Thr Thr

180 185 190

Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile

195 200 205

Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu

210 215 220

Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr

245 250 255

Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly

290 295 300

Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

305 310

<210> 30

<211> 313

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 30

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln

20 25 30

Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His

35 40 45

Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu

50 55 60

Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp

65 70 75 80

Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys

85 90 95

Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala

100 105 110

Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe

115 120 125

Arg Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met

130 135 140

Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val

145 150 155 160

Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp

165 170 175

Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Thr

180 185 190

Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp

195 200 205

Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala

210 215 220

Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu

225 230 235 240

Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val

245 250 255

Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val

260 265 270

Gly Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu

275 280 285

Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser

290 295 300

Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

305 310

<210> 31

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 31

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Ile Ile Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg

115 120 125

Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro

130 135 140

Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe

145 150 155 160

Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys

165 170 175

Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Thr Thr

180 185 190

Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile

195 200 205

Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu

210 215 220

Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr

245 250 255

Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly

290 295 300

Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

305 310

<210> 32

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 32

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Ile Phe Arg Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg

115 120 125

Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro

130 135 140

Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe

145 150 155 160

Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys

165 170 175

Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Thr Thr

180 185 190

Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile

195 200 205

Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu

210 215 220

Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr

245 250 255

Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly

290 295 300

Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

305 310

<210> 33

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 33

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Ile Ile Arg Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg

115 120 125

Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro

130 135 140

Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe

145 150 155 160

Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys

165 170 175

Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Thr Thr

180 185 190

Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile

195 200 205

Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu

210 215 220

Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr

245 250 255

Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly

290 295 300

Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

305 310

<210> 34

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 34

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Ile Phe Arg Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Arg Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Glu Tyr Phe Arg

115 120 125

Asp Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro

130 135 140

Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe

145 150 155 160

Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Lys Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys

165 170 175

Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Thr Thr

180 185 190

Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile

195 200 205

Ser Thr Ile Ile Lys Glu Glu Leu Thr Lys Gly Arg Ala Leu Ala Leu

210 215 220

Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr

245 250 255

Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Ile Asn Lys His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly

290 295 300

Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Asn

305 310

<210> 35

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 35

Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln Phe Thr Gln Gly

1 5 10 15

Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp

20 25 30

Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala

35 40 45

Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu

50 55 60

Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe

65 70 75 80

Arg Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp

85 90 95

Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe

100 105 110

Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro Asp Leu Val Leu

115 120 125

Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser

130 135 140

Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile

145 150 155 160

Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala

165 170 175

Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr

195 200 205

Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe

210 215 220

Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala

225 230 235 240

Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Ile Asn Ala His

245 250 255

Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly

260 265 270

Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp

275 280 285

Gln Lys Leu Ser

290

<210> 36

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 36

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Ala Asp Asn Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Ile Phe Arg Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg

115 120 125

Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro

130 135 140

Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe

145 150 155 160

Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys

165 170 175

Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Thr Thr

180 185 190

Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile

195 200 205

Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu

210 215 220

Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr

245 250 255

Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly

290 295 300

Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

305 310

<210> 37

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 37

Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln Phe Thr Gln Gly

1 5 10 15

Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp

20 25 30

Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Ala Asp Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala

35 40 45

Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu

50 55 60

Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe

65 70 75 80

Arg Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp

85 90 95

Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe

100 105 110

Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro Asp Leu Val Leu

115 120 125

Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser

130 135 140

Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile

145 150 155 160

Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala

165 170 175

Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr

195 200 205

Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe

210 215 220

Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala

225 230 235 240

Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Ile Asn Ala His

245 250 255

Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly

260 265 270

Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp

275 280 285

Gln Lys Leu Ser

290

<210> 38

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 38

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Ile Phe Arg Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg

115 120 125

Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro

130 135 140

Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe

145 150 155 160

Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys

165 170 175

Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Thr Thr

180 185 190

Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile

195 200 205

Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu

210 215 220

Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr

245 250 255

Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly

290 295 300

Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser

305 310

<210> 39

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 39

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro

20 25 30

Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala

35 40 45

Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn

50 55 60

Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe

65 70 75 80

Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu

85 90 95

Lys Gln Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Asn Met Phe Asp Val Lys Lys

100 105 110

Ala Ile Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Asn Tyr

115 120 125

Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Lys His Leu Gly Val

130 135 140

Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser

145 150 155 160

Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro

165 170 175

Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys

180 185 190

Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Asn Lys Asn Leu Asn Asp Ile

195 200 205

Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu

210 215 220

Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr

245 250 255

Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Val Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly

290 295 300

Gln Asp Ser Trp Gln Lys Leu Ser

305 310

<210> 40

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 40

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro

20 25 30

Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala

35 40 45

Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn

50 55 60

Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe

65 70 75 80

Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu

85 90 95

Lys Gln Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Asn Met Phe Asp Val Lys Glu

100 105 110

Ala Ile Arg Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr

115 120 125

Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Lys His Leu Gly Val

130 135 140

Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser

145 150 155 160

Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Lys Gly Ser Lys Asp Pro

165 170 175

Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys

180 185 190

Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Asn Lys Asn Leu Asn Asp Ile

195 200 205

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Glu Leu Thr Asn Gly Lys Ala Leu Gly Leu

210 215 220

Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr

245 250 255

Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Val Asn Lys His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly

290 295 300

Gln Asp Ser Trp Gln Lys Leu Asn

305 310

<210> 41

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 41

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro

20 25 30

Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala

35 40 45

Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp

50 55 60

Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe

65 70 75 80

Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu

85 90 95

Lys Gln Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu

100 105 110

Ala Ile Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr

115 120 125

Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val

130 135 140

Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser

145 150 155 160

Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro

165 170 175

Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys

180 185 190

Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile

195 200 205

Ser Asp Leu Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu

210 215 220

Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Gly Ala Asp Phe Asp Ala Glu Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr

245 250 255

Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Val Asn Ala Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly

290 295 300

Gln Asp Ser Trp Asn Gln Thr Ser

305 310

<210> 42

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 42

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro

20 25 30

Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala

35 40 45

Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp

50 55 60

Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe

65 70 75 80

Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu

85 90 95

Lys Gln Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu

100 105 110

Ala Ile Arg Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr

115 120 125

Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val

130 135 140

Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser

145 150 155 160

Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Lys Gly Ser Lys Asp Pro

165 170 175

Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys

180 185 190

Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile

195 200 205

Ser Asp Leu Ile Lys Glu Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu

210 215 220

Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Gly Ala Asp Phe Asp Ala Glu Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr

245 250 255

Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Val Asn Lys Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly

290 295 300

Gln Asp Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 43

<211> 310

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 43

Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro

1 5 10 15

His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Lys Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Asn Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Gly Leu Ser Ala Arg Arg Ile Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Asn Lys Asn Leu Asn Asp Ile Ser Thr

195 200 205

Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly Glu Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp

290 295 300

Ser Trp Gln Lys Leu Ser

305 310

<210> 44

<211> 843

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus pyogenes

<400> 44

Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala

1 5 10 15

Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn

20 25 30

Thr Val Lys Ala Glu Glu Lys Thr Val Gln Thr Gly Lys Thr Asp Gln

35 40 45

Gln Val Gly Ala Lys Leu Val Gln Glu Ile Arg Glu Gly Lys Arg Gly

50 55 60

Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Arg Ala Ser Thr

65 70 75 80

Gly Ile Asp Gly Lys Gln Gln His Pro Glu Asn Thr Met Ala Glu Val

85 90 95

Pro Lys Glu Val Asp Ile Leu Phe Val Phe His Asp His Thr Ala Ser

100 105 110

Asp Ser Pro Phe Trp Ser Glu Leu Lys Asp Ser Tyr Val His Lys Leu

115 120 125

His Gln Gln Gly Thr Ala Leu Val Gln Thr Ile Gly Val Asn Glu Leu

130 135 140

Asn Gly Arg Thr Gly Leu Ser Lys Asp Tyr Pro Asp Thr Pro Glu Gly

145 150 155 160

Asn Lys Ala Leu Ala Ala Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Thr Asp Arg

