СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАДИАЦИОННОГО, ХИМИЧЕСКОГО И/ИЛИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ОРГАНИЗМА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАДИАЦИОННОГО, ХИМИЧЕСКОГО И/ИЛИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ОРГАНИЗМА Российский патент 2014 года по МПК A61K39/295 A61K39/10 A61K33/24 A61K41/00 A61P39/00 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к производству и использованию препаратов, предназначенных для экстраиммунной терапии при радиационно-химическо-биологическом поражении организма или каждого из поражений.

Известен способ лечения радиационных поражений организма, предусматривающий введение противолучевой сыворотки млекопитающих подкожно в дозе 100-125 мг/кг массы тела молодым и 200-250 мг/кг взрослым в течение 10 суток после облучения, и способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма путем 2-кратного облучения животного-донора на гамма-установке, взятия крови, выделения сыворотки и подкожного ее введения (патент RU №2169572, A61K 35/28, опубл. 27.06.2001 г.).

Недостатком данного изобретения является ограниченность применения препарата - защищает только от радиационных поражений организма.

Известна ассоциированная вакцина для специфической профилактики смешанных инфекционных диарей новорожденных поросят, этнологическими агентами которых являются рота-, коронавирусы и энтеропатогенные штаммы кишечной палочки, содержащие антигены К 88, К 99 и 987 Р (патент RU №2137499, A61K 39/295, опубл. 20.09.1999 г.).

Недостатком этой вакцины является тоже ограниченность применения - только для профилактики инфекционных и вирусных болезней животных.

Известен способ лечения радиационно-кадмиевого поражения организма радиацией и кадмием путем подкожного трехкратного введения противорадиационного лечебно-профилактического иммуноглобулина в дозе 50 мг/кг и введение в рацион бентонита из расчета 2% от его массы (см. Автореф. Л.Р. Фаттерахманова «Комбинированное поражение животных гама-радиацией и кадмием и применение средств терапии». - Казань, 2008. - 23 с.).

Недостатком способа является отсутствие противорадиационного эффекта - способ не защищает животных от поражения организма биологическими агентами, в частности от возбудителя эшерихиоза.

Задачей изобретения является создание унифицированного препарата, обладающего широким спектром лечебного действия как при радиационном, химическом и/или биологическом поражении организма, так и при каждом поражении в отдельности или при их сочетании.

Поставленная задача решается тем, что способ лечения радиационного химического и/или биологического поражении организма предусматривает введение 10%-ного раствора комплексного белково-кадмиевого радиоантигена, состоящего из смеси анатоксинов трех вирулентных штаммов, E. coli №378, 379, 380 и белково-кадмиевого радиоантигена, который 4-кратно подкожно вводят животным, получают гипериммунную антисыворотку, затем выделяют из нее глобулины, которые вводят однократно подкожно в дозе 20-25 мг/кг по белку пораженным животным. А 4-кратное подкожное введение 10%-ного раствора комплексного белкового-кадмиевого радиоантигена проводят с интервалом 2 недели - 1-я, 2-я, 3-я инъекции, затем с интервалом 4 недели - 4-я инъекция в дозе 1 мг белкового-кадмиевого радиоантигена + 500 мкл полного адъюванта Фрейнда для 1-й и 2-й инъекций и в дозе 1 мг белково-кадмиевого радиоантигена + 500 мкл физиологического раствора для 3-й и 4-й инъекций, а через 7 дней берут пробы крови и полученные антисыворотки тестируют в непрямом варианте ИФА на наличие антиэшерихиозных, антикадмиевых и антирадиотоксических поликлональных антител, а затем из них выделяют глобулины путем высаливания сульфатом аммония.

