СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ МАСС-СПЕКТРОСКОПИИ В МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ ОЦЕНКАХ МИШЕНЕЙ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/48 C40B30/04 G01N33/68 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет Предварительной патентной заявки серийный No. EP19306104, поданной 13 сентября 2019 г., и Предварительной патентной заявки серийный No. EP19306110, поданной 16 сентября 2019 г., полное содержание которых, таким образом, приведено в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Настоящие способы относятся к характеризации связывания различных соединений с молекулами-мишенями, с использованием технологии без использования метки, такой как масс-спектрометрия (MS). Они, кроме того, относятся к оценке аффинности лигандов для специфической рецепторной молекулы-мишени.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Ниже представлена информация об уровне техники для конкретных аспектов настоящего изобретения, поскольку они могут относиться к техническим признакам, на которые ссылаются в подробном описании, но необязательно описанным подробно. То есть, индивидуальные части или способы, используемые по настоящему изобретению, могут быть описаны более подробно в документах, обсуждаемых ниже, и эти материалы могут предоставлять дополнительное руководство для специалиста в данной области, для получения или использования конкретных аспектов настоящего изобретения, как заявлено. Содержание таких документов, таким образом, приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Обсуждение ниже не следует рассматривать как допущение применимости этой информации к любому пункту формулы изобретения в настоящем описании или к эффекту описанного материала из предшествующего уровня техники.

НАУЧНЫЕ ПАТЕНТЫ И ПУБЛИКАЦИИ

[0004] В Wanner et al., WO 2002095403 (US 7074334), «Method for determining the binding behavior of ligands which specifically bind to target molecules», описано изобретение, относящееся к способу определения поведения связывания лигандов, которые специфически связываются с молекулами-мишенями по меньшей мере в одном участке связывания, при этом маркеры присутствуют в нативной форме, и концентрации K4 и K5 или количества M2 и M1 определяют посредством масс-спектрометрии.

[0005] В Wanner et al., Патентная публикация США 2006/0201886, «Method for determining the binding behavior of ligands which specifically bind to target molecules», описан способ определения поведения связывания лигандов, которые специфически связываются с молекулами-мишенями по меньшей мере в одном участке связывания. Маркеры присутствуют в нативной форме, и определение концентраций осуществляют способами масс-спектрометрии. Описано использование µ-опиоидных рецепторов в качестве молекул-мишеней, морфина в качестве маркера и налоксона в качестве лиганда в различной концентрации.

[0006] В Dollinger et al. US 5891742, «Affinity selection of ligands by mass spectroscopy», описан способ, в котором соединения отбирают из комбинаторной библиотеки посредством приведения библиотеки в контакт с мишенью (человеческим активатором плазминогена урокиназой), отделения несвязавшихся соединений от комплексов соединение-мишень и анализа комплексов или элюированного соединения посредством масс-спектроскопии.

[0007] В Neiens et al., «Simultaneous Multiple MS Binding Assays for the Dopamine, Norepinephrine, and Serotonin Transporters», ChemMedChem 13(5) 453-463 (2018), описаны анализы связывания без использования метки, на основе масс-спектрометрии (анализы связывания посредством MS), нацеленные на транспортеры моноамина. Человеческие транспортеры дофамина, норадреналина и серотонина (hDAT, hNET и hSERT) используют в экспериментах одновременного связывания.

[0008] В Grimm et al., «Development and validation of an LC-ESI-MS/MS method for the triple reuptake inhibitor indatraline enabling its quantification in MS Binding Assays», Anal Bioanal Chem. 2015 Jan; 407(2):471-85 описан способ количественной оценки посредством LC-MS/MS для индатралина, высокоактивного неизбирательного ингибитора трех транспортеров моноамина (для дофамина, DAT; для норадреналина, NET; для серотонина, SERT), и его использование для анализов связывания посредством MS.

[0009] В de Jong et al., «Development of a multiplex non-radioactive receptor assay: the benzodiazepine receptor, the serotonin transporter and the β-adrenergic receptor», Rapid Comm. Mass Spectrom. 21:567-572 (2007), описан способ, в котором пул рецепторов из кортикальной ткани крысы, т.е. гомогенизированного кортекса, комбинировали с флунитразепамом (который связывается с участками связывания бензодиазепина [рецепторы]), MADAM (2-[2- [(диметиламино)метил]фенил]сульфанил-5-метиланилином; дигидрохлоридом, который связывается с транспортером серотонина), и пиндололом (бета-блокатором [адренергические бета-антагонисты]). Каждый лиганд инкубировали с известным для него вытесняющим средством.

[0010] В Bowes et al., «Reducing safety-related drug attrition: the uses of in vitro pharmacological profiling»; Nat. Rev. Drug Discov. 2012 Dec;11(12):909-22 описано обоснование получения фармакологических профилей in vitro, используемых в четырех основных фармацевтических компаниях. Предложенные мишени включают GPCR, ионные каналы, ферменты, транспортеры нейротрансмиттеров, ядерные рецепторы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Следующее краткое изложение как не предназначено для включения всех признаков и аспектов настоящего изобретению, так и не подразумевает, что изобретение должно включать все признаки и аспекты, обсуждаемые в этом кратком изложении.

[0012] Настоящее изобретение, в различных вариантах осуществления, относится к мультиплексированному способу количественной оценки связывания тестируемого соединения с молекулой-мишенью и связывания с нецелевыми молекулами-мишенями, включающему стадии: (a) получения смеси, содержащей молекулы-мишени из по меньшей мере одной из (i) здоровой или нездоровой человеческой или не относящейся к человеку ткани, и (ii) препарата синтетического белка; (b) инкубации указанных молекул-мишеней во множестве смесей, содержащих лиганды и тестируемые соединения, где указанные молекулы-мишени инкубируют с различными лигандами; (c) после инкубации, удаление несвязавшихся лигандов из указанного множества смесей; затем (d) выделения лигандов, связавшихся с молекулами-мишенями в указанной смеси молекул-мишеней, лигандов и тестируемых соединений; (e) определения количества лиганда, связавшегося с молекулой-мишенью, посредством измерения лигандов, полученных на стадии (d), с использованием масс-спектрометрии и калибровочной кривой; и (f) определения аффинности тестируемого соединения для молекулы-мишени в указанной смеси молекул-мишеней с использованием данных, полученных на стадии (e); и (g) измерения связывания указанного тестируемого соединения с предопределенной молекулой-мишенью и сравнения указанного связывания со связыванием указанного тестируемого соединения с нецелевыми молекулами.

[0013] В различных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к мультиплексированному способу для количественной оценки связывания тестируемого соединения с предопределенной молекулой-мишенью, а также связывания с нецелевыми молекулами-мишенями, включающему стадии: (a) получения смеси, содержащей молекулы-мишени из по меньшей мере одной из (i) здоровой или нездоровой человеческой или не относящейся к человеку ткани, и (ii) препарата синтетического белка; (b) инкубации указанных молекул-мишеней во множестве смесей, содержащих лиганды и тестируемые соединения, где указанные молекулы-мишени инкубируют с различными лигандами; (c) удаления несвязавшихся лигандов из указанного множества смесей; затем (d) выделения лигандов, связавшихся с молекулами-мишенями в указанной смеси молекул-мишеней; (e) определения количества лиганда, связавшегося с молекулами-мишенями, посредством измерения лигандов, полученных на стадии (d), с использованием масс-спектрометрии и калибровочной кривой; (f) определения аффинности тестируемого соединения для молекул-мишеней в указанной смеси молекул-мишеней с использованием данных, полученных на стадии (e); и (g) измерения связывания указанного тестируемого соединения с предопределенной молекулой-мишенью и сравнения указанного связывания со связыванием указанного тестируемого соединения с нецелевыми молекулами.

[0014] Мультиплексирование в настоящих способах может включать множество молекул-мишеней в одной и той же смеси, где молекулы-мишени не существуют в одном препарате в природе. В различных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к гетерологичной смеси молекул-мишеней. В других конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к смеси молекул-мишеней, содержащей по меньшей мере одну человеческую молекулу-мишень или более одной человеческой молекулы-мишени.

[0015] Настоящее изобретение, в конкретных аспектах, относится к способам, как описано выше, где стадия (a) включает получение молекулы-мишени или молекул-мишеней из неочищенного экстракта. Настоящее изобретение, в конкретных аспектах, относится к способу, как описано выше, где указанная стадия получения молекул-мишеней включает получение человеческих молекул-мишеней. Экстракт может присутствовать ex vivo на мембранах из препаратов мембран церебрального кортекса, мозжечка, вентрикулярной и печеночной мембраны.

[0016] В различных вариантах осуществления, связывание тестируемого соединения с предопределенной молекулой-мишенью может происходить в любом из препаратов мембран церебрального кортекса, мозжечка, вентрикулярной и печеночной мембраны. Например, тестируемое соединение представляет интерес для связывания с рецептором A1. Стимуляция рецептора A1 имеет эффект угнетения миокарда посредством уменьшения проведения электрических импульсов. Это делает аденозин полезным лекарственным средством для лечения и диагностики избыточно быстрой частоты сердечных сокращений.

[0017] В различных вариантах осуществления, связывание тестируемого соединения с другими молекулами-мишенями можно считать нецелевым связыванием.

[0018] Настоящее изобретение, в конкретных вариантах осуществления, относится к способам, как описано выше, где стадия (c) включает удаление несвязавшихся лигандов из смесей или множества смесей с использованием стеклянного фильтра. Настоящее изобретение, в конкретных вариантах осуществления, относится к способу, как описано выше, где стадия (d) включает элюцию связанного лиганда со стеклянного фильтра с использованием растворителя, затем концентрирование образцов с фильтра.

[0019] Настоящее изобретение, в конкретных аспектах, относится к способам, как описано выше, где указанная масс-спектроскопия включает использование жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Настоящее изобретение, в конкретных аспектах, относится к способу, как описано выше, дополнительно включающему стадию определения K_on и K_off тестируемого соединения для молекулы-мишени.

[0020] Настоящее изобретение, в конкретных аспектах, относится к способам, как описано выше, где указанные молекулы-мишени присутствуют в смеси рецепторных молекул-мишеней, не существующих в природе. Настоящее изобретение, в конкретных аспектах, относится к способу, как описано выше, где указанные молекулы-мишени выбраны из группы, состоящей из Na⁺ канала, альфа-1-бета-адренорецептора, альфа-2-бета-адренорецептора A1 (рецептора аденозина), M1 (мускаринового рецептора), 5-HT_2A (рецептора серотонина), Альфа 1 нс (адренергического рецептора), Альфа 2 нс (адренергического), D1 (дофаминового рецептора), и 5H-транс (рецептора серотонина).

[0021] В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу, как описано выше, включающему стадию определения K_on и K_off тестируемого соединения для молекулы-мишени, где K_off определяют посредством способа вытеснения или способа разведения.

[0022] Настоящее изобретение, в конкретных вариантах осуществления, относится к способу, как описано выше, где лиганды, используемые для исследования молекул-мишеней, могут быть выбраны из группы, состоящей из CPX, пирензепина, празосина, RX821002, SCH233900, 8-OH-DPAT, EMD281014, пароксетина, D600, MK801 и налоксона.

[0023] Настоящее изобретение, в различных вариантах осуществления, относится к мультиплексированному способу количественной оценки связывания по меньшей мере двух различных тестируемых соединений (тестируемого соединения C1, C2 и след.) по меньшей мере с двумя различными рецепторными молекулами-мишенями (рецептором-мишенью RT1 для C1, RT2 для C2 и след.), на основании конкурентного связывания между тестируемыми соединениями и известными связывающими веществами для RT1 и RT2 (известными связывающими веществами B1, B2 и след.), включающему: (a) получение смеси, содержащей (i) тестируемые соединения C1 и C2; (ii) известные связывающие вещества B1, B2 и (iii) рецепторные молекулы-мишени RT1, RT2; (b) обеспечение возможности формирования комплексов в указанной смеси между тестируемыми соединениями C1, C2 и след., RT1 и RT2, так же как B1 и B2; (c) отделение соединений, которые не формируют комплексы с RT1, RT2 и след., от указанных комплексов; (d) выделение связывающих веществ B1, B2 и след. из комплексов, полученных на стадии (c), и пропускание выделенных связывающих веществ через масс-спектрометр для измерения связывания тестируемых соединений C1 и C2 с использованием масс-спектроскопии; и (e) определение относительных аффинностей C1 и C2 для RT1 и RT2, соответственно.

[0024] Для дополнительного пояснения, выражение «и след.» относится к сериям членов из серий материалов, которые могут быть представлены как C_n, B_n и RT_n, где n составляет между 2 и 40 или между 1 и 40 или между 2 и 50. Это показывает, например, что если n=10, существует 10 C, 10 B и 10 RT.

[0025] С целью пояснения, предусматривают, что группа рецепторных молекул-мишеней (RT), тестируемых соединений (C) и известных связывающих веществ (B) содержит между двумя и приблизительно 20 членами (или более) в одной мультиплексной реакции.

[0026] Настоящее изобретение, в различных вариантах осуществления, относится к способу, как описано выше, где рецепторные молекулы-мишени RT1-RT_n присутствуют в смеси, не обнаруженной в природе в одной смеси или в одной и той же ткани.

[0027] Во многих вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к мультиплексированному способу количественной оценки аффинности связывания по меньшей мере двух различных тестируемых соединений (тестируемого соединения C1-C_n) по меньшей мере с двумя различными рецепторными молекулами-мишенями (рецептор RT1 для C1, RT_n для C_n.), на основании конкурентного связывания между тестируемыми соединениями и известными связывающими веществами для RT1 и RT2 (известное связывающее вещество B1- B_n), включающему: (a) получение смеси, содержащей (i) тестируемые соединения C1-C_n; (ii) известные связывающие вещества B1- B_n и (iii) рецепторные молекулы-мишени RT1-RT_n; (b) обеспечение возможности формирования комплексов в указанной смеси между тестируемыми соединениями C1-C_n, RT1-RT_n, и B1-B_n; (c) отделение соединений, которые не формируют комплексы со своими молекулами-мишенями, от указанных комплексов; (d) выделение известных связывающих веществ из комплексов, полученных на стадии (c), и пропускание выделенных связывающих веществ через масс-спектрометр для измерения связывания тестируемых соединений с использованием масс-спектроскопии; и (e) определение относительных аффинностей соединений C1-C_n для RT1-RT_n, соответственно, где C_n, B_n и RT_n представляют серии членов, где n составляет между 2 и 40.

