Способ синтеза стабилизированных магнитных наноагентов Российский патент 2025 года по МПК A61K33/26 A61K39/395 A61K47/60 C01G49/00 C07K16/00 H01F1/00 B82B3/00 B82Y5/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области магнитных наночастиц для биомедицинских применений. В частности, изобретение относится к магнитным наночастицам, которые можно использовать в составе функциональных белковых наноагентов для нацеливания их на специфические биомолекулярные или клеточные мишени, а также к способу получения указанных магнитных наночастиц и лекарственному средству, содержащему указанные магнитные наночастицы.

Описание предшествующего уровня техники

В последнее время наблюдается неуклонный рост использования нанотехнологий в биологии и медицине, а также других областях науки и техники. Магнитные наночастицы - это новые материалы, которые быстро развиваются и имеют большое прикладное значение. Они уже используются во многих областях современной науки, таких как биомедицина, магнитные жидкости, катализ, ядерно-магнитно-резонансная томография.

Магнитные наночастицы - это класс наноматериалов, которыми можно управлять, воздействуя на них внешними магнитными полями. Благодаря своим уникальным свойствам, которых нет у отдельных молекул, магнитные наночастицы имеют, пожалуй, самую широкую область применения в биомедицине. В частности, они используются для магнитной сепарации биомолекул, магнетофекции - доставки генетического материала внутри клеток, магнитно-контролируемой доставки лекарств, магнитной гипертермии и в качестве зондов / меток для различных основанных на магнетизме методов детекции и визуализации, таких как МРТ, метод количественного определения магнитных частиц (MPQ) и визуализация магнитных частиц (MPI). Среди множества доступных магнитных наноматериалов наночастицы оксида железа [магнетит (Fe₃O₄) и маггемит (γ-Fe₂O₃)] привлекли значительное внимание в биомедицине благодаря своей низкой стоимости, простоты приготовления и функционализации поверхности, биосовместимости и биодеградации. Важно отметить, что несколько магнитных наночастиц были одобрены для внутривенных инъекций человеку в качестве контрастов (Ферукарботран для МРТ печени с усилением контрастности) и для лечения дефицита железа (Ферумокситол). Эффективность и точность этих методов можно вывести на принципиально новый уровень при использовании магнитных наночастиц со встроенными интерфейсами для биокомпьютинга.

Благодаря своей способности реагировать на магнитное поле, МНЧ являются крайне привлекательными для различных тераностических приложений. При использовании МНЧ появляется возможность осуществлять магнитно-контролируемое накопление и высвобождение этих частиц, выполнять отслеживание частиц с помощью магнитно-резонансной томографии (MRI), визуализацию опухолей, точный и количественный мониторинг in vitro и in vivo с помощью метода количественного определения магнитных частиц (MPQ) в чрезвычайно широком линейном динамическом диапазоне (до 7 порядков). Сами по себе МНЧ можно использовать для терапии опухолей, для адресной доставки лекарств в выбранную часть тела или для магнитного разделения клеток, а также для магнитофекции.

На поведение магнитных наночастиц после попадания в тело животного или человека значительно влияет химия поверхностных явлений, размер, а также магнитные свойства самих частиц. В целом, одним из основных факторов, препятствующих клиническому одобрению многих наноагентов, является их быстрое распознавание и поглощение из крови клетками системы мононуклеарных фагоцитов (MPS), в первую очередь клетками Купфера в печени и макрофагами в селезенке. Поэтому химия поверхности наночастиц особенно важна. В целом, стандартные подходы к продлению циркуляции частиц в крови включают различные технические средства, например, модификацию поверхности с помощью «скрытых» ("stealth") покрытий типа ПЭГов, конъюгацию с самопептидами, связывание с дисопсонинами, полисахаридами и другими биосовместимыми полимерами, а также использование несферических наноагентов. Также можно заблокировать систему мононуклеарных фагоцитов (MPS) с помощью различных наноагентов.

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) является популярным решением при разработке различных систем адресной доставки, так как способен обеспечивать стабильность полученных в результате наночастиц в очень широком рН диапазоне. Для задач нанобиомедицины также актуальным является применение покрытий из полиэтиленимина и поливинилового спирта. Однако в наибольшей степени требованиям биосовместимости наноагентов удовлетворяют покрытия на основе природных молекул и полимеров. Для покрытия магнитных наночастиц широко используются полисахариды, такие как декстран, крахмал и хитозан. Покрытие хитозаном частиц магнетита приводит к формированию положительно заряженных частиц, усиливая при этом клеточный захват. В противоположность этому, наночастицы, покрытые декстраном и крахмалом, имеют нейтральный или слабо отрицательный поверхностный заряд при физиологических значениях рН. Поверхностная модификация на основе полисахаридов дает возможность для дальнейшей модификации поверхности наночастиц различными функциональными группами. Это важно для дальнейшей конъюгации с антителами, пептидами или другими биомолекулами.

Магнитные композитные наночастицы представляют собой наноразмерные частицы, обычно состоящие из магнитного сердечника, состоящего из оксидов металлов, железа, кобальта, никеля и т.п., и слоя оболочки полимер/кремний/гидроксиапатит, обернутого вокруг магнитного сердечника. Чаще всего ядерный слой состоит из Fe₃O₄ или γ-Fe₂O₃ с суперпарамагнитными или ферромагнитными свойствами. Под действием внешнего магнитного поля он может достигать направленного движения, что удобно для позиционирования и отделения от среды. Магнитные композитные наночастицы обладают характеристиками суперпарамагнетизма и макромолекул, с магнитным наведением, биосовместимостью, эффектом малого размера, поверхностным эффектом, активной группой и некоторыми биомедицинскими функциями.

Частицы, описанные здесь, могут быть как наночастицами, так и микрочастицами. Когда здесь говорится о наночастице, подразумевается, что также подходит немного более крупная частица, например, микрочастица, в зависимости от конкретного применения. В любом случае частица изготовлена из материала, который является биосовместимым и/или биоразлагаемым. В вариантах осуществления наночастица может быть магнитной частицей, содержащей частицу кобальта, частицу никеля или частицу оксида железа. В некоторых вариантах осуществления наночастица может быть полым ядром, квантовой точкой или неорганической частицей, такой как частица кремнезема, частица пористого кремнезема или частица фосфата кальция, причем такие немагнитные наночастицы дополнительно включают атомы магнитного металла.

Из уровня техники известен близкий способ получения магнитных наночастиц (CN 111110872 А, опубл. 08.05.2020), который включает следующие стадии:

A) После смешивания сополиэфира валерата полигидроксибутирата с раствором Na₂SO₄ и ZnSO₄⋅H₂O, полученную смесь добавляют в раствор Na2CO3, получают коллоид [Zn5(СО₃)2(ОН)6];

Б) Затем смешивают с FeSO₄⋅7H₂O, доводят рН раствора до 11,0±0,3, затем добавляют полученный коллоид [Zn5(СО₃)2(ОН)6], тщательно перемешивают, центрифугируют и диспергируют в растворе этанола.

B) Помещают полученную смесь на футеровку из политетрафторэтилена в реакционном котле высокого давления, выдерживают при постоянной температуре 180°С±2°С в течение 12±0,5 часов, затем отделяют магнитные наночастицы магнитным способом.

Недостатками известного аналога является отсутствие специфичности полученных наночастц к биомолекулярным мишеням, низкой биосовместимостью и жесткими условиями синтеза.

Из уровня техники известен наиболее близкий способ получения магнитных наночастиц (US 6514481 B1, опубл. 04.02.2004), который включает:

1) формирования магнитного ядра,

2) формирование SiO₂ оболочки вокруг упомянутого магнитного ядра,

3) прикрепление нацеливающего агента с помощью углеродного спейсера, причем такого спейсера, в котором от 6 до 20 атомов углерода, а диаметр упомянутой оболочки менее 100 нм.

