ЛИПИДНО-ПОЛИМЕРНАЯ СИСТЕМА ОДНОВРЕМЕННОЙ ДОСТАВКИ ДВУХ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Российский патент 2025 года по МПК A61K9/127 A61K31/496 A61K31/5383 A61K47/36 A61K47/40 A61K47/50 A61P31/04 B82B3/00 B82Y5/00 B82Y30/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и нанобиотехнологиям, в частности к средствам для доставки активных агентов с пролонгированным действием. Система доставки представляет собой комплекс на основе конъюгата хитозана с производными β-циклодекстрина, в который включена молекула фторхинолонового соединения, с липосомальной формой гидрофобного антимикробного соединения. Система доставки может быть использована в фармацевтике для производства формуляции лекарственного средства пролонгированного действия при ингаляционном введении.

Уровень техники

Липосомы в качестве носителей активного агента способны значительно улучшать биофармацевтические свойства лекарственной формуляции за счет сохранности структуры при разбавлении раствора, вариабельной проницаемости бислоя для различных молекул, способности к образованию комплексов включения с препаратами, обладающими различной растворимостью в воде. Особенностью структуры поверхности липосом является возможность нацеливания данной системы на клетки при использовании лигандов разного типа (белков, пептидов, гликолипидов, лектинов и др.).

Несмотря на большое количество преимуществ при использовании липосомальных наноконтейнеров, их стабильность в кровотоке остается параметром, требующим улучшений. При попадании в кровь поверхность липосом покрывают опсонины, белки сыворотки крови, в результате чего мононуклеарная фагоцитарная система (МФС) может извлекать липосомальные частицы из кровотока. Скорость извлечения частиц напрямую зависит от их размера - мелкие частицы обладают большим временем циркуляции по сравнению с крупными частицами [Immordino M.L., Dosio F., Cattel L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. // International journal of nanomedicine. - 2006. - V. 1, № 3. - P. 297-315].

Однако это очевидное ограничение липосом было использовано для эффективной доставки противомикробных препаратов, используемых для лечения инфекций, локализованных в МФС, например, для терапии туберкулеза [Deol P., Khuller G.K., Joshi K. Therapeutic efficacies of isoniazid and rifampin encapsulated in lung-specific stealth liposomes against Mycobacterium tuberculosis infection induced in mice // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 1997. - V. 41, № 6. - P. 1211-1214]. Тем не менее, когда биологическая мишень находится за пределами МФС, использование липосом, которые

способны выходить из этой системы, оправдано для достижения более длительного времени циркуляции. Поиск липосом с более длительным временем циркуляции начался с разработки определенных липидных композиций, обладающих стерической стабильностью. Такого эффекта можно достичь при использовании полиэтиленгликоля, функционализация которым поверхности липосом которым служит барьером против атак МФС [Immordino M.L., Dosio F., Cattel L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. // International journal of nanomedicine. - 2006. - V. 1, № 3. - P. 297-315].

Использование ингаляционных систем доставки позволяет практически исключить влияние МФС на распределение липосом в кровотоке. В таком случае размер липосом должен строго контролироваться. После вдыхания и распределения липосомы могут перемещаться во внелегочные участки и достигать других органов. Чтобы достичь этого, им необходимо проникнуть через эпителий дыхательных путей в интерстициальную ткань, получить доступ к кровотоку и, как следствие, распределиться через кровеносную или лимфатическую систему [Medina C., Santos-Martinez M.J., Radomski A., Corrigan O.I., Radomski M.W. Nanoparticles: pharmacological and toxicological significance // British Journal of Pharmacology. - 2007. - V. 150, № 5. - P. 552-558].

Сродство липосом к липидам легочного сурфактанта приводит к их слиянию на поверхности, в результате чего высвобождение инкапсулированной молекулы может происходить слишком быстро для осуществления эффективной терапии со сниженными побочными эффектами от использования агрессивных препаратов.

Для решения данной проблемы поверхность липосом функционализируют различными агентами, противодействующими агрегации. К примеру, для снижения фагоцитоза используют модификацию поверхности полиэтиленгликолем (ПЭГ), который дополнительно позволяет проникать в слизистую оболочку при хронических обструктивных заболеваниях легких [Yuan H., Chen C.-Y., Chai G., Du Y.-Z., Hu F.-Q. Improved Transport and Absorption through Gastrointestinal Tract by PEGylated Solid Lipid Nanoparticles // Mol Pharm. - 2013. - V. 10, № 5. - P. 1865-1873]. Хитозан (Хит), напротив, можно использовать для модификации поверхности наночастиц для улучшения мукоадгезии. Таким образом, липосомы, функционализированные хитозаном, могут находиться в целевом участке в течение более длительного периода времени, улучшая усвоение лекарственного средства, биодоступность и терапевтическую эффективность. Это свойство особенно эффективно при лечения необструктивных заболеваний легких, включая аллергию и рак легких [van Rijt S.H., Bein T., Meiners S. Medical nanoparticles for next generation drug delivery to the lungs // European Respiratory Journal. - 2014. - V. 44, № 3. - P. 765-774].