[0028] Настоящее изобретение, в различных вариантах осуществления, относится к способу, как описано выше, где стадия (a) включает получение рецепторных молекул-мишеней из неочищенного экстракта. Настоящее изобретение, в конкретных аспектах, относится к способу, как описано выше, где указанная стадия получения рецепторных молекул-мишеней RT1-RT_n включает получение человеческих рецепторных молекул-мишеней. Настоящее изобретение, в конкретных аспектах, относится к способу, как описано выше, где стадия (c) включает отделение с использованием стеклянного фильтра и промывки. Настоящее изобретение, в конкретных аспектах, относится к способу, как описано выше, где стадия (d) включает элюцию связанного лиганда с фильтра с использованием растворителя, затем концентрирование образцов с фильтра.

[0029] Настоящее изобретение, в различных вариантах осуществления, относится к способу, как описано выше, где указанная масс-спектроскопия включает использование жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Настоящее изобретение, в различных других вариантах осуществления, относится к способу, как описано выше,, дополнительно включающему стадию определения K_on и K_off тестируемого соединения для молекулы-мишени.

[0030] Кроме того, настоящее изобретение относится к мультиплексированному способу количественной оценки аффинности связывания тестируемого соединения с молекулой-мишенью, включающему стадии: (a) получения по меньшей мере трех молекул-мишеней, как указано на схеме ниже (Таблица 1); (b) инкубации указанных молекул-мишеней во множестве смесей, содержащих лиганды и тестируемые молекулы; (c) удаления несвязавшихся лигандов из смесей; (d) выделения лигандов, связавшихся с молекулами-мишенями; (e) определения количества каждого лиганда, присутствовавшего на молекулах-мишенях, посредством измерения лигандов, полученных на стадии (d), посредством масс-спектрометрии, с использованием калибровочной кривой, полученной с использованием известных концентраций лиганда; и (f) расчета аффинности тестируемого соединения для молекулы-мишени из данных, полученных на стадии (e). Способ, как описано, где одинаковое тестируемое соединение используют с каждой молекулой-мишенью. Способ дополнительно включает использование молекул-мишеней с лигандами, как показано в таблице 2.

Молекула-мишень Рецептор аденозина A1 Мускариновый рецептор ацетилхолина 5-HT_2A (серотонин) Альфа-1A-адренергический рецептор Альфа-2A-адренергический рецептор Дофаминовый рецептор D1 Транспортер 5HT Рецептор 5HT1a Рецептор 5HT2a Ca канал Cave Рецептор PCP Опиоидный рецептор

Таблица 1

Молекула-мишень Лиганд Рецептор аденозина A1 CPX Мускариновый рецептор ацетилхолина Пирензепин 5-HT_2A (серотонин) EMD281014 Альфа-1A-адренергический рецептор Празосин Альфа-2A-адренергический рецептор RX82102 Дофаминовый рецептор D1 SCH23390 Транспортер 5HT пароксетин Рецептор 5HT1a 8-OH-DPAT Рецептор 5HT2a EMD281014 Ca канал Cave D600 Рецептор PCP MK801 Опиоидный рецептор налоксон

Таблица 2

[0031] Настоящее изобретение, в конкретных аспектах, относится к способу, как описано выше, с использованием следующих комбинаций рецепторных молекул-мишеней и лигандов (Таблица 3):

Рецепторная молекула-мишень Лиганд Рецептор аденозина A1 CPX Мускариновый рецептор ацетилхолина M1 пирензепин 5HT1a 8-OH-DPAT/5 5-HT_2A (серотонин) EMD281014 Альфа-1A-адренергический рецептор Празосин Альфа-2A-адренергический рецептор RX82102 Дофаминовый рецептор D1 SCH23390 Транспортер 5HT пароксетин Ca++ канал («Cave») D600 Опиоидный мю-рецептор Налоксон Сигма-рецептор/рецептор PCP MK801

Таблица 3

[0032] Вышеуказанные рецепторные молекулы-мишени можно анализировать с другими лигандами, не перечисленными в вышеуказанной таблице 3, или другие рецепторные молекулы-мишени, не перечисленные в вышеуказанной таблице 3, можно анализировать с лигандами, показанными выше.

[0033] В различных вариантах осуществления, настоящие способы включают мультиплексный способ определения значений K_on и K_off тестируемого соединения для молекулы-мишени, включающий стадии: (a) получения смеси молекул-мишеней из по меньшей мере одной из (i) здоровой или нездоровой человеческой или не относящейся к человеку ткани, и (ii) препарата синтетического белка; (b) инкубации указанных молекул-мишеней во множестве смесей, содержащих лиганды и тестируемые соединения, где указанные молекулы-мишени связывают с различными лигандами и инкубируют с различными молекулами-мишенями; (c) после инкубации, удаления несвязавшихся лигандов из смесей; (d) выделения связанных лигандов, связавшихся с молекулами-мишенями; (e) определения количества лиганда, связавшегося с молекулами-мишенями, посредством измерения лигандов, полученных на стадии (d) в определенных временных точках в реакции, с использованием масс-спектрометрии и калибровочной кривой; и (f) расчета K_on или K_off тестируемого соединения для молекулы-мишени с использованием данных, полученных на стадии (e).

[0034] В различных вариантах осуществления, настоящие способы включают способ, где K_on и K_off определяют в смесях различных мембран ex vivo, состоящих по меньшей мере из двух препаратов крысиного кортекса, мозжечка, вентрикулярной и печеночной мембраны. В конкретных аспектах, настоящие способы включают способ, где смеси мембран содержат по меньшей мере два из рецепторов A1, A2A (h), A3 (h), M1, M2 (h), Альфа1 нс, Альфа2 нс, D1, D2S (h), 5HT1a, 5HT2a, 5H-транс, Cave, PCP, опиоидного нс, AT2 (h), B2 (h), CB1 (h), CCK1 (CCKA), H4 (h) и CysLT1 (LTD4) (h). В конкретных аспектах, настоящие способы включают смесь мембран, содержащую все из перечисленных рецепторов. В других конкретных вариантах осуществления, настоящие способы включают способ, где K_off определяют посредством способа вытеснения. В конкретных аспектах, настоящие способы включают способ, где K_off определяют посредством способа разведения. В различных вариантах осуществления, (h) обозначает человеческий.

[0035] В различных вариантах осуществления, молекулы-мишени представляют собой рецепторы.

[0036] Как описано ниже, одинаковое тестируемое соединение можно использовать с вышеуказанными различными рецепторными молекулами-мишенями и различными лигандами, получая информацию о целевом и нецелевом связывании посредством тестируемого соединения.

[0037] Другие признаки станут очевидными из сопутствующих фигур и из следующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0038] Примеры вариантов осуществления проиллюстрированы в качестве примера, а не ограничения, в таблицах и в сопутствующих фигурах, подобные ссылки обозначают сходные элементы, и в них:

[0039] На фиг. 1A и 1B показан иллюстративный технологический поток для анализов связывания MS, используемых для характеризации связывания различных лигандов (молекул-мишеней или рецепторных молекул-мишеней) с тестируемым соединением.

[0040] На фиг. 2A-2C показана корреляция между связыванием радиоактивного лиганда и настоящим способом связывания MS в натриевых каналах крысиного кортекса. Фиг. 2A представляет собой график, показывающий результаты анализа связывания радиоактивного лиганда для натриевых каналов. Фиг. 2B представляет собой график, показывающий результаты анализа связывания MS для вератридина. Фиг. 2C представляет собой график, показывающий результаты анализа связывания MS для батрахотоксина.

[0041] Фиг. 3A представляет собой график, показывающий эффект концентрации WB4101 в присутствии празосина и RX821002. Фиг. 3B представляет собой график, показывающий эффект концентрации йохимбина в присутствии RX821002 и празосина.

[0042] На фиг. 4A-K показана серия графиков, показывающих результаты анализа одновременного связывания с использованием молекул-мишеней крысиного кортекса. Фиг. 4A представляет собой график, показывающий эффект концентрации NECA в присутствии CPX при 5 нМ на крысином кортексе. Фиг. 4B представляет собой график, показывающий эффект концентрации атропина в присутствии пирензепина при 1нМ на крысином кортексе. Фиг. 4C представляет собой график, показывающий эффект концентрации серотонина в присутствии 8-OH-DPAT при 1нМ на крысином кортексе. Фиг. 4D представляет собой график, показывающий эффект концентрации WB4101 в присутствии празосина при 1нМ на крысином кортексе. Фиг. 4E представляет собой график, показывающий эффект концентрации йохимбина в присутствии RX821002 при 1нМ на крысином кортексе. Фиг. 4F представляет собой график, показывающий эффект концентрации бутакламола в присутствии SCH23390 при 1нМ на крысином кортексе. Фиг. 4G представляет собой график, показывающий эффект концентрации зимелидина в присутствии пароксетина при 1нМ на крысином кортексе. Фиг. 4H представляет собой график, показывающий эффект концентрации серотонина в присутствии EMD281014 при 1нМ на крысином кортексе. Фиг. 4I представляет собой график, показывающий эффект концентрации D888 в присутствии D600 при 5 нМ на крысином кортексе. Фиг. 4J представляет собой график, показывающий эффект концентрации DAMGO в присутствии налоксона при 1нМ на крысином кортексе. Фиг. 4K представляет собой график, показывающий эффект концентрации SKF10047 в присутствии MK801 при 5 нМ на крысином кортексе.

[0043] Фиг. 5 представляет собой схематический технологический поток для использования MS для определения кинетики связывания тестируемого соединения с родственной ему рецепторной молекулой.

[0044] Фиг. 6A представляет собой график, показывающий результаты анализа MS для определения кривой кинетики связывания CGP54626 на GABAB1b/2. Фиг. 6B представляет собой график, показывающий результаты анализа MS для определения кривой кинетики диссоциации GABAB1b/2 от CGP542626 при концентрации 1нМ способом вытеснения посредством добавления 10 мкМ CPG52432. Фиг. 6C представляет собой график, показывающий результаты анализа MS для определения кривой кинетики диссоциации GABAB1b/2 от CGP54626 при концентрации 5нМ способом разведения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

ОБЗОР

[0045] Настоящее изобретение относится к способу измерения активности связывания тестируемого соединения с рецепторной молекулой-мишенью с использованием смеси биологически значимых молекул-мишеней. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам измерения активности связывания тестируемых соединений с различными молекулами рецепторов (мишеней) с использованием гетерологичной смеси биологически значимых молекул-мишеней. Молекулы-мишени в этом анализе можно использовать для оценки нецелевого связывания. В одном аспекте способа используют анализ конкурентного связывания с использованием молекулы или ткани -мишени, как известно, связывающейся с лигандом. Как известно из принципов радиоиммунных анализов (RIA), кривые разведения строят с использованием различных концентраций известного лиганда (или «маркера») и его связывания с молекулой-мишенью. В отличие от RIA, маркеры в настоящем способе не нужно метить или иным образом химически модифицировать. Связывание тестируемого соединения с лигандом и тканью (молекулами-мишенями) затем измеряют при известной концентрации; затем сигнал MS сравнивают с сигналами MS, полученными на кривой разведения. Эффективность тестируемого соединения в связывании с молекулой-мишенью затем узнают, и можно определять IC₅₀ или EC₅₀.

[0046] В настоящих способах, характеристики связывания тестируемых соединений с различными молекулами-мишенями можно определять в мультиплексном способе. Настоящие способы относятся также к способам in vitro исследования лекарственных средств-кандидатов.

[0047] В настоящих способах можно использовать коммерчески доступное оборудование для высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и MS. Формат MS может представлять собой электрораспыление из лунки, или использование матрицы в формате с лазерной десорбцией/ионизацией с помощью матрицы (MALDI), или использование другого способа ионизации.

[0048] Настоящие способы можно автоматизировать с использованием лабораторного робототехнического оборудования. Все разделения и реакции в способе содержатся в одной и той же лунке для образцов, до того времени, когда выделенные молекулы вводят в HPLC. Можно использовать планшет для образцов с любым количеством желательных лунок.

[0049] Множество молекул-мишеней можно получать для использования в настоящих способах. Неочищенные или очищенные экстракты можно использовать, например, посредством способов, описанных в US 4446122, «Purified human prostate antigen»; US 6548019, «Device and methods for single step collection and assaying of biological fluids»; Magomedova et al., «Quantification of Oxysterol Nuclear Receptor Ligands by LC/MS/MS»; Methods Mol. Biol. 2019;1951:1-14; и Wang, «Purification and autophosphorylation of insulin receptors from rat skeletal muscle», Biochim Biophys Acta. 1986 Aug 29;888(1):107-15, содержание каждого из которых, таким образом, приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

[0050] Использование стеклянного фильтра для получения образца для анализа MS можно проводить, как описано, например, в Merck Millipore, «Perfection in preparation for better mass spectra», Merck Millipore, описание продукта 2012 г., получено на (colon slash slash www. merckmillipore.com/INTERSHOP/web/WFS/Merck-JP-Site/ja_JP/-/JPY/ShowDocument-Pronet id=201306.10657.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0051] Если не определено иное, все технические и научные термины используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, какое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это изобретение. Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, описаны предпочтительные способы и материалы. В общем, номенклатура, используемая в связи с клеточной и молекулярной биологией и химией, и в их способах, является хорошо известной и общепринятой в данной области. Конкретные экспериментальные способы, не определенные специфически, в общем, осуществляют в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области, и как описано в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитируют и обсуждают на протяжении настоящего описания. Для целей ясности, следующие термины определены ниже.