Недостатками известного наиболее близкого аналога является необходимость множества шагов для придания частицам специфичности, что делает процесс менее воспроизводимым, также требуются дополнительные шаги формирования промежуточной оболочки между ядром и таргетирующим элементом, а также треубется спейсер, который может негативно влиять на специфичность частиц в виду своей гидрофобности/заряженности и т.п.

Таким образом, требуемый технический результат заключается в способе создания стабилизированных магнитных наноагентов, предпочтительно специфичных к молекулярным мишеням, отличающимся малым количеством шагов синтеза, улучшенной воспроизводимостью, биобезопасностью (биосовместимостью) и, предпочтительно, характеризующимся отсутствием дополнительных оболочек или спейсеров.

Краткое описание изобретения

Для достижения указанного технического результата предложен способ синтеза стабилизированных магнитных наноагентов, включающий следующие стадии:

i) коллоидный раствор исходных магнитных наночастиц смешивают с раствором гамма-иммуноглобулинов с целью получения реакционной смеси, при этом иммуноглобулин имеет конечную концентрацию не менее 1 мг/мл;

ii) полученную реакционную смесь нагревают до температуры от 45 до 98 градусов Цельсия с целью получения суспензии стабилизированных магнитных наночастиц.

Кроме того, способ синтеза функционализированных магнитных наноагентов, нацеленных на специфическую биомолекулярную или клеточную мишень, включающий следующие стадии:

i) коллоидный раствор исходных магнитных наночастиц смешивают с раствором гамма-иммуноглобулинов, включающих в том числе иммуноглобулины-антитела против упомянутой биомолекулярной или клеточной мишени с целью получения реакционной смеси, при этом иммуноглобулин имеет конечную концентрацию не менее 1 мг/мл;

ii) полученную реакционную смесь нагревают до температуры от 45 до 98°С с целью получения суспензии функционализированных магнитных наночастиц.

Кроме того, применение магнитной наночастицы, полученной упомянутым способом, в реагенте для трансфекции.

Кроме того, магнитный наноагент с белковым покрытием для диагностики, биоимиджинге и терапии в биомедицине, содержащий наноагент, полученный упомянутым способом.

Кроме того, применение магнитного наноагента с белковым покрытием для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения рака печени, рака желудка, рака легких, рака груди или рака шейки матки.

Сущность изобретения поясняется чертежами

На фиг. 1 представлена характеристика nFe₃O₄@IgNP и исследования in vivo.

На фиг. 2 представлены результаты анализа DLS.

На фиг. 3 представлено SEM-изображение; масштаб шкалы - 500 нм.

На фиг. 4 представлена фармакокинетика клиренса nFe₃O₄@IgNPs из кровотока мыши, аппроксимация (экспоненциальная регрессия по методу LOESS) и расчетный период полувыведения.

На фиг. 5 представлены результаты анализа биораспределения nFe₃O₄@IgNPs после внутривенного и внутрибрюшинного введений.

На фиг. 6 представлена МРТ (магнитно-резонансная томография) репрезентативных изображений для инъецированных и не инъецированных мышей (последовательность FLASH); овалы указывают на области, связанные с печенью.

На фиг. 7 представлены флуоресцентные изображения всего тела in vivo для инъецированных и не инъецированных мышей, наночастицы были помечены Су7.

На фиг. 8 представлены флуоресцентные изображения органов ex vivo для инъецированных и не инъецированных мышей, наночастицы были помечены Су7. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Значение n=3 для каждой группы (количество независимых животных).

На фиг. 9 представлены испытания на безопасность in vivo при внутривенной инъекции nFe₃O₄@IgNPs через 24 часа после инъекций. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего, n=3 для каждой группы (количество независимых животных).

На чертежах цифрами обозначены:

1. - иммуноглобулины

2. - наноразмерный магнетит

3. - наночастицы

Подробное описание изобретения

В рамках данного изобретения предложен способ синтеза стабилизированных магнитных наноагентов, включающий следующие стадии:

i) коллоидный раствор исходных магнитных наночастиц смешивают с раствором гамма-иммуноглобулинов с целью получения реакционной смеси, при этом иммуноглобулин имеет конечную концентрацию не менее 1 мг/мл;

ii) полученную реакционную смесь нагревают до температуры от 45 до 98°С с целью получения суспензии стабилизированных магнитных наночастиц.

Кроме того, способ синтеза функционал изированных магнитных наноагентов, нацеленных на специфическую биомолекулярную или клеточную мишень, включающий следующие стадии:

i) коллоидный раствор исходных магнитных наночастиц смешивают с раствором гамма-иммуноглобулинов, включающих в том числе иммуноглобулины-антитела против упомянутой биомолекулярной или клеточной мишени с целью получения реакционной смеси, при этом иммуноглобулин имеет конечную концентрацию не менее 1 мг/мл;

ii) полученную реакционную смесь нагревают до температуры от 45 до 98°С с целью получения суспензии функционализированных магнитных наночастиц.

Кроме того, способ, в котором упомянутые исходных магнитные наночастицы представляют собой суперпарамагнитные частицы.

Кроме того, способ, в котором упомянутые исходных магнитные наночастицы представляют собой кристаллиты магнетита, маггемита, смешанные шпинели на основе железа, никеля или кобальта.

Кроме того, способ, в котором упомянутые исходные магнитные наночастицы имеют размер от 5 до 25 нм.

Кроме того, способ, в котором упомянутые исходные магнитные наночастицы имеют размер от 25 до 100 нм.

Кроме того, способ, в котором упомянутые исходных магнитные наночастицы имеют размер от 50 до 200 нм.

Кроме того, способ, в котором упомянутое нагревание проводят от 40 до 45°С.

Кроме того, способ, в котором упомянутое нагревание проводят от 45 до 55°С.

Кроме того, способ, в котором упомянутое нагревание проводят от 55 до 75°С.

Кроме того, способ, в котором упомянутое нагревание проводят от 75 до 95°С.

Кроме того, способ, в котором упомянутое нагревание проводят в течение от 30 секунд до 2 минут.

Кроме того, способ, в котором упомянутое нагревание проводят в течение от 2 секунд до 4 минут.

Кроме того, способ, в котором упомянутое нагревание проводят в течение от 4 секунд до 6 минут.

Кроме того, способ, в котором после упомянутого нагрева упомянутую суспензию остужают до комнатной температуры с помощью метода активного охлаждения.

Кроме того, способ, в котором после упомянутого нагрева реакционной смеси дополнительно проводят ее инкубацию с раствором кросс-линкера.

Кроме того, способ, в котором упомянутый кросс-линкер является формальдегидом, глутаральдегидом или диглицидиловым эфиром полиэтиленгликоля.

Кроме того, способ, в котором после упомянутого кратковременного нагрева смеси дополнительно проводят ее инкубацию с концентрированным раствором формальдегида при конечной концентрации формальдегида не более 0.1% в течение ночи при комнатной температуре.

Кроме того, способ, в котором для облегчения обнаружения наноагентов in vitro и in vivo на шаге смешения в смесь добавляют раствор флуорофора.

Кроме того, способ, в котором для облегчения обнаружения частиц in vitro и in vivo на шаге смешения в смесь добавляют водный раствор эфира флуорофора.

Кроме того, способ, в котором упомянутые гамма-иммуноглобулины являются смесью нескольких гамма-иммуноглобулинов.

Кроме того, способ, в котором добавляют электролит для увеличения ионной силы раствора.

Кроме того, способ, в котором упомянутый электролит является хлоридом натрия. Кроме того, способ, в котором концентрация упомянутого электролита в смеси не более 500 ммоль/л.

Кроме того, способ, в котором концентрация упомянутого электролита в смеси не менее 50 ммоль/л.

Кроме того, способ, в котором рН реакционной смеси от 3 до 7.

Кроме того, способ, в котором упомянутый белок имеет изоэлектрическую точку в диапазоне значений pI от 3 до 7.

Кроме того, способ, в котором упомянутый белок имеет изоэлектрическую точку в диапазоне значений pI от 7 до 11.

Кроме того, способ, в котором после шага нагревания, обрабатывают реакционную смесь ультразвуком.