Поставленная задача решается и тем, что создан способ получения глобулинов для лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма, предусматривающий сначала получение белкового антигена из смеси анатоксинов из трех энтеропатогенных вирулентных штаммов возбудителя эшерихиоза телят E. coli №378, 379, 380 путем выращивания их на среде Хоттингера с последующим добавлением 0,4-0,5%-ного формалина, дальнейшим термостатированием при температуре 37°C в течение 10-12 дней и осаждением смеси анатоксинов стерильным раствором гидроокиси алюминия, затем получения радиоантигена из E. coli «ПЛ-6» путем выращивания культуры на мясопептонном агаре в течение 48 часов с последующим смывом биомассы физиологическим раствором и облучением полученной суспензии с концентрацией 1,2-10¹⁰ м.к./см³ на гамма-установке в дозе 140-150 Гр, с дальнейшим термостатированием в течение 3,5-4,5 ч при 37°C и экстрагированием радиотоксина 70%-ным подкисленным 0,05% соляной кислотой до pH 5,5 этанолом, последующим упариванием экстрагента на роторном испарителе при температуре 20°C до исходного объема, и далее получения белково-кадмиевого радиоантигена сначала путем предварительного дехлорирования кадмия хлорида, получения гидроокиси кадмия, а затем в полученный 2,7%-ный раствор радиоантигена добавляют 0,77%-ный раствор гидроокиси кадмия в соотношении 1:1 с последующим термостатированием при температуре 37°C в течение 30 мин, упариванием и растворением осадка до 12,8%-ной концентрации, дальнейшим получением белково-кадмиевого радиоантигена путем добавления 1,2%-ного раствора смеси трех анатоксинов E. coli и 12,8%-ного раствора кадмиевого радиоантигена в соотношении 1:9, дальнейшего конъюгирования компонентов при комнатной температуре в течение 8-10 часов, стандартизации по сухому веществу до 10%-ной концентрации и дальнейшего розлива во флаконы и хранения при температуре 4-6°C. А дехлорирование кадмия хлорида проводят путем щелочного гидролиза с использованием, например, едкого натрия в соотношении 1:2 соответственно, подогревают до температуры 40-45°C, гидролиз ведут в течение ночи, надосадочную жидкость, содержащую растворенный NaCl, декантируют, а полученный осадок - гидроокись кадмия разводят до 1%-ной концентрации и используют для получения белково-кадмиевого радиоантигена.

Полученные по описанной технологии глобулины обеспечивают эффективное лечение поражений организма, вызванных как при комплексном радиационном, химическом и/или биологическом воздействии, так и при их отдельном воздействии.

Технология получения глобулинов для лечения радиационного, химического и/или биологического поражения и способ лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма состоит из 4 этапов.

На 1 этапе готовят белковую часть комплексного антигена эшерихиозный анатоксин (ЭАТ). Для его получения используют 3 вирулентных (энтеропатогенных) штамма возбудителя эшерихиоза телят: E. coli №378, 379 и 380, которые выращивают на среде Хоттингера в течение 48 ч при 37°C с последующим добавлением формалина (0,4-0,5%), термостатированием при 37°C в течение 10-12 дней и осаждением смеси анатоксинов стерильным раствором гидроокиси алюминия (ГОА) из расчета 1% на весь объем.

После отстаивания анатоксина в течение 2-3 дней надосадочную жидкость декантируют, осадок + смесь анатоксинов в виде геля используют в качестве белка-носителя гаптеновой части конъюгированного антигена (кадмированного производного радиоантигена).

На втором этапе технологического цикла получают микробный радиотоксин (РТ).

В качестве донора антигена используют вакцинный штамм E. coli «ПЛ-6», который высевают на твердую питательную среду (МПА) и выращивают в аэробных условиях 48 ч при температуре 37°C, затем биомассу смывают физиологическим раствором pH 7,2, трехкратно отмывают центрифугированием, центрифугат ресуспендируют в физиологическом растворе в концентрации 1,2-10¹⁰ м.к./см³ и используют для выделения РТ. Для этой цели микробную суспензию с указанной плотностью облучают на гамма-установке «Исследователь» в дозе 140-150 Гр с последующим термостатированием культуры в течение 4 ч при температуре 37°C. По истечении указанной экспозиции микробную биомассу осаждают центрифугированием и к осадку прибавляют 96% этанол в соотношении 1:5 и экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем экстракт центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 мин, супернатант сливают.

Полученный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе до исходного объема и нейтрализуют 0,1 н КОН до pH 7,4, разводят физиологическим раствором до 2,7%-ной концентрации (27 мг/мл) и используют в дальнейшей работе в качестве одного из компонентов (радиоантигена) полиантигенного комплекса.