[0052] Когда представлен диапазон значений, понятно, что каждое промежуточное значение, до десятой единицы нижнего предела, если контекст явно не требует иного, между верхним и нижним пределами этого диапазона, и любым другим указанным или промежуточным значением в этом указанном диапазоне, включено в способы, клетки, композиции и наборы. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, а также включены в способы, клетки, композиции и наборы, ограниченные любым конкретно исключенным пределом в указанном диапазоне. Когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любой или оба из этих включенных пределов, также включены в способы, клетки, композиции и наборы.

[0053] Конкретные диапазоны представлены в настоящем описании с использованием числовых значений, которым предшествует термин «приблизительно». Термин «приблизительно» используют в настоящем описании для обеспечения буквального обоснования точного количества, которому оно предшествует, так же как количества, которое составляет около или приблизительно количества, которому термин предшествует. При определении того, составляет ли количество около или приблизительно конкретно перечисленного количества, неперечисленное количество около или приблизительно может представлять собой количество, которое, в контексте, в котором оно представлено, обеспечивает существенный эквивалент конкретно перечисленного количества.

[0054] Содержание всех публикаций и патентов, процитированных в настоящем описании, приведено в настоящем описании в качестве ссылки, как если бы было конкретно и индивидуально указано, что содержание каждых индивидуальных публикации или патента приведено в настоящем описании в качестве ссылки, и приведено в настоящем описании в качестве ссылки для раскрытия и описания материалов и/или способов, в связи с которыми процитированы публикации. Цитирование любой публикации приведено для ее содержания до даты подачи, и его не следует рассматривать как допущение, что настоящие способы, клетки, композиции и наборы не предоставлены для датирования такой публикации задним числом, поскольку представленная дата публикации может отличаться от фактической даты публикации, которая может нуждаться в независимом подтверждении.

[0055] Следует отметить, что, как используют в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если контекст явно не требует иного. Следует, кроме того, отметить, что пункты формулы изобретения могут быть выведены для исключения любого необязательного элемента. Таким образом, это утверждение предназначено, чтобы служить предшествующим основанием для использования такой исключительной терминологии, как «единственно», «только» и т.п., в связи с перечислением заявленных элементов, или использования «отрицательного» ограничения.

[0056] Термин «аффинность» используют в общепринятом смысле для обозначения аффинности связывания. Аффинность связывания представляет собой силу взаимодействия связывания между отдельной биомолекулой (например, белком) и ее лигандом/партнером по связыванию (например, лекарственным средством или ингибитором). Аффинность связывания, как правило, измеряют и регистрируют посредством равновесной константы диссоциации (Kd), которую используют для оценки и ранжирования сил бимолекулярных взаимодействий. Соответственно, кинетика связывания описывает, насколько быстро соединение связывается со своей мишенью, и насколько быстро оно диссоциирует от нее. Таким образом, она измеряет две вещи - скорость связывания и скорость диссоциации. См., US 5324633A, «Method and apparatus for measuring binding affinity».

[0057] Термин «лиганд», или «связывающее вещество» использован в настоящем описании для обозначения материала, который, как известно, связывается с данным рецептором или другой молекулой-мишенью. Этот термин можно дополнительно понять со ссылкой на Siimans et al., US 5814498, «Methods of enumerating receptor molecules for specific binding partners on formed bodies and in solution», содержание которого, таким образом, приведено в качестве ссылки как предоставляющее концепцию конкурентного связывания.

[0058] «Смесь мишеней» или молекулы-мишени означает смесь структурно различных мишеней или других рецепторных молекул-мишеней. В качестве неограничивающего примера, эта смесь может содержать рецепторы глутамата, дофаминовые рецепторы D1, и никотиновые рецепторы ацетилхолина. Эти рецепторы могут присутствовать в одном типе ткани, таком как церебральный кортекс головного мозга животного, или могут не присутствовать в одном типе ткани. Смесь мишеней может также включать, например, рецепторы глутамата (из церебрального кортекса) и рецепторы VEGF (из эндотелиальных клеток). См. ниже «гетерологичная смесь рецепторных молекул-мишеней».

[0059] «Гетерологичная смесь рецепторных молекул-мишеней» относится к смеси различных молекул-мишеней, которые не обнаружены в природе в одной ткани, или, если присутствуют в одной и той же ткани, имеют различные биологические функции. В качестве неограничивающего примера, эта смесь может содержать более одной ткани, выбранной из группы, состоящей из модифицированных клеток, экспрессирующих сопряженные с G-белком рецепторы (GPCR), церебрального кортекса из животных источников (имеющего 15 различных молекул-мишеней, как описано, например, в Zilles et al., «Multiple Transmitter Receptors in Regions and Layers of the Human Cerebral Cortex», Front Neuroanat. 11:78 (2017)), мозжечка, сердца, мышц (включая сердечные ионные каналы), биологических ферментов (например, COX2, COX1, MAO, PDE4, Ache, LCK), ядерных рецепторов (например, AR и NR3C1) и молекул нуклеиновой кислоты.

[0060] Молекулы-мишени могут иметь желательное связывание и связывание, которое не является желательным, известное как нецелевое связывание. Как обсуждали выше, нецелевого связывания, как правило, избегают по причинам безопасности. См. Bowes et al. и Eurofins Safety Panels, h-t-t-ps-:slash-slash www(dot).eurofinsdiscoveryservices.com/cms/cms-content/services/safety-and-efficacy/safety- pharmacology/safety-panels/, описывающие выбор панелей безопасности in vitro Safety.

[0061] Термин «MS» означает масс-спектрометрию. В настоящем способе, можно использовать множество способов масс-спектрометрии, например, AMS (масс-спектрометрию с ускорителем), газовую хроматографию-MS, жидкостную хроматографию-MS, ICP-MS (масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой), IRMS (масс-спектрометрию изотопного отношения), спектрометрию ионной подвижности-MS, MALDI-TOF, SELDI-TOF, тандемную MS, TIMS (масс-спектрометрию с термической ионизацией), и SSMS (масс-спектрометрию с искровым излучателем).

[0062] Термин «мультиплексный» относится к анализу, в котором множество различных анализов проводят в одной процедуре, с использованием различных молекул-мишеней, имеющих различные лиганды. Способ может также включать наличие различных тестируемых соединений. Связывание тестируемого соединения с различными молекулами-мишенями, которые не существуют вместе в природе, можно проводить одновременно в мультиплексном анализе. Кроме того, в мультиплексном анализе можно получать множество результатов из одной смеси рецепторов-мишеней и получать профиль связывания с различными молекулами-мишенями, которые могут прояснять связывание мишени и, таким образом, безопасность.

[0063] Термин «жидкостная хроматография/тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением» можно, кроме того, понимать со ссылкой, например, на Bandu et al., «Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometric (LC/ESI-MS/MS) Study for the Identification and Characterization of In Vivo Metabolites of Cisplatin in Rat Kidney Cancer Tissues: Online Hydrogen/Deuterium (H/D) Exchange Study», PLosOne 2015 Aug 5:10(8).

[0064] Термин «рецепторная молекула-мишень» или «молекула-мишень», или «рецепторная молекула» относится к биологическому соединению, для которого следует измерять связывание тестируемого соединения. Данная рецепторная молекула-мишень может присутствовать в целевой ткани, полученной из клетки, животного (относящегося или не относящегося к человеку). Ее можно получать посредством рекомбинантной ДНК, или иным образом синтезировать так, чтобы она содержала одну или более представляющих интерес молекул-мишеней. Она может являться связанной с мембраной или существовать в жидкой смеси, такой как фермент. Потенциальные ткани для рецепторов-мишеней, используемых в настоящем описании, могут представлять собой церебральный кортекс, астроциты головного мозга, нейрональные ткани (включая нейрональные стволовые клетки), ткани сердца, ткани печени, ткани крови, ткани почки, ткани глаза, ткани кишечника и т.д. Ткань-мишень может являться нормальной или пораженной заболеванием. Она может происходить из животного источника или относящегося к человеку источника. Термин «гетерологичная смесь молекул-мишеней» относится к тканям или линиям клеток из различных источников, как проиллюстрировано выше. Ткани могут представлять собой различные ткани, если они происходят из одной и той же ткани, но ткани имеют различную структуру, из-за заболевание, состояния развития, или т.п.

[0065] Термин «синтетический препарат белка» обозначает препарат белка, который был синтезирован, а не получен из нативной клетки или ткани. Синтетический препарат белка можно синтезировать посредством способов рекомбинантной ДНК, синтеза пептидов, или т.п.

[0066] Термин «тестируемое соединение» обозначает материал, подвергаемый исследованию по его аффинности связывания для молекул-мишеней. Оно может взаимодействовать и конкурировать с известным лигандом (маркером), если оно связывается с молекулой-мишенью, которая также связана с маркером. Тестируемое соединение может представлять собой потенциальное лекарственное средство, так же как метаболиты такого лекарственного средства. Оно может представлять собой малую молекулу или белок, или полинуклеотид. Оно может также представлять собой молекулу, подвергаемую тестированию из-за его потенциала к диагностическому применению in vivo.

ОБОБЩЕННЫЙ СПОСОБ И АППАРАТ

[0067] Настоящие способы можно адаптировать для широкого множества тестируемых соединений и широкого множества мишеней, для которых необходимо исследовать характеристики связывания тестируемых соединений. Особенный интерес представляет исследование тестируемых соединений, которые являются кандидатами на лекарственное средство для использования in vivo у человека. Связывание тестируемых соединений с различными молекулами-мишенями, представленными в различных тканях, исследуют в настоящих способах. Связывание либо является желательным для терапевтического эффекта, либо не является желательным для избегания нецелевых эффектов, для целей безопасности лекарственного средства. Таким образом, настоящие способы находят применение, например, в идентификации потенциальных терапевтических средств для человека и их потенциального нежелательного связывания с различными тканями человека, экспрессирующими потенциальные мишени для связывания тестируемого соединения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Технологический поток

[0068] Со ссылкой в настоящее время на фиг. 1A и 1B, показано, что настоящие способы включают серии стадий инкубации, разделения и промывки, приводящих к прямой или опосредованной количественной оценке тестируемых соединений, которые диссоциируют от молекулы-мишени из-за конкуренции с известным связывающим лигандом. См. врезку на фиг. 1A, иллюстрирующую одну тестируемую лунку 107. Лиганды обозначены 1, 2 и 3 для обозначения различных лигандов 105, связывающихся с различными рецепторными молекулами-мишенями 104 в одной лунке.

[0069] На фиг. 1A-1B показана инкубация гетерологичной смеси рецепторных молекул-мишеней с лигандами (известными связывающими веществами), и различными тестируемыми соединениями. Лунки, флаконы или другие контейнеры содержат молекулы-мишени. Как показано в 101, стадия (a), данная лунка в многолуночном планшете может содержать смеси молекул-мишеней 104, лигандов (известных связывающих веществ) 105 и различных тестируемых соединений 106. Как показано во врезке 107, молекулы-мишени 104 могут связываться с различными лигандами 105, обозначенными как 1, 2 и 3. Установление различий и идентификацию лигандов проводят посредством MS. Различные лунки содержат различные количества молекул, благодаря чему результаты анализа лунок на фиг. 1A и 1B можно использовать для построения кривых концентраций, как показано на фиг. 2-6. Затем, как показано на фиг. 1A, стадия (b), несвязавшиеся лиганды отделяют от комплексов в лунках. Затем, как показано в (c), лиганды, связавшиеся с молекулами-мишенями, отделяют от смеси и извлекают из лунки для использования на фиг. 1B, стадия (d). Извлечение связанных лигандов на стадии (c) можно облегчать посредством использования ацетонитрила 103 и стеклянного фильтра, позволяющего прохождение только несвязавшихся лигандов. Различные органические растворители можно использовать на этой стадии, так же как на других стадиях выделения для подготовки лигандов для использования на стадии (d).

[0070] После выделения связавшихся ранее молекул лигандов, количество лиганда, полученного из каждой лунки, количественно оценивают посредством жидкостной хроматографии и MS (масс-спектроскопии) с электрораспылением (стадия (d) на фиг. 1B). используют способ LC/ESI-MS/MS, так что жидкостная хроматография может уменьшать количество не относящихся к делу пиков масс-спектроскопии, когда масс-спектрометр используют для идентификации и количественной оценки различных лигандов.

[0071] На фиг. 1B показано устройство для HPLC 108, растворители для получения подвижной фазы 109, модуль для получения смесей компонентов 110 и колонка для HPLC 111, имеющая выход на источник ионов 112 и масс-спектрометр 113. Иллюстративный анализ хроматограммы и масс-спектра выявляет абсолютную количественную оценку элюированных молекул-мишеней 114.

[0072] В другом варианте осуществления настоящих способов, фиксированное количество тестируемого соединения соединение можно измерять при различных концентрациях лигандов (известных связывающих веществ). То есть, используют избыток тестируемого соединения, если это доступно, и используют различные количества лигандов. Лиганд вызывает посредством конкуренции диссоциацию комплекса тестируемое соединение-молекула-мишень для определения поведения связывания тестируемого соединения с молекулой-мишенью.

[0073] Кроме того, на фиг 1A и 1B показана подготовка рецепторных молекул-мишеней, помещенных в тестируемые лунки, флаконы или другие контейнеры. Они могут представлять собой неочищенный экстракт ткани, содержащей рецепторные молекулы-мишени. Ткань может представлять собой кровь, сыворотку, спинномозговую жидкость, фрагмент головного мозга (церебральный кортекс, мозжечок, ствол головного мозга и т.д.), экстракты желез (надпочечников, гипофиза, тимуса, поджелудочной железы, яичников, щитовидной железы, яичек, гипоталамуса и т.д.), или ткань органа, такого как сердце, скелетная мышца, почка, легкое и т.д. Ткань может происходить человеческой или не относящейся к человеку ткани, или ткани животного. Она может являться нормальной или пораженной заболеванием. Рецепторные молекулы-мишени не должны являться очищенными, и их выбирают на основании предполагаемого использования тестируемого соединения, доступности известных лигандов и цели исследования. Целью исследования может являться получение профиля безопасности, где широкое множество потенциальных молекул-мишеней можно тестировать с использованием тестируемого соединения для оценки нежелательного связывания.