Кроме того, способ, в котором упомянутый гамма-иммуноглобулин является антителом против молекулярной или клеточной мишени.

Кроме того, способ, в котором упомянутый гамма-иммуноглобулин является противоопухолевым антителом.

Кроме того, способ, в котором иммуноглобулины-антитела против упомянутой биомолекулярной или клеточной мишени является противоопухолевым антителом.

Кроме того, применение магнитной наночастицы, полученной упомянутым способом, в реагенте для трансфекции.

Кроме того, магнитный наноагент с белковым покрытием для диагностики, биоимиджинге и терапии в биомедицине, содержащий наноагент, полученный упомянутым способом.

Кроме того, применение магнитного наноагента с белковым покрытием для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения рака печени, рака желудка, рака легких, рака груди или рака шейки матки.

Другой аспект изобретения относится к способу получения магнитных наночастиц, нацеленных на специфическую биомолекулярную или клеточную мишень, характеризующийся тем, который включает следующие стадии:

i) коллоидный раствор магнитных наночастиц смешивают с раствором гамма-иммуноглобулинов, имеющим значение рН от 3 до 7 и ионную силу не более 500 ммоль/л, с целью получения реакционной смеси, при этом иммуноглобулин имеет конечную концентрацию не менее 1 мг/мл;

ii) полученную реакционную смесь нагревают до температуры от 50 до 80°С в течение 30-300 секунд с целью получения магнитной суспензии;

iii) полученную магнитную суспензию обрабатывают ультразвуком в течение не более 30 с при комнатной температуре;

iv) затем полученную магнитную суспензию смешивают с концентрированным раствором формальдегида до конечной концентрации формальдегида не более 0.1%, перемешивают и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре, получают магнитные наночастицы;

v) полученные магнитные наночастицы трижды промывают на центрифуге 10000 г, 10 мин.

При этом, с целью маркировки упомянутых магнитных наночастиц, вместе с формальдегидом на стадии iv) добавляют водный раствор эфира сульфо-цианина 3 NHS (Су3) с исходной концентрацией 10 мг/мл.

Кроме того, упомянутый раствор формальдегида может быть раствором глутаральдегида или диглицидиловым эфиром полиэтиленгликоля.

В следующем аспекте изобретение относится к функциональному белковому наноагенту для визуализации и терапии в биомедицине, содержащему магнитные наночастицы, полученные способом, упомянутым в первом аспекте изобретения.

Кроме того, функциональный белковый наноагент с упомянутыми магнитными наночастицами может содержать магнитный материал с суперпарамагнитными свойствами из магнетита, маггемита, смешанные шпинели на основе железа, никеля или кобальта.

При этом, упомянутые магнитные наночастицы в составе функционального белкового наноагента имеют размер в диапазоне 10-100 нм.

Аналогичным образом, изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию или Лекарственное средство, в котором используется функциональный белковый наноагент, содержащий упомянутые магнитные наночастицы.

В следующем аспекте изобретение относится к применению функционального белкового наноагента, содержащего упомянутые магнитные наночастицы, для изготовления и производства лекарственного средства.

На протяжении всего описания используемые здесь термины следует понимать как значения, обычно используемые в данной области техники.

В контексте настоящего изобретения термин «магнитная наночастица» относится к структуре, содержащей суперпарамагнитное ядро, окруженное иммуноглобулинами.

Магнитная наночастица включает сердечник, оболочку и ореол, оболочка покрывает сердечник, оболочка защищает сердечник, а также оболочка предотвращает утечку магнитного материала из сердечника; гало включает рН-чувствительную группу, которая может реагировать высвобождением в нейтральных или кислых условиях; материал, составляющий ореол, содержит полиэтиленгликоль, который может гарантировать устойчивость наночастиц к биологическому загрязнению и длительную циркуляцию в организме; Гало также обеспечивает химическую основу для связывания группы молекул-мишеней.

Частица может иметь любую форму, включая, но не ограничиваясь: сферу, квадрат, прямоугольник, треугольник, круглый диск, кубовидную форму, куб, прямоугольный параллелепипед, конус, цилиндр, призму, пирамиду, прямоугольный круглый цилиндр и другие правильные или неправильные формы. Необязательно, диаметр наночастицы может составлять около 1-999 нм, включая, например, от примерно 50 нм до примерно 500 нм. Необязательно диаметр микрочастицы составляет 1-999 мкм, например, от примерно 50 мкм до примерно 500 мкм.

Функциональные магнитные наночастицы, как предусмотрено в настоящем документе, могут иметь любую подходящую магнитную композицию, включая, но не ограничиваясь, наночастицы на основе железа, наночастицы на основе никеля, наночастицы на основе кобальта, определенные наночастицы лантаноидов, определенные наночастицы актиноидов, определенные наночастицы переходных металлов, определенные наночастицы постпереходных металлов, определенные немагнитные наночастицы, связанные с металлом, магнитное ядро - немагнитная оболочка, ядро - оболочка, наночастицы, немагнитное ядро - магнитная оболочка, ядро - оболочка или тому подобное.

Функциональная составляющая выбирается на основе предполагаемого использования функциональных частиц, и в зависимости от предполагаемого использования может использоваться множество функциональных составляющих. Например, функциональная часть может быть целевым агентом, терапевтическим агентом, агентом визуализации, ферментом и любой их комбинацией. Функциональная часть необязательно распознает конкретные биологические мишени, например, определенные клетки или рецепторы или другие биомолекулы, присутствующие in vivo или in vitro. Функциональная часть может быть небольшой молекулой или биологическим агентом и может быть естественным или неестественным агентом. Необязательно, функциональная часть представляет собой антитело или его фрагмент или химерную молекулу с множеством функций, например, с целевой частью, терапевтическим агентом и/или меткой. Необязательно функциональная часть специфически связывает выбранный тип клеток, например, опухолевую клетку.

Термин «диаметр» относится к максимальному расстоянию между двумя противоположными точками на поверхности частицы.

Термин «сердечник» относится к магнитному сердечнику, присутствующему в каждой магнитной наночастице, способному обеспечивать магнетизм.

Термин «оболочка» относится к внешней оболочке, покрывающей ядро магнитной наночастицы, которая может защищать магнитный сердечник магнитопровода в нейтральной или кислой среде и обеспечивать соединение последующих функциональных химических групп.

Термин «гало» может гарантировать, что магнитные наночастицы циркулируют в крови в течение длительного времени без проглатывания, имеют рН-зависимое высвобождение и могут связываться с функциональными антителами для захвата пузырьков в организме.

Термин «группа» относится к химической группе, связанной с поверхностью магнитной наночастицы. Функциональная группа может быть ковалентно или нековалентно связана с оболочкой магнитной наночастицы.

Термин «антитело» включает иммуноглобулины, полученные естественным путем или частично или полностью синтетически, и их фрагменты. Термин также включает любой белок, имеющий связывающий домен, гомологичный связывающему домену иммуноглобулина. «Антитело» также включает полипептиды, которые содержат каркасные области из генов или фрагментов иммуноглобулинов, которые специфически связываются с антигенами и распознают их. Использование термина «антитело» предназначено для включения целых антител, поликлональных, моноклональных и рекомбинантных антител и их фрагментов, а также включает одноцепочечные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, мышиные антитела, химеры, мышь-человек, мышь- приматы, моноклональные антитела приматов и человека, фрагменты антител, такие как scFv, Fab, Fab', Fv, dAb, нанотело, фрагмент Fd, диатело и родственные антителу полипептиды. Антитела включают биспецифические антитела и мультиспецифические антитела, если они проявляют требуемую биологическую активность или функцию.

