Способ получения суспензии биодеградируемого наноматериала на основе сывороточного альбумина Российский патент 2025 года по МПК C07K14/765 A61K47/42 A61K9/10 

Изобретение относится к биомедицинской химии и молекулярной биологии и может быть использовано в качестве биобезопасного транспортера биологически активных веществ в виде суспензии наночастиц сывороточного белка.

Сывороточный белок альбумин является биоразлагаемым и биосовместимым, первостепенная его функция заключается в осуществлении транспортировки и распределении экзогенных и эндогенных лигандов в системе кровообращении. Он обладает также способностью действовать как важный внеклеточный антиоксидант и обеспечивать защиту от свободных радикалов и других вредных химических агентов.

При введении связывание лекарственных препаратов с белками плазмы крови является важным параметром, за счет которого происходит элиминация и распределение противоопухолевого препарата. Благодаря тому, что поступающие композитные наноматериалы или лекарственные препараты в свободном виде связываются с альбумином крови, растворимость лекарств увеличивается. Тем самым белок создает благоприятные условия для поступаемых компонентов, защищая их от деградации, а также предотвращая неспецифическую потерю лекарства в процессе транспортировки.

Материалы на основе органических биополимеров, в том числе бычий и человеческий сывороточные альбумины, широко используются в биомедицинских исследованиях ввиду их биосовместимости и биоразлагаемости. Основным критерием качества биополимеров являются контролируемые профили высвобождения препарата, доставщиками которого являются наноконструкции на основе сывороточных белков. Высвобождение препарата наблюдается в закисленных рН, порядка 5, что соответствует микроокружению большинства раковых новообразований. Помимо этого, получаемые наноконструкции должны обладать оптимальными параметрами, которые пригодны для внутривенного введения. Для улучшения клеточной проницаемости размерные характеристики наночастиц в суспензии не должны превышать 200 нм и должны иметь минимальный индекс полидисперсности (≤0,25), что будет свидетельствовать о монодисперсности полученной суспензии наноконструкций на основе сывороточного белка - альбумина.

Известен способ получения наночастиц из человеческого сывороточного альбумина с последующим внедрением/адсорбцией противоопухолевого препарата доксорубицина и дальнейшей его доставки (Daehyun Kim, Seung Soo Lee, et al. Combination Therapy with Doxorubicin-Loaded Reduced Albumin Nanoparticles and Focused Ultrasound in Mouse Breast Cancer Xenografts. Pharmaceuticals 13,235 (2020)). Наночастицы, полученные методом десольватации этиловым спиртом, фиксируют 8% глутаровым альдегидом. Известно, что глутаровый альдегид оказывает генотоксическое влияние на организм человека, вследствие образования оснований Шиффа. Использование глутарового альдегида сопровождается такими неприятными эффектами, как токсический некроз, отек и воспаление.

Аналогичная работа по получению наночастиц (Yifan Wang, Si Chen, et al. Preparation Optimization of Bovine Serum Albumin Nanoparticles and Its Application for siRNA Delivery. Drug Design, Development and Therapy 15, 1531-1547 (2021)) была представлена, но уже на основе бычьего сывороточного альбумина, в качестве сшивающего агента был использован глутаровый альдегид.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом является способ получения суспензии наночастиц сывороточного альбумина для упаковки и доставки противоопухолевого препарата растительного происхождения - доцетаксела, заключающийся в следующем. Исходный раствор сывороточного альбумина человека (150 мг) растворяли в 2,0 мл 10 мМ раствора NaCl, титрованного до рН 7-10. Затем раствор денатурировали с образованием наночастиц путем непрерывного добавления 8,0 мл десольватирующего агента этанола при перемешивании (500 об/мин) при комнатной температуре. После процесса десольватации добавляли 8% глутаровый альдегид, чтобы обеспечить сшивание полученных наночастиц. Процесс сшивания осуществляли в течение 24 часов. В качестве дополнительного денатурирующего агента использовали 6 мМ глюкозу (D-глюкоза, 99,5% безводная). Далее наночастицы денатурированного белка помещали в УФ-камеру под ультрафиолетовое излучение (длина волны 254 нм) на 30 минут. Расстояние между источником света и образцом составляло 15 см (Hassan Niknejada, and Raziyeh Mahmoudzadeh. Comparison of Different Crosslinking Methods for Preparation of Docetaxel-loaded Albumin Nanoparticles. Iranian Journal of Pharmaceutical Research 14 (2), 385-394 (2015)).