На третьей стадии получают кадмиевое производное радиоантигена - хиноидного радиотоксина. При этом для снижения токсичности комплексного антигена предварительно проводят дехлорирование кадмия хлорида (CdCl₂) путем его щелочного гидролиза с помощью NaCl по реакции:

CdCl₂+2NaOH=Cd(OH)₂+2NaCl.

Для этого готовят водные растворы 1-молярного раствора CdCl₂ (182 г/моль) и 2 молярного раствора NaOH (149,12 г/моль), которые в соотношении 1:2 (например, 100 мл раствора CaCl₂ и 200 мл NaOH) сливают, доводят pH раствора до 7,7-8,0, подогревают до 35-40°C и гидролиз ведут в течение ночи, затем надосадочную жидкость, содержащую растворенный NaCl, декантируют и полученный осадок - гидроксид кадмия (Cd(OH)₂) разводят до концентрации 1% раствора (10 мг/мл) и используют для получения производного радиоантигена.

Радиоантиген, представляющий собой по химическому составу окисленный хинон (o-хинон), т.е. весьма высокореакционноспособный активный радикал со свободной (разорванной) двойной связью в процессе окисления, способный легко присоединять ионы органических (белок, аминокислоты, ферменты) и неорганических (металлы и другие химические агенты) веществ. В свою очередь, гидроксид кадмия - слабый электролит и в водных растворах он гидролизуется на ионы (Cd⁺, OH″) и активный Cd⁺ легко присоединяется к окисленному о-хинону по месту разрыва двойной связи, образуя кадмиевое производное хинона C₆H₁₀OCd.

Для получения кадмиевого производного радиоантигена (КПРА) к определенному объему (например, к 50 мл) 2,7%-ного раствора радиоантигена прибавляют равный объем 0,77%-ного раствора гидроксида кадмия (Cd(OH)₂) и смесь термостатируют при шуттелировании в течение 30 мин при 37°C. Затем растворитель упаривают на вакуумной центрифуге. Осадок растворяют в минимальном количестве воды и добавляют к раствору белка (анатоксина E. coli), используемого в качестве носителя гаптеновой части полиантигена - кадмиевого радиоантигена. Количество кадмиевого радиотоксина составляет 10-кратный молярный избыток по отношению к количеству белка: к 50 мл 1,2%-ного раствора анатоксина E. coli добавляют 50 мл 12,8%-ного раствор кадмиевого радиоантигена.

Реакцию конъюгирования проводят в течение ночи при комнатной температуре.

Для подтверждения стабильности конъюгированного антигена в растворе, измерения молярного соотношения кадмия, радиоантигена и белка в конъюгате проводят спектральный анализ путем измерения оптических плотностей нативных компонентов антигенов (CdCl₂ o-хинона и анатоксина) и самого конъюгированного антигена на спектрофотометре.

Для измерения молярного соотношения кадмиевого производного o-хинона (радиоантигена) и белка используют метод Бредфорда (реагент Бредфорда). Для этого кумасси бриллиантовый синий G-250 (100 мг) растворяют в 50 мл 95% этанола. Затем добавляют 100 мл 85%-ной (мол. об.) фосфорной кислоты, разбавляют водой до 1 л. Используют образец, содержащий 5 мкг белка в 1 мкл. В кювету добавляют 0,5 мл реагента-красителя (реактив Бредфорда), затем вносят 1 мкл образца, хорошо перемешивают. Через 10 мин измеряют оптическую плотность при 595 нм.

Концентрацию белка определяют по калибровочной кривой, построенной с помощью эндотоксина E. coli. Затем по спектру конъюгата определяют молекулярную концентрацию CdCl₂, o-хинона, а затем определяют молекулярное соотношение CdCl₂, o-хинона и белка в конъюгате. Отсутствие в триантигенном комплексе спектров поглощения, характерных для отдельных компонентов, составляющих единый триантигенный комплекс, свидетельствует о стабильности полученного конъюгата.

