Производные пиридинов со свойствами Epac-ингибиторов Российский патент 2025 года по МПК C07D213/42 C07D213/75 C07D213/76 A61K31/4425 A61P9/00 

Производные пиридинов со свойствами Ерас-ингибиторов

Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к биологически активным соединениям, обладающим кардиотропной активностью, конкретно к новой группе гидрохлоридов или бромидов замещенных производных пиридинов общей формулы (1):

где два или несколько из заместителей R¹-R⁶ являются алкильными группами, при этом остальные заместители являются водородами; заместитель R⁷ может быть этильной группой или отсутствовать; один из атомов X, Y, Z является атомом азота, при этом остальные являются атомами углерода, связанными с водородом; n может быть равным 0 или 1; атом А является атомом серы или углерода, при этом если А - атом серы, то W является атомом кислорода, а если А является атомом углерода, то W отсутствует.

Изначально полагали, что единственным аллостерическим эффекторм сАМР является открытый в 1968 году фермент - сАМР-зависимая протеинкиназа или протеинкиназа А (РКА). Однако в декабре 1998 года был идентифицирован сАМФ зависимый белок, который без участия РКА активировал малые GEF-азы (cAMP-GEFs) Rap суперсемейства белков Ras (Rat sarcoma) [Kawasaki H, Springett GM, Mochizuki N, et al. Science. 1998; 282(5397): 2275]. Этот белок получил название сАМР-регулируемый фактор обмена гуанидиновых нуклеотидов (cAMP-GEF) или обменный белок напрямую активируемый сАМР (exchange protein directly activated by сАМР, Epac) [de Rooij J, Zwartkruis FJ, Verheijen MH, et al. Nature. 1998; 396(6710): 474].

Показано, что белки Epac играют ключевую роль в регуляции базисных внутриклеточных сигнальных путей ответственных за поддержание внутриклеточного гомеостаза, а их гипер/гипоэкспрессия лежит в основе патогенеза многих патологических процессов, что позволяет рассматривать их как принципиально новую биомишень для создания оригинальных, высокоэффективных лекарственных средств [Munoz-Llancao Р, Henriquez DR, Wilson С, et al. J Neurosci. 2015; 35(32): 11315].

Выделяют две изоформы сигнальных белков Epac - Epacl или cAMP-GEF-I (молекулярная масса около 100kDa) и Ерас2 или cAMP-GEF-II (молекулярная масса около 110kDa), которые кодируются различными генами. У людей Epacl кодируется геном RapGEF3, содержащим 28 экзонов и расположенном на 12-ой хромосоме (12q13.11: 47,734,367-47,771,041), в то время как ген Ерас2, RapGEF4, расположен на хромосоме 2 (2q31.1) и содержит 31 экзон [Banerjee U, Cheng X. Gene. 2015; 570(2): 157]. Сигнальные белки Epac (Epacl и Ерас2), близки к друг другу и по своей структуре, являются мультидоменными белками содержащими NH₂-концевую регуляторную область и СООН-концевой каталитический регион [Dao КК, Teigen К, Kopperud R, et al. J Biol Chem. 2006; 281(30): 21500]. Сигнальные белки Epac1 и Epac2 реализуют свои внутриклеточные эффекты как самостоятельно, так и в связке с РКА [Fujita Т, Umemura М, Yokoyama U, et al. Cell Mol Life Sci. 2017; 74(4): 59123; Lezoualc'h F, Fazal L, Laudette M, Conte C. Circ Res. 2016,118(5), 881].

В кардиомиоцитах экспрессируются как белки Epac1, так и белки Ерас2. В экспериментах in vitro выполненных на культуре кардиомицитов мышей показано, что экспресиия белков Epac1 у взрослых животных по сравнению с новорожденными увеличивается на 42%, тогда как белков Ерас2 в 3,7 раза [Ulucan С, Wang X, Baljinnyam Е, et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007; 293(3): Н1662]. В кардиомиоцитах локализация белков Epac различна, с чем во многом и связаны различия в их функциональной активности. Белки Epacl располагаются в близи внутренней поверхности клеточной мембраны, на мембране митохондрий, на перинуклеарной мембране и возможно в ядре клетки, тогда как белки Ерас2 локализуются в области Z-линий рядом с Т-трубочками вблизи которых сосредоточено скопление цистерн саркоплазматического ретикулума [Pereira L, Rehmann Н, Lao DH, et al. Proc Natl Acad Sci. USA. 2015; 112(13): 3991].

В нормальных физиологических условиях белки Epacl регулирют инотропную функцию сердца [Oestreich ЕА, Wang Н, Malik S, et al. J Biol Chem. 2007; 282(8): 5488], процессы межклеточного сопряжения кардиомиоцитов [Duquesnes N, Derangeon M, Metrich M, et al. Pflugers Arch. 2010; 460(4): 731; Lee TM, Lin SZ, Chang NC. PLoS One. 2013; 8(8): e71878], подавляет NO- и ROS-индуцированный апоптоз кардиомиоцитов [Wu ХМ, Ou QY, Zhao W, et al. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2014; 122(10): 608]. Однако, избыточная активация/экспрессия белков Epac1, опосредованная β₁-адреностимуляцией, что клинически соответствует ситуации наблюдаемой у пациентов, страдающих хронической сердечной недостаточностью различного генеза, приводит к развитию гипертрофии/ремоделирования сердечной мышцы [Metrich М, Lucas A, Gastineau М, et al. Circ Res. 2008; 102(8): 959; Metrich M, Laurent AC, Breckler M, et al. Cell Signal. 2010; 22(10): 1459], инициирует развитии фиброза миокарда [Yokoyama U, Patel HH, Lai NC, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(17): 6386; Yokoyama U, Patel HH, Lai NC, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(17): 6386].