Циклодекстрины (ЦД) представляют собой природные и синтетические макроциклы, состоящие из шести, семи и восьми D-глюкопиранозных остатков, соединенных между собой 1,4-α-гликозидной связью.

Одной из важных характеристик циклодекстринов является образование комплексов включения «гость-хозяин» как в растворе, так и в твердом состоянии, в котором каждая гостевая молекула окружена гидрофобной средой полости циклодекстрина, что позволяет использовать циклодекстрины в качестве перспективных носителей гидрофобных и амфифильных препаратов. Образование комплекса приводит к изменению физико-химических свойств молекул «гостя» и может иметь значительный фармацевтический потенциал, позволяя повысить растворимость некоторых препаратов за счет гидрофильной наружной оболочки и усилить проникновение лекарств через биологические мембраны [Loftsson T., Moya-Ortega M.D., Alvarez-Lorenzo C., Concheiro A. Pharmacokinetics of cyclodextrins and drugs after oral and parenteral administration of drug/cyclodextrin complexes // Journal of Pharmacy and Pharmacology. - 2016. - V. 68, № 5. - P. 544-555]. Поскольку ЦД биосовместимы и нетоксичны, данные олигосахариды широко применяются для получения лекарственных формуляций с пониженной вероятностью возникновения побочных эффектов, а также улучшенными биодоступностью и проницаемостью препарата сквозь биологические барьеры.

β-ЦД наиболее широко применяется в качестве «хозяина» при связывании лекарств - малых органических молекул вследствие простой технологии получении и оптимального набора физико-химических свойств, в первую очередь, размера внутренней полости. Однако невысокая растворимость и потенциальная нефторотоксичность ограничивают применение в фармацевтической промышленности. Напротив, производные β-ЦД с различными заместителями характеризуются высокими показателями растворимости и эффективности комплексообразования вследствие дополнительной стабилизации вне гидрофобной полости β-ЦД.

В качестве носителей антибактериальных препаратов широко распространены полимерные наночастицы, для которых характерны структурная стабильность, обеспечивающая защиту включенной молекулы от деградации и выведения из организма, возможность регулировки размера и заряда поверхности и кинетики высвобождения лекарства из матрицы [Misra R., Acharya S., Dilnawaz F., Sahoo S.K. Sustained antibacterial activity of doxycycline-loaded polylactide-co-glycolide) and poly(ε-caprolactone) nanoparticles // Nanomedicine. - 2009. - V. 4, № 5. - P. 519-530].

В том случае, когда лекарство инкапсулировано или ковалентно присоединено в виде пролекарства, увеличение эффективности действия препарата происходит без изменения молекулярной структуры и реакции клеток-мишеней с лекарством [Xiao H., Song H., Yang Q., Cai H., Qi R., Yan L., Liu S., Zheng Y., Huang Y., Liu T., Jing X. A prodrug strategy to deliver cisplatin(IV) and paclitaxel in nanomicelles to improve efficacy and tolerance // Biomaterials. - 2012. - V. 33, № 27. - P. 6507-6519]. Во время фазы распределения в кровотоке наноразмерные контейнеры защищают лекарство от компонентов плазмы и сохраняют его стабильность. Поскольку многие молекулы лекарственных средств гидрофобны, их связывание с гидрофильными носителями повышает их растворимость и сводит к минимуму потребность в дополнительных солюбилизирующих вспомогательных веществах, которые могут вызывать нежелательные побочные эффекты [Duncan R. Development of HPMA copolymer-anticancer conjugates: Clinical experience and lessons learnt // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2009. - V. 61, № 13. - P. 1131-1148; Kopeček J., Kopečková P. HPMA copolymers: Origins, early developments, present, and future☆ // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2010. - V. 62, № 2. - P. 122-149]. Из-за увеличенного размера носителя по сравнению с молекулой лекарственного средства период полувыведения из плазмы, накопление в ткани-мишени и клиренса лекарственного средства могут быть увеличены.

Хитозан является одним из наиболее распространенных полимеров, используемых при ингаляционной доставке за счет высокой мукоадгезии, что увеличивает эффективность всасывания лекарственного средства. Ранее было показано, что положительный заряд хитозана «открывает» межклеточные плотные соединения эпителия легких, тем самым увеличивая поглощение [Chopra S., Mahdi S., Kaur J., Iqbal Z., Talegaonkar S., Ahmad F.J. Advances and potential applications of chitosan derivatives as mucoadhesive biomaterials in modern drug delivery // Journal of Pharmacy and Pharmacology. - 2010. - V. 58, № 8. - P. 1021-1032]. Интересно, что хитозан обладает антибактериальной активностью за счет связывания с фосфорильными группами и липополисахаридами на мембранах бактериальных клеток, что является дополнительным преимуществом в борьбе с легочными бактериальными инфекциями [Mohammed M., Syeda J., Wasan K., Wasan E. An Overview of Chitosan Nanoparticles and Its Application in Non-Parenteral Drug Delivery // Pharmaceutics. - 2017. - V. 9, № 4. - P. 53].