165 170 175

Gly Val Asp Gly Leu Asp Ile Asp Ile Glu His Glu Phe Thr Asn Lys

180 185 190

Arg Thr Pro Glu Glu Asp Ala Arg Ala Leu Asn Val Phe Lys Glu Ile

195 200 205

Ala Gln Leu Ile Gly Lys Asn Gly Ser Asp Lys Ser Lys Leu Leu Ile

210 215 220

Met Asp Thr Thr Leu Ser Val Glu Asn Asn Pro Ile Phe Lys Gly Ile

225 230 235 240

Ala Glu Asp Leu Asp Tyr Leu Leu Arg Gln Tyr Tyr Gly Ser Gln Gly

245 250 255

Gly Glu Ala Glu Val Asp Thr Ile Asn Ser Asp Trp Asn Gln Tyr Gln

260 265 270

Asn Tyr Ile Asp Ala Ser Gln Phe Met Ile Gly Phe Ser Phe Phe Glu

275 280 285

Glu Ser Ala Ser Lys Gly Asn Leu Trp Phe Asp Val Asn Glu Tyr Asp

290 295 300

Pro Asn Asn Pro Glu Lys Gly Lys Asp Ile Glu Gly Thr Arg Ala Lys

305 310 315 320

Lys Tyr Ala Glu Trp Gln Pro Ser Thr Gly Gly Leu Lys Ala Gly Ile

325 330 335

Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Val Pro Ser Thr

340 345 350

Tyr Lys Asn Arg Thr Ser Thr Asn Leu Gln Arg His Glu Val Asp Asn

355 360 365

Ile Ser His Thr Asp Tyr Thr Val Ser Arg Lys Leu Lys Thr Leu Met

370 375 380

Thr Glu Asp Lys Arg Tyr Asp Val Ile Asp Gln Lys Asp Ile Pro Asp

385 390 395 400

Pro Ala Leu Arg Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val Gly Gln Tyr Lys Gly

405 410 415

Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Thr Leu Val Leu Thr Gly Asp Lys Ile

420 425 430

Gln Asn Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Ser Lys Leu Gln Lys Leu Glu

435 440 445

Leu Arg Gln Leu Ser Asn Val Lys Glu Ile Thr Pro Glu Leu Leu Pro

450 455 460

Glu Ser Met Lys Lys Asp Ala Glu Leu Val Met Val Gly Met Thr Gly

465 470 475 480

Leu Glu Lys Leu Asn Leu Ser Gly Leu Asn Arg Gln Thr Leu Asp Gly

485 490 495

Ile Asp Val Asn Ser Ile Thr His Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ser His

500 505 510

Asn Ser Leu Asp Leu Ser Glu Lys Ser Glu Asp Arg Lys Leu Leu Met

515 520 525

Thr Leu Met Glu Gln Val Ser Asn His Gln Lys Ile Thr Val Lys Asn

530 535 540

Thr Ala Phe Glu Asn Gln Lys Pro Lys Gly Tyr Tyr Pro Gln Thr Tyr

545 550 555 560

Asp Thr Lys Glu Gly His Tyr Asp Val Asp Asn Ala Glu His Asp Ile

565 570 575

Leu Thr Asp Phe Val Phe Gly Thr Val Thr Lys Arg Asn Thr Phe Ile

580 585 590

Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly

595 600 605

Arg Gln Tyr Val Ser Lys Asp Tyr Thr Tyr Glu Ala Phe Arg Lys Asp

610 615 620

Tyr Lys Gly Tyr Lys Val His Leu Thr Ala Ser Asn Leu Gly Glu Thr

625 630 635 640

Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp

645 650 655

Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly

660 665 670

Ser Gly Ala Ile Met Met Glu Asn Leu Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile

675 680 685

Gly Thr Ser Gly Asp Phe Glu Gln Ala Lys Lys Ile Phe Asp Gly Glu

690 695 700

Lys Ser Asp Arg Phe Phe Thr Trp Gly Gln Thr Asn Trp Ile Ala Phe

705 710 715 720

Asp Leu Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Glu Trp Arg Leu Phe Asn Ala

725 730 735

Glu Thr Asn Thr Glu Ile Lys Thr Asp Ser Ser Leu Asn Val Ala Lys

740 745 750

Gly Arg Leu Gln Ile Leu Lys Asp Thr Thr Ile Asp Leu Glu Lys Met

755 760 765

Asp Ile Lys Asn Arg Lys Glu Tyr Leu Ser Asn Asp Glu Asn Trp Thr

770 775 780

Asp Val Ala Gln Met Asp Asp Ala Lys Ala Ile Phe Asn Ser Lys Leu

785 790 795 800

Ser Asn Val Leu Ser Arg Tyr Trp Arg Phe Cys Val Asp Gly Gly Ala

805 810 815

Ser Ser Tyr Tyr Pro Gln Tyr Thr Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Arg

820 825 830

Leu Ser Asn Asp Val Ala Asn Thr Leu Lys Asp

835 840

<210> 45

<211> 959

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus pyogenes

<400> 45

Glu Glu Lys Thr Val Gln Val Gln Lys Gly Leu Pro Ser Ile Asp Ser

1 5 10 15

Leu His Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys Glu Phe Lys Glu Glu Leu

20 25 30

Ser Lys Ala Gly Gln Glu Ser Gln Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala Lys

35 40 45

Ala Gln Gln Ala Asp Lys Gln Ala Gln Glu Leu Ala Lys Met Lys Ile

50 55 60

Pro Glu Lys Ile Pro Met Lys Pro Leu His Gly Pro Leu Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Lys Thr Ser Asp Pro Thr Glu Lys Asp

85 90 95

Lys Val Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys Glu Val Asp Leu Ala Phe

100 105 110

Ile Phe His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser Leu Phe Trp Lys Glu Leu

115 120 125

Ala Thr Lys His Val Pro Lys Leu Asn Lys Gln Gly Thr Arg Val Ile

130 135 140

Arg Thr Ile Pro Trp Arg Phe Leu Ala Gly Gly Asp Asn Ser Gly Ile

145 150 155 160

Ala Glu Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Asn Thr Pro Glu Gly Asn Lys Ala

165 170 175

Leu Ala Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val Tyr Lys Tyr Asn Leu Asp

180 185 190

Gly Leu Asp Val Asp Val Glu His Asp Ser Ile Pro Lys Val Asp Lys

195 200 205

Lys Glu Asp Thr Ala Gly Val Glu Arg Ser Ile Gln Val Phe Glu Glu

210 215 220

Ile Gly Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Val Asp Lys Ser Arg Leu Phe

225 230 235 240

Ile Met Asp Ser Thr Tyr Met Ala Asp Lys Asn Pro Leu Ile Glu Arg

245 250 255

Gly Ala Pro Tyr Ile Asn Leu Leu Leu Val Gln Val Tyr Gly Ser Gln

260 265 270

Gly Glu Lys Gly Gly Trp Glu Pro Val Ser Asn Arg Pro Glu Lys Thr

275 280 285

Met Glu Glu Arg Trp Gln Gly Tyr Ser Lys Tyr Ile Arg Pro Glu Gln

290 295 300

Tyr Met Ile Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu Asn Ala Gln Glu Gly Asn

305 310 315 320

Leu Trp Tyr Asp Ile Asn Ser Arg Lys Asp Glu Asp Lys Ala Asn Gly

325 330 335

Ile Asn Thr Asp Ile Thr Gly Thr Arg Ala Glu Arg Tyr Ala Arg Trp

340 345 350

Gln Pro Lys Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly Ile Phe Ser Tyr Ala Ile

355 360 365

Asp Arg Asp Gly Val Ala His Gln Pro Lys Lys Tyr Ala Lys Gln Lys

370 375 380

Glu Phe Lys Asp Ala Thr Asp Asn Ile Phe His Ser Asp Tyr Ser Val

385 390 395 400

Ser Lys Ala Leu Lys Thr Val Met Leu Lys Asp Lys Ser Tyr Asp Leu

405 410 415

Ile Asp Glu Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala Leu Arg Glu Ala Val Met