Помимо этого, к настоящему времени показано, что в условиях острой ишемии миокарда активация белка MitEpacl сопровождается гибелью кардиомиоцитов, которая в условиях целостного организма манифистируется увеличением зоны инфаркта [Fazal L, Laudette М, Paula-Gomes S, et al. Circ Res. 2017; 120(4): 645].

В отличие от белков Epacl, белки Ерас2 преимущественно контролируют ритмическую активность сердца по средствам регуляции внутриклеточного гомеостаза ионов Са²⁺ и процессов электро-механического сопряжения кардиомиоцитов [Cazorla О, Lucas A, Poirier F, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106: 14144], а их избыточная активность инициирует аритмогенез [Pereira L, Cheng H, Lao DH, et al. Circulation. 2013; 127(8): 913; Bobin P, Varin A, Lefebvre F, et al. Cardiovasc Res. 2016; 110(1): 151]. Аритмогенные эффекты белков Epac2 реализуются по средствам активации CaMKIIδ которая, в свою очередь, фосфорилирует RyR2 и как следствие этого диастолическую не зависимую от РКА «утечку» ионов Са²⁺ из цистерн саркоплазматического ретикулума [Neef S, Heijman J, Otte К, et al. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2017; 390(8): 857; Li M, Hothi SS, Salvage SC, et al. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2017; 44(6): 686].

Таким образом, к настоящему времени накоплен достаточно убедительный материал о вкладе белков Ерас в формирование таких патологических процессов как гипертрофия, ремоделирование, фиброз миокарда и нарушение сердечного ритма создает фундаментальную базу для поиска оригинальных лекарственных средств на основе селективных блокаторов белков Epac1 и Ерас2, что позволит обеспечить новые терапевтические направления для лечения аритмий, сердечной недостаточности и ремоделирования сердца и сосудов [Tan YQ, Li J, Chen HW. Biomed Pharmacother. 2022; 148: 112726].

Сущность изобретения.

Целью настоящего изобретения является поиск новых биологически-активных соединений, обладающих свойствами Ерас-ингибиторов, в ряду производных пиридина общей формулы (1).

Соединения общей формулы (1), их свойства и способ получения в. специальной и патентной литературе не описаны.

В качестве примеров соединений формулы (1) настоящего изобретения следует назвать:

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала лекарственных средств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, обладающих свойствами Ерас-ингибиторов.

Дизайн замещенных производных пиридинов с потенциальными свойствами Ерас-ингибиторов

Анализ существующих соединений, обладающих свойствами Ерас-ингибиторов, позволяет идентифицировать отдельную группу веществ, соответствующих обобщенной фармакофорной модели, представленной на фигуре 1. В эту модель входят два ароматических фрагмента, один из которых, как правило, более объемный. Данные фрагменты связаны между собой коротким линкером с акцептором водородной связи.

На основании полученной фармакофорной модели была предложена группа гидрохлоридов или бромидов замещенных производных пиридинов общей формулы (1), в которых первым ароматическим фрагментом является пиридиновое кольцо, а вторым, объемным ароматическим фрагментом, являются различные метил-замещенные фенильные группы. В роли связывающего линкера и акцептора водородной связи была выбрана амидная или сульфамидная группа, в некоторых случаях дополненная метиленовой группой. В соответствии с настоящим изобретением в соединениях общей формулы (1) два или несколько из заместителей R¹-R⁶ являются алкильными группами, при этом остальные заместители являются водородами; заместитель R⁷ может быть этильной группой или отсутствовать; один из атомов X, Y, Z является атомом азота, при этом остальные являются атомами углерода, связанными с водородом; n может быть равным 0 или 1; атом А является атомом серы или углерода, при этом если А - атом серы, то W является атомом кислорода, а если А является атомом углерода, то W отсутствует.

Докинговые исследования

Пространственная структура Ерас2 в неактивной форме представлена в Protein Data Bank (Идентификатор 2BYV). Wild et al. [Wild CT, Zhu Y, Na Y, et al. ACS Med. Chem. Lett. 2016; 7(5): 460] была выдвинута гипотеза о наличие особого сайта связывания неактивной формы Ерас2 на поверхности двух CNBD - доменов в данной конформации.

Лигандами данного сайта связывания являются малые биароматические молекулы типа ESI-05. Связываясь с поверхностями двух CNBD-доменов, эти соединения стабилизируют неактивную форму Ерас2. Ключевыми аминокислотными остатками данного сайта связывания являются LYS 42 и HIS 335. На фигуре 2 представлены модели связывания соединений типа ESI-05 с сайтом связывания Ерас2.

С использованием гипотезы о сайте связывания ингибиторов на поверхности двух CNBD - доменов неактивного белка Ерас2 был осуществлен молекулярный докинг сконструированных соединений в этот сайт. Докинговые исследования проводили в программе Schrodinger с использованием указанной выше пространственной структуры белка Ерас2 в неактивном состоянии (PDB ID: 2BYV).

В результате было установлено, что соединения сконструированной группы арилсульфониламинопиридинов обладают хорошей тропностью к предполагаемому сайту связывания Ерас2-ингибиторов, превосходя известные соединения (ESI-05 и подобные).

На фигуре 3 представлены результаты молекулярного докинга одного из сконструированных соединений в сайт связывания ингибиторов Ерас2 в 2D- и 3D-проекциях. Ключевыми взаимодействиями «лиганд-рецептор» в этом случае является π-катионное взаимодействие фенильного кольца молекулы с остатком LYS42 и гидрофобное взаимодействие молекулы с последовательностью GLU332-HID335-ILE336-LYS337-ALA338.