[0074] Кроме того, рецепторные молекулы-мишени можно получать без использования эндогенной ткани, но, вместо этого, получать посредством синтеза рДНК или белка. Известные клонированные рецепторы, которые можно использовать в настоящих способах, включают рецепторы гистамина H3, опиоидные рецепторы, сопряженные с G-белком рецепторы, ванилоидные рецепторы, рецепторы глутамата и т.д.

[0075] Мультиплексные способы в настоящем описании осуществляют во множестве реакционных областей (лунок), показанных как F, G и H, для имеющего 8 рядов, 96-луночного планшета (как показано в 101). Можно использовать 384-луночный планшет или другие многолуночные форматы. В этом примере, рецепторные молекулы-мишени подготавливали с лигандом и тестируемыми соединениями и проводили мультиплексную инкубацию при 2 час, 37°C в 96-луночном планшете. Как показано во врезке 107 ниже панели (a), лунка содержит ряд рецепторов, связанных с лигандами 105, и ряд рецепторов 104, связанных с тестируемым соединением 106 вместо лиганда 105.

[0076] После инкубации на стадии (a), комплексы молекул-рецепторов-мишеней, связавшихся с молекулами-мишенями, отделяют от несвязавшихся лигандов и свободных молекул-мишеней посредством фильтрации. Вакуумную фильтрацию применяют одновременно ко всему планшету (Фиг. 1A, стадия (b). Альтернативно, на стадии (b) можно использовать лунки, содержащие поршень или шприц, для отделения связавшихся комплексов от несвязавшихся молекул. Альтернативно, рецепторные молекулы-мишени можно метить для отделения от лунок. В этом варианте осуществления, несвязавшиеся молекулы можно легко удалять.

[0077] После отделения связавшегося лиганда от свободных лигандов, комплексы можно промывать с использованием буфера с низкой ионной силой и наконец, элюировать с использованием органического буфера или буфера с высокой ионной силой, эффективно выделяя связанные с лигандом рецепторы для обработки на стадии (c). Рецепторы можно также метить с использованием магнитных бусин и перерабатывать, как описано выше. Соответственно, как показано на фиг. 1A стадия (b) 102, выделенный комплекс лиганд-рецептор дополнительно обрабатывают таким образом, чтобы отделить лиганд от связанных рецепторных молекул-мишеней, например, путем элюции посредством ацетонитрила (Фиг. 1A, стадия (c), 103). На стадии (d), (Фиг. 1B), выделенные молекулы лигандов со стадии (c) анализируют напрямую с использованием LC MS с электрораспылением-MS (жидкостной хроматографии - ионизации электрораспылением в режиме определения положительных ионов - тандемной масс-спектрометрии).

[0078] Со ссылкой в настоящее время на фиг. 1B, стадия (d), смесь лигандов очищают посредством жидкостной хроматографии и анализируют посредством масс-спектроскопии. Использованное изображение взято из Wikipedia «Liquid chromatography-mass spectrometry», https(colon slash slash en.wikipedia(dot)org/wiki/Liquid_chromatography-mass_spectrometry, загружено 6-28-2019. Как отмечено в настоящем описании, масс-спектрометрия (MS) представляет собой аналитический способ, измеряющий отношение массы к заряду (m/z) заряженных частиц (ионов). Хотя существует множество различных видов масс-спектрометров, во всех из них используют электрические или магнитные поля для манипуляции движением ионов, образованных из представляющего интерес аналита, и определения их отношения m/z. Основными компонентами масс-спектрометра являются источник ионов, масс-анализатор, детектор, и системы для данных и вакуума. Источник ионов представляет собой место, где компоненты образца, введенного в систему MS, ионизируют посредством электронных пучков, фотонных пучков (УФ-света), лазерных пучков или коронного разряда. В случае ионизации электрораспылением, источник ионов двигает ионы, которые существуют в жидком растворе, в газовую фазу. Источник ионов конвертирует и фрагментирует нейтральные молекулы образца в ионы газовой фазы, которые посылает в масс-анализатор. В то время как масс-анализатор прилагает электрические и магнитные поля для сортировки ионов по их массам, детектор измеряет и усиливает ионный ток для расчета содержания каждого разрешенного по массе иона. Для получения масс-спектра, который может быть легко различим человеческим глазом, система данных регистрирует, обрабатывает, хранит и выводит на дисплей данные в компьютере. В примере, используют MS с ионизацией электрораспылением.

[0079] Калибровочную кривую с известными концентрациями используют для количественной оценки количества тестируемого соединения, которое посредством конкуренции вызвало диссоциацю лиганда и связалось с тестируемой рецепторной молекулой. Другие различные способы масс-спектроскопии, как подробно описано выше, можно использовать, при условии, что они не образуют избыточные посторонние данные.

[0080] Следует отметить, что известное связывающее вещество, т.е. маркер, является немеченым (как и тестируемое соединение). Это является ключевым преимушеством настоящего способа MS над способом RIA (радиоиммунного анализа). RIA также основан на конкуренции между известным связывающим веществом и тестируемым соединением, но требует, чтобы маркер являлся меченным радиоактивной меткой для достижения желательной чувствительности. В альтернативном варианте осуществления, метку, такую как дейтерий, можно добавлять для увеличения чувствительности.

[0081] Дополнительные подробности жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением можно обнаружить в Becker, US 6835927, «Mass spectrometric quantification of chemical mixture components», содержание которого, таким образом, приведено в качестве ссылки.

[0082] Таким образом, на фиг. 1A и 1B показаны серии стадий инкубации и промывки для описанного анализа, для прямой или опосредованной количественной оценки тестируемых соединений, где на стадии (a) данная лунка 101 в многолуночном планшете содержит смесь рецепторной молекулы-мишени 104, лиганда (известного связывающего вещества) 105 и тестируемого соединения 106. Кроме того, как показано во врезке 107, молекула-мишень может связываться с различными лигандами, обозначенными как 1, 2 и 3. Смеси позволяют инкубацию в течение 2 час при 37°C в многолуночном планшете. После инкубации на стадии (a), вакуумную фильтрацию прилагают 102 к многолуночному планшету для отделения связавшейся рецепторной молекулы-мишени от несвязавшихся лигандов и свободных молекул-мишеней, как показано на стадии (b). На стадии (c) показано, что отделенный комплекс лиганд-рецептор дополнительно промывают буфером низкой ионной силы, например, путем элюции посредством ацетонитрилом 103, так чтобы отделять лиганд от связанной рецепторной молекулы-мишени перед переводом на стадию (d) описанного анализа связывания. На стадии (d), (Фиг. 1B), выделенные молекулы лиганда со стадии (c) анализируют напрямую с использованием LC MS с электрораспылением-MS (жидкостной хроматографии-ионизации электрораспылением в режиме определения положительных ионов-тандемной масс-спектрометрии).

ПРИМЕР 2: Сравнимость между настоящим способом MS и способом RIA

[0083] Со ссылкой в настоящее время на фиг. 2A, анализ связывания радиоактивного лиганда на натриевом (Na) канале и его сравнение с настоящим способом MS, показано на фиг. 2B и 2C. На фиг. 2B показано специфическое связывание вератридина в присутствии батрахотоксина при 50 нМ. Этот эксперимент проводили с использованием натриевых каналов в качестве рецепторных молекул-мишеней. Можно считать, что лиганд (известное связывающее вещество) представляет собой батрахотоксин, который связывает и необратимо открывает натриевые каналы нервных клеток и предотвращает их закрытие. Тестируемое соединение представляет собой нейротоксин вератридин, который действует посредством связывания и предотвращения инактивации потенциалозависимых натриевых ионных каналов в клеточных мембранах сердца, нервов и скелетных мышц.

[0084] SNR (отношение сигнала к шуму) определяли следующим образом (Таблица 4):

SNR 6 8 Батрахотоксин (Kd=91 нМ) 143 нМ (EC50) Вератридин 5,6 мкМ (IC50) 12,2 мкМ (IC50)

Таблица 4

[0085] На фиг. 2C показано указание на специфичность связывания. Кривая 201 на фиг. 2C показывает общий сигнал, кривая 202 показывает сигнал, ассоциированный с неспецифическим связыванием в присутствии вератридина, и кривая 203 показывает специфический сигнал. В этом случае, связывание батрахотоксина определяли в мембранах, которые предварительно инкубировали с конкурентом (вератридином), как известно, связывающимся с тем же самым участком. Таким образом можно определять, не связывается ли специфический лиганд неспецифически с фильтром, пластиком или другими участками.

Материалы и способы:

Получение мембраны крысиного кортекса

[0086] Крысиные кортексы от самцов крыс Wistar собирали и переносили в 50 мМ Трис-HCl (pH, 7,4), и гомогенизировали посредством polyton. Гомогенат центрифугировали при 50000 g в течение 15 минут при 4°C. Полученный осадок промывали в буфере для лизиса, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH, 7,4), содержащий 1 мкг/мл лейпептина и 1 мкМ пепстатин, и центрифугировали при 50000 g в течение 15 минут при 4°C. Осадок наконец ресуспендировали в меньшем объеме буфера для лизиса, и конечную концентрацию белка определяли в соответствии со способом Бредфорд с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Фильтрация и элюция образцов

[0087] Инкубацию останавливали посредством фильтрации после переноса связывающей/реакционной смеси (аликвоты 200 мкл на лунку) в 96-луночные планшеты со стеклянным фильтром, и затем быстро фильтровали в вакууме, мембранную фракцию, связанную с фильтрами, промывали несколько раз буфером для промывки (50 мМ Трис-HCl и 150 мМ NaCl) в вакуумном коллекторе. Мембранные фильтры предварительно обрабатывали в течение 1 часа с использованием 50 мМ Трис-HCl и 0,3% раствора полиэтиленимина (PEI).

[0088] Фильтры сушили в течение одного часа при 50°C и охлаждали до комнатной температуры до элюции батрахотоксина с использованием ацетонитрила (содержащего 100 пМ антипирин в качестве внутреннего стандарта) посредством вакуумного коллектора. Относительную количественную оценку лиганда в каждом образце проводили посредством UHPLC-MS-MS, использовали отношение площади для лиганда и внутреннего стандарта.

Разработка способа UHPLC-MS/MS

[0089] Анализ UHPLC-QQQ проводили посредством системы 1290 Infinity Binary LC (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), соединенной с масс-спектрометром Q-TRAP 5500 с источником ионов ESI Turbo V (SCIEX, Foster City, CA, USA).

[0090] Хроматографическое разделение проводили на колонке C18 (Poroshell 120 EC-C18, Agilent). Объем инъекции составлял 20 мкл (инъекция с полным заполнением петли). Подвижная фаза состояла из двух растворов, включающих растворитель A (0,1% муравьиная кислота и 6 мМ ацетат аммония в воде) и растворитель B (0,1% муравьиная кислота и 6 мМ ацетат аммония в ацетонитриле), колонку термостатировали в печи при 35°C, и скорость потока составляла 650 мкл/мин.

[0091] Хроматографический градиент, используемый для колонки C18; начальный состав B составлял 0% в течение 0,3 мин и увеличивался до 80% от 0,3 до 0,9 мин, затем 100% достигали от 1 мин до 1,3 мин, с последующим повторным уравновешиванием до исходного состояния в течение 0,3 мин.

[0092] Для анализа MS, данные получали с использованием ионизации электрораспылением (ESI) в режиме определения положительных ионов, напряжение ионораспыления устанавливали на 5500 В. Десольватацию в источнике осуществляли с использованием следующих установленных параметров: температура (TEM) при 600°C, источник ионов газа 1 (GS1) при 40 фунт/кв. дюйм (276 кПа)), источник ионов газа 2 (GS2) при 50 фунт/кв. дюйм (345 кПа) и газовая завеса (CUR) при 50 фунт/кв. дюйм (345 кПа). Конкретные параметры способа MRM, позволяющие количественную оценку и мониторирование лиганда (батрахотоксина) описаны в таблице 5. Необработанные данные обрабатывали в Sciex Analyst, и индивидуальную AUC (площадь под кривой) для каждого аналита в каждом образце определяли с использованием программного обеспечения MultiQuant.

Q1, масса (Да) Q3, масса (Да) Время (мсек) ID DP
(вольт) EP
(вольт) CE
(вольт) CXP
(вольт) 539,2 400,2 150 Батрахотоксин 140 10 23 12

DP: потенциал декластеризации, EP: входной потенциал, CE: энергия соударения и CXP: напряжение на выходе ячейки соударений.

Таблица 5: Способ MRM

Связывание посредством экспериментов MS

Определение оптимальной концентрации лиганда

[0093] Препараты кортикальной мембраны, содержащие рецептор участка 2 натриевого канала (Na⁺) и батрахотоксин, инкубировали в трех повторах в буфере для анализа (50 мМ Hepes/Трис-HCl, 0,8 мМ MgSO4, 5 мМ KCl, 7,5 мг/л яда скорпиона, 2 мМ MgCl2, 10 мкг/мл трипсина, 1 г/л глюкозы, 130 мМ холин, 1 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл пепстатина и 0,1% BSA) в полипропиленовых 96-луночных планшетах с глубокими лунками при 37°C. Сначала, 12 концентраций (в диапазоне от 10 пМ от 300 нМ) батрахотоксина совместно инкубировали в течение 60 минут при 37°C, с 1 концентрацией (200 мкг/лунку) препарата крысиной кортикальной мембраны.

[0094] Неспецифическое связывание определяли посредством совместной инкубации с 10 мкМ верапамилом.

[0095] Инкубацию останавливали посредством фильтрации после переноса всего объема реакционной смеси для связывания в планшет с фильтром. Оставшееся количество батрахотоксина определяли посредством UHPLC-MS/MS.