Недостатками известного способа являются низкое качество получаемого наноматериала, связанное с большими размерами наночастиц (130-145 нм), а также с недостаточной стабильностью и токсичностью.

Задачей изобретения является получение стабильной суспензии наночастиц альбумина с размерами до 200 нм без дополнительных токсичных химических реагентов для фиксации и стабилизации денатурированных белковых молекул.

Технический результат: повышение стабильности получаемой суспензии биодеградируемого наноматериала на основе альбумина и удлинение срока ее хранения.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Исходный белок (сывороточный альбумин) растворяют в воде в соотношении белок: вода, равном 1: (5-1000) по массе, далее для ионизации белковой молекулы добавляют буферный раствор до достижения рН раствора, равного 9,0. К полученному раствору покапельно, с постоянной скоростью и при постоянном перемешивании (3000 об/мин), добавляют органический растворитель (этиловый спирт, ацетон, ацетонитрил) в соотношении раствор белка в воде: органический растворитель, равном 1:(2-10) по объему до характерной беловато-зеленой опалесценции белковой молекулы. Полученную конечную смесь переносят в емкость и воздействуют ультрафиолетовым излучением с дозой (плотностью энергии) от 0,22 до 2,66 Дж/см² в течение 5-60 минут.

Далее суспензию наночастиц сывороточного альбумина подвергают центрифугированию в течение 30 минут со скоростью не менее 13000 оборотов в минуту. Данную процедуру проводят 3 раза для удаления остатков несвязавшейся белковой молекулы, затем от стабильной суспензии наночастиц отбирают надосадочную жидкость и переводят наночастицы для хранения в органический растворитель, либо в физиологический раствор (рН 7.4), в зависимости от цели использования.

В качестве органического растворителя, в частном случае, используют этиловый спирт, ацетон, ацетонитрил, взятые в концентрации не ниже 90%.

В качестве буферного раствора, в частном случае, используют натрий боратный буферный раствор.

Для ультрафиолетового облучения, в частном случае, используют 2 ртутные лампы низкого давления ДБ-15 с длиной волны 253,7 нм, расстояние от источника 12 см.

Биодеградируемый наноматериал на основе альбумина хранят в виде суспензии в соответствующем органическом растворителе, выбранном из группы: ацетон, ацетонитрил, этиловый спирт, концентрация которых не ниже 90%. Соотношение суспензии наночастиц к растворителю составляет 1:1000 по объему.

Предлагаемый способ позволяет получать биоразлагаемую и биосовместимую суспензию наночастиц сывороточного альбумина без использования каких-либо дополнительных химических реагентов для образования белковых сшивок, с использованием в качестве сшивающего агента ультрафиолетового излучения, что позволяет использовать наночастицы в биомедицинских целях, в том числе для таргетной терапии раковых заболеваний. Срок хранения суспензии наночастиц сывороточного альбумина составляет не менее полугода с сохранением первоначальных морфологических характеристик.

Существенными отличиями предлагаемого способа по сравнению с прототипом, являются:

1. Использование 2-х видов сывороточного альбумина для формирования наночастиц: бычий и сывороточный альбумин человека.

2. Использование расширенного ряда органических растворителей для денатурации нативной белковой молекулы с последующим формированием наночастиц: этиловый спирт, ацетон, ацетонитрил, конечная концентрация которых составляет не ниже 90%.

3. Использование расширенного диапазона дозы ультрафиолетового излучения от 0,22 до 2,66 Дж/см² для формирования биодеградируемого наноматериала на основе сывороточного белка.

Для формирования конечной суспензии биодеградируемых наночастиц используют ограниченный круг реагентов, которые не оказывают токсического влияния на формируемый наноматериал: дистиллированная вода, пропущенная через фильтр, спирт и сывороточный альбумин. Токсичность полученных наночастиц не превышает 10%, и при получении суспензии не используются дополнительные денатурирующие агенты, такие как глутаровый альдегид и глюкоза (прототип).

Предлагаемое изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:

На фиг. 1 представлено изображение с просвечивающего электронного микроскопа наночастиц на основе бычьего сывороточного альбумина, полученных при денатурации белковой молекулы ацетонитрилом. Время облучения суспензии ультрафиолетовым излучением составило 5 минут при дозе 0,22 Дж/см².

На фиг. 2 представлено изображение наночастиц бычьего сывороточного альбумина, полученных при денатурации белковой молекулы ацетоном. Время облучения суспензии ультрафиолетовым излучением составило 10 минут при дозе 0,44 Дж/см².