Синтез заявляемых производных пиридинов.

Представляемые в настоящем изобретении соединения общей формулы (1) можно получить по следующей схеме:

Пиридин-содержащие амины (3) вводят во взаимодействие с хлорангидридами бензойных или арилсульфонильных кислот (4) в хлористом метилене, в присутствии триэтиламина в качестве основного катализатора, в результате чего образуются соответствующие замещенные производные пиридина (1). Для получения солей (2) основания (1) вводят во взаимодействие с кислотами HG. Для получения четвертичных аммонийных солей (2') основания (1) вводят во взаимодействие с алкилгалагенидами при нагревании.

Строение веществ общей формулы (1) подтверждено данными спектров ЯМР ¹Н и ЯМР ¹³С, а их чистота - данными ТСХ.

Для определения физико-химических характеристик новых веществ использовали следующую аппаратуру. Температуры плавления определяли на приборе Optimelt МРА100 (Stanford Research Systems, США) в открытых капиллярах без корректировки. Строение целевых и промежуточных соединений устанавливали методами одномерной ¹Н-,¹³С-ЯМР спектроскопии и двумерной (COSY - гомоядерная корреляция, HSQC -гетероядерная одноквантовая корреляция) ЯМР-спектроскопии. Спектры ¹Н- и ¹³С-ЯМР регистрировали в шкале δ, м. д. на спектрометре Bruker FOURIER 300 HD (Bruker Corporation, Leipzig, Germany, 300 и 75 МГц для ядер ¹Н- и ¹³С соответственно) в растворах CDCl₃, внутренний стандарт тетраметилсилан (0 м.д.). Константа спин-спинового взаимодействия J, Гц.

Для обозначения резонансных сигналов использовали следующие сокращения: с -синглет, д - дублет, т - триплет, м - мультиплет. Тонкослойную хроматографию (ТСХ) выполняли на алюминиевых силикагелевых пластинах DC-Kieselgel 60 G/F₂₅₄ (Merck, Германия) с обнаружением в УФ-свете и парах иода. Элюент 1 для ТСХ: толуол: ацетон: метанол: триэтиламин (70:45:15:5); элюент 2 для ТСХ: этилацетат:гексан (1:3).

Пример 1. Гидрохлорид N,2,4,6-тетраметил-N-(пиридин-4-ил)бензолсульфонамида.

a. Общая методика синтеза производных арилсульфониламинопиридинов

В 3-горлой круглодонной колбе объемом 100 мл, снабженной хлоркальциевой трубкой, термометром и капельной воронкой с противодавлением, растворяют 15 ммоль N-замещенного пиридинамина в 10 мл хлористого метилена, далее приливают 0,025 моль триэтиламина. Колбу охлаждают до температуры -10°С и прикапывают раствор 18 ммоль замещенного бензол-1-сульфонилхлорида в 30 мл хлористого метилена. Следят, чтобы при прибавлении температура не превышала 0°С. После завершения прибавления раствор оставляют перемешиваться при комнатной температуре в течение 48 ч. Контроль за протеканием реакции обеспечивают при помощи ТСХ. После завершения реакции смесь промывают водным раствором соли (9 г NaCl на 100 мл воды, 2×50 мл), органическую фазу сушат и упаривают на РПИ. Получившейся осадок очищают колоночной хроматографией на оксиде аллюминия (III) в качестве эллюента используется хлористый метилен. Далее осадок перекристаллизовывают из смеси этилацетата и гексана (1:1). Получившиеся кристаллы фильтруют и промывают небольшим количеством гексана, затем сушат. Полученное вещество (15 ммоль) растворяют в 15 мл изопропилового спирта при нагревании, доводят до кипения и добавляют эквимолярное количество НС1 конц (1 мл), охлаждают до комнатной температуры и убирают в холодильник на 24 часа. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и высушивают в сушильном шкафу при 70°С в течение 3 часов.

б. Гидрохлорид N,2,4,6-тетраметил-N-(пиридин-4-ил)бензолсульфонамида (ZMEI-3).

Пример 4. Гидрохлорид N,2,4,6-тетраметил-N-(пиридин-3-ил)-бензолсульфонамида (ZMEI-16).

Получают в соответствии с примером 1 (пункт а) из 2,4,6-триметилбензолсульфонилхлорида и N-метилпиридин-3-амина.

Пример 11. Синтез гидрохлорида N,2,4,6-тетраметил-N-(пиридин-4-ил)бензамида (ZMEI-7).

Пример 12. Синтез 1-этил-4-((N,2,4,6-тетраметилфенил)сульфонамидо)пиридин-1-иум бромида (ZMEI-14).

Растворяют 1 г (3,44 ммоль) N,2,4,6-тетраметил-N-(пиридин-4-ил)бензолсульфонамида в 10 мл в герметичном сосуде, который помещают в нагревательный аппарат, и смесь выдерживают при температуре 70°С в течение 18 часов. Декантируют растворитель с выпавшего смолообразного осадка после охлаждения реакционной смеси, остаток заливают 10 мл этилацетата и растирают. Осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом и высушивают в вакууме. Выход 98%.