Полученный по вышеописанной методике триантигенный комплекс - белково-кадмиевый радиоантиген (БКРА), представляющий собой 10%-ный раствор антигенов, содержащий в 1 мл препарата 100 мг антигенного вещества, из которых на долю анатоксина приходится 10 мг, на долю радиоантигена - 78 мг и на долю кадмия - 12 мг, на следующем 4-м этапе используют в качестве иммунизирующего агента для получения антисывороток. Для исключения токсического действия БКРА на организм исходный (10%-ный) раствор антигена разводят в 50 раз, получая таким образом 0,2%-ный рабочий раствор, в 1 мл которого содержится 2 мг антигенного вещества, из которых, согласно вышеприведенному соотношению компонентов, на долю экзотоксинного белка приходится 0,2, мг, радиоантигена - 1,56 мг и кадмия - 0,24 мг.

Для определения антигенной (антителосинтезирующей) активности конъюгированного антигена (БКРА) используют белых мышей, которых иммунизируют по 4-кратной схеме. Первую иммунизацию проводят путем подкожной инъекции 1 мг конъюгата в 500 мкл ПАВ, 2-ю через 2 недели 1 мг конъюгата в 500 мкл ПАВ, 3-ю через 2 недели 1 мг конъюгата в 500 мкл физиологического раствора, 4-ю через 4 недели 1 мг конъюгата в 500 мкл физиологического раствора.

Для тестирования антисывороток через неделю после 4-й иммунизации у животных отбирают по 50 мкл крови из яремной вены.

Учитывая, что оптимальным методом определения количества антител является иммуноферментный анализ (ИФА), а более доступным и простым его вариантом - непрямой конкурентный метод, при тестировании антисыворток используют последний вариант тест-системы.

Для проведения непрямого конкурентного анализа ИФА приготавливают иммунологические планшеты. Для этого готовят рабочий раствор конъюгата БКРА с концентрацией 10 мкг/мл. В каждую лунку планшета вносят 50 мкл полученного раствора и инкубируют в шейкере-инкубаторе в течение 1 ч при 37°C, 500 об/мин. Промывают планшет 3 раза фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) pH 7,2 с 0,05% Tween-20. Затем, для предотвращения неспецифической сорбции реагентов, вносят в каждую лунку планшета 100 мкл 2%-ного раствора экзотоксина (анатоксина) E. coli в ФСБ и инкубируют 30 мин при 37°C, 500 об/мин. После этого планшет промывают 5 раз раствором ФСБ (pH 7,2) с 0,05% Tween-20.

В готовые планшеты вносят по 50 мкл последовательных двукратных разведений полученных гипериммунных антисывороток (начиная с 1:2 и заканчивая 1:1024). Каждое разведение вносят в 2 повторностях (т.е. по 2 лунки на каждое разведение).

Инкубируют планшет 1 ч при 37°C, 500 об/мин в шейкере-инкубаторе. Затем промывают планшет 3 раза раствором ФСБ (pH 7,2) с 0,05% Tween-20 и вносят раствор антимышиных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, в ФСБ с 1% экзотоксином E. coli. Инкубируют 1 ч при 37°C, 500 об/мин в шейкере-инкубаторе и промывают планшет 5 раз раствором ФСБ (pH 7,2) с 0,05% Tween-20. Вносят субстрат для пероксидазы хрена (3,3', 5,5' -тетраметилбензидин). Инкубируют 10 мин при комнатной температуре, после чего останавливают цветовую реакцию добавлением равного объема (50 мкл) 1М серной кислоты (H₂SO₄). В планшетном спектрофотометре регистрируют поглощение при 450 нм, титры полученных сывороток в зависимости от срока иммунизации составляют 1:64-1:500.

Для подтверждения специфичности полученных антисывороток по отношению к свободному анатоксину E. coli, радиотоксину и экотоксиканту - кадмия хлориду их исследуют методом конкурентного ИФА, в ходе которого проверяют взаимодействие сывороток со свободными антигенами, составляющими конъюгированный антиген (БКРА). Для этого сыворотки при выбранном разведении вносят в лунки подготовленного микропланшета с различными разведениями свободных экзотоксина (анатоксина) E. coli, радиотоксина (радиоантигена) и кадмия хлорида. Они ингибируют взаимодействие сывороток с конъюгатом БКРА, сорбированным на твердой фазе (т.е. антитела взаимодействуют со свободными экзотоксином E. coli, радиотоксином и кадмия хлоридом), о чем судят по изменению оптической плотности при 492 нм. Уменьшение оптической плотности от 0,7 до 0,3 (при добавлении анатоксина E. coli) от 0,5 до 0,05 (при добавлении радиоантигена) и от 0,45 до 0,12 (при добавлении CdCl₂) свидетельствует о наличии в исследуемых сыворотках специфических антиэшерихиозных, антирадиотоксических и антикадмиевых антител, которые способны взаимодействовать со свободными иммунотоксическими агентами - экзотоксином E. coli, радиотоксином и экотоксикантом - CdCl₂ в организме, нейтрализовать их, оказывая, таким образом, антитоксический эффект как при изолированном, так и сочетанном поступлении их в организм.