Для анализов насыщения:

[0096] Аликвоты мембраны, содержащие 200 мкг препарата крысиной кортикальной мембраны инкубировали в трех повторах в присутствии 50 нМ батрахотоксина в общем объеме 200 мкл буфера для анализа. Инкубацию останавливали посредством фильтрации после инкубации в течение 60 минут при 37°C.

[0097] Неспецифическое связывание определяли посредством совместной инкубации с 10 мкМ верапамила.

[0098] Инкубацию останавливали посредством фильтрации после переноса всего объема реакционной смеси для связывания в планшет с фильтром. Оставшееся количество батрахотоксина определяли посредством UHPLC-MS/MS.

Конкурентные масс-анализы связывания:

[0099] Анализы вытеснения лиганда проводили с использованием восьми концентраций конкурентного лиганда, вератридина (в диапазоне от 0,1 нМ до 100 мкМ) в трех повторах. Инкубацию останавливали посредством фильтрации после инкубации в течение 60 минут при 37°C. Оставшееся количество батрахотоксина определяли посредством UHPLC-MS/MS.

ПРИМЕР 3: Мультиплексирование с использованием 2 одновременных мишеней

[00100] Фиг. 3A представляет собой график, показывающий эксперимент одновременного связывания с использованием альфа 1- и альфа 2-бета-адренорецепторов. Молекулы-мишени содержатся в крысином кортексе, который содержит как альфа 1-, так и альфа 2-бета-адренорецепторы. Тестируемое соединение представляет собой WB4101, и лиганды представляют собой празосин и RX821002. На фиг. 3B показано одновременное определение связывания с α1 и α2 бета-адренорецепторами с использованием йохимбина в качестве тестируемого соединения и таких же молекул-мишеней и лигандов, как на фиг. 3A.

[00101] В настоящее время приведена подробная ссылка на фиг. 3A. Препарат крысиного кортекса использовали для измерения эффекта соединений на две различные молекулы-мишени, в этом случае, α1B-адренергический рецептор и α2B-адренергический рецептор. Эти два рецептора являются структурно и функционально различными. Человеческий α-1A адренергический рецептор (ADRA1A) имеет каноническую длину 466 аминокислот и массу 51487 Да. Человеческий α-2A адренергический рецептор (ADRA2A) имеет каноническую длину 450 аминокислот и массу 48957 Да.

[00102] WB4101 является известным антагонистом α1B-адренергического рецептора. Празосин представляет собой лекарственное средство, известное как связывающееся с альфа-1 (α1) адренергическим рецептором, который представляет собой сопряженный с G-белком рецептор (GPCR). Эти рецепторы обнаружены на гладкой мускулатуре сосудов. RX821002 является сильным, избирательным антагонистом α2-адренорецептора.

[00103] В этом примере использовали молекулу-мишень, содержащую оба α1 и α2-бета-адренорецептора, инкубированную с WB4101 (тестируемым соединением) в присутствии празосина (лиганда, или «маркера», для α1) и RX821002 (лиганда, или «маркера», для α2), как показано на фиг. 3A. На фиг. 3B, йохимбин (тестируемое соединение) тестировали в присутствии празосина (маркера для α1) и RX821002 (маркера для α2). Сигналы обозначены нс для неспецифических.

[00104] Как показано на фиг. 3A, показано, что как празосин, так и RX821002 специфически связываются с α1 и α1 адренергическим рецептором (соответственно). На фиг. 3B показано одновременное определение связывания α1 и α1 с использованием йохимбина в качестве тестируемого соединения и таких же мишеней и лигандов, как на фиг 3A.

Получение мембраны крысиного кортекса

[00105] Крысиные кортексы от самцов крыс Wistar собирали и переносили в 50 мМ Трис-HCl (pH, 7,4), и гомогенизировали посредством polyton. Гомогенат центрифугировали при 50000 g в течение 15 минут при 4°C. Полученный осадок промывали в буфере для лизиса, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH, 7,4), содержащий 1 мкг/мл лейпептина и 1 мкМ пепстатин, и центрифугировали при 50000 g в течение 15 минут при 4°C. Осадок наконец ресуспендировали в меньшем объеме буфера для лизиса, и конечную концентрацию белка определяли в соответствии со способом Бредфорд с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Фильтрация и элюция образцов

[00106] Инкубацию останавливали посредством фильтрации после переноса связывающей/реакционной смеси (аликвоты 200 мкл на лунку) в 96-луночные планшеты со стеклянным фильтром, и затем быстро фильтровали в вакууме, мембранную фракцию, связанную с фильтрами, промывали несколько раз буфером для промывки (50 мМ Трис-HCl и 150 мМ NaCl) в вакуумном коллекторе. Мембранные фильтры предварительно обрабатывали в течение 1 часа с использованием 50 мМ Трис/HCl и 0,3% раствора полиэтиленимина (PEI).

[00107] Фильтры сушили в течение одного часа при 50°C и охлаждали до комнатной температуры до элюции лигандов с использованием ацетонитрила (содержащего 100 пМ антипирин в качестве внутреннего стандарта) посредством вакуумного коллектора. Относительную количественную оценку лиганда в каждом образце проводили посредством UHPLC-MS-MS, использовали отношение площади для лиганда и внутреннего стандарта.

Разработка способа UHPLC-MS/MS

[00108] Анализ UHPLC-QQQ проводили посредством системы 1290 Infinity Binary LC (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), соединенной с масс-спектрометром Q-TRAP 5500 с источником ионов ESI Turbo V (SCIEX, Foster City, CA, USA).

[00109] Хроматографическое разделение проводили на колонке C18 (Poroshell 120 EC-C18, Agilent). Объем инъекции составлял 20 мкл (инъекция с полным заполнением петли). Подвижная фаза состояла из двух растворов, включающих растворитель A (0,1% муравьиная кислота и 6 мМ ацетат аммония в воде) и растворитель B (0,1% муравьиная кислота и 6 мМ ацетат аммония в ацетонитриле), колонку термостатировали в печи при 35°C, и скорость потока составляла 650 мкл/мин.

[00110] Хроматографический градиент, используемый для колонки C18; начальный состав B составлял 0% в течение 0,3 мин и увеличивался до 80% от 0,3 до 0,9 мин, затем 100% достигали от 1 мин до 1,3 мин, с последующим повторным уравновешиванием до исходного состояния в течение 0,3 мин.

[00111] Для анализа MS, данные получали с использованием ионизации электрораспылением (ESI) в режиме определения положительных ионов, напряжение ионораспыления устанавливали на 5500 В. Десольватацию в источнике осуществляли с использованием следующих установленных параметров: температура (TEM) при 600°C, источник ионов газа 1 (GS1) при 40 фунт/кв. дюйм (276 кПа), источник ионов газа 2 (GS2) при 50 фунт/кв. дюйм (345 кПа) и газовая завеса (CUR) при 50 фунт/кв. дюйм (345 кПа). Конкретные параметры способа MRM, позволяющие количественную оценку и мониторирование празосина (лиганда, или «маркера», для α1) и RX821002 (лиганда, или «маркера», для α1) описаны в таблице 6. Необработанные данные обрабатывали в Sciex Analyst, и индивидуальную AUC (площадь под кривой) для каждого аналита в каждом образце определяли с использованием программного обеспечения MultiQuant.

Q1, масса (Да) Q3, масса (Да) Время (мсек) ID DP
(вольт) EP
(вольт) CE
(вольт) CXP
(вольт) 384,300 231,162 100 Празосин 140 10 56 9 235,100 203,000 100 RX821002 40 10 21 23

DP: потенциал декластеризации, EP: входной потенциал, CE: энергия соударения и CXP: напряжение на выходе ячейки соударений.

Таблица 6

Связывание посредством экспериментов MS

Определение оптимальной концентрации лиганда

[00112] Препараты крысиной кортикальной мембраны, содержащие как альфа 1 неизбирательные (α1 НС), так и альфа 2 неизбирательные (α2 НС) рецепторы, совместно инкубировали с празосином (специфическим лигандом α1 НС) и RX821002 (специфическим лигандом α2 НС) одновременно. Анализ проводили в трех повторах в буфере для анализа (50 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА/Трис, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ MgCl2 и 0,1% BSA) в полипропиленовых 96-луночных планшетах с глубокими лунками при 22°C. Сначала, 12 концентраций (в диапазоне от 0,1 нМ до 300 нМ) празосина и RX821002 совместно инкубировали в течение 60 минут при 22°C, с 3 концентрациями (200 мкг/лунку) препаратов крысиной кортикальной мембраны.

[00113] Неспецифическое связывание определяли посредством совместной инкубации с 10 мкМ WB 4101 и йохимбином.

[00114] Инкубацию останавливали посредством фильтрации после переноса всего объема реакционной смеси для связывания в планшет с фильтром. Оставшееся количество как празосина, так и RX821002 определяли посредством UHPLC-MS/MS.

Конкурентные масс-анализы связывания:

[00115] Анализы вытеснения лиганда проводили с использованием 12 концентраций конкурентных лигандов, WB4101 (ингибитора α1 НС) и йохимбина (ингибитора α2 НС) (в диапазоне от 0,1 нМ до 100 мкМ), и 0,3 нМ празосина и 1 нМ RX821002. Их совместно инкубировали с 200 мкг/лунку крысиной кортикальной мембраны в буфере для анализа, в трех повторах. Инкубацию останавливали посредством фильтрации после инкубации в течение 60 минут при 22°C. Оставшееся количество как празосина, так и RX821002 определяли посредством UHPLC-MS/MS как антагониста альфа-2-адренергического рецептора.

ПРИМЕР 4: Мультиплексирование различных молекул-мишеней

[00116] Фиг. 4A-K представляют собой серии графиков, показывающих результаты анализа одновременного связывания с использованием молекул-мишеней крысиного кортекса. Лиганды и тестируемые соединения показаны на каждой фигуре. Молекулы-мишени представляют собой следующие рецепторные молекулы: A1 (рецептор аденозина) (Фиг. 4A); M1 (мускариновый рецептор) (Фиг. 4B); 5-HT 2A (рецептор серотонина) (Фиг. 4C); Альфа 1 нс (адренергический рецептор) (Фиг. 4D); Альфа 2 нс (адренергический рецептор) (Фиг. 4E); D1 (дофаминовый рецептор) (Фиг. 4F); 5H-транс (рецептор серотонина) (Фиг. 4G); 5-HT2A рецептор (Фиг.4H); Ca++ канал (Фиг. 4I); опиоидный мю-рецептор (Фиг. 4J); PCP (опиоидный сигма-рецептор) (Фиг. 4K).

[00117] Как показано на фиг. 4A-K, 11 различных молекул-мишеней исследовали одновременно. Можно использовать различные ткани. Например, первая рецепторная молекула-мишень, рецептор аденозина A1, обнаружен также в гладкой мускулатуре в сосудистой системе.

[00118] Эксперимент на фиг. 4 A-K может быть обобщен следующим образом (Таблица 7):

Фигура Молекула-мишень Маркерный лиганд Тестируемое соединение 4A Рецептор аденозина A1 CPX NECA 4B Мускариновый рецептор ацетилхолина пирензепин Атропин 4C 5-HT2A (серотонина) 8-OH-DPAT Серотонин 4D Альфа-1A-адренергический рецептор Празосин WB4101 4E Альфа-2A-адренергический рецептор RX82102 Йохимбин 4F Дофаминовый рецептор D1 SCH23390 Бутакламол 4G 5HT транспортер пароксетин Зимелидин 4H 5-HT (серотонина) EMD281014 Серотонин 4I Ca++ канал D600 D888 4J Опиоидный рецептор налоксон DAMGO 4K PCP (опиоидный рецептор сигма-типа) MK801 SKF10047

Таблица 7

Материалы и способы:

Получение мембраны крысиного кортекса

[00119] Крысиные кортексы от самцов крыс Wistar собирали и переносили в 50 мМ Трис-HCl (pH, 7,4), и гомогенизировали посредством polyton. Гомогенат центрифугировали при 50000 g в течение 15 минут при 4°C. Полученный осадок промывали в буфере для лизиса, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH, 7,4), содержащий 1 мкг/мл лейпептина и 1 мкМ пепстатин, и центрифугировали при 50000 g в течение 15 минут при 4°C. Осадок наконец ресуспендировали в меньшем объеме буфера для лизиса, и конечную концентрацию белка определяли в соответствии со способом Бредфорд с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Фильтрация и элюция образцов

[00120] Инкубацию останавливали посредством фильтрации после переноса образца для связывания (аликвоты 200 мкл на лунку) в 96-луночные планшеты со стеклянным фильтром, и затем быстро фильтровали в вакууме, мембранную фракцию, связанную с фильтрами, промывали несколько раз буфером для промывки (50 мМ Трис-HCl и 150 мМ NaCl) в вакуумном коллекторе. Мембранные фильтры предварительно обрабатывали в течение 1 часа с использованием 50 мМ Трис/HCl и 0,3% раствора полиэтиленимина (PEI).

[00121] Фильтры сушили в течение одного часа при 50°C и охлаждали до комнатной температуры до элюции специфических лигандов с использованием ацетонитрила (содержащего 100 пМ антипирин в качестве внутреннего стандарта) посредством вакуумного коллектора. Относительную количественную оценку лиганда в каждом образце проводили посредством UHPLC-MS-MS, использовали отношение площади для лиганда и внутреннего стандарта.

Разработка способа UHPLC-MS/MS

[00122] Анализ UHPLC-QQQ проводили посредством системы 1290 Infinity Binary LC (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), соединенной с масс-спектрометром Q-TRAP 5500 с источником ионов ESI Turbo V (SCIEX, Foster City, CA, USA).

[00123] Хроматографическое разделение проводили на колонке C18 (Poroshell 120 EC-C18, Agilent). Объем инъекции составлял 20 мкл (инъекция с полным заполнением петли). Подвижная фаза состояла из двух растворов, включающих растворитель A (0,1% муравьиная кислота и 6 мМ ацетат аммония в воде) и растворитель B (0,1% муравьиная кислота и 6 мМ ацетат аммония в ацетонитриле), колонку термостатировали в печи при 35°C, и скорость потока составляла 650 мкл/мин.