Экспериментальная фармакологическая часть

Животные содержались в стандартных условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологи имени В.В. Закусова» при контролируемом освещении (12 ч - свет/ 12 ч -темнота) и постоянной температуре (+21-+23°С) со свободным доступом к воде и брикетированному корму в течение 10 суток до начала тестирования. Условия содержания соответствовали ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур» (Переиздание) и ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами» (Переиздание). Все работы с лабораторными животными были выполнены в соответствии с общепринятыми нормами обращения с животными, на основе стандартных операционных процедур, принятых в НИИ фармакологии имении В.В. Закусова, международными правилами (European Communities Council Directive of November 24, 1986 (86/609/EEC), а также в соответствии с «Правилами работы с животными», утвержденными биоэтической комиссией ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»

Пример 13. Скрининг в экспериментах in vitro целевой кардиотропной активности производных пиридинов, потенциально обладающих свойствами ингибиторов белков Ерас

Метод «Изолированная полоска миокарда»

Исследования выполнены на беспородных крысах-самцах в возрасте 3 месяцев. Наркотизированных животных (уретан 1300 мг/кг, в/б) фиксировали в положении на спине, после чего быстро извлекали сердце и помещали его в чашку Петри с оксигенированным карбогеном (95% О₂ и 5% СО₂) охлажденным раствором Кребса-Хенселайта (рН=7,4). Состав раствора Кребса-Хенселайта в мМ: NaCl-121; KC1-4,69; KH₂PO₄-1,1; NaHCO₃-23,8; MgSO₄-1,6; CaCl₂-1,6; ЭДТА-0,032; D-глюкоза-8.

Параллельно продольной оси правого желудочка сердца крыс иссекали полоску миокарда длиной 8-12 и шириной 1-2 мм, один конец которой крепили вертикально к нержавеющему металлическому стержню, а второй - к изометрическому датчику силы (Radnoti) при помощи лигатуры. Полоску располагали таким образом, чтобы ее середина оказалась между двумя платиновыми электродами, расположенными по бокам на расстоянии 2-3 мм от нее. Затем ткань помещали в резервуар объемом 5 мл, заполненным раствором Кребса-Хенселайта, параметры которого описаны выше.

Сокращение полоски миокарда вызывали одиночными прямоугольными импульсами (4 мс, 10 В, 1 Гц) с помощью электростимулятора HSE (Германия). Период адаптации ткани перед исследованием длился 40-60 мин, в течение которого постепенно повышали температуру раствора (до 38,0°С) и корректировали натяжение полоски до уровня, при котором она генерировала максимальную силу сокращения.

Для регистрации сокращений полосок использовали систему регистрации данных PowerLab 8/35, а для обработки полученных результатов - программное обеспечение LabChart 7 Pro.

Статистическая обработка полученных данных: нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка, гомогенность дисперсий - с помощью критерия Левена. Так как распределение многих выборок отличалось от нормального, то для определения статистической значимости различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Полученные результаты выражали в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей. Критический уровень значимости составлял α=0,05.

В эксперимент включали только полоски миокарда правого предсердия, обладающие собственным автоматизмом. Биологическую активность изучаемых соединений под шифрами ZMEI-3, ZMEI-7, ZMEI-14, ZMEI-15, ZMEI-18, ZMEI-19 и ZMEI-22 оценивали в следующем диапазоне концентраций: 10^-6 М, 10^-5 М, 2×10^-5 М, 3×10^-5М, 5×10^-5М и 10^-4М.

Согласно полученным результатам соединения, ZMEI-7 и ZMEI-14 в диапазоне изученных концентраций не влияют на автоматизм изолированной полоски миокарда правого предсердия (фиг. 4). Иная картина наблюдается при внесении в перфузат соединений ZMEI-3, ZMEI-15, ZMEI-18, ZMEI-19 и ZMEI-22. Эти соединения, начиная с концентрации 3×10^-5 М, вызывают дозозависимое урежение частоты сокращения полоски миокарда (фиг.5). При увеличении концентрации изучаемых соединений до 5×10^-5 М и 10^-4 М происходит полное статистически значимое подавление автоматизма полоски: ZMEI-3 - р<0,001; ZMEI-15 - р<0,01; ZMEI-18 - р<0,05; ZMEI-22 - р<0,001. Для соединения ZMEI-19 - p>0,05.

Поскольку известно, что регуляторные белки Ерас2 играют важную роль в регуляции ритмической активности сердца [Sugawara К, Shibasaki Т, Takahashi Н, Seino S. Gene. 2016; 575: 577; Fujita Т, Umemura М, Yokoyama U, et al. Cell Mol Life Sci. 2017; 74(4): 591], нельзя исключить, что наблюдаемое в наших экспериментах подавление автоматизма изолированной полоски миокарда, вызванное соединением ZMEI-3, может быть связано с его ингибирующим влиянием на белки Ерас2.

По результатам этих скриниговых исследований для дальнейшего изучения были отобраны соединения ZMEI-3; ZMEI-15 и ZMEI-22. Биологические эффекты этих соединений были аналогичными и проиллюстрированы на примере соединения ZMEI-3.

Пример 14. Определение LD₅₀ соединения ZMEI-3

Метод определения LD₅₀

Значения LD₅₀ определяли на беспородных мышах-самцах. Соединение ZMEI-3; вводили внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл/10 г массы тела не менее чем в пяти различных дозах, количество животных в каждой серии было равно 6. В качестве растворителя использовали апирогенную воду для инъекций. Летальность животных оценивали через 24 часа после введения соединений. Значения LD₁₆, LD ₅₀и LD₈₄ с их доверительными 95% интервалами рассчитывали по методу Литчфилда-Вилкоксона.

Как следует из полученных данных LD₁₆, LD₅₀ и LD₈₄ для соединения ZMEI-3 составляет соответственно 332,2 (82,2-457,9), 447,7 (250,5-624,4) и 686,8 (517,4-1156,7), т.е. соединение ZMEI-3 относится к малотоксичным веществам.

Пример 15. Изучение влияния соединения ZMEI-3, потенциально обладающего свойствами ингибитора белков Ерас2 на тонус изолированных сосудов.