420 425 430

Ala Gln Val Gly Thr Arg Lys Gly Asp Leu Glu Arg Phe Asn Gly Thr

435 440 445

Leu Arg Leu Asp Asn Pro Ala Ile Gln Ser Leu Glu Gly Leu Asn Lys

450 455 460

Phe Lys Lys Leu Ala Gln Leu Asp Leu Ile Gly Leu Ser Arg Ile Thr

465 470 475 480

Lys Leu Asp Arg Ser Val Leu Pro Ala Asn Met Lys Pro Gly Lys Asp

485 490 495

Thr Leu Glu Thr Val Leu Glu Thr Tyr Lys Lys Asp Asn Lys Glu Glu

500 505 510

Pro Ala Thr Ile Pro Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Gly Leu Thr Gly

515 520 525

Leu Lys Glu Leu Asp Leu Ser Gly Phe Asp Arg Glu Thr Leu Ala Gly

530 535 540

Leu Asp Ala Ala Thr Leu Thr Ser Leu Glu Lys Val Asp Ile Ser Gly

545 550 555 560

Asn Lys Leu Asp Leu Ala Pro Gly Thr Glu Asn Arg Gln Ile Phe Asp

565 570 575

Thr Met Leu Ser Thr Ile Ser Asn His Val Gly Ser Asn Glu Gln Thr

580 585 590

Val Lys Phe Asp Lys Gln Lys Pro Thr Gly His Tyr Pro Asp Thr Tyr

595 600 605

Gly Lys Thr Ser Leu Arg Leu Pro Val Ala Asn Glu Lys Val Asp Leu

610 615 620

Gln Ser Gln Leu Leu Phe Gly Thr Val Thr Asn Gln Gly Thr Leu Ile

625 630 635 640

Asn Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Ala Tyr Gln Asn His Lys Ile Ala Gly

645 650 655

Arg Ser Phe Val Asp Ser Asn Tyr His Tyr Asn Asn Phe Lys Val Ser

660 665 670

Tyr Glu Asn Tyr Thr Val Lys Val Thr Asp Ser Thr Leu Gly Thr Thr

675 680 685

Thr Asp Lys Thr Leu Ala Thr Asp Lys Glu Glu Thr Tyr Lys Val Asp

690 695 700

Phe Phe Ser Pro Ala Asp Lys Thr Lys Ala Val His Thr Ala Lys Val

705 710 715 720

Ile Val Gly Asp Glu Lys Thr Met Met Val Asn Leu Ala Glu Gly Ala

725 730 735

Thr Val Ile Gly Gly Ser Ala Asp Pro Val Asn Ala Arg Lys Val Phe

740 745 750

Asp Gly Gln Leu Gly Ser Glu Thr Asp Asn Ile Ser Leu Gly Trp Asp

755 760 765

Ser Lys Gln Ser Ile Ile Phe Lys Leu Lys Glu Asp Gly Leu Ile Lys

770 775 780

His Trp Arg Phe Phe Asn Asp Ser Ala Arg Asn Pro Glu Thr Thr Asn

785 790 795 800

Lys Pro Ile Gln Glu Ala Ser Leu Gln Ile Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

805 810 815

Asn Leu Asp Asn Leu Leu Glu Asn Pro Asn Lys Phe Asp Asp Glu Lys

820 825 830

Tyr Trp Ile Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ala Gln Gly Glu Arg Ala Thr

835 840 845

Ala Phe Ser Asn Thr Leu Asn Asn Ile Thr Ser Lys Tyr Trp Arg Val

850 855 860

Val Phe Asp Thr Lys Gly Asp Arg Tyr Ser Ser Pro Val Val Pro Glu

865 870 875 880

Leu Gln Ile Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Asn Ala Asp Thr Ile Met Lys

885 890 895

Thr Val Thr Thr Ala Lys Glu Leu Ser Gln Gln Lys Asp Lys Phe Ser

900 905 910

Gln Lys Met Leu Asp Glu Leu Lys Ile Lys Glu Met Ala Leu Glu Thr

915 920 925

Ser Leu Asn Ser Lys Ile Phe Asp Val Thr Ala Ile Asn Ala Asn Ala

930 935 940

Gly Val Leu Lys Asp Cys Ile Glu Lys Arg Gln Leu Leu Lys Lys

945 950 955

<210> 46

<211> 995

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus pyogenes

<400> 46

Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala

1 5 10 15

Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn

20 25 30

Thr Val Lys Ala Glu Glu Lys Thr Val Gln Val Gln Lys Gly Leu Pro

35 40 45

Ser Ile Asp Ser Leu His Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys Glu Phe

50 55 60

Lys Glu Glu Leu Ser Lys Ala Gly Gln Glu Ser Gln Lys Val Lys Glu

65 70 75 80

Ile Leu Ala Lys Ala Gln Gln Ala Asp Lys Gln Ala Gln Glu Leu Ala

85 90 95

Lys Met Lys Ile Pro Glu Lys Ile Pro Met Lys Pro Leu His Gly Pro

100 105 110

Leu Tyr Gly Gly Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Lys Thr Ser Asp Pro

115 120 125

Thr Glu Lys Asp Lys Val Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys Glu Val

130 135 140

Asp Leu Ala Phe Ile Phe His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser Leu Phe

145 150 155 160

Trp Lys Glu Leu Ala Thr Lys His Val Pro Lys Leu Asn Lys Gln Gly

165 170 175

Thr Arg Val Ile Arg Thr Ile Pro Trp Arg Phe Leu Ala Gly Gly Asp

180 185 190

Asn Ser Gly Ile Ala Glu Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Asn Thr Pro Glu

195 200 205

Gly Asn Lys Ala Leu Ala Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val Tyr Lys

210 215 220

Tyr Asn Leu Asp Gly Leu Asp Val Asp Val Glu His Asp Ser Ile Pro

225 230 235 240

Lys Val Asp Lys Lys Glu Asp Thr Ala Gly Val Glu Arg Ser Ile Gln

245 250 255

Val Phe Glu Glu Ile Gly Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Val Asp Lys

260 265 270

Ser Arg Leu Phe Ile Met Asp Ser Thr Tyr Met Ala Asp Lys Asn Pro

275 280 285

Leu Ile Glu Arg Gly Ala Pro Tyr Ile Asn Leu Leu Leu Val Gln Val

290 295 300

Tyr Gly Ser Gln Gly Glu Lys Gly Gly Trp Glu Pro Val Ser Asn Arg

305 310 315 320

Pro Glu Lys Thr Met Glu Glu Arg Trp Gln Gly Tyr Ser Lys Tyr Ile

325 330 335

Arg Pro Glu Gln Tyr Met Ile Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu Asn Ala

340 345 350

Gln Glu Gly Asn Leu Trp Tyr Asp Ile Asn Ser Arg Lys Asp Glu Asp

355 360 365

Lys Ala Asn Gly Ile Asn Thr Asp Ile Thr Gly Thr Arg Ala Glu Arg

370 375 380

Tyr Ala Arg Trp Gln Pro Lys Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly Ile Phe

385 390 395 400

Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Gln Pro Lys Lys Tyr

405 410 415

Ala Lys Gln Lys Glu Phe Lys Asp Ala Thr Asp Asn Ile Phe His Ser

420 425 430

Asp Tyr Ser Val Ser Lys Ala Leu Lys Thr Val Met Leu Lys Asp Lys

435 440 445

Ser Tyr Asp Leu Ile Asp Glu Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala Leu Arg