[00124] Хроматографический градиент, используемый для колонки C18; начальный состав B составлял 0% в течение 0,3 мин и увеличивался до 80% от 0,3 до 0,9 мин, затем 100% достигали от 1 мин до 1,3 мин, с последующим повторным уравновешиванием до исходного состояния в течение 0,3 мин.

[00125] Для анализа MS, данные получали с использованием ионизации электрораспылением (ESI) в режиме определения положительных ионов, напряжение ионораспыления устанавливали на 5500 В. Десольватацию в источнике осуществляли с использованием следующих установленных параметров: температура (TEM) при 600 °C, источник ионов газа 1 (GS1) при 40 фунт/кв. дюйм (276 кПа), источник ионов газа 2 (GS2) при 50 фунт/кв. дюйм (345 кПа) и газовая завеса (CUR) при 50 фунт/кв. дюйм (345 кПа). Конкретные параметры способа MRM, позволяющие количественную оценку и мониторирование лигандов, описаны в таблице 8. Необработанные данные обрабатывали в Sciex Analyst, и индивидуальную AUC (площадь под кривой) для каждого аналита в каждом образце определяли с использованием программного обеспечения MultiQuant.

Q1, масса (Да) Q3, масса (Да) Время (мсек) ID DP
(вольт) EP
(вольт) CE
(вольт) CXP
(вольт) 305,200 263,100 150 CPX 100 10 32 11 352,200 113,000 150 ПИРЕНЗЕПИН 80 10 27 18 384,142 95,000 150 ПРАЗОСИН 196 10 77 14 235,100 203,100 150 RX821002 20 10 23 9 288,100 179,115 150 SCH23390 10 10 31 8 248,100 147,100 150 8-OH-DPAT 40 10 28 7 377,200 209,200 150 EMD281014 20 10 31 9 330,100 192,200 150 ПАРОКСЕТИН 40 10 29 8 485,500 165,100 150 D600 60 10 37 22 222,100 178,100 150 MK801 50 10 54 8 328,100 212,200 150 НАЛОКСОН 60 10 53 9

DP: потенциал декластеризации, EP: входной потенциал, CE: энергия соударения и CXP: напряжение на выходе ячейки соударений.

Таблица 8

Связывание посредством экспериментов MS

Конкурентные масс-анализы связывания:

[00126] Анализы вытеснения лиганда проводили с использованием препаратов крысиной кортикальной мембраны, естественным образом содержащей следующие рецепторы A1 (аденозина), M1 (мускариновый), Альфа1 нс (адренергический), Альфа2 нс (адренергический), D1 (дофаминовый), 5HT1a (серотонина), 5HT2a (серотонина), 5H-транс (серотонина), Ca²⁺ канал (участок для верапамила), глутаматный (неизбирательный) крысиный ионный канал и опиоидные неизбирательные рецепторы

Рецептор Используемые специфический лиганд/концентрация Ингибитор A1-аденозина CPX/1 нМ NECA M1--мускариновый ПИРЕНЗЕПИН/1 нМ атропин Альфа1 нс--адренергический ПРАЗОСИН/1 нМ WB 4101 Альфа2 нс-- адренергический RX821002/1 нМ Йохимбин D1-дофаминовый SCH23390/1 нМ Бутакламол 5HT1a -- серотонина 8-OH-DPAT/5 нМ серотонин 5HT2a--серотонина EMD281014/1 нМ серотонин 5H-транс--серотонина ПАРОКСЕТИН/1 нМ Зимелидин Cave (Ca канал) D600/1 нМ D888 PCP--опиоидный рецептор сигма-типа MK801/ 5 нМ SKF10047 Опиоидный нс НАЛОКСОН/1 нМ DAMGO

Таблица 9

[00127] Анализы вытеснения лиганда проводили с использованием 8 концентраций ингибитора (см. таблицу 9) (в диапазоне от 0,1 нМ до 100 мкМ) и смеси одной концентрации каждого специфического лиганда (см. таблицу 9). Их совместно инкубировали с 200 мкг/лунку крысиной кортикальной мембраны в буфере для анализа (50 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА/Трис, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ MgCl2 и 0,1% BSA), в трех повторах. Инкубацию останавливали посредством фильтрации после инкубации в течение 60 минут при 22°C. Оставшееся количество каждого специфического лиганда (см. таблицу 9) определяли посредством UHPLC-MS/MS.

ПРИМЕР 5: Мультиплексирование различных гетерологичных тканей - мембран ex vivo : крысиного кортекса, крысиного мозжечка и крысиной вентрикулярной ткани

[00128] В этом примере показано мультиплексирование анализа MS конкурентного связывания, как описано, но с различными тканями в одном и том же эксперименте.

[00129] Результаты показаны в таблице 10 ниже. Различные ткани использованы в этом примере. Иллюстративные источники тканей для рецепторных молекул-мишеней представляют собой церебральный кортекс, мозжечок и вентрикулярную мембрану (крысиные или человеческие). Анализы связывания, показанные в столбце 1, представляли собой A1, M1 и т.д. В каждом случае, добавляли известный лиганд (показанный как [лиганд] в столбце 2) и измеряли степень связывания с исследуемыми тканями. Известные (маркерные) лиганды являлись такими, как использовано в примере 4. Получали калибровочную кривую. Как показано ниже, SNR обозначает отношение сигнала к шуму, и %CV обозначает коэффициент изменчивости в процентах.

Анализ связывания Крысиный кортекс, 180мкг Мозжечок, 180 мкг Вентрикулярная (мембрана), 180 мкг A1 [лиганд]: нМ 0,1 1 5 SNR: 7 4,5 1,5 %CV 5,30 3,7 51,6 M1 [лиганд]: нМ 5 SNR: 17,5 %CV 6,5 Альфа 1 нс [лиганд]: нМ 0,1 0,1 0,1 SNR: 53,7 13,5 28,1 %CV 12 25,7 13,1 Альфа 2 нс [лиганд]: нМ 0,1 1 SNR: 51,3 11,2 %CV 4,2 6,5 D1 [лиганд]: нМ 1 SNR: 46,6 %CV 7,7 5HT1a [лиганд]: нМ 1 SNR: 4,1 %CV 32,7 5HT2a [лиганд]: нМ 0,1 0,1 1 SNR: 14,2 2,5 2,3 %CV 12,2 80,4 113,4 5HT-транс [лиганд]: нМ 0,1 0,1 0,1 SNR: 5 2,5 2,8 %CV 6,9 29,4 127,5 CAVE [лиганд]: нМ 1 0,1 SNR: 2,4 3,2 %CV 7 31,7 PCP [лиганд]: нМ 10 50 SNR: 2,2 2,4 %CV 26,9 27,4 ОПИОИДНЫЙ нс [лиганд]: нМ 1 SNR: 9,8 %CV 8,7

Таблица 10

ПРИМЕР 6: Мультиплексирование в одной лунке - масс-анализ связывания 20 лигандов в смесях крысиных мембран ex vivo или в смесях рекомбинантных мембран

[00130] В этом примере, различные ткани и/или рецепторные молекулы комбинируют в одной и той же лунке в одной реакции. Крысиный кортекс, мозжечок и вентрикулярную мембрану добавляют в одну лунку, и проводят серии реакций, с использованием лигандов, как показано в примере 5.

Материалы и способы:

Получение мембран ex vivo

[00131] Крысиные кортексы от самцов крыс Wistar собирают и переносят в 50 мМ Трис- HCl (pH, 7,4), и гомогенизируют посредством polyton. Гомогенат центрифугируют при 50000 g в течение 15 минут при 4°C. Полученный осадок промывают в буфере для лизиса, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH, 7,4), содержащий 1 мкг/мл лейпептина и 1 мкМ пепстатин, и центрифугируют при 50000 g в течение 15 минут при 4°C. Осадок наконец ресуспендируют в меньшем объеме буфера для лизиса, и конечную концентрацию белка определяют в соответствии со способом Бредфорд с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

[00132] Получение крысиного мозжечка, печеночной и вентрикулярной мембраны проводят, как описано выше.

Получение рекомбинантной мембраны

Культивирование клеток и экспрессия

[00133] Стабильную трансфекцию человеческой линии клеток проводят с использованием подходящего экспрессирующего вектора, содержащего кодирующие последовательности для представляющего интерес рецептора. Отдельные колонии стабильно трансфицированных клеток далее культивируют в селективных средах с использованием специфического антибиотика. Окончательный отбор клонов основан на аффинности связывания клонов для специфического лиганда.

Выделение мембран

[00134] Сухой осадок клеток клона из человеческих клеток, стабильно экспрессирующих представляющий интерес рецептор, ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, 5 мМ Трис-ЭДТА, 20 мМ NaCl, 1,5 мМ CaCl2, 5 мМ MgCl2, 10 мкг/мл ингибитор трипсина, 1 мкг/мл лейпептина, 75 мкг/мл PMSF). Клетки лизируют с использованием ультразвукового зонда (Sonifier 250, Branson). Лизат клеток центрифугируют при 50000 x g в течение 15 минут при 4°C. Осадок мембраны ресуспендируют в буфере для лизиса, содержащем 10% (об./об.) глицерин, и конечную концентрацию белка определяют в соответствии со способом Бредфорд с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Фильтрация и элюция образцов

[00135] Инкубацию останавливают посредством фильтрации после переноса образца для связывания (аликвоты 200 мкл на лунку) в 96-луночные планшеты со стеклянным фильтром, и затем быстро фильтруют в вакууме, мембранную фракцию, связанную с фильтрами, промывают несколько раз буфером для промывки (50 мМ Трис- HCl и 150 мМ NaCl) в вакуумном коллекторе. Мембранные фильтры предварительно обрабатывают в течение 1 часа с использованием 50 мМ Трис/HCl и 0,3% раствора полиэтиленимина (PEI).

[00136] Фильтры сушат в течение одного часа при 50°C и охлаждают до комнатной температуры до элюции специфических лигандов с использованием ацетонитрила (содержащего 100 пМ антипирин в качестве внутреннего стандарта) посредством вакуумного коллектора. Относительную количественную оценку лиганда в каждом образце проводят посредством UHPLC-MS-MS, используют отношение площади для лиганда и внутреннего стандарта.

Разработка способа UHPLC-MS/MS

[00137] Анализ UHPLC-QQQ проводят посредством системы 1290 Infinity Binary LC (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), соединенной с масс-спектрометром Q-TRAP 5500 с источником ионов ESI Turbo V (SCIEX, Foster City, CA, USA).

[00138] Хроматографическое разделение проводят на колонке C18 (Poroshell 120 EC-C18, Agilent). Объем инъекции составляет 20 мкл (инъекция с полным заполнением петли). Подвижная фаза состоит из двух растворов, включающих растворитель A (0,1% муравьиная кислота и 6 мМ ацетат аммония в воде) и растворитель B (0,1% муравьиная кислота и 6 мМ ацетат аммония в ацетонитриле), колонку термостатируют в печи при 35°C, и скорость потока составляет 650 мкл/мин.

[00139] Хроматографический градиент, используемый для колонки C18; начальный состав B составляет 0% в течение 0,3 мин и увеличивается до 80% от 0,3 до 0,9 мин, затем 100% достигают от 1 мин до 1,3 мин, с последующим повторным уравновешиванием до исходного состояния в течение 0,3 мин.

[00140] Для анализа MS, данные получают с использованием ионизации электрораспылением (ESI) в режиме определения положительных ионов, напряжение ионораспыления устанавливают на 5500 В. Десольватацию в источнике осуществляют с использованием следующих установленных параметров: температура (TEM) при 600°C, источник ионов газа 1 (GS1) при 40 фунт/кв. дюйм (276 кПа), источник ионов газа 2 (GS2) при 50 фунт/кв. дюйм (345 кПа) и газовая завеса (CUR) при 50 фунт/кв. дюйм (345 кПа). Конкретные параметры способа MRM, позволяющие количественную оценку и мониторирование лигандов, описаны в таблице 11. Необработанные данные обрабатывают в Sciex Analyst, и индивидуальную AUC (площадь под кривой) для каждого аналита в каждом образце определяют с использованием программного обеспечения MultiQuant.

Q1, масса (Да) Q3, масса (Да) Время (мсек) ID DP
(вольт) EP
(вольт) CE
(вольт) CXP
(вольт) 305,200 263,100 50 CPX 100 10 32 11 408,1 219,2 50 CGS 21680 131 10 35 10 300,2 270,2 50 AB-MECA 175 10 19 13 352,200 113,000 50 ПИРЕНЗЕПИН 80 10 27 18 479,3 240,1 50 AF-DX 384 120 10 28 9 384,142 95,000 50 ПРАЗОСИН 196 10 77 14 235,100 203,100 50 RX821002 20 10 23 9 288,100 179,115 50 SCH23390 10 10 31 8 356,2 325,2 50 Метилспиперон 90 10 15 13 248,100 147,100 50 8-OH-DPAT 40 10 28 7 377,200 209,200 50 EMD281014 20 10 31 9 330,100 192,200 50 ПАРОКСЕТИН 40 10 29 8 485,500 165,100 50 D600 60 10 37 22 222,100 178,100 50 MK801 50 10 54 8 328,100 212,100 50 НАЛОКСОН 60 10 53 9 1052,5 958,2 50 CGP 42112A 50 10 17 10 1060,6 938,5 50 Брадикинин 75 10 22 16 352,200 113,000 50 CP 55,940 80 10 27 18 1064,2 1001,2 50 CCK8 76 10 23 8 112,1 95,1 50 Гистамин 159 10 24 11 497,3 434,3 50 LTD4 125 10 26 17

DP: потенциал декластеризации, EP: входной потенциал, CE: энергия соударения и CXP: напряжение на выходе ячейки соударений.

Таблица 11

Связывание посредством экспериментов MS

Конкурентные масс-анализы связывания:

[00141] Анализы вытеснения лиганда проводят с использованием смесей из 4 различных мембран ex vivo из препаратов крысиного кортекса, мозжечка, вентрикулярной и печеночной мембраны. Равное количество каждого препарата мембраны ткани смешивают (50 мкг).