Метод «Изолированные сосуды»

Анестезированных крыс (25% раствор уретана, 4 мл/кг) декапитировали и извлекали грудной отдел аорты. Часть изолированной аорты (≈1 см) помещали в раствор Кребса-Хеиселейта, охлажденный до +4°С, и использовали в физиологических экспериментах. Состав раствора Кребса-Хенселейта в мМ: NaCl-121; KC1-4,69; KH₂PO₄-1,1; NaHCO₃-23,8; MgSO₄-1,6; CaCl₂-1,6; ЭДТА-0,032; D-глюкоза-8.

Измерение силы сокращения аорты в изометрическом режиме. Сосуды очищали от жировой и соединительной тканей и нарезали на кольца шириной 1,5-2,2 мм, которые крепили на держателях, помещенных в раствор Кребса-Хенселайта, аэрируемый карбогеном (5% СО₂ в О₂) в проволочном четырехканальном миографе (Danish Муо Technology, модель Multi Myograph System - 620М).

После достижения в камерах миографа температуры раствора 37,0±0,5°С фрагменты аорты растягивали радиально до оптимального диаметра просвета, соответствующего 90% пассивного диаметра сосуда при 100 мм Hg. После процедуры растяжения и последующего периода стабилизации в течение 20 мин жизнеспособность сосудов проверяли с помощью 1 мкМ фенилэфрина - агониста а-адренорецепторов (Sigma, США). Сохранность эндотелия тестировали с помощью агониста мускариновых рецепторов 10 мкМ карбахола - негидролизируемого ацетилхолинэстеразами аналога ацетилхолина (Sigma, США).

Результаты обрабатывали в Microsoft Excel с использованием количественных данных силы сокращения сосудов (мН), экспортированных из программного обеспечения миографа (LabChart Pro).

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5. Для сравнения средних значений и статистических различий между группами использовали дисперсионный анализ (ANOVA) с последующими апостериорными тестами Тьюки. Расхождения считались достоверными при р<0,05.

В экспериментах на изолированном сосуде показано, что соединение ZMEI-3 вызывает дозозависимую релаксацию сосуда (фиг. 6), которая, возможно, осуществляется не за счет эндотелий-зависимых механизмов, поскольку на фоне его внесения в перфузат у сосуда сохраняется вазодилатирующая реакция на неселективный холиномиметик карбахолин (10^-5). Также показано, что соединение ZMEI-3 (10^-4) практически полностью подавляет вазоконстрикторную реакцию сосуда на агонист сцд-адренорецепторов норадреналин (10^-6) (фиг. 7).

К сожалению, мы не смогли оценить, связано ли вазодилатирующее действие соединения ZMEI-3 с ингибированием белка Ерас 2, поскольку селективный агонист этого белка глибенкламид [Takahashi Н, Shibasaki Т, Park JH, et al. Diabetes. 2015;. 64(4): 1262] в условиях наших экспериментов не влияет на тонус сосуда. Вместе с тем нельзя исключить, что вазодилатация, инициированная соединением ZMEI-3, может быть связана с ингибированием белка Ерас2, поскольку показано, что Ерас-опосредованная вазоконстрикция может быть связана их способностью инициировать экспрессию α₂-адренорецепторов в гладкомышечных клетках сосудов [Michel МС, Insel PA. Am J Physiol Cell Physiol. 2012; 303(5): 488].

Пример 16. Изучение особенностей антиаритмической активности соединения ZMEI-3, потенциально обладающего свойствами ингибитора белков Ерас2, на модели аконитиновой аритмии.

Метод воспроизведения аконитиновой аритмии

Наркотизированных крыс (уретан 1300 мг/кг, в/б) фиксировали в положении на спине на подогреваемом операционном столике. Катетеризировали левую бедренную вену для введения аконитина и изучаемых соединений. Перед началом эксперимента у животных регистрировали ЭКГ (стандартные отведения, калибровочный сигнал 20 мВ, скорость записи 50 мм/сек, продолжительность записи 60 с). В качестве регистратора использовали компьютерный электрокардиограф «Поли-Спектр 8/В» (Россия). Затем подбирали дозу аконитина (n=11, в/в, болюсом), которая во всех экспериментах в пределах 1-2 минут после окончания его введения вызывает смешанную предсердно-желудочковую экстрасистолию; величина подобранной дозы - 30 мкг/кг. После подбора дозы аконитина во всех сериях экспериментов изучаемые соединения вводили в/в (в 0,2-0,3 мл апирогенной воды для инъекций) за 2 минуты до введения аконитина. Непрерывную регистрацию ЭКГ начинали за 2 минуты до начала введения аконитина или исследуемых соединений и продолжали в течение 20 минут от момента окончания в/в введения аконитина.

В каждой экспериментальной группе подсчитывали количество животных, у которых возникала политопная экстрасистолия (ПЭС) в первые 10 минут после введения аконитина.

Статистическую обработку проводили с помощью критерия точной вероятности Фишера, при сравнении 2-х и более выборок с контролем учитывали множественность сравнений. Критический уровень значимости α=0,05.

Результаты экспериментов представлены в таблице 1. Как следует из полученных данных соединение ZMEI-3 (2 мг/кг, в/в), введенное за 2 минуты до аконитина, не проявляет антиаритмическую активность.