Таким образом, антисыворотки, полученные путем иммунизации животных комплексным полиантигеном (БКРА), представляют собой поликлональные антитела с различной иммунологической компетентностью, обладающие способностью вступать в химическую связь с экотоксикантами (радиотоксины, экзотоксины, тяжелые металлы), что является основанием для испытания их в качестве средств экстраиммунной терапии, при поражении организма агентами физической (у-лучи), химической (экотоксикант - CdCl₂) и биологической (E. coli) природы.

Для стандартизации иммунохимического состава антител и повышения их терапевтической активности из антисывороток выделяют глобулины в соответствии с общепринятыми в иммунохимии методами (см. кн. «Экспериментальная иммунохимия». Под ред. Н.В. Холчева. - М.: Медицина. -1968. - 665 с), осадок глобулинов разводят до 10%-ной концентрации (100 мг/мл), фасуют в стерильные стеклянные флаконы емкостью 500 см³, стерилизуют и хранят в холодильнике при 4-6°C.

Полученный 10%-ный раствор глобулинов вводят облученным, больным эшерихиозом и пораженным кадмия хлоридом животным однократно подкожно в дозах 20-25 мг/кг по белку (0,4 мл/кг).

Способ получения конъюгированного антигена и многофункционального лечебного глобулина иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для получения эшерихиозного анатоксина энтеротоксигенные вирулентные штаммы E. coli №378, 379, 380 засевали в двухлитровые колбы со средой Хоттингера (pH 7,8), выращивали в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 дней при температуре 35, 36, 37, 38, 39°C. Затем к культуре добавляли формалин до концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 и 0,7%, выдерживали в термостате при 35, 36, 37, 38°C в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 дней. Полученный анатоксин осаждали 5, 7, 9, 10, 12, 14%-ным стерильным раствором гидроокиси алюминия (ГОА) из расчета 0,5, 0,7, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2% на весь объем. Результаты опытов показали, что наиболее высокой биологической активностью обладает смесь анатоксинов, полученных из трех штаммов E. coli №№378, 379 и 380, выращенных на среде Хоттингера в течение 24 ч с последующим добавлением формалина из расчета 0,4-0,5% и термостатирования культур при 37°C в течение 10-12 дней, и осаждения смеси алюминия из расчета 1 об.%. Любые изменения параметров инкубирования культур (температуры, экспозиции), концентрации формалина и количества штаммов-продуцентов приводило к снижению биологической активности анатоксинов.

Пример 2. Для получения второго компонента - радиоантигена (окисленного о-хинона), штамм E. coli «ПЛ-6» высевали на плотную питательную среду (МПА) и выращивали при 37°C в течение 24, 48, 72 ч. Затем биомассу смывали физиологическим раствором, центрифугировали при 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 об/мин, повторяя эту процедуру 1, 2, 3, 4, 5 раз. Осадок, ресуспендировали в физиологическом растворе из расчета 1,0·10¹⁰, 1,1·10¹⁰, 1,2·10¹⁰, 1,3·10¹⁰, 1,4·10¹⁰ м.к./см³ и облучали на гамма-установке «Исследователь» в дозах 50, 100, 200, 250, 300 Гр при мощности дозы 2,064 Кл. После облучения культуру инактивировали при 35, 36, 37, 38, 39°C в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 ч и проводили экстрагирование радиотоксина с использованием 50, 60, 70, 80, 90%-ного подкисленного (0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05 0,06, 0,07% HCl) до pH 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7 этанола, повторяя эту операцию 2, 3, 4, 5 раз. Полученные экстракты упаривали на роторном испарителе при 10, 15, 20, 25°C до исходного объема и нейтрализовали 0,05, 0,07, 0,1, 0,2, 0,3 н. КОН до pH 6,4, 6,5, 6,7, 6,8, 7,0, 7,1 и 7,2. Результаты опытов показали, что наиболее активные препараты радиотоксина (радиоантигена) получены при выращивании E. coli «ПЛ-6» при 37°C в течение 24 ч, облучении суспензии микроба с концентрацией 1,2-10¹⁰ м.к./см³, в дозе 140-150 Гр, термостатировании в течение 3,5-4,5 при 37°C, этаноловом экстрагировании культуры подкисленным (0,05 HCl) до pH 5,5-5,6, упаривании экстрагента при 37°C. Любые изменения указанных параметров в сторону уменьшения или увеличения приводят к снижению биологической активности радиотоксина.