[00142] Кроме того, анализы вытеснения лиганда также проводят с использованием смеси 20 различных рекомбинантных мембран (см. таблицу 12), равные количества (10 мкг) каждого препарата мембраны смешивают.

Рецептор Специфический лиганд Ингибитор A1 CPX NECA A2A (h) CGS 21680 NECA A3 (h) AB-MECA IB-MECA M1 ПИРЕНЗЕПИН атропин M2 (h) AF-DX 384 4-DAMP Альфа1 нс ПРАЗОСИН WB 4101 Альфа2 нс RX821002 Йохимбин D1 SCH23390 Бутакламол D2S (h) Метилспиперон Бутакламол 5HT1a 8-OH-DPAT серотонин 5HT2a EMD281014 серотонин 5H-транс ПАРОКСЕТИН Зимелидин Cave D600 D888 PCP MK801 SKF10047 Опиоидный нс НАЛОКСОН DAMGO AT2 (h) CGP 42112A Ангиотензин II B2 (h) Брадикинин HOE 140 CB1 (h) CP 55,940 WIN 55,212-2 CCK1 (CCKA) CCK-8S SIB-CCK8 H4 (h) Гистамин PDGF-BB CysLT1 (LTD4) (h) LTD4 MK571

Таблица 12

[00143] Конкурентные масс-анализы связывания проводят с использованием 8 концентраций ингибиторов (см. таблицу 12) (в диапазоне от 0,1 нМ до 100 мкМ) и смеси одной концентрации каждого специфического лиганда (см. таблицу 12), в которой каждый лиганд присутствует при конечной концентрации 5 нМ. Их совместно инкубируют при 200 мкг/лунку либо смеси мембран ex vivo, либо смеси рекомбинантных мембран в буфере для анализа (50 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА/Трис, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ MgCl2 и 0,1% BSA), в трех повторах. Инкубацию останавливают посредством фильтрации после инкубации в течение 60 минут при 22°C. Оставшееся количество каждого специфического лиганда (см. таблицу) определяют посредством UHPLC-MS/MS.

ПРИМЕР 7: Мультиплексирование в одной лунке для тестирования безопасности

[00144] В этом примере, комбинацию различных типов тканей комбинируют в индивидуальных лунках, как показано в таблице 13 ниже:

Рецептор Ткань Известный Лиганд/субстрат GPCR, рецептор аденозина A1 Общераспространенный по всему организму. Аденозин циклооксигеназа 2 (COX2) синовиоциты, эндотелиальные клетки, хондроциты, остеобласты и моноциты/макрофаги, стимулированные с использованием цитокинов Арахидоновая кислота Моноаминоксидаза (MAO) Гипоталамус и гиппокампальный крючок Серотонин, мелатонин, норадреналин, адреналин Транспортер дофамина Головной мозг (черная субстанция) дофамин

Таблица 13

[00145] Вышеуказанные рецепторные молекулы-мишени можно получать из перечисленных тканей или продуцировать в клонированной клетке.

[00146] Материалы и способы осуществляют, как описано выше.

ПРИМЕР 8A, 8B: Фармакологическое определение K_on и K_off

[00147] Фиг. 5 представляет собой схематический технологический поток для использования MS для определения кинетики связывания тестируемого соединения с родственной ему рецепторной молекулой. Как показано, материал, содержащий молекулы-мишени (например, крысиный кортекс), инкубируют с лигандом и тестируемым соединением (на этой фигуре имипрамин и серотонин). Связавшиеся лиганды выделяют посредством способов, как описано выше, и определяют количество каждого лиганда. Как показано в фиг. 5, образец, содержащий по меньшей мере одну рецепторную молекулу-мишень (например, крысиный кортекс) сначала инкубируют 501 с лигандом и тестируемым соединением, например, имипрамином (5нМ) и серотонином (10 мкМ), соответственно, в буфере, содержащем Трис/HCl, NaCl, KCl и BSA. После инкубации, связанный комплекс рецептор-лиганд отделяют 502 посредством способов, как описано по настоящему изобретению. Выделенный комплекс лиганд-рецептор далее обрабатывают таким образом, чтобы отделить лиганд от связанной рецепторной молекулы-мишени, например, посредством использования ацетонитрила и стеклянного фильтра, позволяющего прохождение только несвязавшихся лигандов (503). После выделения связавшихся молекулы лигандов, из каждой лунки, в считывателе для множества планшетов 504 количественно оценивают 505 посредством жидкостной хроматографии/ESI-MS/MS с использованием калибровочной кривой для определения K_on и K_off.

[00148] Как показано на фиг. 5, буфер, лиганд (имипрамин) и неспецифическое связывающее вещество серотонин инкубируют в различных лунках. Отделение входящей в комплекс молекулы-мишени в крысином кортексе, транспортера серотонина (5-HT), проводят, как ранее. Комплекс разделяют с использованием акрилoнитрила, и отделенный серотонин измеряют посредством MS для определения K_on и K_off.

[00149] Фиг. 6A, 6B и 6C представляют собой серии графиков, показывающих результаты способа MS для определения кинетики связывания, K_on (Фиг. 6A) и кинетики диссоциации, K_off (Фиг. 6B и 6C). На фиг. 6B, кинетика диссоциации GABAB1b/2 от CGP54626, при концентрации 1 нМ способом вытеснения посредством добавления 10 мкМ CPG52432. Точки данных представляют специфическое связывание (средние +/- SD, n=2). На фиг. 6C показана кинетика диссоциации GABA_B1b/2 от CGP54626 при концентрации 5 нМ способом разведения. Точки данных представляют специфическое связывание (средние +/- SD, n=2).

[00150] На фиг. 6A показано определение кривой кинетики связывания и K_on посредством измерения специфического связывания с различными интервалами времени. На фиг. 6B показаны кривая кинетики диссоциации и K_off, полученные посредством измерения уменьшения специфического связывания лиганда с рецепторной молекулой-мишенью с течением времени. На фиг. 6C показана кинетика диссоциации, как измерено посредством разведения.

Пример 8A: K_on/_Koff GABA 1b

Культивирование клеток и экспрессия GABA_B1b/2

[00151] Стабильную трансфекцию линии клеток CHO-S проводили с использованием вектора pCi/neo (Promega), содержащего кодирующие последовательности для человеческого рецептора GABA B, состоящего из 2 звеньев 1b (NM_021903), так же как GABA 2 (NM_005458). Отдельные колонии стабильно трансфицированных клеток далее культивировали в селективных средах с использованием генетицина. Окончательный отбор клонов был основан на аффинности связывания клонов для ^3H[CGP54626].

Выделение мембран

[00152] Сухой осадок клеток клона из клеток CHO-S, стабильно экспрессирующих GABAB1b/2, ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, 5 мМ Трис-ЭДТА, 20 мМ NaCl, 1,5 мМ CaCl2, 5 мМ MgCl₂, 10 мкг/мл ингибитора трипсина, 1 мкг/мл лейпептин, 75 мкг/мл PMSF). Клетки лизировали с использованием ультразвукового зонда (Sonifier 250, Branson). Лизат клеток центрифугировали при 50000 x g в течение 15 минут при 4°C. Осадок мембраны ресуспендировали в буфере для лизиса, содержащем 10% (об./об.) глицерин и конечную концентрацию белка определяли в соответствии со способом Бредфорд с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Фильтрация и элюция образцов

[00153] Инкубацию останавливали посредством фильтрации после переноса образца для связывания (аликвоты 200 мкл на лунку) в 96-луночные планшеты со стеклянным фильтром, и затем быстро фильтровали в вакууме, мембранную фракцию, связанную с фильтрами, промывали несколько раз буфером для промывки (50 мМ Трис-HCl и 150 мМ NaCl) в вакуумном коллекторе. Мембранные фильтры предварительно обрабатывали в течение 1 часа с использованием 50 мМ Трис/HCl и 0,3% раствора полиэтиленимина (PEI).

[00154] Фильтры сушат в течение одного часа при 50°C и охлаждают до комнатной температуры до элюции CGP54626 с использованием ацетонитрила (содержащего 100 пМ антипирин в качестве внутреннего стандарта) посредством вакуумного коллектора. Относительную количественную оценку лиганда в каждом образце проводили посредством UHPLC-MS-MS, использовали отношение площади для лиганда и внутреннего стандарта.

Разработка способа UHPLC-MS/MS

[00155] Анализ UHPLC-QQQ проводили посредством системы 1290 Infinity Binary LC (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), соединенной с масс-спектрометром Q-TRAP 5500 с источником ионов ESI Turbo V (SCIEX, Foster City, CA, USA).

[00156] Хроматографическое разделение проводили на колонке C18 (Poroshell 120 EC-C18, Agilent). Объем инъекции составлял 20 мкл (инъекция с полным заполнением петли). Подвижная фаза состояла из двух растворов, включающих растворитель A (0,1% муравьиная кислота и 6 мМ ацетат аммония в воде) и растворитель B (0,1% муравьиная кислота и 6 мМ ацетат аммония в ацетонитриле), колонку термостатировали в печи при 35°C, и скорость потока составляла 650 мкл/мин.

[00157] Хроматографический градиент, используемый для колонки C18; начальный состав B составлял 0% в течение 0,3 мин и увеличивался до 80% от 0,3 до 0,9 мин, затем 100% достигали от 1 мин до 1,3 мин, с последующим повторным уравновешиванием до исходного состояния в течение 0,3 мин.

[00158] Для анализа MS, данные получали с использованием ионизации электрораспылением (ESI) в режиме определения положительных ионов, напряжение ионораспыления устанавливали на 5500 В. Десольватацию в источнике осуществляли с использованием следующих установленных параметров: температура (TEM) при 600 °C, источник ионов газа 1 (GS1) при 40 фунт/кв. дюйм (276 кПа), источник ионов газа 2 (GS2) при 50 фунт/кв. дюйм (345 кПа) и газовая завеса (CUR) при 50 фунт/кв. дюйм (345 кПа). Конкретные параметры способа MRM, позволяющие количественную оценку и мониторирование лигандов (CGP54626), описаны в таблице 14. Необработанные данные обрабатывали в Sciex Analyst, и индивидуальную AUC (площадь под кривой) для каждого аналита в каждом образце определяли с использованием программного обеспечения MultiQuant.

Q1, масса (Да) Q3, масса (Да) Время (мсек) ID DP
(вольт) EP
(вольт) CE
(вольт) CXP
(вольт) 408,1 236,0 150 CGP54626-1 131 10 27 10 408,1 219,2 150 CGP54626-2 131 10 35 10

DP: потенциал декластеризации, EP: входной потенциал, CE: энергия соударения и CXP: напряжение на выходе ячейки соударений.

Таблица 14

Связывание посредством экспериментов MS

Определение оптимальной концентрации рецептора и лиганда

[00159] Препараты мембраны, содержащие GABA_B1b/2 и CGP54626, инкубировали в трех повторах в буфере для анализа (50 мМ Трис-HCl, 2,5 мМ CaCl2, 10 мкг/мл трипсина, 1 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл пепстатина) в полипропиленовых 96-луночных планшетах с глубокими лунками при 22°C. Сначала, 6 концентраций (0,1, 0,5, 1, 3, 5, 10, 25 и 50 нМ) CGP54626 (Tocris, ref: 1088) совместно инкубировали в течение 60 минут при 22°C, с 3 концентрациями (45, 100 и 180 мкг/лунку) рекомбинантного рецептора GABA_B1b/2.

[00160] Неспецифическое связывание определяли посредством совместной инкубации с 10 мкМ CGP52432.

[00161] Инкубацию останавливали посредством фильтрации после переноса всего объема реакционной смеси для связывания в планшет с фильтром. Оставшееся количество CGP54626 определяли посредством UHPLC-MS/MS.

Для анализов насыщения:

[00162] Аликвоты мембраны, содержащие 10-180 мкг белка GABA_B1b/2, инкубировали в трех повторах в присутствии 1 нМ CGP54626 в общем объеме 200 мкл буфера для анализа. Инкубацию останавливали посредством фильтрации после инкубации в течение 60 минут при 22°C.

[00163] Неспецифическое связывание определяли посредством совместной инкубации с 10 мкМ CGP52432

[00164] Инкубацию останавливали посредством фильтрации после переноса всего объема реакционной смеси для связывания в планшет с фильтром. Оставшееся количество CGP54626 определяли посредством UHPLC-MS/MS.

Масс-анализы связывания (K_on):

[00165] Аликвоты мембраны, содержащие 22,5 мкг/100 мкл мембранного белка GABAB1b/2, инкубировали в общем объеме 2000 мкл буфера для анализа при 22°C с 1 нМ CGP54626. В каждой временной точке, 200 мкл реакционной смеси отбирали, инкубацию останавливали посредством фильтрации. Оставшееся количество CGP54626 определяли посредством UHPLC-MS/MS. См. фиг. 6A.

[00166] Неспецифическое связывание определяли посредством совместной инкубации с 10 мкМ CGP52432.

Конкурентные масс-анализы связывания:

[00167] Анализы вытеснения лиганда проводили с использованием восьми концентраций конкурентного лиганда, CGP52432 (в диапазоне от 1 нМ до 30 мкМ), GABA (в диапазоне от 10 нМ до 1 мМ) и баклофена (в диапазоне от 10 нМ до 1 мМ). Их совместно инкубировали с 45 мкг/лунку мембранного белка GABAB1b/2 и 1 нМ CGP54626 в буфере для анализа, в трех повторах. Инкубацию останавливали посредством фильтрации после инкубации в течение 60 минут при 22°C. Оставшееся количество CGP54626 определяли посредством UHPLC-MS/MS.

Масс-анализы связывания-диссоциации - вытеснение.