Поскольку соединение ZMEI-3 рассматривается как потенциальный ингибитор регуляторных белков Ерас2, которые, как известно, обладают проаритмической активностью, преимущественно за счет инициации аномальной диастолической утечки ионов Са²⁺ из цистерн СПР, которая реализуется посредством активации β₁-AR/cAMP/Epac2/PI3K/Akt/NOSl/CaMKIIδ/RyR2 сигнального каскада [Ruiz-Hurtado G, Morel Е, Dominguez-Rodriguez A, et al. J Mol Cell Cardiol. 2013; 58: 162; Pereira L, Bare DJ, Galice S, et al. J Mol Cell Cardiol. 2017; 108: 8]. Отсутствие эффекта (эффект «на игле») соединения ZMEI-3 в условиях настоящего эксперимента представляется прогнозируемым, поскольку для подавления активности выше приведенного сигнального каскада необходим отределеный временной промежуток. Исходя из этого в следующей серии экспериментов соединение ZMEI-3 вводили в/б в течение 3-х дней до начала эксперимента, чтобы гарантированно заблокировать сопряженные с белком Ерас2 сигнальные каскады.

Пример 17. Изучение особенностей антиаритмической активности соединения ZMEI-3, потенциально обладающего свойствами ингибитора белков Ерас2, на модели реперфузионных аритмий

Метод воспроизведения реперфузионных аритмий

Наркотизированных (уретан 1300 мг/кг, в/б) крыс переводили на искусственное дыхание при помощи аппарата искусственной вентиляции легких для мелких животных (Ugo Basele, Италия), после чего производили тороко- и перикардотомию и под левую нисходящую коронарную артерию сразу же после ее выхода из-под ушка подводили лавсановую лигатуру. Ишемию миокарда вызывали одномоментной перевязкой коронарной артерии. Через 8 минут лигатуру снимали. Оценивали наличие/отсутствие фибрилляции желудочков сердца в течение 3-х минут от момента начала реперфузии. Исследуемые соединения (в/в, в 0,2-0,3 мл апирогенной воды для инъекций), а в контрольной серии - апирогенную воду для инъекций вводили за 5 минут до начала реперфузии. Регистрацию ЭКГ (II стандартное отведение) начинали за минуту до перевязки коронарного сосуда и продолжали в течение всего эксперимента. В работе использовали цифровой электрокардиограф Поли-Спектр-8 В (Нейрософт, Россия).

Для оценки противофибрилляторного и антиаритмического действия в каждой группе подсчитывали количество животных, у которых возникала: необратимая фибрилляция желудочков сердца (ФЖ), опасные для жизни аритмии - обратимая фибрилляция желудочков сердца (ОФЖ) или желудочковая тахикардия, экстрасистолия.

Соединение ZMEI-3 (2 мг/кг/сут) вводили в течение 3 дней до начала эксперимента.

Статистическую обработку проводили с помощью критерия точной вероятности Фишера, при сравнении 2-х и более выборок с контролем учитывали множественность сравнений. Критический уровень значимости α=0,05.

Результаты экспериментов представлены в таблице 2.

Как следует из полученных данных, соединение ZMEI-3 (2 мг/кг, в/в) в условиях настоящего эксперимента проявляет выраженную противофибрилляторную активность: если в контроле фибрилляции возникают у 9 из 13 животных (70% случаев), то у крыс получавших соединение ZMEI-3, только у 3 из 13 (23% случаев).

Пример 18. Изучение влияния соединения ZMEI-3, потенциально обладающего свойствами ингибитора белков Ерас 2, на инотропную функцию сердца в модельных экспериментах, воспроизводящих алкогольную кардиомиопатию

Трансляционная модель алкогольной кардиомиопатии

Алкогольная кардиомиопатия (АКМП) моделируется на крысах. Животные содержатся в индивидуальных клетках стандарта Т/3 в условиях вивария (температура 21-23°С, относительная влажность воздуха 40-60%) при регулируемом 12 ч/12 ч световом режиме (свет/темнота) с предоставлением брикетированного стандартного корма ad libitum. Животные подвергаются принудительной алкоголизации, основанной на предоставлении в качестве единственного источника жидкости 10%-ного раствора этанола. Среднесуточное потребление алкоголя в пересчете на чистый этанол колебалось в пределах 5,0-6,5 г/кг. Показано, что через 24 недели принудительной алкоголизации у животных развивается алкогольная кардиомиопатия, воспроизводящая основные клинико-диагностические признаки этого заболевания - дилатация правого и левого желудочков сердца, снижение инотропной функциисердца, жировавая дистрофия миокарда, снижение электрической стабильности кардиомиоцитов [Крыжановский С.А, Колик Л.Г, Цорин И.Б, и др. Бюл эксп Биол и медицины. 2017; 163(5): 582].

Эхокардиография на мелких животных

Наркотизированных крыс (кетамин 100 мг/кг в/б) фиксировали на операционном столике в положении на животе. Измерения производили в условиях закрытой грудной клетки и спонтанного дыхания в одномерном М- и двухмерном В-модальных режимах при положении датчика эхокардиографа в парастернальной позиции по длинной оси сердца. В М-модальном режиме оценивали конечно-систолический (КСР) и конечно-диастолический (КДР) размеры левого желудочка сердца, затем по методу Teicholz рассчитывали показатели насосной функции сердца: фракцию выброса (ФВ) и фракцию укорочения (ФУ), а также оценивали толщину задней стенки левого желудочка в систолу (ЗСс) и диастолу (ЗСд), толщину межжелудочковой перегородки в систолу (МЖПс) и диастолу (МЖПд), сократимость задней стенки левого желудочка (СЗС), сократимость межжелудочковой перегородки (СМЖП), ударный (УО) и минутный (МОС) объемы сердца.

Оценку эхокардиографических показателей проводили, как минимум, по пяти последовательным сердечным циклам. Все измерения выполняли в соответствии с Рекомендациями Американского общества и Европейской ассоциации по эхокардиографии. В работе использовали цифровые ультразвуковые эхокардиографы DP-6600 и DC-60 с электронным микроконвексным датчиком 65С15ЕА (6,5/8,0 МГц).