Под термином «антитело» или его фрагментом в настоящем документе подразумевается IgG, IgA, IgM, IGD, IgE, а также одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), химерные антитела и гибридные антитела с двойной или множественной специфичностью к антигену или эпитопу и фрагменты, такие как F(ab')2, Fab', Fab и т.п., включая гибридные фрагменты. Таким образом, фрагменты антител, которые сохраняют способность связывать свои специфические мишени, могут быть прикреплены к функциональным частицам. Например, фрагменты антител, которые сохраняют связывающую активность для неопластической клетки, включены в значение термина антитело или его фрагмент. Такие антитела и фрагменты могут быть изготовлены методами, известными в данной области техники, и могут быть проверены на специфичность и активность в соответствии с общими методами получения антител и скрининга антител на специфичность и активность (см. Харлоу и Лейн, Антитела: Лабораторное руководство, Публикации Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк (1988)).

В вариантах осуществления по настоящему изобретению магнитные наночастицы имеют размер от 10 до 100 нм.

Средние размеры магнитных наночастиц в этих системах могут быть измерены стандартными методами, известными специалистам в данной области, такими как микроскопия (например, оптическая микроскопия, электронная микроскопия с отрицательным окрашиванием, просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ), крио-ТЕМ, сканирование электронная микроскопия (SEM), конфокальная микроскопия и сканирующая зондовая микроскопия), методы дифракции и рассеяния (лазерное рассеяние света и фотонная корреляционная спектроскопия) и гидродинамические методы (фракционирование в полевом потоке, гель-проникающая хроматография, ультрацентрифугирование и центробежное осаждение). Предпочтительными методами являются динамическое рассеяние света (DLS) и, более конкретно, фотонная корреляционная спектроскопия. Размеры, измеренные DLS, соответствуют диаметру сферы, которая диффундирует с той же скоростью, что и измеряемая частица.

В контексте настоящего изобретения методы, используемые для определения размера и параметров PDI, предпочтительно являются методами, определенными в стандартах ISO 13321: 1996 Е и ISO 22412: 2008 (издание 1 в обоих случаях). Эти измерения могут быть выполнены с использованием соответствующего оборудования Malvern Instruments Ltd. Zetasizer (см., Например, измерение, описанное в Руководстве пользователя Zetasizer Nano, MAN0317, выпуск 5.0, август 2009 г., для устройства серии Nano ZS).

Стадия (i) включает получение реакционной смеси из коллоидного раствора магнитных наночастиц и раствора гамма-иммуноглобулинов. При этом предпочтительно, чтобы раствор гамма-иммуноглобулинов имел значение рН от 3 до 7 и ионную силу не более 500 ммоль/л, а иммуноглобулин имел конечную концентрацию не менее 1 мг/мл.

На стадии (ii) полученную реакционную смесь нагревают до температуры от 50 до 80°С в течение 30-300 секунд. Этот режим нагрева является предпочтительным для получения магнитной суспензии.

Полученную магнитную суспензию подвергают тщательному перемешиванию - стадия (iii). Предпочтительной формой перемешивания является обработка ультразвуком, но не более 30 с.

Затем на стадии (iv) полученную магнитную суспензию смешивают с концентрированным раствором формальдегида до конечной концентрации формальдегида не более 0.1%, перемешивают и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре, получают магнитные наночастицы. Полученные магнитные наночастицы трижды промывают на центрифуге 10000 g, 10 мин.

При этом, практически любые магнитные кристаллиты можно покрывать белковой оболочкой согласно описанному методу. Для того, чтобы понять, как формируется оболочка, рассмотрим, как происходит процесс без добавления магнитных частиц.

Далее мы демонстрируем одноэтапный, синтез наночастиц иммуноглобулина (IgNPs) с возможностью управлять размером синтеза. Такие наночастицы сохраняют специфичность родительских антител и нацелены на раковые клетки лиганд-зависимым образом. Мы демонстрируем биосовместимость наночастиц и их применимость in vivo.

Иммуноглобулины человека в водном растворе с рН, который ниже изоэлектрической точки белка, были кратковременно нагреты, охлаждены и стабилизированы. Наночастицы были относительно монодисперсными, гидродинамический диаметр составлял 84±8 нм, профиль распределения показан на фиг. 1b. Мы выбрали рН 5,0 и время инкубации 1 мин в качестве сбалансированных условий. Однако время нагрева, а также рН повлияли на размер наночастиц (фиг. 3, 4). Таким образом, синтез контролировался по размеру. Кроме того, наночастицы продемонстрировали почти сферическую геометрию, согласно анализу SEM-изображения (растровый/ сканирующий электронный микроскоп) (фиг. 5). Мы измерили выход синтеза с помощью гравиметрического анализа - около 11% и анализа ВСА (бицинхониновая кислота) - около 15%. Мы предположили, что анализ ВСА завысил выход, такой эффект был продемонстрирован для наночастиц с низким содержанием сшитых белков. Наконец, STF является воспроизводимым синтезом, относительное стандартное отклонение гидродинамических диаметров было рассчитано как 10% (n=10). Наконец, мы изучили IgNPs с помощью анализа ELISA (иммуноферментный анализ) и обнаружили, что наночастицы все еще распознаются антивидовыми антителами (фиг. 6). Таким образом, мы пришли к выводу, что иммуноглобулины, образованные наночастицами, не были полностью денатурированы и, возможно, способны проявлять надлежащее сродство и специфичность.

Для изучения способности наночастиц взаимодействовать со специфическими лигандами мы синтезировали наночастицы (Т₁₀₀ -IgNPs), полученные из одобренного FDA трастузумаба моноклонального антитела против рецептора HER2/neu. Кроме того, мы синтезировали наночастицы, полученные из различных смесей иммуноглобулинов человека/трастузумаба (Т х -IgNPs, х - фракция трастузумаба, фиг. 7).

Мы изучили взаимодействия Тх -IgNPs с клеточными линиями SKBR3 (сверхэкспрессия HER2/neu) и СНО (отрицательный контроль) с использованием визуализации проточной цитометрии (фиг. 8, 9). Скрининг показал, что даже Т10 -IgNP по-прежнему обладают высокой специфичностью. Этот результат показывает, что STF может быть применен для создания/ разработки наноагентов, нацеленных на многие лиганды, и позволяет сократить использование ключевых антитела. К счастью, на сегодняшний день многие терапевтические антитела клинически одобрены и коммерчески доступны, все они могут быть использованы для разработки специфически нацеленных наноагентов на основе иммуноглобулинов. Мы хотели бы отметить, что сыворотка пациентов может использоваться в качестве источника иммуноглобулинов. Такая стратегия может быть применена для разработки персонализированной наномедицины.

Нагретые белки теряют нативную конформацию и имеют тенденцию к агрегации. Однако агрегация, вызванная денатурацией, может существенно не влиять на сродство иммуноглобулинов из-за различных температур денатурации домена. В частности, домен СН2 (часть области Fc) имеет значительно более низкую температуру перехода, чем домены области Fab. Кроме того, кислотные условия могут стабилизировать домены VH и VL (части области Fab). Авторы не видят препятствий для применения STF для создания наночастиц на основе других белков. Мы считаем, что белок должен иметь функциональный домен и, по крайней мере, один менее термостойкий домен, который становится «липким» при нагревании и может способствовать образованию наночастиц. Стоит отметить, что белок может быть тонко настроен с помощью подходов белковой инженерии. Оптимизированные или химерные белки могут образовывать наночастицы в особо мягких условиях.

Устойчивость синтеза IgNP можно количественно оценить с использованием проверенного десятилетиями показателя Е-фактор, который представляет собой отношение массы отходов к полученному продукту. Таким образом, чем меньше значение Е-фактора, тем больше устойчивым является процесс. Ожидается, что значения Е-фактора для синтеза наночастиц будут находиться в диапазоне от 102 до 106. Однако такие огромные значения Е-фактора относятся к методам изготовления нефункционализированных и нецелевых наночастиц, например, золота, кремнезема и т.д. В отличие от этого, STF демонстрирует чрезвычайно низкое воздействие на окружающую среду со значением коэффициента 16,9 (подробности расчета приведены во вспомогательной информации). Такое сравнение показывает, что STF является уникальным методом получения целевых наночастиц с крайне низким воздействием на окружающую среду.