Из уровня техники известны липосомальные формы рифампицина с высокой степенью загрузки лекарственного препарата в систему (RU2223764 C1). Получаемые липосомы имеют размер 100-500 нм, однако процесс синтеза данной системы методически сложен - необходимо использование и высушивание органического растворителя, гомогенизирование системы и фильтрация с использованием ядерного фильтра. Такая система доставки содержит только рифампицин, в то время как для лечения резистентных форм туберкулеза предпочтительнее использовать комбинацию антибактериальных препаратов. К недостаткам описанной системы также относится использование нестабилизированных композиций, что требует лиофилизации как дополнительной стадии технологического процесса, а также недостаточную пролонгированность высвобождения содержимого.

Комбинированные системы рифампицина с антибактериальными препаратами также известны из уровня техники. Известна система, сочетающая рифампицин, этамбутол, изониазид, пиразиномид и пиридоксин при определенном соотношении компонентов и в качестве носителя метацель - это фирменное наименование метиловых эфиров целлюлозы, содержащих 14-30% метоксильных групп (RU2195937 C1). Однако известная система не предполагает ингаляционный способ доставки и подходит исключительно для внутривенного введения. Данная система позволяет осуществлять высвобождение препаратов в течение 4 ч. - этого времени недостаточно для поддержания постоянной терапевтической концентрации лекарственных молекул.

Известно сочетание рифампицина с левофлоксацином (а также изониазидом, пиразинамидом и пиридоксин гидрохлоридом) для противотуберкулезной терапии (RU2247559 C1). Предлагаемое лекарственное средство выполняют в виде различных твердых лекарственных форм - таблеток, капсул, гранул, порошков. Данная система характеризуется высокой антибактериальной активностью in vitro (в т.ч. и на лекарственно-устойчивые штаммы микобактерий туберкулеза), но данная лекарственная форма вводится перорально и не предполагает наличие какой-либо системы доставки препаратов в легкие, поэтому не позволяет достигать пролонгированного высвобождения препарата.

Для ингаляционного введения подходит система, состоящая из этамбутола, изониазида, рифампицина и пиразинамида, содержащая стабилизированные наночастицы серебра (RU2412715 C2). Данная система обладает высокой антибактериальной активностью, однако получение стабилизированных наночастиц серебра является сложной методической задачей.

Таким образом, техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам и прототипу за счет создания комбинированной системы одновременной доставки лекарственного препарата из группы фторхинолонов, и гидрофобных препаратов, которая обладает пролонгированным действием.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является обеспечение контролируемого пролонгированного действия лекарственных соединений (молекул) при повышении биодоступности, время высвобождения - не менее 400 минут. Контролируемое пролонгированное действие лекарственных соединений реализуется за счет включения гидрофобной молекулы лекарственного соединения в липосомальную везикулу, а гидрофильного соединения (молекулы активного вещества) в поры циклодекстрина, ковалентно пришитые к цепи хитозана. Повышение биодоступности реализуется за счет получение частиц в суспензии с гидродинамическим радиусом 100-300 нм, а также использования биосовместимого контейнера.

Кроме того, преимуществом заявленного изобретения является возможность использования системы доставки для ингаляционного введения за счет стабильности и оптимального размера частиц, а также мукоадегезивных свойств хитозана.

Получение комбинированной системы включает в себя шесть стадий, минимальное время протекания самих реакций составляет 20 часов. Существенным преимуществом данного изобретения, которым не обладают известные ранее системы, является возможность достижения контролируемого пролонгированного высвобождения лекарственного препарата из группы фторхинолонов и гидрофобных препаратов в терапевтических концентрациях.

Технический результат достигается комбинированной липидно-полимерной системой доставки лекарственных средств, представляющей собой комплекс липосомальной формы гидрофобного антибактериального соединения с величиной logP не менее 4,0 и конъюгата на основе хитозана 5 - 120 кДа, модифицированного по аминогруппам циклодекстрином с присоединенным гидрофильным антибактериальным соединением с величиной logP не более - 0,4. В качестве циклодекстрина используют 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин, моно-(6-(гексаметилендиамин)-6-дезокси)-β-циклодекстрин; в качестве гидрофильного соединения с величиной logP не более -0,4 используют соединения фторхинолонового ряда, выбранного из группы: левофлоксацин, офлоксацин, моксифлоксацин, ципрофлоксацин. В качестве гидрофобного низкомолекулярного антибактериального соединения используют рифампицин, рапамицин, бета-кариофеллен. При этом мольное соотношение гидрофобного соединения в липосомах к соединению в циклодекстрине соответствует терапевтическому и составляет от 4:1 до 10:1.

Также технический результат достигается способом синтеза системы доставки, заключающимся в том, что синтез проводят с помощью реакции тозилирования производного β-циклодекстрина и замещения по амино-группе хитозана в присутствии диметилформамида при температуре 95±5°С. Из тозилированного производного β-циклодекстрина и хитозана 5-120 кДа в присутствии диметилформамида при температуре 95±5°С образуют конъюгат, одновременно проводят получение липосомальных форм гидрофобного соединения способом гидратации липидной пленки раствором лекарственной молекулы (лекарственного соединения, вещества) в 0,01-0,02 М натрий-фосфатном буферном растворе, затем проводят включение соединения в полимерный конъюгат в кислой среде при pH=3,5-4,5. Основомольное соотношение свободных аминогруппы хитозана : производное β-циклодекстрина составляет от 1:1 до 1:20, а основомольное соотношение липосом к полимеру составляет от 1:1 до 1:8.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлено схематичное строение комбинированной системы.