450 455 460

Glu Ala Val Met Ala Gln Val Gly Thr Arg Lys Gly Asp Leu Glu Arg

465 470 475 480

Phe Asn Gly Thr Leu Arg Leu Asp Asn Pro Ala Ile Gln Ser Leu Glu

485 490 495

Gly Leu Asn Lys Phe Lys Lys Leu Ala Gln Leu Asp Leu Ile Gly Leu

500 505 510

Ser Arg Ile Thr Lys Leu Asp Arg Ser Val Leu Pro Ala Asn Met Lys

515 520 525

Pro Gly Lys Asp Thr Leu Glu Thr Val Leu Glu Thr Tyr Lys Lys Asp

530 535 540

Asn Lys Glu Glu Pro Ala Thr Ile Pro Pro Val Ser Leu Lys Val Ser

545 550 555 560

Gly Leu Thr Gly Leu Lys Glu Leu Asp Leu Ser Gly Phe Asp Arg Glu

565 570 575

Thr Leu Ala Gly Leu Asp Ala Ala Thr Leu Thr Ser Leu Glu Lys Val

580 585 590

Asp Ile Ser Gly Asn Lys Leu Asp Leu Ala Pro Gly Thr Glu Asn Arg

595 600 605

Gln Ile Phe Asp Thr Met Leu Ser Thr Ile Ser Asn His Val Gly Ser

610 615 620

Asn Glu Gln Thr Val Lys Phe Asp Lys Gln Lys Pro Thr Gly His Tyr

625 630 635 640

Pro Asp Thr Tyr Gly Lys Thr Ser Leu Arg Leu Pro Val Ala Asn Glu

645 650 655

Lys Val Asp Leu Gln Ser Gln Leu Leu Phe Gly Thr Val Thr Asn Gln

660 665 670

Gly Thr Leu Ile Asn Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Ala Tyr Gln Asn His

675 680 685

Lys Ile Ala Gly Arg Ser Phe Val Asp Ser Asn Tyr His Tyr Asn Asn

690 695 700

Phe Lys Val Ser Tyr Glu Asn Tyr Thr Val Lys Val Thr Asp Ser Thr

705 710 715 720

Leu Gly Thr Thr Thr Asp Lys Thr Leu Ala Thr Asp Lys Glu Glu Thr

725 730 735

Tyr Lys Val Asp Phe Phe Ser Pro Ala Asp Lys Thr Lys Ala Val His

740 745 750

Thr Ala Lys Val Ile Val Gly Asp Glu Lys Thr Met Met Val Asn Leu

755 760 765

Ala Glu Gly Ala Thr Val Ile Gly Gly Ser Ala Asp Pro Val Asn Ala

770 775 780

Arg Lys Val Phe Asp Gly Gln Leu Gly Ser Glu Thr Asp Asn Ile Ser

785 790 795 800

Leu Gly Trp Asp Ser Lys Gln Ser Ile Ile Phe Lys Leu Lys Glu Asp

805 810 815

Gly Leu Ile Lys His Trp Arg Phe Phe Asn Asp Ser Ala Arg Asn Pro

820 825 830

Glu Thr Thr Asn Lys Pro Ile Gln Glu Ala Ser Leu Gln Ile Phe Asn

835 840 845

Ile Lys Asp Tyr Asn Leu Asp Asn Leu Leu Glu Asn Pro Asn Lys Phe

850 855 860

Asp Asp Glu Lys Tyr Trp Ile Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ala Gln Gly

865 870 875 880

Glu Arg Ala Thr Ala Phe Ser Asn Thr Leu Asn Asn Ile Thr Ser Lys

885 890 895

Tyr Trp Arg Val Val Phe Asp Thr Lys Gly Asp Arg Tyr Ser Ser Pro

900 905 910

Val Val Pro Glu Leu Gln Ile Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Asn Ala Asp

915 920 925

Thr Ile Met Lys Thr Val Thr Thr Ala Lys Glu Leu Ser Gln Gln Lys

930 935 940

Asp Lys Phe Ser Gln Lys Met Leu Asp Glu Leu Lys Ile Lys Glu Met

945 950 955 960

Ala Leu Glu Thr Ser Leu Asn Ser Lys Ile Phe Asp Val Thr Ala Ile

965 970 975

Asn Ala Asn Ala Gly Val Leu Lys Asp Cys Ile Glu Lys Arg Gln Leu

980 985 990

Leu Lys Lys

995

<210> 47

<211> 995

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus pyogenes

<400> 47

Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala

1 5 10 15

Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn

20 25 30

Thr Val Lys Ala Glu Glu Lys Thr Val Gln Val Gln Lys Gly Leu Pro

35 40 45

Ser Ile Asp Ser Leu His Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys Glu Phe

50 55 60

Lys Glu Glu Leu Ser Lys Ala Gly Gln Glu Ser Gln Lys Val Lys Glu

65 70 75 80

Ile Leu Ala Lys Ala Gln Gln Ala Asp Lys Gln Ala Gln Glu Leu Ala

85 90 95

Lys Met Lys Ile Pro Glu Lys Ile Pro Met Lys Pro Leu His Gly Pro

100 105 110

Leu Tyr Gly Gly Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Lys Thr Ser Asp Pro

115 120 125

Thr Glu Lys Asp Lys Val Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys Glu Val

130 135 140

Asp Leu Ala Phe Ile Phe His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser Leu Phe

145 150 155 160

Trp Lys Glu Leu Ala Thr Lys His Val Pro Lys Leu Asn Lys Gln Gly

165 170 175

Thr Arg Val Ile Arg Thr Ile Pro Trp Arg Phe Leu Ala Gly Gly Asp

180 185 190

Asn Ser Gly Ile Ala Glu Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Asn Thr Pro Glu

195 200 205

Gly Asn Lys Ala Leu Ala Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val Tyr Lys

210 215 220

Tyr Asn Leu Asp Gly Leu Asp Val Asp Val Glu His Asp Ser Ile Pro

225 230 235 240

Lys Val Asp Lys Lys Glu Asp Thr Ala Gly Val Glu Arg Ser Ile Gln

245 250 255

Val Phe Glu Glu Ile Gly Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Val Asp Lys

260 265 270

Ser Arg Leu Phe Ile Met Asp Ser Thr Tyr Met Ala Asp Lys Asn Pro

275 280 285

Leu Ile Glu Arg Gly Ala Pro Tyr Ile Asn Leu Leu Leu Val Gln Val

290 295 300

Tyr Gly Ser Gln Gly Glu Lys Gly Gly Trp Glu Pro Val Ser Asn Arg

305 310 315 320

Pro Glu Lys Thr Met Glu Glu Arg Trp Gln Gly Tyr Ser Lys Tyr Ile

325 330 335

Arg Pro Glu Gln Tyr Met Ile Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu Asn Ala

340 345 350

Gln Glu Gly Asn Leu Trp Tyr Asp Ile Asn Ser Arg Lys Asp Glu Asp

355 360 365

Lys Ala Asn Gly Ile Asn Thr Asp Ile Thr Gly Thr Arg Ala Glu Arg

370 375 380

Tyr Ala Arg Trp Gln Pro Lys Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly Ile Phe

385 390 395 400

Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Gln Pro Lys Lys Tyr

405 410 415

Ala Lys Gln Lys Glu Phe Lys Asp Ala Thr Asp Asn Ile Phe His Ser

420 425 430

Asp Tyr Ser Val Ser Lys Ala Leu Lys Thr Val Met Leu Lys Asp Lys

435 440 445

Ser Tyr Asp Leu Ile Asp Glu Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala Leu Arg

450 455 460

Glu Ala Val Met Ala Gln Val Gly Thr Arg Lys Gly Asp Leu Glu Arg

465 470 475 480

Phe Asn Gly Thr Leu Arg Leu Asp Asn Pro Ala Ile Gln Ser Leu Glu

485 490 495

Gly Leu Asn Lys Phe Lys Lys Leu Ala Gln Leu Asp Leu Ile Gly Leu

500 505 510

Ser Arg Ile Thr Lys Leu Asp Arg Ser Val Leu Pro Ala Asn Met Lys

515 520 525

Pro Gly Lys Asp Thr Leu Glu Thr Val Leu Glu Thr Tyr Lys Lys Asp

530 535 540

Asn Lys Glu Glu Pro Ala Thr Ile Pro Pro Val Ser Leu Lys Val Ser

545 550 555 560

Gly Leu Thr Gly Leu Lys Glu Leu Asp Leu Ser Gly Phe Asp Arg Glu

565 570 575

Thr Leu Ala Gly Leu Asp Ala Ala Thr Leu Thr Ser Leu Glu Lys Val

580 585 590

Asp Ile Ser Gly Asn Lys Leu Asp Leu Ala Pro Gly Thr Glu Asn Arg

595 600 605

Gln Ile Phe Asp Thr Met Leu Ser Thr Ile Ser Asn His Val Gly Ser

610 615 620

Asn Glu Gln Thr Val Lys Phe Asp Lys Gln Lys Pro Thr Gly His Tyr

625 630 635 640

Pro Asp Thr Tyr Gly Lys Thr Ser Leu Arg Leu Pro Val Ala Asn Glu

645 650 655

Lys Val Asp Leu Gln Ser Gln Leu Leu Phe Gly Thr Val Thr Asn Gln

660 665 670

Gly Thr Leu Ile Asn Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Ala Tyr Gln Asn His