На фиг. 3 представлено изображение наночастиц сывороточного альбумина человека, полученных при денатурации белковой молекулы этиловым спиртом. Время облучения суспензии ультрафиолетовым излучением составило 30 минут при дозе 1,32 Дж/см².

На фиг. 4 представлено изображение наночастиц сывороточного альбумина человека, полученных при денатурации белковой молекулы этиловым спиртом. Время облучения суспензии ультрафиолетовым излучением составило 60 минут при дозе 2,66 Дж/см².

На фиг. 5 представлена гистограмма выживаемости нераковой клеточной линии НеК 293, обработанной наночастицами сывороточного альбумина человека под действием ультрафиолетового излучения в течение 20 минут при дозе облучения 0,88 Дж/см²).

Пример 1.

Бычий сывороточный альбумин (БСА) растворяли в дистиллированной воде, пропущенной через фильтр, в соотношение 1:2 (белок: вода) по массе, далее для ионизации белковой молекулы добавляли натрий боратный буфер (SBB) до достижения рН 9,0. К полученному раствору покапельно (пипеточным дозатором), с постоянной скоростью и при постоянном перемешивании, добавляли органический растворитель (99,8% ацетонитрил) в соотношении раствор белка в воде: ацетонитрил, равном 1:2 (по объему) до характерной беловато-зеленой опалесценции белковой молекулы.

Полученную конечную смесь переносили в отдельную емкость и воздействовали ультрафиолетовым излучением с дозой 0,22 Дж/см², в течение 5 минут. УФ-установка представляет собой 2 ртутные лампы низкого давления ДБ-15 с длиной волны 253,7 нм, расстояние от источника 12 см).

Пример 2.

Бычий сывороточный альбумин (БСА) растворяли в дистиллированной воде, пропущенной через фильтр, в соотношение 1:500 (белок: вода) по массе, далее для ионизации белковой молекулы добавляли SBB (натрий боратный) буфер до достижения рН раствора 9,0. К полученному раствору покапельно, с постоянной скоростью и при постоянном перемешивании, добавляли органический растворитель (99,5% ацетон) в соотношении по объему 1:5 (раствор белка в воде: ацетон) до характерной беловато-зеленой опалесценции белковой молекулы. Полученную конечную смесь переносили в отдельную емкость и воздействовали ультрафиолетовым излучением с дозой 0,44Дж/см² в течение 10 минут.

Пример 3.

Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) растворяли в дистиллированной воде, пропущенной через фильтр, в соотношение 1:1000 (белок: вода) по массе, далее для ионизации белковой молекулы добавляли SBB (натрий боратный) буфер до достижения рН раствора равного 9,0. К полученному раствору покапельно, с постоянной скоростью и при постоянном перемешивании, добавляли органический растворитель (95% этиловый спирт) в соотношении по объему 1:10 (раствор белка в воде: этиловый спирт) до характерной беловато-зеленой опалесценции белковой молекулы. Полученную конечную смесь переносили в отдельную емкость и воздействовали ультрафиолетовым излучением с энергией 1,32 Дж/см² в течение 30 минут.

Пример 4.

Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) модифицировали аналогично примеру 3, за исключением того, что полученную конечную смесь подвергали воздействию ультрафиолетовым излучением с дозой 2,66 Дж/см², в течение 60 минут.

Пример 5. Исследование суспензии наночастиц методами просвечивающей электронной микроскопии и динамического светорассеяния.

Полученные по примерам 1-4 образцы биосовместимой суспензии наночастиц на основе человеческого/бычьего сывороточного альбумина исследовали методом динамического светорассеяния (гидродинамический диаметр составил от 60 до 111 нм; индекс полидисперсности - ПДИ не превышает 0,1, дзета-потенциал поверхности варьируется до -16 мВ) и просвечивающей электронной микроскопии, (фиг. 1 - денат. агент ацетонитрил, фиг. 2 - ацетон, фиг. 3 - этиловый спирт, время облучения 30 мин; фиг. 4 - этиловый спирт, время облучения 60 мин). Морфологию определяли методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) с помощью негативного контрастирования образцов низкой электронной плотности 0,5% раствором уранил ацетата. На фиг. 1 представлено изображение наночастиц на основе БСА, полученных при денатурации ацетонитрилом, время облучения 5 минут; на фиг. 2 - наночастицы на основе БСА, ден. агент ацетон, время облучения 10 минут; на фиг. 3 - наночастицы на основе ЧСА, ден. агент спирт, время облучения 30 минут; на фиг. 4 -наночастицы на основе ЧСА, ден. агент спирт, время облучения 60 минут. Наночастицы данного типа были визуализированы на поверхности отдельными обособленными друг от друга шарообразными объектами, средний размер которых варьировался от 50 до 100 нм.