На фиг. 2 представлены микрофотографии СЭМ комбинированной системы для NH₂-ЦД (А, Б) и NH₂-ЦД-Хит (В, Г). Ускоряющее напряжение 5 кВ.

На фиг. 3 представлены кривые одновременного высвобождения лекарственных молекул из комбинированной системы - Левофлоксацин более темная линия и Рифампицин (светлая линия) из комбинированной системы, состоящей из липосом ДПФХ:КЛ 80:20, нагруженных Риф, с носителем NH2-ЦД-Хит, нагруженным Лев. Натрий-фосфатный буферный раствор 0,01 М, рН = 7,4, Т = 37°С.

Осуществление изобретения

Для разработки комбинированной системы доставки предложено использовать комплексы лекарственной молекулы с конъюгатами на основе хитозана с молекулярной массой от 5 до 120 кДа и 2-гидроксипропил-β-циклодекстрином, моно-(6-(гексаметилендиамин)-6-дезокси)-β-циклодекстрином, комплексами данных молекул с фторхинолонами, например левофлоксацином, офлоксацином, моксифлоксацином, ципрофлоксацином с нейтральными (дипальмитоилфосфатидилхолин ДПФХ100%) и анионными (дипальмитоилфосфатидилхолин : кардиолипин (КЛ) 80:20) липосомальными формами рифампицина, а также иных гидрофобных веществ с биологической активностью, например рапамицина, бета-кариофеллена. Синтез систем доставки проводят с помощью реакции тозилирования производного β-циклодекстрина и замещения по амино-группе хитозана в присутствии диметилформамида при температуре 95±5°С.

Преимущества предложенной методики синтеза по сравнению с известными для похожих систем - высокий процент включения лекарственного препарата в пространственную сетку полимерной системы доставки (20% для левофлоксацина и 30% для рифампицина), простота очистки и выделения синтезированной системы.

На первой стадии синтеза из тозилированного производного β-циклодекстрина и хитозана 5-120 кДа в присутствии диметилформамида при температуре 95±5°С образуется конъюгат, используемый в качестве носителя менее гидрофобного препарата, например, левофлоксацина. Получение комплекса включения препарата в полимерный конъюгат происходит в кислой среде при pH=3,5-4,5 (HCl). Отдельно происходит получение липосомальных форм гидрофобного препарата из группы фторхинолонов, например рифампицина, методом гидратации липидной пленки раствором лекарственной молекуле в натрий-фосфатном буферном растворе (0,01-0,02 М).

Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°C.

Комбинированную систему получали путем соединения комплекса включения левофлоксацина в конъюгат хитозана и производных β-циклодекстрина с липосомальной формой рифампицина (фиг. 1). Мольное соотношение левофлоксацина к рифампицину составляет от 4:1 до 10:1 и соответствует терапевтическому.

Таким образом, способ синтеза комбинированной системы методически прост, включает в себя три стадии: получение и очистка конъюгата хитозана с производным β-циклодекстрина, получение комплексов синтезированного полимерного носителя с левофлоксацином, получение липосомальной формы рифампицина и объединение данных систем. Возможно получение систем с заданным размером (100-600 нм). Антибактериальное действие комбинированной системы в агаре на двух штаммах: грамотрицательных бактериях Escherichia coli ATCC 25922 и грамположительных бактериях Bacillus subtilis ATCC 6633 указывает на наличие тенденции к пролонгированному действию по сравнению с действием свободного лекарственного препарата.

Важным аспектом представленной технологии с точки зрения ее дальнейшего применения для различных систем введения лекарства является оценка скорости высвобождения лекарственных препаратов из комбинированной системы в зависимости от выбора липосомальной формы рифампицина и производного β-циклодекстрина, что позволит использовать разработанную систему доставки для достижения пролонгированного высвобождения.

Структура системы подтверждается методами ИК-спектроскопии Фурье, сканирующей электронной микроскопии, исследованиями размера частиц и ζ-потенциала.

Ниже представлено более подробное описание заявляемого изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и модификациям, понятным специалисту на основе прочтения данного описания. Такие изменения не ограничивают объем притязаний. Например, могут изменяться способы получения комплексов включения производного циклодекстрина и лекарственной молекулы (сухое или термомеханическое смешение и последующее растворение комплекса в буфере, использование сверхкритических технологий и т.д.), очистки продукта от органического растворителя и непрореагировавших веществ, а также методы концентрации и сушки полученного вещества.

Пример 1.