675 680 685

Lys Ile Ala Gly Arg Ser Phe Val Asp Ser Asn Tyr His Tyr Asn Asn

690 695 700

Phe Lys Val Ser Tyr Glu Asn Tyr Thr Val Lys Val Thr Asp Ser Thr

705 710 715 720

Leu Gly Thr Thr Thr Asp Lys Thr Leu Ala Thr Asp Lys Glu Glu Thr

725 730 735

Tyr Lys Val Asp Phe Phe Ser Pro Ala Asp Lys Thr Lys Ala Val His

740 745 750

Thr Ala Lys Val Ile Val Gly Asp Glu Lys Thr Met Met Val Asn Leu

755 760 765

Ala Glu Gly Ala Thr Val Ile Gly Gly Ser Ala Asp Pro Val Asn Ala

770 775 780

Arg Lys Val Phe Asp Gly Gln Leu Gly Ser Glu Thr Asp Asn Ile Ser

785 790 795 800

Leu Gly Trp Asp Ser Lys Gln Ser Ile Ile Phe Lys Leu Lys Glu Asp

805 810 815

Gly Leu Ile Lys His Trp Arg Phe Phe Asn Asp Ser Ala Arg Asn Pro

820 825 830

Glu Thr Thr Asn Lys Pro Ile Gln Glu Ala Ser Leu Gln Ile Phe Asn

835 840 845

Ile Lys Asp Tyr Asn Leu Asp Asn Leu Leu Glu Asn Pro Asn Lys Phe

850 855 860

Asp Asp Glu Lys Tyr Trp Ile Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ala Gln Gly

865 870 875 880

Glu Arg Ala Thr Ala Phe Ser Asn Thr Leu Asn Asn Ile Thr Ser Lys

885 890 895

Tyr Trp Arg Val Val Phe Asp Thr Lys Gly Asp Arg Tyr Ser Ser Pro

900 905 910

Val Val Pro Glu Leu Gln Ile Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Asn Ala Asp

915 920 925

Thr Ile Met Lys Thr Val Thr Thr Ala Lys Glu Leu Ser Gln Gln Lys

930 935 940

Asp Lys Phe Ser Gln Lys Met Leu Asp Glu Leu Lys Ile Lys Glu Met

945 950 955 960

Ala Leu Glu Thr Ser Leu Asn Ser Lys Ile Phe Asp Val Thr Ala Ile

965 970 975

Asn Ala Asn Ala Gly Val Leu Lys Asp Cys Ile Glu Lys Arg Gln Leu

980 985 990

Leu Lys Lys

995

<210> 48

<211> 311

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 48

Met Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr

1 5 10 15

Pro Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala

20 25 30

Asn Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn

35 40 45

Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu

50 55 60

Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp

65 70 75 80

Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys

85 90 95

Gln Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala

100 105 110

Ile Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe

115 120 125

Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe

130 135 140

Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu

145 150 155 160

Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg

165 170 175

Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu

180 185 190

Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser

195 200 205

Asp Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser

210 215 220

His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly

225 230 235 240

Ala Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp

245 250 255

Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val

260 265 270

Asn Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp

275 280 285

Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln

290 295 300

Asp Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 49

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 49

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr

20 25 30

Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Gly Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser

85 90 95

Gly Ile Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 50

<211> 445

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 50

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Gly Ala Ser Gly Ser Gln Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ala Ile Gly Asp Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 51

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 51

Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser

1 5 10

<210> 52

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 52

Gly Asp Ser Glu Arg Pro Ser

1 5

<210> 53

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 53

Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Ile Tyr Val

1 5 10

<210> 54

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 54

Thr Tyr Ala Met Gly

1 5

<210> 55

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 55

Ser Ile Gly Ala Ser Gly Ser Gln Thr Arg Tyr Ala Asp Ser

1 5 10

<210> 56

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 56

Leu Ala Ile Gly Asp Ser Tyr

1 5

<210> 57

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Гидрофобная аминокислота

<400> 57

Gly His Phe Gly Gly Xaa Tyr

1 5

<---

Группа изобретений относится к генной терапии. Предложен способ повышения эффективности генной терапии, основанной на AAV, у субъекта, имеющего анти-AAV нейтрализующие антитела. Субъекту вводят нипокалимаб, AAV-вектор, содержащий терапевтический гетерологичный полинуклеотид, и IdeS или ее модифицированный вариант, указанные в любой из SEQ ID NO: 3-18, 23 или 48. Также предложены наборы, содержащие указанные нипокалимаб, AAV-вектор и IdeS или ее модифицированный вариант. Изобретения позволяют снижать уровни нейтрализующих антител до самых низких уровней титра у пациентов с высокими титрами NAb и обеспечить эффективную трансдукцию AAV для улучшения генной терапии на основе AAV. 3 н. и 76 з.п. ф-лы, 14 ил., 9 табл., 19 пр.

1. Способ повышения эффективности генной терапии, основанной на AAV, у субъекта, имеющего анти-AAV NAb, включающий:

(а) введение субъекту нипокалимаба;

(b) введение указанному субъекту аденоассоциированного вирусного (AAV) вектора, содержащего терапевтический гетерологичный полинуклеотид; и

(c) введение указанному субъекту IdeS или ее модифицированного варианта, указанных в любой из SEQ ID NO: 3-18, 23 или 48.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что

(a) указанный субъект нуждается в лечении заболевания, вызванного потерей функции или активности белка, и указанный гетерологичный полинуклеотид кодирует полипептид или пептид, который обеспечивает или дополняет функцию или активность указанного белка, или

(b) указанный субъект нуждается в лечении заболевания, вызванного усилением функции, активности или экспрессии белка, и указанный гетерологичный полинуклеотид транскрибируется в нуклеиновую кислоту, которая ингибирует, снижает или уменьшает экспрессию указанного усиления функции, активности или экспрессии указанного белка.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что FcRn-опосредованная рециркуляция IgG снижена у указанного субъекта.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что у указанного субъекта повышен клиренс IgG.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что стадию (а) выполняют перед стадией (b).

6. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что стадию (b) выполняют перед стадией (а).

7. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что стадию (а) и стадию (b) выполняют примерно в одно и то же время.

8. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что стадию (а) выполняют два или несколько раз до или после стадии (b).

9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 90 дней до или после стадии (а).

10. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 60 дней до или после стадии (а).

11. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 45 дней до или после стадии (а).

12. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 30 дней до или после стадии (а).

13. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 21 дня до или после стадии (а).

14. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 14 дней до или после стадии (а).

15. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 7 дней до или после стадии (а).

16. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 72 часов до или после стадии (а).

17. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 48 часов до или после стадии (а).

18. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 24 часов до или после стадии (а).

19. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 12 часов до или после стадии (а).

20. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в течение примерно 6 часов до или после стадии (а).

21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят до, после или примерно в то же время, что и стадию (а).

22. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят до, после или примерно в то же время, что и стадию (b).

23. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят два или несколько раз до, после или примерно в то же время, что и стадию (а).

24. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят два или несколько раз до, после или примерно в то же время, что и стадию (b).

25. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 90 дней до или после стадии (а) или стадии (b).

26. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 60 дней до или после стадии (а) или стадии (b).

27. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 45 дней до или после стадии (а) или стадии (b).

28. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 30 дней до или после стадии (а) или стадии (b).

29. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 21 дня до или после стадии (а) или стадии (b).

30. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 14 дней до или после стадии (а) или стадии (b).

31. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 7 дней до или после стадии (а) или стадии (b).

32. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 72 часов до или после стадии (а) или стадии (b).

33. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 48 часов до или после стадии (а) или стадии (b).

34. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 24 часов до или после стадии (а) или стадии (b).

35. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 12 часов до или после стадии (а) или стадии (b).

36. Способ по любому из пп. 21-24, отличающийся тем, что указанную IdeS или ее модифицированный вариант вводят в течение примерно 6 часов до или после стадии (а) или стадии (b).

37. Способ по любому из пп. 1-36, отличающийся тем, что указанный вектор AAV содержит капсидные белки, с которыми связываются антитела или IgG.

38. Способ по любому из пп. 1-36, отличающийся тем, что указанный вектор AAV содержит капсидные белки VP1, VP2 и/или VP3, с которыми связываются антитела или IgG.

39. Способ по п. 37 или 38, отличающийся тем, что указанный вектор AAV содержит капсидный белок VP1, VP2 и/или VP3, имеющий 60% или более идентичность последовательности капсидного белка VP1, VP2 и/или VP3, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV3B, AAV-2i8, Rh10, Rh74, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 капсидных белков VP1, VP2 и/или VP3.

40. Способ по п. 37 или 38, отличающийся тем, что указанный вектор AAV содержит капсидный белок VP1, VP2 и/или VP3, имеющий 100% идентичность последовательности капсидного белка VP1, VP2 и/или VP3, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV3B, AAV-2i8, Rh10, Rh74, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 капсидных белков VP1, VP2 и/или VP3.

41. Способ по любому из пп. 1-40, отличающийся тем, что указанный субъект имеет антитела или IgG, которые связываются с указанным вирусным вектором.

42. Способ по любому из пп. 1-40, отличающийся тем, что у указанного субъекта отсутствуют антитела или IgG, которые связываются с указанным вирусным вектором.

43. Способ по любому из пп. 1-42, отличающийся тем, что указанный субъект имеет антитела или IgG, которые связываются с указанным полипептидом или пептидом, кодируемым указанным гетерологичным полинуклеотидом.

44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что указанные антитела включают IgG, IgM, IgA, IgD и/или IgE.

45. Способ по любому из пп. 1-44, дополнительно включающий определение присутствия, количественное определение количества или эффекторной функции связывающих вирусный вектор антител или IgG, присутствующих у указанного субъекта, перед выполнением стадии (а), после выполнения стадии (а), но перед выполнением стадии (b) и/или после выполнения стадий (a) и (b).

46. Способ по любому из пп. 1-44, дополнительно включающий анализ биологического образца от указанного субъекта на присутствие, количество или эффекторную функцию антител, связывающих вирусный вектор, или IgG, присутствующих в указанном образце, перед выполнением стадии (а), после выполнения стадии (а), но до выполнения стадии (b) и/или после выполнения стадий (а) и (b).

47. Способ по п. 45 или 46, отличающийся тем, что указанную стадию определения и/или анализа проводят до и/или после введения указанной протеазы или гликозидазы.

48. Способ по п. 46 или 47, отличающийся тем, что указанный биологический образец от указанного субъекта представляет собой продукт крови.

49. Способ по любому из пп. 1-48, отличающийся тем, что указанный способ приводит к снижению на 20-50%, 50-75%, 75-90%, 90-95% или 95% или более указанных антител или IgG, связывающих вирусный вектор.

50. Способ по любому из пп. 46-48, отличающийся тем, что указанные связывающие вирусный вектор антитела или IgG, присутствующие в указанном биологическом образце или продукте крови от указанного субъекта, составляют менее примерно 1:100000, где 1 часть указанного биологического образца или продукта крови, разведенная в 100000 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

51. Способ по любому из пп. 46-48, отличающийся тем, что указанные связывающие вирусный вектор антитела или IgG, присутствующие в указанном биологическом образце или продукте крови от указанного субъекта, составляют менее примерно 1:50000, где 1 часть указанного биологического образца или продукта крови, разведенная в 50000 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

52. Способ по любому из пп. 46-48, отличающийся тем, что указанные связывающие вирусный вектор антитела или IgG, присутствующие в указанном биологическом образце или продукте крови от указанного субъекта, составляют менее примерно 1:10000, где 1 часть указанного биологического образца или продукта крови, разведенная в 10000 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

53. Способ по любому из пп. 46-48, отличающийся тем, что указанные связывающие вирусный вектор антитела или IgG, присутствующие в указанном биологическом образце или продукте крови от указанного субъекта, составляют менее примерно 1:1000, где 1 часть указанного биологического образца или продукта крови, разведенная в 1000 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

54. Способ по любому из пп. 46-48, отличающийся тем, что указанные связывающие вирусный вектор антитела или IgG, присутствующие в указанном биологическом образце или продукте крови от указанного субъекта, составляют менее примерно 1:100, где 1 часть указанного биологического образца или продукта крови, разведенная в 100 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

55. Способ по любому из пп. 46-48, отличающийся тем, что указанные связывающие вирусный вектор антитела или IgG, присутствующие в указанном биологическом образце или продукте крови от указанного субъекта, составляют менее примерно 1:10, где 1 часть указанного биологического образца или продукта крови, разведенная в 10 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

56. Способ по любому из пп. 46-48, отличающийся тем, что указанные связывающие вирусный вектор антитела или IgG, присутствующие в указанном биологическом образце или продукте крови от указанного субъекта, составляют менее примерно 1:5, где 1 часть указанного биологического образца или продукта крови, разведенная в 5 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

57. Способ по любому из пп. 46-48, отличающийся тем, что соотношение связывающих вирусный вектор антител или IgG, присутствующих в указанном биологическом образце или продукте крови, составляет менее примерно 1:4, где 1 часть указанного биологического образца или продукта крови, разведенная в 4 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

58. Способ по любому из пп. 46-48, отличающийся тем, что соотношение связывающих вирусный вектор антител или IgG, присутствующих в указанном биологическом образце или продукте крови, составляет менее примерно 1:3, где 1 часть указанного биологического образца или продукта крови, разведенная в 3 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

59. Способ по любому из пп. 1-48, отличающийся тем, что соотношение связывающих вирусный вектор антител или IgG, присутствующих в указанном биологическом образце или продукте крови, составляет менее примерно 1:2, где 1 часть указанного биологического образца или продукта крови, разведенная в 2 частях буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

60. Способ по любому из пп. 1-48, отличающийся тем, что соотношение связывающих вирусный вектор антител или IgG, присутствующих в указанном биологическом образце или продукте крови, составляет менее примерно 1:1, где 1 часть указанного биологического образца или продукта крови, разведенная в 1 части буфера, дает 50% нейтрализацию вирусного вектора.

61. Способ по любому из пп. 1-60, дополнительно включающий определение присутствия или количественное определение количества антител или IgG, которые связываются с полипептидом или пептидом, кодируемым указанным гетерологичным полинуклеотидом, после выполнения стадии (а), но перед выполнением стадии (b), и/или после выполнения стадий (а) и (b).

62. Способ по любому из пп. 1-60, дополнительно включающий определение присутствия или количественное определение количества антител или IgG, которые связываются с указанным гетерологичным полинуклеотидом или нуклеиновой кислотой, после выполнения стадии (а), но до выполнения стадии (b), и/или после выполнения стадий (а) и (b).