Нагретые белки теряют нативную конформацию и имеют тенденцию к агрегации. Однако агрегация, вызванная денатурацией, может существенно не влиять на сродство иммуноглобулинов из-за различных температур денатурации домена. В частности, домен СН2 (часть области Fc) имеет значительно более низкую температуру перехода, чем домены области Fab. Кроме того, кислотные условия могут стабилизировать домены VH и VL (части области Fab). Нет препятствий для применения STF для создания наночастиц на основе других белков. В одном воплощении, белок имеет функциональный домен и, по крайней мере, один менее термостойкий домен, который становится «липким» при нагревании и может способствовать образованию наночастиц. Белок может быть тонко настроен с помощью подходов белковой инженерии.

Быстрое термическое образование (STF) позволяет синтезировать наночастицы на основе иммуноглобулинов и контролировать их свойства. Наночастицы сохраняют сродство к фракциям иммуноглобулинов. Способ также может быть применим для синтеза гибридных наночастиц без дополнительных химических модификаций. Наноагенты специфическим образом взаимодействуют с рецепторами клеток, не обладают токсичностью и подходят для применения in vivo. Кроме того, мы предполагаем, что STF позволяет синтезировать наночастицы из материалов пациентов и это может стать прорывом в области персонализированной медицины. Рассчитанный Е-фактор доказывает, что STF оказывает впечатляюще низкое воздействие на окружающую среду по сравнению с современными технологиями синтеза наноматериалов. Таким образом, STF является перспективной и экологически чистой синтетической стратегией, которая может применяться во многих биомедицинских областях благодаря своей гибкости и биобезопасность.

Устойчивость синтеза IgNP можно количественно оценить с использованием проверенного десятилетиями показателя Е-фактор, который представляет собой отношение массы отходов к полученному продукту. Таким образом, чем меньше значение Е-фактора, тем больше устойчивым является процесс. Ожидается, что значения Е-фактора для синтеза наночастиц будут находиться в диапазоне от 102 до 106. Однако такие огромные значения Е-фактора относятся к методам изготовления нефункционализированных и нецелевых наночастиц, например, золота, кремнезема и т.д. В отличие от этого, STF демонстрирует чрезвычайно низкое воздействие на окружающую среду со значением коэффициента 16,9. Подробности расчета приведены во вспомогательной информации. Такое сравнение показывает, что STF является уникальным методом получения целевых наночастиц с крайне низким воздействием на окружающую среду.

Влияние состава: подбор условий (рН, соль).

В одном воплощении метода для получения наноагентов (частиц) выбирают рН раствора, а также ионную силу раствора. Изменения рН раствора добиваются, например, путем титрования раствора нужным количеством таких сильных кислот как соляная, серная, азотная и др., сильных щелочей - гидроксид натрия, гидроксид калия, или слабых кислот - угольной, уксусной, и др„ или слабых щелочей - гидроксид аммония и др. Ионную силу изменяют (доводят) путем, например, добавления (титрования) различных солей сильных и слабых кислот и щелочей, например, хлорид натрия, хлорид калия, сульфат аммония, хлорид аммония и др.

Кроме того, в одном воплощении метода рН и концентрацию раствора белка доводят до нужных значений с помощью добавления к раствору белка буферного раствора или непосредственна за счет растворения белка в буферном растворе.

Однако, параметр рН и ионной силы - это взаимосвязанные параметры, обоюдно влияющие на параметры получаемых частиц. Как показано в Примерах, для таких белков как альбумин, иммуноглобулин, овальбумин, и др. - чем выше рН, тем больше ионной силы (соли) требуется для генерации частиц.

Кросс-сшивка

В одном воплощении метода, полученные частицы кросс-сшивают для обеспечения большей стабильности частиц с точки зрения дезинтеграции (растворения за счет перехода индивидуальных белковых молекул из наночастиц обратно в раствор; или за счет деградации различными ферментами организма (например, протеазами) или клеток или иных биологических систем).

В одном воплощениии метода для кросс-сшивки наночастиц, их смешивают с бифункциональными кросс-линкерами. Это может быть глутаровый альдегид, формальдегид, диглицидиловый эфир, генипин и т.п. В одном воплощении метода, используют такой кросс-линкер, который оставляет частицы или делает их высокоспецифичными с точки зрения распознавания/связывания со своей биологической мишенью. В частности, кросс-сшивка формальдегидом или диглицидиловым эфиром предпочтительнее использования глутарового альдегида, т.к. как правило позволяет добиться более специфичных частиц. В то же время, для таких задач как неспецифическая трансфекция клеток генетическим материалом предпочтительно использовать кросс-сшивающий агент, который приводит не к избирательности частиц, а наоборот позволяет им высокоэффективно связываться с различными мишенями. Так, например, глутаровый альдегид приводит к образованию оснований Шиффа, которые обладают частичным положительным зарядом, а потому будут эффективно выполнять задачу связывания ДНК (которая заряжена отрицательно) для целей доставки генетического материала в клетки.

Дополнительные компоненты:

Как уже было упомянуто выше, помимо белковых молекул, реакционная смесь может содержать другие вещества и компоненты - буферные соли, кислоты, щелочи, различные терапевтические, диагностические наночастицы и молекулы. Такими частицами могут быть золотые наночастицы, наночастицы магнетита, полимерные частицы и пр. А молекулы могут быть как макромолекулярные, так и низкомолекулярными - растворители (диметилсульфоксид, диметилформамид, ацетон, этанол и т.п.), флуорофоры (родамин, флуоресцеин), фотосенсибилизаторы, цитостатики и цитотоксические вещества - доксорубицин, паклитаксел и т.п.

Помимо того, что упомянутые наночастицы или молекулы добавляют для их инкапсуляции и загрузки в белковые наночастицы (о чем будет сказано подробнее ниже), в одном воплощении, данные частицы и молекулы добавляют для обеспечения растворимости, стабильности других компонент реакционной смеси. Например, для создания высокой концентрации красителя орсеина в реакционной смеси, орсеин предварительно растворяют в ДМСО и этот раствор уже добавляют в реакционную смесь.

Кроме того, в одном воплощении метода также используют ПАВы и другие стабилизаторы эмульсий и т.п., добавляя их в реакционную смесь. Так, например, можно добиться получения стабильных частиц в тех комбинациях рН и ионной силы, где при обработке излучением образуется белковые макроагрегаты. С одной стороны, как было отмечено выше, это имеет существенные недостатки перед системами, свободными от использования ПАВ. С другой стороны, этот метод позволяет получать частицы в тех рН, где могут быть намного более растворимы или стабильные лекарственные молекулы терапевтической нагрузки.

Нагрузка

Описанными способами можно эффективно загружать различные агенты. Во-первых, это могут быть наночастицы такие как золотые наночастицы, магнитные наночастицы, другие кристаллические частицы, полимерные наночастицы и микрочастицы, квантовые точки, наноалмазы, нанофосфоры, нанорубины. Кроме того, это могут быть различные молекулы, малые молекулы (родамин, флуоресцеин и т.п.), фотосенсибилизаторы, цитостатики и цитотоксические вещества (доксорубицин, паклитаксел, даунорубицин, и другие).

Способ загрузки

Кроме того, в одном воплощении метода можно получать белковые наночастицы, нагруженные различными терапевтическими агентами. В одном воплощении метода раствор или суспензию терапевтического агента добавляют в реакционную смесь до облучения. При этом достигается крайне высокая эффективность загрузки терапевтического агента в белковую матрицу наночастицы. Важно, что терапевтическоий агент может быть растворен либо ресуспендирован в дополнительных растворителях таких как этанол, ацетон, диметилсульфоксид, диметилформамид. Добавление подобного рода растворителей либо не мешает генерации наночастиц, либо требует малого изменения других параметров реакционной смеси таких как рН, ионная сила и режимов облучение микроволновым излучением. Это дает возможность использовать как сильно гидрофобные терапевтические агенты, так и гидрофильные, и амфифильные. В случае использования наночастиц в качестве терапевтического агента и/или нагрузки создаваемых частиц, они также могут быть ресуспендированы в любом подходящем растворителе. Изобретение позволяет существенно улучшить параметры нагрузки белковых наночастиц за счет использование водного раствора как основной среды, в которой происходит синтез. В отличие от коацерватного синтеза белковых наночастиц, водная среда вокруг получаемых наночастиц препятствуют выходу гидрофобных терапевтических агентов из объема наночастиц. Отметим, что в коацерватном методе синтеза белковых наночастиц высокое содержание более гидрофобных растворителей (этанол, ацетон), наоборот, способствует плохому включению гидрофобного терапевтического агента в матрицу получаемых наночастиц, так как сродство такого агента к раствору получается больше, чем к белковой матрице. Наоборот, генерация белковых наночастиц в рамках предлагаемого изобретения лишена такого недостатка. А именно гидрофобный терапевтический агент предпочитает активнее включаться в белковую матрицу наночастицы, чем оставаться в растворе.