Синтез конъюгатов хитозана и производных β-циклодекстрина осуществляли согласно методике без существенных изменений [Yuan Z., Ye Y., Gao F., Yuan H., Lan M., Lou K., Wang W. Chitosan-graft-β-cyclodextrin nanoparticles as a carrier for controlled drug release // Int. J. Pharm. - 2013. - V. 446, № 1-2. - P. 191-198]. Для этого к раствору хитозана в уксусной кислоте (рН = 4,0) по каплям приливали растворы полученных на первой стадии тозилированных производных β-циклодекстрина в ДМФА. Реакционную смесь держали в термостате при 95°С в течение 16 часов, после чего проводили диализ продуктов в диализных мешках «Orange Scientific» с молекулярной массой отсечения 12-14 кДа против дистиллированной воды в течение суток.

Комплексы левофлоксацина с амино-производным β-циклодекстрина получали добавлением к раствору левофлоксацина в HCl (pH=4,0) концентрацией 3 мг/мл требуемого количества раствора производного β-циклодекстрина с тем же pH, доводили объем до 0,5 мл. Концентрация левофлоксацина поддерживалась постоянной во всех образцах и была равна 1 мг/мл, мольный избыток производного β-ЦД варьировался в интервале от 0,1 до 10. Комплексы инкубировали при 37°С в течение 60 минут.

Липосомы получали методом гидратации липидной пленки с последующей обработкой ультразвуком. Растворы ДПФХ и КЛ в хлороформе (25 мг/мл) в необходимом массовом соотношении (ДПФХ 100% и ДПФХ:КЛ 80:20) помещали в круглодонную колбу, затем удаляли растворитель на роторном испарителе при температуре ниже 55°С. Полученную тонкую пленку диспергировали в 0,01 М натрий-фосфатном буферном

растворе (рН = 7,4) до концентрации липидов 5 мг/мл, далее колбу подвергали воздействию ультразвуковой ванны (37 Гц) в течение 5 минут. Непрозрачную суспензию переносили в пластиковую пробирку и обрабатывали ультразвуком (22 кГц) в течение 10 минут в непрерывном режиме при постоянном охлаждении на диспергаторе 4710 «Cole-Parmer Instrument».

Липосомальные формы рифампицина получали аналогичным образом с некоторыми изменениями: тонкую липидную пленку диспергировали в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе (рН = 7,4), содержащем рифампицин в концентрации 2 мг/мл. Несвязавшийся препарат отделяли с помощью диализа против 0,01 М натрий-фосфатного буферного раствора (рН = 7,4) в диализных мешках «Serva» с молекулярной массой отсечения 3500 Да в течение 120 минут при температуре 4°С.

Комбинированную систему получали путем смешивания комплексов включения левофлоксацина с липосомальной формой рифампицина.

Пример 2.

Синтез комбинированной системы проводили аналогично примеру 1. При этом использовали для получения тозилированного производного β-циклодекстрина дистиллированную воду в качестве растворителя.

Пример 3.

Синтез комбинированной системы проводили аналогично примеру 1. При этом использовали для получения тозилированного производного β-циклодекстрина равную смесь дистиллированной воды и ДМФА в качестве растворителя.

Анализ структуры и свойств комбинированной системы.

Характеризацию конъюгата хитозана с 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрином (ГП-ЦД-Хит) проводили с помощью титрования свободных амино-групп 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой (ТНБС). Для этого к растворам ГП-ЦД-Хит и Хит в боратном буфере (pH = 9,0) добавляли ТНБС, регистрировали оптическую плотность при длине волны 420 нм в течение 60 минут на спектрометре УФ- и видимого диапазона Cary eclipse UV-Vis spectrometer в кварцевой кювете Hellma Analytics при температуре 22°С. Начальная концентрация ТНБС при титровании хитозана была 1⋅10^-3 М, при титровании ГП-ЦД-Хит 2⋅10^-3 М, концентрации ГП-ЦД-Хит и Хит 2 мг/л.

УФ-спектры комплексов включения регистрировали на спектрометре УФ- и видимого диапазона AmerSharm Biosciences UltraSpec 2100 pro трижды в интервале от 200 до 400 нм в кварцевой кювете Hellma Analytics при температуре 22 °С. Исходные образцы разбавлялись HCl (pH = 4,0) до концентрации Лев 3⋅10^-5 М.

ИК-спектры комплексов регистрировали на ИК-спектрометре Фурье Tensor 27 «Bruker» (Германия), оснащенного MCT-детектором, охлаждаемым жидким азотом, с термостатом фирмы «Huber» (США). Измерения проводили в термостатируемой ячейке нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО, BioATR-II, «Bruker», Германия) с использованием кристалла однократного отражения ZnSe, при 22°С и постоянной скорости продувки системы сухим воздухом аппаратом «Jun-Air» (Германия). На кристалл ячейки НПВО наносили аликвоту (50 мкл) образца, спектр регистрировали трижды в интервале от 4000 до 950 см^-1, с разрешением 1 см^-1; производили 70-кратное сканирование и усреднение. Фон регистрировали аналогично. Спектры анализировали с помощью программы Opus 7.0.

Спектры флуоресценции комплексов регистрировали на флуоресцентном спектрометре Varian Cary трижды в интервале от 350 до 650 нм при длине волны возбуждения λ_ex = 288 нм в кварцевой кювете Hellma Analytics. Исходные образцы разбавлялись HCl (pH = 4,0) до концентрации левофлоксацина 3⋅10^-5 М.