Статистическую обработку полученных данных. Нормальность распределения данных проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка, гомогенность дисперсий - с помощью критерия Левена. Так как в подавляющем большинстве случае данные имели распределение близкое к нормальному и дисперсии выборок были гомогенны, то для сравнения независимых выборок использовали однофакторный дисперсионный анализ с последующей обработкой методом множественных сравнений по Ньюмену-Кейлсу или Даннету (для сравнения всех выборок с одной). Для сравнения зависимых выборок(разные временные точки после введения вещества) с исходным уровнем применяли дисперсионный анализ повторных измерений с последующей обработкой методом множественных сравнений по Даннету. Результаты представляли в виде средних арифметических и их стандартных ошибок. Критический уровень значимости α=0,05.

Результаты экспериментов приведены в таблице 3. Как следует из полученных данных, у интактных крыс, у которых в течение 24 недель единственным источником жидкости был 10%-ный раствор этилового спирта, сократительная функция левого желудочка сердца за 4-недельный период депривации практически не изменилась. Так, например, фракция выброса левого желудочка (ФВ) у алкоголизированных крыс составила, соответственно, 66,4±1,5% и 65,0±1,8% (р=0,29). Иная картина наблюдается у животных, в течение месяца получавших соединение ZMEI-3 (2 мг/кг/, ежедневно, в течение 28 дней в/б) (табл. 3). Так, например, ФВ у них за период наблюдения увеличелась с 69,0±1,0% до 76,5±1,2% (р=0,0001).

Таким образом, результаты этой серии экспериментов свидетельствуют о том, что систематическая терапия соединением ZMEI-3 способствует в условиях сформировавшейся АКМП статистически значимому увеличению сократимости левого желудочка сердца и, следовательно, уменьшению тяжести течения патогомоничной для АКМП хронической сердечной недостаточности.

Пример 19. Изучение влияния соединения ZMEI-3, потенциально обладающего свойствами ингибитора белков Ерас2, на морфогистологические характеристики миокарда в модельных экспериментах, воспроизводящих АКМП

Гистологические исследования

В процессе патологоанатомического вскрытия и изучения состояния внутренних органов осуществляли вскрытие и забор сердца. Сердце извлекали и помещали в фиксирующий раствор - забуференный формалин в 10% концентрации при соблюдении объемного соотношения 1:20. По окончании фиксации из сердца вырезали фронтальные сегменты, захватывающие желудочки. Вырезанные фрагменты помещали в заливочные кассеты, затем осуществляли гистологическую проводку по стандартному протоколу с помощью Автоматического тканевого процессора карусельного типа (Leica TP 1020, Leica Microsystems, ФРГ). По завершении проводки участки миокарда заливали в гомогенизированную парафиноподобную среду Paraplast (Leica Biosystems Richmond, США). Для заливки в парафин использовали модульную Систему заливки тканей с графическим дисплеем (Tissue-Tek® ТЕК, Sakura, Япония). Гистологические срезы толщиной 5-6 микрон получали с помощью специально оборудованного Рабочего места для микротомии (Bio-Optica Milano SPA, Италия) и ротационного микротома (Accu-Cut SRM 200, Sakura, Япония). Предметные стекла с помещенными на них срезами просушивали. В дальнейшем депарафинированные и окрашенные галлоцианин-эозином срезы помещали под покровные стекла, используя при этом синтетическую монтирующую среду Bio Mount (Bio-Optica Milano SPA, Италия).

Готовые микропрепараты представленных фрагментов желудочков исследовали в проходящем свете с помощью микроскопа Nikon Eclipse 55 I (Япония) при увеличении 40, 100, 200 и 400. Документировали изображения фотокамерой Nikon DS-Filc с применением программы визуализации изображений NIS Elements BR для Nikon. АКМП воспроизводили как описано в примере 18.

Микроскопическая картина миокарда желудочков крыс с АКМП характеризуется типичной цитоархитектоникой. В стенке сердца визуализируется эпикард, миокард и эндокард. Эндокард выстилает изнутри камеры и клапаны сердца. Миокард представлен связанными между собой поперечнополосатыми мышечными клетками кардиомиоцитами, расположенными послойно. Между мышечными структурами миокарда обнаруживается рыхлая соединительная ткань, кровеносные сосуды и нервы. Заметно увеличение пространства между кардиомиоцитами и капиллярами. Эпикард представляет собой соединительнотканную пластину, плотно сросшуюся с миокардом.

В миокарде всех алкоголизированных крыс отмечается выраженное расстройство кровообращения - диффузное и очаговое венозное полнокровие, а также капиллярное полнокровие с эритростазом. Следует отметить, что просветы сосудов в большинстве случаев расширены. Морфологические признаки периваскулярного отека и васкулита выражены у большинства животных. В саркоплазме большинства кардиомиоцитов и межмышечной строме обнаруживаются вакуоли и мелкие капли жира (фиг. 8).

При изучении клеток миокарда на средних и больших увеличениях обнаруживается выраженный полиморфизм кардиомиоцитов. Цитоплазма части клеток гомогенна, с потерей поперечной исчерченности (фиг. 9).

Их ядра уменьшены в размерах, гиперхромны или лизированы. Другая часть кардиомиоцитов, имеющая крупные ядра с хорошо визуализирующимся хроматином, находится в состоянии умеренной гипертрофии. Поперечная исчерченность цитоплазмы этих гипертрофированных кардиомиоцитов заметна

Микроскопический анализ миокарда желудочков алкоголизированньгх крыс, леченных соединением ZMEI-3 (2 мг/кг, в/б, в течении 28 дней), позволил установить его характерную цитоархитектонику. В стенке сердца леченных соединением ZMEI-3 крыс визуализируется эпикард, миокард и эндокард. Эндокард выстилает изнутри камеры и клапаны сердца. Миокард представлен кардиомиоцитами, расположенными послойно. Между кардиомиоцитами обнаруживается рыхлая соединительная ткань, кровеносные сосуды и нервы. Эпикард представлен соединительнотканной пластиной.