Кроме того, в одном воплощении метода терапевтический агент может быть включен (инкапсулирован) в уже полученные наночастицы путем сорбции, основанной на электростатическом, гидрофобно-гидрофильном, координационным или ином взаимодействии.

Кроме того, в одном воплощении метода терапевтический агент может быть присоединен к сформированным белковом наночастицам за счет ковалентной или не ковалентной конъюгации. В таком случае для высвобождения данного терапевтического агента требуется использование известных в литературе приемов обратимой конъюгации. То есть могут быть использованы различные лабильные связи, которые тем или иным способом разрушаются для высвобождения терапевтического агента.

Количество нагрузки

Фармакологически активный агент(ы) могут присутствовать в широком диапазоне концентраций в композиции изобретения, как определено конечными применениями композицией изобретения. Например, фармакологически активный функциональный агент (агенты) может присутствовать в составе изобретения в диапазоне: от примерно 0.0001% до примерно 95% массы в единице объема, по результатам измерения в смеси перед выпариванием и лиофилизацией. В одном варианте осуществления, когда фармакологически активным агентом является паклитаксел, концентрация фармакологически активного агента в органическом растворителе (растворителях) (т.е. перед добавлением любых других необязательных компонентов смеси) может находиться в диапазоне от примерно 0,001 мг/мл до примерно 1000 мг/мл.

Можно включить каждое из активных веществ, перечисленных в приведенном выше списке активных агентов в матрицу частиц белковой системы-носителя. Однако, из-за различных физико-химических свойств активных ингредиентов (например, растворимость, изотермы адсорбции, связывание с белками плазмы, значения pK) для конкретного лекарственного средства может потребоваться оптимизировать процесс изготовления лекарственно-содержащих наночастиц.

Кроме того, в одном воплощении изобретения, используют функциональное агент, являющийся ионом, заряженным веществом, заряженной молекулой или молекулами (и т.п.) в совокупности с хелатирующим агентом (хелатором). Например, в одном воплощении изобретения для эффективного включения ионов железа может быть использован хелатор дефероксамин (Deferoxamine), для включения в до наночастицы ионов гадолиния используют DTPA или другой хелатор.

Соответственно, при добавлении магнитных кристаллитов в вышеописанные реакции, происходит формирование белковых оболочек на кристаллитах (или рост белковой частицы на зародышах, которыми являются магнитные частицы-кристаллиты).

Нагретые белки теряют нативную конформацию и имеют тенденцию к агрегации. Однако агрегация, вызванная денатурацией, может существенно не влиять на сродство иммуноглобулинов из-за различных температур денатурации домена. В частности, домен СН2 (часть области Fc) имеет значительно более низкую температуру перехода, чем домены области Fab. Кроме того, кислотные условия могут стабилизировать домены VH и VL (части области Fab). Авторы не видят препятствий для применения STF для создания наночастиц на основе других белков. Мы считаем, что белок должен иметь функциональный домен и, по крайней мере, один менее термостойкий домен, который становится «липким» при нагревании и может способствовать образованию наночастиц. Стоит отметить, что белок может быть тонко настроен с помощью подходов белковой инженерии. Оптимизированные или химерные белки могут образовывать наночастицы в особо мягких условиях. Затем мы продемонстрировали, что STF можно использовать для загрузить IgNPs наночастицами разной природы. Мы инкапсулировали наноразмерный магнетит (nFe3O4, протокол синтеза и характеристики доступны во вспомогательной информации) в белковую матрицу и сформированные гибридные наноагенты nFe₃O₄@IgNPs (фиг. 1). Стандартные подходы для функционализации наночастиц белками требуют образования органического, например, PEG, или неорганического, например, кремнезем или золото интерфейса между наночастицами и иммобилизованными биомолекулами. Напротив, STF позволяет напрямую конъюгировать антитела и наночастицы, и такое преимущество упрощает синтез, уменьшает количество отходов, исключает использование органических растворителей.

Инкапсулированный магнетит ожидаемо увеличил размер наночастиц (фиг. 2, 3). Эти наноагенты были изучены in vivo. Мы исследовали их распространение/ циркуляцию (фиг. 4); период полураспада циркуляции был сравнительно небольшой, около 30 с. Мы полагаем, что данный факт объясняется ролью иммуноглобулинов при опсонизации, ожидается, что быстрому удалению/ очищению наночастиц будет способствовать адсорбция макрофагов за счет их специфичных к иммуноглобулинам рецепторов. Тем не менее, быстрый захват наночастиц макрофагами потенциально может позволить использовать их для нацеливания на макрофаги, что представляет особый интерес для лечения/ терапии ВИЧ-1 и рака. С другой стороны, время обращения/ циркуляции может быть значительно увеличено.

Кроме того, мы провели анализ биораспределения (фиг. 5) nFe₃CO₄@IgNPs, введенных внутривенно (в/в) и внутрибрюшинно (в/б). Внутривенное введение привело к ожидаемому накоплению наночастиц в двух основных кроветворных/ очищающих кровь органах, содержащих клетки системы мононуклеарных фагоцитов: печени и селезенке. Однако внутрибрюшное введение значительно изменили профиль распределения тканей. В частности, наночастицы накапливались в поджелудочной железе, а также в жировой ткани. Мы полагаем, что данный факт можно объяснить наличием специфических популяций макрофагов. Специфичное для органа накопление может быть использовано для биомедицинских применений, таких как визуализация или терапия. Мы продемонстрировали, что nFe₃O₄@IgNPs проявляет значительные отрицательные контрастные свойства и, следовательно, могут быть использованы в магнитно-резонансной томографии (фиг. 6). Кроме того, мы предполагаем, что такие магнитные наноагенты могут быть агентами гипертермии. Наконец, мы демонстрируем, что наночастицы также подходят для флюоресцентной визуализации всего тела in vivo, и органов ex vivo. Как видно на фиг. 7, 8, биораспределение наночастиц, помеченных Су7, аналогично измеренному с помощью MPQ биораспределению их немеченых аналогов (см. фиг. 9).

Кроме того, мы провели анализ биораспределения (фиг. 5) nFe₃O₄@IgNPs, введенных внутривенно (в/в) и внутрибрюшинно (в/б). Внутривенное введение привело к ожидаемому накоплению наночастиц в двух основных кроветворных/ очищающих кровь органах, содержащих клетки системы мононуклеарных фагоцитов: печени и селезенке. Однако внутрибрюшное введение значительно изменило профиль распределения тканей. В частности, наночастицы накапливались в поджелудочной железе, а также в жировой ткани. Мы полагаем, что данный факт можно объяснить наличием специфических популяций макрофагов. Специфичное для органа накопление может быть использовано для биомедицинских применений, таких как визуализация или терапия. Мы продемонстрировали, что nFe₃O₄@IgNPs проявляют значительные отрицательные контрастные свойства и, следовательно, могут быть использованы в магнитно-резонансной томографии (фиг. 6). Кроме того, мы предполагаем, что такие магнитные наноагенты могут быть агентами гипертермии. Наконец, мы демонстрируем, что наночастицы также подходят для флюоресцентной визуализации всего тела in vivo, и органов ex vivo. Как видно на фиг. 7, 8 биораспределение наночастиц, помеченных Су7, аналогично измеренному с помощью MPQ биораспределению их немеченых аналогов (см. фиг. 5).