Пример 3. Для получения кадмиевого радиоантигена (хиноидного РТ) с целью снижения токсичности кадмия хлорида и повышения его реакционной способности вначале проводили его дехлорирование путем гидролиза CdCl₂ концентрированным раствором щелочи (NaOH). Для этого готовили насыщенные (40, 50, 60%-ные) растворы щелочи и CdCl₂ и смешивали их в молярных соотношениях (г/моль) CdCl₂+NaOH 0,5:0,5, 1:1, 1:1,5, 1:2, 1:2,5, 1:3. Гидролиз вели при 20, 25, 30, 35, 40°C в течение 10, 15, 20, 25, 30-часовой экспозиции. По истечении указанных экспозиций надосадок удаляли. Установлено, что максимальный выход гидроксида кадмия которого достигался при молярном соотношении компонентов (CdCl₂+NaOH) 1:2 при 10-12-часовой экспозиции и температуре 35°C.

Пример 4. Для получения кадмиевого радиоантигена к 10, 20, 30, 40, 50 мл 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 2,7, 2,9, 3,0%-ного раствора радиоантигена прибавляли 10, 20, 30, 40, 50 мл 0,50, 0,60, 0,65, 0,70, 0,73, 0,77, 0,80, 0,85%-ные растворы гидроксида кадмия (Cd(OH)₂) и смесь инкубировали в термостате при 25, 30, 35, 37, 39, 40°C в течение 10, 15, 20, 25, 30, 35 мин.

Результаты спектрального анализа показали, что максимальный выход конечного продукта - кадмиевого радиоантигена достигается при соотношении компонентов 3:1, т.е. при добавлении к 50 мл 2,7%-ного раствора 0,77%-ного раствора кадмия гидроксида, что составляло соотношение 3:1. Любые изменения указанного соотношения приводили к уменьшению выхода конечного продукта.

Пример 5. Для получения конъюгированного белково-кадмиевого радиоантигена (БКРА) готовили 0,03-, 0,06-, 0,07-, 0,08-, 0,09-, 0,1-, 0,2-, 0,3-молярные растворы экзобелка (анатоксина E. coli) и 0,5-, 0,6-, 0,7-, 0,8-, 0,9-, 1,0-, 2,0-, 3,0- молярные растворы кадмиевого радиоантигена и к 50 мл растворов каждого разведения экзобелка прибавляли по 50 мл растворов кадмиевого радиоантигена, реакцию конъюгирования проводили в течение 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 часов при 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36°C.

По истечении указанных экспозиций определяли стабильность конъюгированного антигена и оптимальные молярные соотношения компонентов в полиантигене методом спектрального анализа путем измерения оптических плотностей нативных компонентов антигенов (CdCl₂, o-хинона и анатоксина) и самого конъюгированного антигена на спектрофотометре (например, СФ-46). В качестве показателя стабильности полученного антигенного комплекса служило отсутствие в триантигенном комплексе спектров поглощения, характерных для отдельных компонентов полиантигена, а молярные соотношения CdCl₂, o-хинона и экзобелка E. coli в полиантигене определяли путем измерения оптических плотностей растворов с различными молярными соотношениями отдельных компонентов и самого конъюгата. Установлено, что значения оптических плотностей полиантигена и отдельных компонентов (экзобелок-анатоксин E. coli: радиоантиген: кадмий) совпадали при молярных соотношениях компонентов 1:7,8:1,2 соответственно.