ζ-потенциалы и размеры частиц измерялись с использованием системы Malvern Zetasizer Nano ZS (Великобритания), оснащенной гелий-неоновым лазером (5 мВт, 633 нм) в качестве источника света. Эксперимент проводился в термостатированной ячейке при 22°C.

Морфологию конъюгатов хитозана с производными β-циклодекстрина исследовали методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на микроскопе JIB-4501 JEOL (Германия) с многолучевой системой при ускоряющем напряжении 5 кВ. Образцы порошка, помещенные на пластины СЭМ, были покрыты слоем золота толщиной 15 нм с помощью установки для напыления Q150R Plus от Quorum Technologies (Великобритания) (фиг.2).

Исследование антибактериальной активности лекарственных форм in vitro проводили методом диффузии в агаре [Balouiri M., Sadiki M., Ibnsouda S.K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review // Journal of Pharmaceutical Analysis. - 2016. - V. 6, № 2. - P. 71-79] с использованием питательной среды Luria-Bertani (рН 7,4). Ночную культуру Escherichia coli ATCC 25922 или Bacillus subtilis ATCC 6633 (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт», Москва, Россия) разбавили до 0,5 стандарта мутности по Мак-Фарланду. Далее 500 мкл бактериальной суспензии распределяли по поверхности твердой питательной среды стеклянным шпателем. Через 20 минут из агара были удалены диски диаметром ~ 9 мм с помощью стерильного пластикового наконечника на 1 мл и в образовавшиеся лунки были помещены исследуемые образцы (по 50 мкл). Чашки Петри инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Далее измеряли диаметры возникших зон ингибирования бактериального роста. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли как концентрацию образца, при которой диаметр зоны ингибирования соответствует 9 мм. Эксперименты проводили независимо трижды, полученные значения усреднены и представлены со стандартным отклонением.

Высвобождение лекарственных препаратов

Эксперименты по кинетике высвобождения левофлоксацина из производных β-циклодекстрина проводили в растворе HCl (pH = 4,0) при температуре 37°С и скорости вращения 120 об/мин. Для этого комплексы Лев-ЦД объемом 1 мл помещали в диализный мешок «Orange Scientific» с молекулярной массой отсечения 12-14 кДа против 10 мл внешнего раствора HCl (pH = 4,0). Концентрация Лев составляла 3⋅10^-5 М, концентрация торов ЦД - 1,5⋅10^-5 М. Отбор проб объемом 100 мкл проводили в течение суток, поддерживая постоянный объем внешнего раствора. Образцы анализировали методом УФ-спектроскопии для определения доли высвобожденного препарата.

Эксперименты по кинетике высвобождения рифампицина из липосом проводили в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе (рН = 7,4) при температуре 37°С и скорости вращения 120 об/мин. Для этого липосомальные формы рифампицина объемом 1 мл помещали в диализный мешок «Orange Scientific» с молекулярной массой отсечения 12-14 кДа против 10 мл внешнего 0,01 М натрий-фосфатного буферного раствора (рН = 7,4). Отбор проб объемом 100 мкл проводили в течение суток, поддерживая постоянный объем внешнего раствора. Образцы анализировали методом УФ-спектроскопии для определения доли высвобожденного препарата.

Эксперименты по кинетике одновременного высвобождения рифампицина и левофлоксацина из комбинированной системы проводили в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе (рН = 7,4) при температуре 37°С и скорости вращения 120 об/мин. Для этого получали комплексы липосом (5 мг/мл), нагруженных рифампицином (2 мг/мл), с комплексом NH₂-ЦД-Хит-Лев в осново-мольном соотношении 1:7. Полученные комплексы объемом 1 мл помещали в 10 мл внешнего 0,01 М натрий-фосфатного буферного раствора (рН = 7,4). Отбор проб объемом 100 мкл проводили в течение суток, поддерживая постоянный объем внешнего раствора. Образцы анализировали методом УФ-спектроскопии для определения доли высвобожденного препарата.

Изучение высвобождения лекарственных препаратов проводили путем описания кинетических кривых моделями нулевого и первого порядков, Хигучи, Корсмейера-Пеппаса и Хиксона-Кроуэлла согласно уравнениям (1-5):

Модель нулевого порядка: , (1)

Модель первого порядка: , (2) Модель Хигучи: , (3) Модель Корсмейера-Пеппаса: , (4) Модель Хиксона-Кроуэлла: , (5)

где - время, мин; - количество препарата, высвобожденного за время , %; - исходное количество препарата, %; - максимальное количество препарата, %; - константа высвобождения нулевого порядка, мин^-1; - константа высвобождения первого порядка, мин^-1; - константа высвобождения Хигучи, мин^-0.5; - константа высвобождения Корсмейера-Пеппаса; - показатель высвобождения; - константа высвобождения Хиксона-Кроуэлла, мин^-1.

Наиболее подходящую модель для каждой системы определяли по наибольшему значению коэффициента детерминации (R²).

Высвобождение препаратов из комбинированной системы на основе липосомальной формы рифампицина (Риф) и левофлоксацина (Лев), загруженного в NH₂-ЦД-Хит, отличается от высвобождения из отдельных конструкций липосомальной формы рифампицина (ЛРиф) и комплекса левофлоксацина с бета-циклодекстрином (Лев-β-ЦД-содержащий лиганд) (фиг. 3).