Кроме того, STF позволяет загружать наночастицы с амфифильными или гидрофобными функциональными группами низкомолекулярных агентов, например красителями или лекарственными препаратами. Однако такая функционализация требует настройки синтеза из-за возможных взаимодействий между иммуноглобулинами и агентами. Наконец, мы изучили токсичность nFe₃O₄@IgNP (фиг. 9) с помощью гематологических и биохимических анализов крови.

При испытаниях на безопасность in vivo при внутривенной инъекции nFe₃O₄@IgNPs практически все параметры существенно не изменились. Кроме того, уровни активности лактатдегидрогеназы, количество эритроцитов, концентрация гемоглобина, средняя корпускулярная концентрация гемоглобина и гематокрита находятся в пределах нормы BALB/c. Изменения в количестве лейкоцитов и моноцитов незначительны и менее чем на 15% превышает верхние пределы нормальных уровней. Таким образом, мы пришли к выводу, что у наночастиц не должно быть никаких соответствующих побочных эффектов.

Практически все параметры существенно не изменились. Кроме того, уровни активности лактатдегидрогеназы, количество эритроцитов, концентрация гемоглобина, средняя корпускулярная концентрация гемоглобина и гематокрита находятся в пределах нормы BALB/c. Изменения в количестве лейкоцитов и моноцитов незначительны и менее чем на 15% превышает верхние пределы нормальных уровней. Таким образом, мы пришли к выводу, что у наночастиц не должно быть никаких соответствующих побочных эффектов.

Некоторые иллюстративные примеры, которые ясно показывают признаки и преимущества изобретения, описаны ниже, тем не менее, их не следует интерпретировать как ограничение объекта изобретения, определенного в формуле изобретения.

Примеры

Пример 1: Синтез стабилизированных магнитных наноагентов.

50 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН от 4,5 до 6,0), 30 мкл водного раствора nFe₃O₄ (наноразмерный магнетит) (32,5 г/л), 50 мкл диализованного раствора иммуноглобулина с концентрацией 20 мг/мл и 70 мкл воды MilliQ смешивали в микроцентрифужной пробирке 0,6 мл. Пробирку вставляли в гнездо предварительно нагретого термовибратора TS-100 (Biosan, Латвия) при температуре 98°С и инкубировали в течение 60 секунд. Затем пробирку обрабатывали ультразвуком в течение примерно 10 секунд при комнатной температуре в ультразвуковой ванне (35 кГц, 40 Вт, SONOREX RK 31, Банделин, Германия). Далее в пробирку добавляли 1,6 мкл 37%-ного раствора формальдегида, пипетировали и инкубировали в течение ночи на ротаторе при комнатной температуре. После инкубации в течение 1 мин при 100 g получали смесь. Супернатант собирали и смешивали со 100 мкл PBS; наночастицы отделяли с помощью постоянного магнита и промывают водой MilliQ. После этого наночастицы трижды центрифугировали (10 мин, 15000 g) и промывали водой MilliQ. Наконец, полученные стабилизированные магнитные наноагенты были повторно диспергированы в 200 мкл воды MilliQ.

Пример 2. Маркировка стабилизированных магнитных наноагентов флуорофором.

Синтезировали стабилизированные магнитные наноагенты как в Примере 1, но вместе с формальдегидом добавляли 1,2 мкл 10 мг/мл водного раствора эфира сульфоцианин 3 NHS (Су3).

Пример 3. Синтез стабилизированных магнитных наноагентов с использованием молекул гамма-иммуноглобулинов человека.

50 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН от 4,5 до 6,0), 30 мкл водного раствора nFe3O4 (наноразмерный магнетит) (32,5 г/л), 50 мкл диализованного раствора гамма-иммуноглобулинов человека с концентрацией 20 мг/мл и 70 мкл воды MilliQ смешивали в микроцентрифужной пробирке 0,6 мл. Пробирку вставляли в гнездо предварительно нагретого термовибратора TS-100 (Biosan, Латвия) при температуре 98°С и инкубировали в течение 60 секунд. Затем пробирку обрабатывали ультразвуком в течение примерно 10 секунд при комнатной температуре в ультразвуковой ванне (35 кГц, 40 Вт, SONOREX RK 31, Банделин, Германия). Далее в пробирку добавляли 1,6 мкл 37% - ного раствора формальдегида, пипетировали и инкубировали в течение ночи на ротаторе при комнатной температуре. После инкубации в течение 1 мин при 100 g получали смесь. Супернатант собирали и смешивали со 100 мкл PBS; наночастицы отделяли с помощью постоянного магнита и промывают водой MilliQ. После этого наночастицы трижды центрифугировали (10 мин, 15000 g) и промывали водой MilliQ. Наконец, полученные стабилизированные магнитные наноагенты были повторно диспергированы в 200 мкл воды MilliQ.

Пример 4. Синтез стабилизированных магнитных наноагентов с трастузумабом.

Для синтеза 100% наночастиц трастузумаба, проводят синтез как в Примере 3, со следующими компонентами: 100 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН от 4,5 до 6,0), 50 мкл воды MilliQ и 50 мкл диализованного раствора трастузумаба с концентрацией 20 мг/мл.

Кроме того, мы синтезировали наночастицы, полученные из различных смесей иммуноглобулинов человека/трастузумаба (Tx-IgNPs, х - фракция трастузумаба, фиг. 2а).

Пример 5. Синтез стабилизированных магнитных наноагентов на основе гамма-иммуноглобулинов мыши.

Для синтеза абилизированных магнитных наноагентов на основе гамма-иммуноглобулинов мыши, проводят синтез как в Примере 3, со следующими компонентами: 100 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН от 4,5 до 6,0), 50 мкл воды MilliQ и 50 мкл диализованного раствора гамма-иммуноглобулинов мыши с концентрацией 10-50 мг/мл.

Пример 6. Синтез стабилизированных магнитных наноагентов на основе ритуксимаба.

Для синтеза стабилизированных магнитных наноагентов на основе ритуксимаба, проводят синтез как в Примере 3, со следующими компонентами: 100 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН от 4,5 до 6,0), 50 мкл воды MilliQ и 50 мкл диализованного раствора ритуксимаба с концентрацией 10-50 мг/мл.

Кроме того, мы синтезировали наночастицы, полученные из различных смесей иммуноглобулинов человека/ритуксимаб (Rx-IgNPs, х - фракция ритуксимаба).

Пример 7. Синтез стабилизированных магнитных наноагентов на основе гамма-иммуноглобулинов человека, нагруженных доксорубицином.

Проводят синтез как в Примере 3, со следующими компонентами: 90 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН от 4,5 до 6,0), 50 мкл воды MilliQ и 50 мкл диализованного раствора гамма-иммуноглобулинов человека с концентрацией 10-50 мг/мл, и 10 мкл раствора доксорубицина в концентрации 1-10 г/л..

Пример 8. Синтез стабилизированных магнитных наноагентов на основе гамма-иммуноглобулинов человека, нагруженных флуорофором - нильским красным.

Проводят синтез как в Примере 3, со следующими компонентами: 90 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН от 4,5 до 6,0), 50 мкл воды MilliQ и 50 мкл диализованного раствора гамма-иммуноглобулинов человека с концентрацией 10-50 мг/мл, и 10 мкл раствора нильского красного в концентрации 1-10 г/л.

Пример 9. Синтез стабилизированных магнитных наноагентов на основе гамма-иммуноглобулинов человека, нагруженных нильским красным.

Проводят синтез как в Примере 3, со следующими компонентами: 90 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН от 4,5 до 6,0), 50 мкл воды MilliQ и 50 мкл диализованного раствора гамма-иммуноглобулинов человека с концентрацией 10-50 мг/мл, и 10 мкл раствора нильского красного в ДМСО в концентрации 0.1-1 г/л.