Пример 6. Для определения антигенности (антителосинтезирующей) активности полученного белково-кадмиевого радиоантигена (БКРА) проводили иммунизацию белых мышей. Использовали 2 группы экспериментальных животных, каждая из которых состояла из 5 особей. Первая группа получала полиантиген внутрибрюшинно, вторая - подкожно. Использовали 4-кратную схему иммунизации с варьированием доз (0,25, 0,50, 1,0, 1,5 мг антигена) и интервала (через 2, 4, 6 недель) между введениями конъюгата.

Результаты тестирования антисывороток в прямом варианте ИФА показали, что наибольший титр антител был обнаружен у животных, подвергнутых по 2 схеме иммунизация (2-я группа), предполагающей 4-кратное подкожное введение антигена с интервалом 2 (1-я, 2-я, 3-я инъекция) и 4 недели (4-я инъекция) в дозах 1 мг БКРА+500 мкл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) (1-я инъекция), 1 мг БКРА+500 мкл неполного адъюванта Фрейнда (НАФ) (2-я инъекция), 1 мг БКРА+500 мкл физиологического раствора (3-я и 4-я инъекция соответственно).

Пример 7. Для оценки радиозащитной, антиэшерихиозной и антикадмиевой активности полиглобулина опыты ставили на облученных в дозе 7,7 Гр, затравленных кадмия хлоридом в дозе 50,8 мг/кг и зараженных возбудителем эшерихиоза 1·10⁹ м.к. белых мышах, которым за 24 ч до и через 24 ч после облучения, затравки CdCl₂ и заражения возбудителем эшерихиоза вводили подкожно однократно глобулины в дозах 0,12 (6 мг/кг), 0,25 (12 мг/кг), 0,5 (25 мг/кг), 1,0 мг (50 мг/кг). Перед применением исходный препарат (10%-ный раствор глобулина) разводили в 2, 4 и 8 раз, получая, таким образом, 5, 2,5 и 1,25%-ные концентрации препарата.

Установлено, что максимальная радиозащитная (выживаемость 66,6% облученных животных), антиэшерихиозная (выживаемость 59,1% зараженных возбудителем эшерихиоза животных) и антидотная (выживаемость 61,9% затравленных CdCl₂ животных) наступала при однократном подкожном введении глобулинов в дозе 25 мг/кг. Изменение дозы препарата в сторону снижения приводило к снижению лечебного эффекта, а повышение - к увеличению расхода препарата. Следовательно, оптимальной лечебной дозой препарата является 25 мг/кг по белку.

Таким образом, сконструированный конъюгированный полиантигенный препарат позволяет получать поликлональные антитела - глобулины, обладающие полифункциональными лечебными свойствами при экопаталогиях, вызванных агентами радиационной, химической и/или биологической природы.

Группа изобретений относится к ветеринарии и медицине, в частности к получению и использованию биопрепаратов для иммунотерапии экопатологий. Группа изобретений включает получение белкового антигена из смеси анатоксинов из трех энтеропатогенных вирулентных штаммов возбудителя эшерихиоза телят E. coli №378, 379, 380 путем выращивания их на среде Хоттингера с последующим добавлением 0,4-0,5%-ного формалина, дальнейшим термостатированием в течение 10-12 дней и охлаждением смеси анатоксинов стерильным раствором гидроокиси алюминия, затем получения радиоантигена из E. coli «ПЛ-6» путем выращивания культур на мясопептонном агаре с последующим смывом биомассы физиологическим раствором и облучением полученной суспензии с концентрацией 1,2·10¹⁰ м.к./см³ на гамма-установке в дозе 140-150 Гр с дальнейшим термостатированием и экстрагированием радиотоксина 70%-ным подкисленным 0,05%-ной соляной кислотой до pH 5,5 этанолом, последующим упариванием экстрагента до исходного объема, далее получение белково-кадмиевого радиоантигена сначала путем предварительного дехлорирования кадмия хлорида, получения гидроокиси кадмия, добавления в полученный 2,7%-ный раствор радиоантигена 0,77%-ного раствора гидроокиси кадмия в соотношении 1:1 с последующим термостатированием при температуре 37°C в течение 30 мин, упариванием и растворением осадка до 12,8%-ной концентрации, дальнейшим получением белково-кадмиевого радиоантигена путем добавления 1,2%-ного раствора смеси трех анатоксинов E. coli и 12,8%-ного раствора кадмиевого радиоантигена в соотношении 1:9, конъюгирования компонентов при комнатной температуре в течение 8-10 часов, стандартизацию по сухому веществу до 10%-ной концентрации и розлив во флаконы, хранение при температуре 4-6°C. Группа изобретений также относится способу лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма введением 10%-ного раствора комплексного белково-кадмиевого радиоантигена. Применение группы изобретений эффективно в лечении радиационного, химического и/или биологического поражения. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 пр.