В миокарде большинства леченных соединением ZMEI-3 крыс обнаруживаются признаки расстройства кровообращения в виде диффузного венозного и капиллярного полнокровия, частично с эритростазом. Стенки крупных сосудов отечны, инфильтрированы лимфомакрофагами. В межмышечной строме большинства крыс обнаруживаются вакуоли и мелкие капли жира (фиг. 10).

Микроскопия с использованием средних и больших увеличений позволяет выявить в миокарде выраженный полиморфизм кардиомиоцитов. Встречается небольшое количество мышечных клеток, имеющих светлую гомогенную цитоплазму, с потерей ее поперечной исчерченности и уменьшенными в размерах гипохромными ядрами. Часть кардиомиоцитов находится в состоянии гипертрофии. Они содержит крупные ядра с видимым, диффузно распыленным хроматином (фиг. 11). Поперечная исчерченность их саркоплазмы хорошо визуализируется.

Таким образом микроскопическое исследование миокарда желудочков алкоголизированньгх крыс, леченных соединением ZMEI-3, позволило установить значительное уменьшение морфологических признаков его алкогольного поражения. У леченых животных расстройства кровообращения были менее выраженными, а число регрессивных форм кардиомиоцитов заметно снижалось. Вакуолизация и инфильтрация жиром шли, главным образом, по интерстицию миокарда. В то же время, у нелеченных алкоголизированньгх животных были отмечены еще и признаки вакуольной и жировой дистрофии саркоплазмы кардиомиоцитов.

Следует отметить, что применение соединения ZMEI-3 у алкоголизированньгх крыс продемонстрировало его кардиопротективную активность.

Описание чертежей

Фигура 1. Фармакофорный дизайн потенциальных Ерас-ингибиторов в ряду производных пиридинов.

Фигура 2. Модель связывания соединений типа ESI-05 с сайтом связывания Ерас2.

Фигура 3. Результаты молекулярного докинга одного из сконструированных соединений (ZMEI-3) в сайт связывания ингибиторов Ерас2 в 2D- и 3D-проекциях.

Фигура 4. Влияние соединения ZMEI-7 на автоматизм изолированной полоски миокарда правого предсердия крысы.

Фигура 5. Влияние соединения ZMEI-3 на автоматизм изолированной полоски миокарда правого предсердия крысы.

Фигура 6. Влияние соединения ZMEI-3 на тонус изолированного сосуда.

Фигура 7. Влияние соединения ZMEI-3 на вазоконстрикторую рескцию сосуда на норадреналин.

Фигура 8. Микрофотография фрагмента миокарда алкоголизированной крысы №95, (×200). Стрелками обозначены: 1 - диффузное полнокровие миокарда; 2 - вакуоли и капли жира.

Фигура 9. Микрофотография фрагмента миокарда алкоголизированной крысы №79, (×400). Стрелками обозначены: 1 - диффузное полнокровие миокарда; 2 - вакуоли и капли жира; 3 -кардиомиоциты с гомогенной цитоплазмой и лизированным ядром.

Фигура 10. Микрофотография фрагмента миокарда алкоголизированной крысы №21, леченной соединением ZMEI-3, (×200). Стрелками обозначены: 1 - диффузное полнокровие миокарда; 2 - вакуоли и мелкие капли жира.

Фигура 11. Микрофотография фрагмента миокарда алкоголизированной крысы №27, леченной соединением ZMEI-3, (×400). Стрелками обозначены: 1-диффузное полнокровие миокарда; 2 - вакуоли и мелкие капли жира; 3 - полиплоидные кардиомиоциты.

Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к соединению, представляющему собой гидрохлориды или бромиды замещенных производных пиридинов общей формулы (1), которые обладают кардиотропной активностью и являются малотоксичными. В формуле (1) два или несколько из заместителей R¹-R⁶ являются алкильными группами, при этом остальные заместители являются водородами; заместитель R⁷ может быть этильной группой или отсутствовать; один из атомов X, Y, Z является атомом азота, при этом остальные являются атомами углерода, связанными с водородом; n может быть равным 0 или 1; атом А является атомом серы или углерода, при этом если А - атом серы, то W является атомом кислорода, а если А является атомом углерода, то W отсутствует. 3 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл., 19 пр.

1. Соединения, представляющие собой гидрохлориды или бромиды замещенных производных пиридинов общей формулы (1)

где два или несколько из заместителей R¹-R⁶ являются алкильными группами, при этом остальные заместители являются водородами; заместитель R⁷ может быть этильной группой или отсутствовать; один из атомов X, Y, Z является атомом азота, при этом остальные являются атомами углерода, связанными с водородом; n может быть равным 0 или 1; атом А является атомом серы или углерода, при этом если А - атом серы, то W является атомом кислорода, а если А является атомом углерода, то W отсутствует.

2. Соединение по п. 1, представляющее собой гидрохлорид N,2,4,6-тетраметил-N-(пиридин-4-ил)бензолсульфонамида (ZMEI-3), обладающее кардиотропной активностью.

3. Соединение по п. 1, представляющее собой гидрохлорид N,3,5-триметил-N-(пиридин-4-ил)бензолсульфонамида (ZMEI-15), обладающее кардиотропной активностью.

4. Соединение по п. 1, представляющее собой гидрохлорид N,2,3,5,6-пентаметил-N-(пиридин-4-ил)бензолсульфонамида (ZMEI-22), обладающее кардиотропной активностью.