Пример 10. Синтез стабилизированных магнитных наноагентов на основе гамма-иммуноглобулинов человека без кросс-линкера.

50 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН от 4,5 до 6,0), 30 мкл водного раствора nFe₃O₄ (наноразмерный магнетит) (32,5 г/л), 50 мкл диализованного раствора иммуноглобулина с концентрацией 20 мг/мл и 70 мкл воды MilliQ смешивали в микроцентрифужной пробирке 0,6 мл. Пробирку вставляли в гнездо предварительно нагретого термовибратора TS-100 (Biosan, Латвия) при температуре 98°С и инкубировали в течение 60 секунд. Затем пробирку обрабатывали ультразвуком в течение примерно 10 секунд при комнатной температуре в ультразвуковой ванне (35 кГц, 40 Вт, SONOREX RK 31, Банделин, Германия).

Пример 11. Синтез стабилизированных магнитных наноагентов на основе молекул гамма-иммуноглобулинов человека, кросс-сшитого диглицедиловым эфиром ПЭГ.

50 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН от 4,5 до 6,0), 30 мкл водного раствора nFe₃O₄ (наноразмерный магнетит) (32,5 г/л), 50 мкл диализованного раствора иммуноглобулина с концентрацией 20 мг/мл и 70 мкл воды MilliQ смешивали в микроцентрифужной пробирке 0,6 мл. Пробирку вставляли в гнездо предварительно нагретого термовибратора TS-100 (Biosan, Латвия) при температуре 98°С и инкубировали в течение 60 секунд. Затем пробирку обрабатывали ультразвуком в течение примерно 10 секунд при комнатной температуре в ультразвуковой ванне (35 кГц, 40 Вт, SONOREX RK 31, Банделин, Германия). Затем в пробирку добавляли 30 мкл 1%-ного раствора диглицедилового эфира ПЭГ, перемешивали и инкубировали в течение ночи на ротаторе при комнатной температуре. После инкубации в течение 1 мин при 100 g получали смесь. Супернатант собирали и смешивали со 100 мкл PBS; наночастицы отделяли с помощью постоянного магнита и промывают водой MilliQ. После этого наночастицы трижды центрифугировали (10 мин, 15000 g) и промывали водой MilliQ. Наконец, полученные стабилизированные магнитные наноагенты были повторно диспергированы в 200 мкл воды MilliQ.

Пример 12. Направленных таргетинг клеток-мишеней стабилизированными магнитными наноагентами на основе трастузумаба.

Было изучено взаимодействие стабилизированных магнитных наноагентов из Примера 4 - Тх -IgNPs с клеточными линиями SKBR3 (сверхэкспрессия HER2/neu) и СНО (отрицательный контроль) с использованием визуализации проточной цитометрии. Скрининг показал, что даже Т₁₀-IgNP по-прежнему обладают высокой специфичностью. Этот результат показывает, что STF может быть применен для создания / разработки наноагентов, нацеленных на многие лиганды, и позволяет сократить использование ключевых антитела. На сегодняшний день многие терапевтические антитела клинически одобрены и коммерчески доступны, все они могут быть использованы для разработки специфически нацеленных наноагентов на основе иммуноглобулинов. Сыворотка пациентов может также использоваться в качестве источника иммуноглобулинов. Такая стратегия может быть применена для разработки персонализированной наномедицины.

Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к способу синтеза стабилизированных магнитных наноагентов, включающему следующие стадии: i) коллоидный раствор исходных магнитных наночастиц смешивают с раствором гамма-иммуноглобулинов с целью получения реакционной смеси, при этом гамма-иммуноглобулины имеют конечную концентрацию не менее 1 мг/мл; ii) полученную реакционную смесь нагревают до температуры от 45 до 98°C с целью получения суспензии стабилизированных магнитных наночастиц, причем упомянутые исходные магнитные наночастицы представляют собой кристаллиты магнетита, маггемита, смешанные шпинели на основе железа, никеля или кобальта. Технический результат заключается в создании стабилизированных магнитных наноагентов, предпочтительно специфичных к молекулярным мишеням, способом, отличающимся малым количеством шагов синтеза, улучшенной воспроизводимостью, биобезопасностью (биосовместимостью) и предпочтительно характеризующимся отсутствием дополнительных оболочек или спейсеров. 28 з.п. ф-лы, 9 ил., 12 пр.

1. Способ синтеза стабилизированных магнитных наноагентов, включающий следующие стадии:

i) коллоидный раствор исходных магнитных наночастиц смешивают с раствором гамма-иммуноглобулинов с целью получения реакционной смеси, при этом гамма-иммуноглобулины имеют конечную концентрацию не менее 1 мг/мл;

ii) полученную реакционную смесь нагревают до температуры от 45 до 98°С с целью получения суспензии стабилизированных магнитных наночастиц,

отличающийся тем, что упомянутые исходные магнитные наночастицы представляют собой кристаллиты магнетита, маггемита, смешанные шпинели на основе железа, никеля или кобальта.

2. Способ по п. 1, в котором упомянутые исходные магнитные наночастицы представляют собой суперпарамагнитные частицы.

3. Способ по п. 1, в котором упомянутые исходные магнитные наночастицы имеют размер от 5 до 25 нм.

4. Способ по п. 1, в котором упомянутые исходные магнитные наночастицы имеют размер от 25 до 100 нм.

5. Способ по п. 1, в котором упомянутые исходных магнитные наночастицы имеют размер от 50 до 200 нм.

6. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят от 40 до 45°С.

7. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят от 45 до 55°С.

8. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят от 55 до 75°С.

9. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят от 75 до 95°С.

10. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят в течение от 30 с до 2 мин.

11. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят в течение от 2 с до 4 мин.

12. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят в течение от 4 с до 6 мин.

13. Способ по п. 1, в котором после упомянутого нагрева упомянутую суспензию остужают до комнатной температуры с помощью метода активного охлаждения.

14. Способ по п. 1, в котором после упомянутого нагрева реакционной смеси дополнительно проводят ее инкубацию с раствором кросс-линкера.

15. Способ по п. 1, в котором упомянутый кросс-линкер является формальдегидом, глутаральдегидом или диглицидиловым эфиром полиэтиленгликоля.

16. Способ по п. 1, в котором после упомянутого кратковременного нагрева смеси дополнительно проводят ее инкубацию с концентрированным раствором формальдегида при конечной концентрации формальдегида не более 0,1% в течение ночи при комнатной температуре.

17. Способ по п. 1, в котором для облегчения обнаружения наноагентов in vitro и in vivo на шаге смешения в смесь добавляют раствор флуорофора.

18. Способ по п. 1, в котором для облегчения обнаружения частиц in vitro и in vivo на шаге смешения в смесь добавляют водный раствор эфира флуорофора.

19. Способ по п. 1, в котором упомянутые гамма-иммуноглобулины являются смесью нескольких гамма-иммуноглобулинов.

20. Способ по п. 1, в котором добавляют электролит для увеличения ионной силы раствора.

21. Способ по п. 1, в котором упомянутый электролит является хлоридом натрия.

22. Способ по п. 1, в котором концентрация упомянутого электролита в смеси не более 500 ммоль/л.

23. Способ по п. 1, в котором концентрация упомянутого электролита в смеси не менее 50 ммоль/л.

24. Способ по п. 1, в котором рН реакционной смеси от 3 до 7.

25. Способ по п. 1, в котором упомянутый белок имеет изоэлектрическую точку в диапазоне значений pI от 3 до 7.

26. Способ по п. 1, в котором упомянутый белок имеет изоэлектрическую точку в диапазоне значений pI от 7 до 11.

27. Способ по п. 1, в котором после шага нагревания, обрабатывают реакционную смесь ультразвуком.

28. Способ по п. 1, в котором упомянутый гамма-иммуноглобулин является антителом против молекулярной или клеточной мишени.

29. Способ по п. 1, в котором упомянутый гамма-иммуноглобулин является противоопухолевым антителом.