63. Способ по любому из пп. 1-62, отличающийся тем, что указанный субъект страдает заболеванием легких, нарушением свертываемости крови, талассемией, заболеванием крови, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, болезнью Хантингтона, боковым амиотрофическим склерозом (ALS), эпилепсией, лизосомной болезнью накопления, GM2-ганглиозидозом I типа (болезнью Тея-Сакса), GM2-ганглиозидозом II типа (болезнью Сандхоффа), муколипидозом I типа (сиалидозом I и II типа), II типа (I-клеточной болезнью), III типа (псевдоболезнью Гурлера) и IV типа, болезнями накопления мукополисахарида (болезнью Гурлера и ее вариантами, Хантера, Санфилиппо A, B, C, D типов, Моркио A и B типов, болезнью Марото-Лами и Слая), болезнью Ниманна-Пика A/B, C1 и C2 типов и болезнью Шиндлера I и II типов), наследственным ангионевротическим отеком (HAE), нарушением накопления меди или железа, дефицитом лизосомальной кислой липазы, неврологическим или нейродегенеративным нарушением, раком, диабетом 1 или 2 типа, дефицитом аденозиндезаминазы, нарушением обмена веществ, заболеванием твердых органов или инфекционным вирусным, бактериальным или грибковым заболеванием.

64. Способ по любому из пп. 1-62, отличающийся тем, что указанный субъект страдает нарушением свертываемости крови.

65. Способ по любому из пп. 1-62, отличающийся тем, что указанный субъект страдает гемофилией А, гемофилией А с ингибирующими антителами, гемофилией В, гемофилией В с ингибирующими антителами, дефицитом любого фактора свертывания крови: VII, VIII, IX, X, XI, V, XII, II, фактора фон Виллебранда или комбинированным дефицитом FV/FVIII, талассемией, дефицитом эпоксидредуктазы С1, витамина К или дефицитом гамма-карбоксилазы.

66. Способ по любому из пп. 1-62, отличающийся тем, что указанный субъект страдает анемией, кровотечением, связанным с травмой, повреждением, тромбозом, тромбоцитопенией, инсультом, коагулопатией, синдромом диссеминированного внутрисосудистого свертывания (DIC); избыточной антикоагуляцией, связанной с гепарином, низкомолекулярным гепарином, пентасахаридом, варфарином, низкомолекулярными антитромботическими препаратами или нарушением тромбоцитов, таким как синдром Бернара-Сулье, тромбастения Гланцмана или дефицит пула тромбоцитов.

67. Способ по любому из пп. 1-62, отличающийся тем, что указанный гетерологичный полинуклеотид кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, гормона роста (GH), гормона щитовидной железы (PTH), рилизинг-фактора гормона роста (GRF), фолликулостимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH), хорионического гонадотропина человека (hCG), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтинов, ангиостатина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), эритропоэтина (ЕРО), фактора роста соединительной ткани (CTGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), кислого фактора роста фибробластов (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста α (TGFα), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), инсулиновых факторов роста I и II (IGF-I и IGF-II), TGFβ, активинов, ингибинов, костного морфогенного белка (BMP), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофинов NT-3 и NT4/5, цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (GDNF), нейртурина, агрина, нетрина-1 и нетрина-2, фактора роста гепатоцитов (HGF), эфринов, ноггина, sonic hedgehog и тирозингидроксилазы.

68. Способ по любому из пп. 1-62, отличающийся тем, что указанный гетерологичный полинуклеотид кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО), интерлейкинов, моноцитарного хемоаттрактантного белка, фактора ингибирования лейкоза, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, Fas лиганда, факторов некроза опухоли α и β, интерферонов α, β и γ, фактора стволовых клеток, flk-2/flt3 лиганда, химерных иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, гуманизированных антител, одноцепочечных антител, Т-клеточных рецепторов, химерных Т-клеточных рецепторов, одноцепочечных Т-клеточных рецепторов, молекул МНС класса I и класса II.

69. Способ по любому из пп. 1-62, отличающийся тем, что указанный гетерологичный полинуклеотид кодирует трансмембранный белок-регулятор муковисцидоза (CFTR), фактор свертывания крови, антитело, 65 кДа белок, специфичный к пигментному эпителию сетчатки (RPE65), эритропоэтин, рецептор LDL, липопротеинлипазу, орнитинтранскарбамилазу, β-глобин, α-глобин, спектрин, α-антитрипсин, аденозиндезаминазу (ADA), переносчик металлов, сульфамидазу, фермент, участвующий в лизосомной болезни накопления (ARSA), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу, β-25 глюкоцереброзидазу, сфингомиелиназу, лизосомальную гексозаминидазу, дегидрогеназу кетокислот с разветвленной цепью, гормон, фактор роста, инсулиноподобный фактор роста 1 или 2, фактор роста тромбоцитов, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, нейротрофический фактор-3 и -4, нейротрофический фактор головного мозга, глиальный фактор роста, трансформирующий фактор роста α и β, цитокин, α-интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-12, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, лимфотоксин, продукт суицидного гена, тимидинкиназу вируса простого герпеса, цитозиндезаминазу, дифтерийный токсин, цитохром P450, дезоксицитидинкиназу, фактор некроза опухоли, белок лекарственной резистентности, белок-супрессор опухоли, пептид с иммуномодулирующими свойствами, толерогенный или иммуногенный пептид или белок Tregitop или hCDR1, инсулин, глюкокиназу, гуанилатциклазу 2D, Rab-сопровождающий белок 1, LCA 5, орнитинкетокислотную аминотрансферазу, ретиношизин 1, USH1C, Х-сцепленный пигментный ретинит ГТФазу, MERTK, DFNB1, ACHM 2, 3 и 4, PKD-1 или PKD-2, TPP1, CLN2, сульфатазу, N-ацетилглюкозамин-1-фосфаттрансферазу, катепсин A, GM2-AP, NPC1, VPC2, белок-активатор сфинголипидов, одну или несколько цинк-пальцевых нуклеаз для редактирования генома и одну или несколько донорных последовательностей, используемых в качестве шаблонов репарации для редактирования генома.

70. Способ по любому из пп. 1-62, отличающийся тем, что указанный гетерологичный полинуклеотид кодирует ингибиторную нуклеиновую кислоту.

71. Способ по п. 70, отличающийся тем, что указанная ингибирующая нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из киРНК, антисмысловой молекулы, миРНК, РНКи, рибозима и кшРНК.