1. Способ получения глобулинов для лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма, предусматривающий сначала получение белкового антигена из смеси анатоксинов из трех энтеропатогенных вирулентных штаммов возбудителя эшерихиоза телят E. coli №378, 379, 380 путем выращивания их на среде Хоттингера с последующим добавлением 0,4-0,5%-ного формалина, дальнейшим термостатированием при температуре 37°C в течение 10-12 дней и охлаждением смеси анатоксинов стерильным раствором гидроокиси алюминия, затем получения радиоантигена из E. coli «ПЛ-6» путем выращивания культур на мясопептонном агаре в течение 48 часов с последующим смывом биомассы физиологическим раствором и облучением полученной суспензии с концентрацией 1,2·10¹⁰ м.к./см³ на гамма-установке в дозе 140-150 Гр с дальнейшим термостатированием в течение 3,5-4,5 часов при температуре 37°C и экстрагированием радиотоксина 70%-ным подкисленным 0,05%-ной соляной кислотой до pH 5,5 этанолом, последующим упариванием экстрагента на роторном испарителе при температуре 20°C до исходного объема, и далее получения белково-кадмиевого радиоантигена сначала путем предварительного дехлорирования кадмия хлорида, получения гидроокиси кадмия, а затем в полученный 2,7%-ный раствор радиоантигена добавляют 0,77%-ный раствор гидроокиси кадмия в соотношении 1:1 с последующим термостатированием при температуре 37°C в течение 30 мин, упариванием и растворением осадка до 12,8%-ной концентрации, дальнейшим получением белково-кадмиевого радиоантигена путем добавления 1,2%-ного раствора смеси трех анатоксинов E. coli и 12,8%-ного раствора кадмиевого радиоантигена в соотношении 1:9, конъюгирования компонентов при комнатной температуре в течение 8-10 часов, стандартизации по сухому веществу до 10%-ной концентрации и розлива во флаконы, хранения при температуре 4-6°C.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дехлорирование кадмия хлорида проводят путем щелочного гидролиза с использованием, например, едкого натрия в соотношении 1:2 соответственно, подогревают до температуры 40-45°C, гидролиз ведут в течение ночи, надосадочную жидкость, содержащую растворенный NaCl, декантируют, а полученный осадок - гидроокись кадмия разводят до 1%-ной концентрации и используют для получения белково-кадмиевого радиоантигена.

3. Способ лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма, предусматривающий введение 10%-ного раствора комплексного белково-кадмиевого радиоантигена, полученного способом по пп.1, 2, который четырехкратно подкожно вводят животным, получают гипериммунную антисыворотку, затем выделяют из нее глобулины, которые вводят однократно подкожно в дозе 20-25 мг/кг по белку пораженным животным.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что четырехкратное подкожное введение 10%-ного раствора комплексного белково-кадмиевого радиоантигена проводят с интервалом 2 недели (1-я, 2-я, 3-я инъекции), затем с интервалом 4 недели - 4 инъекция, в дозе 1 мг белково-кадмиевого радиоантигена + 500 мкл полного адъюванта Фрейнда для 1-й и 2-й инъекций и в дозе 1 мг белково-кадмиевого радиоантигена + 500 мкл физиологического раствора для 3-й и 4-й инъекций, а через 7 дней после последней инъекции антигена берут пробы крови и полученные антисыворотки тестируют в непрямом варианте ИФА на наличие антиэшерихиозных, антикадмиевых и антирадиотоксических поликлональных антител, а затем из них выделяют глобулины путем высаливания сульфатом аммония.