Наибольший интерес представляет система, состоящая из липосомальной формы Риф, функционализированной NH₂-ЦД-Хит, причем торы β-ЦД нагружены Лев. В экспериментах по высвобождению лекарств из такой системы при 37°С в натрий-фосфатном буферном растворе было установлено, что высвобождение левофлоксацина замедляется относительно контрольной системы - комплекса Лев с NH₂-ЦД-Хит.

Так, спустя 10 часов после начала эксперимента доля выхода Лев превышает 90%, в то время как в комбинированной системе она составляет 77%, достигая максимального значения, а тангенс угла наклона становится меньше на 20% (табл. 1).

Таблица 1. Параметры, характеризующие высвобождение Лев из NH₂-ЦД-Хит и комбинированной системы, содержащей ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 + Лев-NH₂-ЦД-Хит.

Параметр Система Лев-NH₂-ЦД-Хит ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 + Лев-NH₂-ЦД-Хит Доля выхода препарата за 10 ч., % 90 77 Тангенс угла наклона начального участка кривой высвобождения 0,40 0,32

Процесс высвобождения рифампицина из комбинированной системы неординарен: загрузка в полимерный конъюгат Лев приводит к замедлению высвобождения Риф относительно аналогичной системы без Лев: в течение 5 часов происходит высвобождение 40% и 28% препарата во внешний раствор соответственно (табл. 2). Тангенс угла наклона начального участка кривой отличается на 32%, что дает основание предполагать увеличение плотности полимерной оболочки.

Таблица 2. Параметры, характеризующие высвобождение Риф из липосом ДПФХ:КЛ 80:20 в присутствии NH₂-ЦД-Хит и комплекса Лев-NH₂-ЦД-Хит.

Параметр Система ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 + NH₂-ЦД-Хит ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 + Лев-NH₂-ЦД-Хит Доля выхода препарата за 5 ч, % 40 28 Тангенс угла наклона начального участка кривой высвобождения 0,11 0,07

Коэффициент детерминации является важной мерой того, в какой степени модель высвобождения описывает экспериментальные данные, поэтому для оценки соответствия уравнения используемой модели было проведено сравнение значений коэффициента детерминации (R²). Значения R², полученные при обработке экспериментальных данных, представлены в табл. 3.

Таблица 3. Значения коэффициента детерминации R², полученные при обработке с помощью различных моделей кривых высвобождения препаратов липосомальных форм Риф без полимерной оболочки и покрытых полимером, Лев в немодифицированном производном β-циклодекстрина и в конъюгате NH₂-ЦД-Хит.

Система Модель Нулевой порядок Первый порядок Корсмейер-Пеппас Хиксон-Кроуэлл Хигучи Липосомальные формы Риф без полимера ЛРиф ДПФХ 0.8649 0.8653 0.8952 0.8572 0.9366 ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 0.8924 0.8928 0.9620 0.8824 0.9606 Среднее значение R² 0.8787 0.8791 0.9286 0.8698 0.9470 Липосомальные формы Риф, покрытые полимером ЛРиф ДПФХ + ГП-ЦД-Хит 0.9801 0.9802 0.9954 0.9420 0.9671 ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 + ГП-ЦД-Хит 0.9407 0.9407 0.9712 0.8860 0.9713

ЛРиф ДПФХ + NH₂-ЦД-Хит 0.9569 0.9570 0.9570 0.9307 0.9341 ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 + NH₂-ЦД-Хит 0.9719 0.9719 0.9829 0.9231 0.9422 ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 + Лев-NH₂-ЦД-Хит 0.9829 0.9829 0.9912 0.8885 0.9566 Среднее значение R² 0.9665 0.9665 0.9795 0.9141 0.9543 Левофлоксацин без полимера Лев-NH₂-ЦД 0.7009 0.7019 - 0.6933 0.9192 Левофлоксацин в полимерном носителе Лев-NH₂-ЦД-Хит 0.9355 0.9359 0.9850 0.9185 0.9959 ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 + Лев-NH₂-ЦД-Хит 0.9344 0.9347 0.9926 0.9158 0.9952 Среднее значение R² 0.9350 0.9353 0.9888 0.9172 0.9956

Для комбинированной системы на основе липосомальных форм рифампицина и комплексов левофлоксацина с полимерными конъюгатами производных β-циклодекстрина с хитозаном установлено, что высвобождение левофлоксацина замедляется, однако описывается моделью Хигучи в обоих случаях. Высвобождение рифампицина из липосом при образовании комплексов с полимерными конъюгатами характеризуется сменой модели Хигучи на модель Корсмейера-Пеппаса с определяющим типом диффузии против закона Фика.

Исследование антибактериальной активности комбинированных систем.

Исследование антибактериальной активности систем проводилась методом диффузии в агаре [Balouiri M., Sadiki M., Ibnsouda S.K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review // Journal of Pharmaceutical Analysis. - 2016. - V. 6, № 2. - P. 71-79] на двух штаммах: грамотрицательных бактериях Escherichia coli ATCC 25922 и грамположительных бактериях Bacillus subtilis ATCC 6633.