Пример 6. Исследование цитотоксичности наночастиц сывороточного альбумина.

Цитотоксичность наночастиц, полученных по примеру 3, была исследована на нераковой клеточной линии НеК 293 (эмбриональные почки человека). На основании данных построена гистограмма выживаемости клеточной линии в зависимости от концентрации наночастиц (концентрация варьировалась от 0,0027 до 0,27 мкг). На фиг. 5 представлена гистограмма выживаемости нераковой клеточной линии НеК 293, обработанной наночастицами сывороточного альбумина человека под действием ультрафиолетового излучения в течение 20 минут при дозе облучения 0,88 Дж/см². Токсичность суспензии наночастиц низкая и не превышает 10%.

Заявляемым способом получены биосовместимые и биодеградируемые наноматериалы 50-200 нм сферической формы, что соответствует заявленным критериям для использования суспензии наноматериалов в биомедицинских целях. Предлагаемый способ обеспечивает воспроизводимость получения стабильной суспензии наночастиц при заданных параметрах синтеза. Эффективность способа подтверждена экспериментальными данными, которые были получены путем исследования наночастиц методами просвечивающей электронной микроскопии и динамического светорассеяния. На основании полученных результатов сделан вывод, что морфологические и размерные параметры наночастиц всегда варьируются в пределах заявленной нормы, т.е. размеры не превышают 200 нм.

Кроме того, основным преимуществом получаемых наноматериалов является доступность используемых реагентов во время синтеза, а также отсутствие их системной токсичности при дальнейшем использовании готовой композиции наночастиц при внутривенном введении in vivo.

Изобретение относится к области химии, а именно к способу получения суспензии биодеградируемого наноматериала на основе сывороточного альбумина, согласно которому исходный сывороточный альбумин растворяют в воде в соотношении сывороточный альбумин : вода, равном от 1:5 до 1:1000 по массе, далее ионизируют сывороточный альбумин буферным раствором до достижения рН 9,0, к полученному раствору добавляют органический растворитель, выбранный из группы: этиловый спирт, ацетон, ацетонитрил, в соотношении раствор сывороточного альбумина в воде : органический растворитель, равном от 1:2 до 1:10 по объему, затем полученную смесь переносят в емкость и воздействуют ультрафиолетовым излучением с длиной волны 253,7 нм с энергией от 0,22 до 2,66 Дж/см² в течение 5-60 минут, далее полученную суспензию наночастиц сывороточного альбумина подвергают трехкратному центрифугированию для удаления остатков несвязавшегося сывороточного альбумина и переводят готовую суспензию наночастиц сывороточного альбумина на хранение в соответствующий органический растворитель в соотношении 1:1000 по объему. Технический результат заключается в повышении стабильности получаемой суспензии биодеградируемого наноматериала на основе альбумина и удлинении срока ее хранения. 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 пр.

1. Способ получения суспензии биодеградируемого наноматериала на основе сывороточного альбумина, включающий денатурацию сывороточного альбумина органическим растворителем с последующей фиксацией полученной суспензии сшиванием ультрафиолетовым излучением, отличающийся тем, что исходный сывороточный альбумин растворяют в воде в соотношении сывороточный альбумин : вода, равном от 1:5 до 1:1000 по массе, далее ионизируют сывороточный альбумин буферным раствором до достижения рН 9,0, к полученному раствору покапельно, при постоянном перемешивании, добавляют органический растворитель, выбранный из группы: этиловый спирт, ацетон, ацетонитрил, взятые в концентрации не менее 90%, в соотношении раствор сывороточного альбумина в воде : органический растворитель, равном от 1:2 до 1:10 по объему, затем полученную смесь переносят в емкость и воздействуют ультрафиолетовым излучением с длиной волны 253,7 нм с энергией от 0,22 до 2,66 Дж/см² в течение 5-60 минут, далее полученную суспензию наночастиц сывороточного альбумина подвергают трехкратному центрифугированию для удаления остатков несвязавшегося сывороточного альбумина и переводят готовую суспензию наночастиц сывороточного альбумина на хранение в соответствующий органический растворитель, выбранный из группы: этиловый спирт, ацетон, ацетонитрил, взятые в концентрации не менее 90%, в соотношении 1:1000 по объему.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют натрий боратный буферный раствор.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что суспензию наночастиц сывороточного альбумина центрифугируют в течение 30 минут со скоростью не менее 13000 оборотов в минуту.