72. Способ по п. 70, отличающийся тем, что указанная ингибирующая нуклеиновая кислота связывается с геном, транскриптом гена или транскриптом гена, ассоциированным с болезнью полинуклеотидных повторов, выбранным из группы, состоящей из гена хантингтина (HTT), гена, ассоциированного с дентаторубропаллидолуизовой атрофией, андрогенного рецептора на Х-хромосоме при спинобульбарной мышечной атрофии, атаксина-1, -2, -3 и -7 человека, Cav2.1 P/Q потенциалозависимого кальциевого канала (CACNA1A), ТАТА-связывающего белка, противоположной цепи атаксина 8 (ATXN8OS), серин/треонин-протеинфосфатазы 2A, 55 кДа, регуляторной субъединицы B бета изоформы при спиноцеребеллярной атаксии, умственная отсталость, связанная с ломкой Х хромосомой 1, при синдроме ломкой Х хромосомы, умственная отсталость, связанная с ломкой Х хромосомой 1, при синдроме тремора/атаксии, ассоциированном с ломкой Х хромосомой, умственная отсталость, связанная с ломкой Х хромосомой 2, или член семейства AF4/FMR2 2 при умственной отсталости, ассоциированной с хрупкой XE; миотонин-протеинкиназы (МТ-РК) при миотонической дистрофии; фратаксина при атаксии Фридрейха; мутанта гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) при боковом амиотрофическом склерозе; гена, участвующего в патогенезе болезни Паркинсона и/или болезни Альцгеймера; аполипопротеина B (APOB) и пропротеинконвертазы субтилизина/кексина типа 9 (PCSK9), гиперхолестеринемии; HIV Tat, трансактиватора гена транскрипции вируса иммунодефицита человека, при HIV инфекции; HIV TAR, HIV TAR, гена ответного элемента трансактиватора вируса иммунодефицита человека при HIV инфекции; хемокинового рецептора C-C (CCR5) при HIV инфекции; нуклеокапсидного белка вируса саркомы Рауса (RSV) при инфекции RSV, специфичной для печени микроРНК (miR-122) при инфекции вирусом гепатита С; p53, при острой почечной недостаточности или острой почечной недостаточности трансплантата почки с задержкой функции трансплантата или острой почечной недостаточности; протеинкиназы N3 (PKN3) при заблаговременно рецидивирующих или метастатических солидных злокачественных опухолях; LMP2, LMP2, также известной как субъединица протеасомы бета-типа 9 (PSMB 9) при метастатической меланоме; LMP7, также известной как субъединица протеасомы бета-типа 8 (PSMB 8) при метастатической меланоме; MECL1, также известной как субъединица протеасомы бета-типа 10 (PSMB 10) при метастатической меланоме; фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) при солидных опухолях; кинезинового веретенообразного белка при солидных опухолях, супрессора апоптоза В-клеточного CLL/лимфомы (BCL-2) при хроническом миелоидном лейкозе; рибонуклеотидредуктазы М2 (RRM2) при солидных опухолях; фурина при солидных опухолях; полоподобной киназы 1 (PLK1) при опухолях печени, диацилглицеролацилтрансферазы 1 (DGAT1) при гепатите С, бета-катенина при семейном аденоматозном полипозе; бета2-адренорецептора при глаукоме; RTP801/Redd1, также известного как белок транскрипта 4, индуцируемый повреждением ДНК, при диабетическом макулярном отеке (DME) или возрастной дегенерации желтого пятна; рецептора I сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR1) при возрастной дегенерации желтого пятна или хориоидальной неоваскуляризации, каспазы 2 при неартериальной ишемической оптической нейропатии; мутантного белка кератина 6A N17K при врожденной пахионихии; последовательности генома/гена вируса гриппа А при инфекции гриппом; последовательности генома/гена коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) при инфекции SARS; последовательности генома/гена респираторно-синцитиального вируса при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции; последовательности генома/гена филовируса Эбола при инфекции Эбола; последовательности генома/гена вируса гепатита В и С при инфицировании гепатитом В и С; последовательности генома/гена вируса простого герпеса (HSV) при инфекции HSV, последовательности генома/гена вируса коксаки B3 при инфекции вирусом коксаки B3; сайленсинга патогенного аллеля гена типа торсина А (TOR1A) при первичной дистонии, пан-класса I и HLA-аллеля, специфичного для трансплантата; и мутантного гена родопсина (RHO) при аутосомно-доминантно наследуемом пигментном ретините (adRP).

73. Способ по любому из пп. 1-72, отличающийся тем, что указанный полипептид, кодируемый указанным гетерологичным полинуклеотидом, содержит нуклеазу для редактирования генов.

74. Способ по п. 73, отличающийся тем, что указанная нуклеаза для редактирования генов содержит цинк-пальцевую нуклеазу (ZFN) или эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN).

75. Способ по п. 73, отличающийся тем, что указанная нуклеаза для редактирования генов содержит функциональную CRISPR-Cas9 типа II.

76. Способ по любому из пп. 1-75, отличающийся тем, что стадию (а) и/или стадию (b) выполняют два или несколько раз.

77. Способ по любому из пп. 1-76, отличающийся тем, что указанный субъект представляет собой человека.

78. Набор для повышения эффективности генной терапии, основанной на AAV, в котором содержатся:

(а) AAV вектор, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид или пептид;

(b) нипокалимаб;

(с) IdeS или ее модифицированный вариант, указанные в любой из SEQ ID NO: 3-18, 23 или 48; и

(d) этикетка с инструкциями по выполнению способа по любому из пп. 1-77, где (а), (b) и (с) находятся в отдельных или в одном контейнере.

79. Набор для повышения эффективности генной терапии, основанной на AAV, в котором содержатся:

(а) AAV вектор, содержащий гетерологичный полинуклеотид, который транскрибируется в нуклеиновую кислоту, которая ингибирует, снижает или уменьшает экспрессию белка;

(b) нипокалимаб;

(с) IdeS или ее модифицированный вариант, указанные в любой из SEQ ID NO: 3-18, 23 или 48; и

(d) этикетка с инструкциями по выполнению способа по любому из пп. 1-77, где (а), (b) и (с) находятся в отдельных или в одном контейнере.

название	год	авторы	номер документа
ВАРИАНТЫ FC-ОБЛАСТИ С ИЗМЕНЕННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ С НЕОНАТАЛЬНЫМ FC-РЕЦЕПТОРОМ (FCRN) ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ВЕТЕРИНАРИИ	2019	Чжань, Ханцзюнь Нгуйен, Лам Чу, Цини Чинь, Ричард Ли, Шир Цзяннь	RU2830231C2
ВАРИАНТЫ FC-ОБЛАСТИ С МОДИФИЦИРОВАННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬСЯ С FCRN И С СОХРАНЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬСЯ С БЕЛКОМ А	2015	Школаут Александер Шлотауэр Тильман	RU2727639C2
ВАРИАНТЫ FC-ОБЛАСТИ С МОДИФИЦИРОВАННЫМИ СПОСОБНОСТЯМИ СВЯЗЫВАТЬСЯ С FCRN	2015	Шлотауэр Тильман	RU2730592C2
АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА, ИНДУЦИРУЮЩАЯ ИММУННЫЙ ОТВЕТ НА АНТИГЕН-МИШЕНЬ	2012	Игава Томоюки Маеда Ацухико Харая Кента Татибана Тацухико	RU2722829C2
СОДЕРЖАЩИЙ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ПЕРЕНОСЧИК В КЛЕТКУ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ ИММУННОГО КОМПЛЕКСА	2012	Игава Томоюки Хиронива Наока	RU2739792C1
АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА, СПОСОБНАЯ МНОГОКРАТНО СВЯЗЫВАТЬСЯ С МНОЖЕСТВОМ АНТИГЕННЫХ МОЛЕКУЛ	2018	Игава Томоюки Исии Синя Фунаки Михо Хиронива Наока Маэда Ацухико Нэдзу Дзюнити Руйке Баба Такеси Симидзу Сюн	RU2757786C2
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕМОФИЛИИ A	2017	Вонг, Лили Вилсон, Джеймс М. Сидрейн, Дженни Агнес	RU2762257C2
АНТИТЕЛА К ПАРВОВИРУСУ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ВЕТЕРИНАРИИ	2020	Чжань, Ханцзюнь Нгуйен, Лам Рэтклифф, Эллен Чинь, Ричард Ли, Шир Цзяннь	RU2830441C2
БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2017	Кастуриранган Сринатх Гао Чаншоу Рейни Годфри Морроу Мишелль Добсон Клер Луиз Драбик Стейси Шофилд Даррен Карлессо Джанлука Поллицци Кристен Мазор Ярив Оберст Майкл Хэммонд Скотт А. Лобо Брайан Маниквар Пракаш Симэн Джонатан Доведи Саймон Хербст Рональд	RU2766199C2
ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН И ТРАНСПОРТИРУЮЩИЙ СЕГМЕНТ	2017	Игава Томоюки Исикава Хироюки Хиронива Наока	RU2827545C2

US 2011059889 А1, 10.03.2011
WO 2015100299 A1, 07.02.2015
Токарный резец	1924	Г. Клопшток	SU2016A1
JEUNE L
V., et al
Pre-existing anti-adeno-associated virus antibodies as a challenge in AAV gene therapy
Hum Gene Ther Methods
Многоступенчатая активно-реактивная турбина	1924	Ф. Лезель	SU2013A1
Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами	1921	Богач В.И.	SU10A1
BERTIN, B., et al
Capsid-specific removal of circulating antibodies to

Описание патента на изобретение RU2841237C1

Похожие патенты RU2841237C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 841 237 C1

Реферат патента 2025 года КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИЛИ УСИЛЕНИЯ ТРАНСДУКЦИИ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ И ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ИЛИ СНИЖЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Формула изобретения RU 2 841 237 C1

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2025 года RU2841237C1

RU 2 841 237 C1