Определены МИК для свободных препаратов Лев и Риф, а также их формуляций (табл. 4).

Таблица 4. Значения МИК (мкг/мл) исследуемых образцов.

Образец Escherichia coli ATCC 25922 Bacillus subtilis ATCC 6633

Лев 0,1 ± 0,02 0,3 ± 0,03 Лев-NH₂-ЦД-Хит 0,1 ± 0,02 0,28 ± 0,03 Риф 12 ± 1 0,2 ± 0,02 ЛипРиф 12 ± 1 0,2 ± 0,03 Лев : Риф = 4 : 1 (мольн.) - 0,25 ± 0,03 Лев-NH₂-ЦД-Хит + ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20
_{(Лев : Риф = 4 : 1 по моль)} - 0,24 ± 0,02

Исследование in vitro свойств данной системы было проведено только на B. subtilis, поскольку высокие значения МИК_Риф для E. coli не позволяют использовать концентрации Лев, приемлемые для используемой методики.

Таким образом, установлено, что Лев-NH₂-ЦД-Хит + ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 проявляет антибактериальную активность против грамположительных бактерий, МИК составляет 0,24 ± 0,02 мкг/мл. В качестве контроля использовали комбинацию свободных лекарственных молекул в заданном соотношении. Показано, что комбинированная система обладает сравнимым действием с контролем, что указывает на отсутствие негативного влияния системы доставки на in vitro свойства лекарственной композиции.

Группа изобретений относится к химии и фармацевтике, а именно к комбинированной липидно-полимерной системе доставки лекарственных средств и к способу ее получения. Предложенная система доставки представляет собой комплекс липосомальной формы гидрофобного антибактериального соединения с величиной logP не менее 4,0, выбранного из рифампицина, рапамицина или бета-кариофиллена, и полимерного конъюгата хитозана молекулярной массы 5-120 кДа с комплексом включения производного β-циклодекстрина, такого как 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин или моно-(6-(гексаметилендиамин)-6-дезокси)-β-циклодекстрин, и гидрофильного антибактериального соединения с величиной logP не более -0,4, которое является лекарственным соединением фторхинолонового ряда, при этом в указанном полимерном конъюгате хитозан замещен по аминогруппе производным β-циклодекстрина. Группа изобретений обеспечивает контролируемое пролонгированное действие лекарственных соединений при повышении биодоступности. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 3 пр.

1. Комбинированная липидно-полимерная система доставки лекарственных средств, характеризующаяся тем, что представляет собой комплекс липосомальной формы гидрофобного антибактериального соединения с величиной logP не менее 4,0 и полимерного конъюгата хитозана молекулярной массы 5-120 кДа с комплексом включения производного β-циклодекстрина и гидрофильного антибактериального соединения с величиной logP не более -0,4, где в указанном полимерном конъюгате хитозан замещен по аминогруппе производным β-циклодекстрина, при этом гидрофобное антибактериальное соединение с величиной logP не менее 4,0 представляет собой рифампицин, или рапамицин, или бета-кариофиллен, гидрофильное антибактериальное соединение с величиной logP не более -0,4 представляет собой лекарственное соединение фторхинолонового ряда, производное β-циклодекстрина представляет собой 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин или моно-(6-(гексаметилендиамин)-6-дезокси)-β-циклодекстрин.

2. Комбинированная липидно-полимерная система доставки по п.1, характеризующаяся тем, что лекарственное соединение фторхинолонового ряда выбирается из левофлоксацина, офлоксацина, моксифлоксацина, ципрофлоксацина.

3. Комбинированная липидно-полимерная система доставки по п.1, характеризующаяся тем, что мольное соотношение гидрофобного антибактериального соединения с величиной logP не менее 4,0 и гидрофильного антибактериального соединения с величиной logP составляет от 4:1 до 10:1.

4. Способ получения комбинированной липидно-полимерной системы доставки по п.1, характеризующийся тем, что осуществляют синтез полимерного конъюгата путем проведения реакции тозилирования производного β-циклодекстрина с получением тозилированного производного β-циклодекстрина и замещения хитозана с молекулярной массой 5-120 кДа по аминогруппе указанным тозилированным производным β- циклодекстрина в присутствии диметилформамида при температуре 95±5°С с последующим включением гидрофильного антибактериального соединения с величиной logP не более -0,4 в кислой среде при pH=3,5-4,5 с получением комплекса включения в указанном полимерном конъюгате, одновременно осуществляют приготовление липосомальной формы гидрофобного антибактериального соединения с величиной logP не менее 4,0 путем гидратации липидной пленки раствором указанного гидрофобного антибактериального соединения в 0,01-0,02 М натрий-фосфатном буферном растворе, затем объединяют полученный полимерный конъюгат и полученную липосомальную форму.

5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что основомольное соотношение свободных аминогрупп хитозана и производного β-циклодекстрина составляет от 1:1 до 1:20.

6. Способ по п.4, характеризующийся тем, что основомольное соотношение липосомальной формы и полимерного конъюгата составляет от 1:1 до 1:8.