[00168] Аликвоты мембраны, содержащие 22,5 мкг/100 мкл мембранного белка GABA_B1b/2, инкубировали в общем объеме 2000 мкл буфера для анализа при 22°C с использованием 1 нМ CGP54626. Реакции позволяли достичь равновесия в течение 60 минут до начала диссоциации посредством добавления 10 мкМ CPG52432. Диссоциацию останавливали в определенных интервалах времени (1-80 минут) посредством фильтрации 200 мкл реакционной смеси. Образцы для каждой временной точки подготавливали в двух повторах. Оставшееся количество CGP54626 определяли посредством UHPLC-MS/MS. См. фиг. 6B.

Масс-анализы связывания-диссоциации - способ разведения

[00169] Для определения константы K_off посредством разведения, 112,5 мкг/100 мкл мембранного белка GABA_B1b/2 инкубировали с 5 нМ CGP54626 при 22°C в течение 60 минут. Аликвоту 22 мкл отбирали и добавляли в 2178 мкл буфера для анализа, получая в результате разведение 1:100. Диссоциацию останавливали посредством фильтрации через определенные интервалы времени (1-80 минут). Образцы для каждой временной точки подготавливали в двух повторах. Оставшееся количество CGP54626 определяли посредством UHPLC-MS. См. фиг. 6C.

Пример 8B: Эксперименты связывания посредством масс-спектрометрии, мультиплексирующие определение k_on/k_off либо в одной мембране ex vivo , либо в смесях мембран ex vivo , альтернативно, в смесях рекомбинантных мембран

Получение смесей мембран

[00170] Определения K_on и K_off проводят либо на крысиной кортекальной мембране, либо с использованием смесей из 4 различных мембран ex vivo из препаратов крысиного кортекса, мозжечка, вентрикулярной и печеночной мембраны. Равное количество каждого препарата мембраны ткани смешивают (50 мкг). Кроме того, определения K_on и K_off также проводят с использованием смеси 20 различных рекомбинантных мембран (см. таблицу 15), равные количества каждого препарата мембраны смешивают (10 мкг).

Рецептор Специфический лиганд Ингибитор A1 CPX NECA A2A (h) CGS 21680 NECA A3 (h) AB-MECA IB-MECA M1 ПИРЕНЗЕПИН атропин M2 (h) AF-DX 384 4-DAMP Альфа1 нс ПРАЗОСИН WB 4101 Альфа2 нс RX821002 Йохимбин D1 SCH23390 Бутакламол D2S (h) Метилспиперон Бутакламол 5HT1a 8-OH-DPAT серотонин 5HT2a EMD281014 серотонин 5H-транс ПАРОКСЕТИН Зимелидин Cave D600 D888 PCP MK801 SKF10047 Опиоидный нс НАЛОКСОН DAMGO AT2 (h) CGP 42112A Ангиотензин II B2 (h) Брадикинин HOE 140 CB1 (h) CP 55,940 WIN 55,212-2 CCK1 (CCKA) CCK-8S SIB-CCK8 H4 (h) Гистамин PDGF-BB CysLT1 (LTD4) (h) LTD4 MK571

Таблица 15

Масс-анализы связывания (K_on):

[00171] Аликвоты мембраны, содержащие 22,5 мкг/100 мкл смеси каждого мембранного белка инкубируют в общем объеме 2000 мкл буфера для анализа при 22°C со смесью специфических лигандов (см. таблицу 15), каждый при конечной концентрации 1 нМ. В каждой временной точке 200 мкл реакционной смеси отбирают, инкубацию останавливают посредством фильтрации. Оставшееся количество каждого специфического лиганда (см. таблицу) определяют посредством UHPLC-MS/MS.

[00172] Неспецифическое связывание определяют посредством совместной инкубации со смесью специфических ингибиторов (см. таблицу), каждый в конечной концентрации 10 мкМ.

Масс-анализы связывания-диссоциии - вытеснение

[00173] Аликвоты мембраны, содержащие 22,5 мкг/100 мкл смеси каждого мембранного белка инкубируют в общем объеме 2000 мкл буфера для анализа при 22°C со смесью специфических лигандов (см. таблицу 15), каждый при конечной концентрации 1 нМ. Реакции позволяли достичь равновесия в течение 60 минут до начала диссоциации посредством добавления смеси специфических ингибиторов (см. таблицу), каждый в конечной концентрации 10 мкМ. Диссоциацию останавливали в определенных интервалах времени (1-80 минут) посредством фильтрации 200 мкл реакционной смеси. Образцы для каждой временной точки подготавливали в двух повторах. Оставшееся количество каждого специфического лиганда определяли посредством UHPLC- MS/MS.

Масс-анализы связывания-диссоциации - способ разведения

[00174] Для определения константы K_off посредством разведения, 112,5 мкг/100 мкл смеси каждого мембранного белка инкубируют со смесью специфических лигандов (см. таблицу), каждый при конечной концентрации 1 нМ, и инкубируют при 22°C в течение 60 минут. Аликвоту 22 мкл отбирали и добавляли к 2178 мкл буфера для анализа, получая в результате разведение 1:100. Диссоциацию останавливали посредством фильтрации через определенные интервалы времени (1-80 минут). Образцы для каждой временной точки подготавливали в двух повторах. Оставшееся количество каждого специфического лиганда определяют посредством UHPLC-MS/MS.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

[00175] Приведенное выше конкретное описание предназначено для приведения примеров и иллюстрации изобретения, и его не следует рассматривать как ограничивающее объем изобретения, который ограничен буквальным и эквивалентным объемом прилагаемой формулы изобретения. Любые патенты или публикации, упомянутые в настоящем описании, предназначены для передачи деталей способов и материалов, которые можно использовать для осуществления конкретных аспектов изобретения, которые могут не быть явно указаны, но которые могут являться понятными для специалистов в данной области. Содержание таких патентов или публикаций, таким образом, приведено в качестве ссылки в той же степени, как если бы каждое являлась конкретно и индивидуально приведенным в качестве ссылки и содержалось в настоящем описании, как необходимо для цели описания и обеспечения возможности осуществления способа или материала, на которые ссылаются.

[00176] Предшествующее просто иллюстрирует принципы настоящего описания. Понятно, что специалист в данной области является способным разрабатывать различные аранжировки, которые, хотя и не описаны или не показаны явно в настоящем описании, воплощают принципы изобретения и включены в его содержание и объем. Кроме того, все примеры и условные выражения, процитированные в настоящем описании, принципиально предназначены для облегчения понимания читателем вклада принципов изобретения и концепций авторов настоящего изобретения в продвижение в данной области, и их следует рассматривать как не ограничивающие такие специфически перечисленные примеры и условия. Кроме того, все утверждения в настоящем описании, перечисляющие принципы, аспекты и варианты осуществления изобретения, так же как его конкретные примеры, предназначены для включения как структурных, так и функциональных его эквивалентов. Кроме того, подразумевают, что такие эквиваленты включают как известные в настоящее время эквиваленты, так и эквиваленты, которые будут разработаны в будущем, т.е., любые разработанные элементы, осуществляющие такую же функцию, независимо от структуры. Объем настоящего изобретения, таким образом, не предназначен для ограничения иллюстративных вариантов осуществления, показанных и описанных в настоящем описании.

Группа изобретений относится к способам оценки аффинности лигандов для специфической рецепторной молекулы-мишени. Раскрыт мультиплексный способ количественной оценки связывания тестируемого соединения с предопределенной молекулой-мишенью и с нецелевыми молекулами, включающий стадии: (a) получения смеси молекул-мишеней из неочищенного экстракта; (b) инкубации указанной смеси молекул-мишеней во множестве смесей лигандов и тестируемых соединений; (c) удаления несвязавшихся лигандов из указанного множества смеси молекул-мишеней; (d) выделения лигандов, связанных с указанными молекулами-мишенями в указанной смеси молекул-мишеней; (e) определения количества указанного лиганда, связанного молекулой-мишенью, с использованием масс-спектрометрии и калибровочной кривой; (f) определения аффинности тестируемого соединения для указанных молекул-мишеней; (g) измерения связывания указанного тестируемого соединения с предопределенной молекулой-мишенью и сравнения указанного связывания со связыванием указанного тестируемого соединения с нецелевыми молекулами; (h) расчета K_on и K_off указанного тестируемого соединения для указанной молекулы-мишени. Также раскрыты мультиплексные способы количественной оценки аффинности связывания и мультиплексный способ определения K_on и/или K_off. Группа изобретений обеспечивает мультиплексный способ оценки аффинности связывания тестируемых соединений. 4 н. и 22 з.п. ф-лы, 6 ил., 15 табл., 8 пр.

1. Мультиплексный способ количественной оценки связывания тестируемого соединения с предопределенной молекулой-мишенью и с нецелевыми молекулами, включающий стадии:

(a) получения смеси молекул-мишеней из неочищенного экстракта из по меньшей мере одной из (i) здоровой или нездоровой человеческой или не относящейся к человеку ткани, и (ii) препарата синтетического белка, где указанные молекулы-мишени присутствуют в смеси молекул-мишеней, которые не существуют в природе в одном и том же препарате ткани;

(b) инкубации указанной смеси молекул-мишеней во множестве смесей лигандов и тестируемых соединений, где указанные молекулы-мишени связываются с различными лигандами;

(c) удаления несвязавшихся лигандов из указанного множества смеси молекул-мишеней;

(d) выделения лигандов, связанных с указанными молекулами-мишенями в указанной смеси молекул-мишеней;

(e) определения количества указанного лиганда, связанного молекулой-мишенью, посредством измерения лигандов, полученных на стадии (d), в определенные моменты времени в реакционной смеси, с использованием масс-спектрометрии и калибровочной кривой;

(f) определения аффинности тестируемого соединения для указанных молекул-мишеней в указанной смеси указанных молекул-мишеней с использованием данных, полученных на стадии (e);

(g) измерения связывания указанного тестируемого соединения с предопределенной молекулой-мишенью и сравнения указанного связывания со связыванием указанного тестируемого соединения с нецелевыми молекулами; и

(h) расчета K_on и K_off указанного тестируемого соединения для указанной молекулы-мишени с использованием данных, полученных на стадии (e).

2. Способ по п. 1, где указанная смесь молекул-мишеней дополнительно содержит гетерологичную смесь указанных молекул-мишеней, где указанная гетерологичная смесь указанных молекул-мишеней представляет собой или

(a) смесь различных молекул-мишеней, отсутствующих в природе в одном препарате ткани; или

(b) смесь различных молекул-мишеней, присутствующих в одной ткани, где каждая молекула-мишень имеет биологическую функцию, отличную от другой молекулы-мишени, присутствующей в указанной смеси различных молекул-мишеней.

3. Способ по п. 1 или 2, где указанная смесь молекул-мишеней содержит мишени, представляющие собой человеческие молекулы-мишени.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где стадия (c) включает удаление несвязавшихся лигандов из указанного множества смесей с использованием стеклянного фильтра.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где стадия (d) включает элюцию связанных лигандов с фильтра с использованием растворителя, затем концентрирование образцов с фильтра.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где стадия (e) с использованием масс-спектроскопии включает использование жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением.

7. Способ по п. 1, где K_off определяют посредством способа вытеснения.

8. Способ по п. 1, где K_off определяют посредством способа разведения.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где указанные молекулы-мишени выбраны из по меньшей мере одной группы из группы, состоящей из: Na+ каналов, альфа-1-бета-адренорецепторов, альфа-2-бета-адренорецепторов, рецептора аденозина A1, мускаринового рецептора M1, рецептора серотонина 5-HT_2A, адренергического рецептора Альфа 1 нс, адренергического Альфа 2 нс, дофаминового рецептора D1 и рецептора серотонина 5H-транс.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где лиганды представляют собой по меньшей мере один лиганд, выбранный из группы, состоящей из: CPX, пирензепина, празосина, RX821002, SCH233900, 8-OH-DPAT, EMD281014, пароксетина, D600, MK801 и налоксона.

11. Мультиплексный способ количественной оценки аффинности связывания по меньшей мере двух различных тестируемых соединений (тестируемого соединения C1-C_n) по меньшей мере с двумя различными рецепторными молекулами-мишенями (рецептором RT1 для C1, RT_n для C_n), на основании конкурентного связывания между тестируемыми соединениями и известными связывающими веществами для RT1 и RT_n известным связывающим веществом B1 для RT1 и B_n для RT_n, соответственно, включающий:

(a) получение смеси из неочищенного экстракта, содержащей (i) тестируемые соединения C1-C_n; (ii) известные связывающие вещества B1-B_n и (iii) рецепторные молекулы-мишени RT1-RT_n, где RT1-RT_n не существуют в природе в одном и том же препарате ткани;

(b) обеспечение возможности формирования комплексов в указанной смеси между тестируемыми соединениями C1-C_n, RT1-RT_n и B1-B_n;

(c) отделение тестируемых соединений, которые не формируют комплексы со своими молекулами-мишенями, от указанных комплексов;

(d) выделение известных связывающих веществ из комплексов, полученных на стадии (c), и пропускание выделенных связывающих веществ через масс-спектрометр для измерения связывания тестируемых соединений с использованием масс-спектроскопии; и

(e) определение относительных аффинностей соединений C1-C_n для RT1-RT_n, соответственно, где C_n, B_n и RT_n представляют серии членов, где n составляет между 2 и 40.

12. Способ по п. 11, где указанные рецепторные молекулы-мишени получают из мембран ex vivo из по меньшей мере двух из препаратов мембраны: препаратов мембраны кортекса, препаратов мембраны мозжечка, вентрикулярных препаратов мембраны и печеночных препаратов мембраны.

13. Способ по любому из пп. 11 или 12, где указанная стадия получения рецепторных молекул-мишеней RT1-RT_n включает получение человеческих рецепторных молекул-мишеней.

14. Способ по любому из пп. 11-13, где стадия (c) включает отделение с использованием стеклянного фильтра и промывки.

15. Способ по любому из пп. 11-14, где стадия (d) включает элюцию связанного лиганда с фильтра с использованием растворителя, затем концентрирование образцов с фильтра.

16. Способ по любому из пп. 11-15, где указанная масс-спектроскопия включает использование жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением.

17. Способ по любому из пп. 11-16, дополнительно включающий стадию определения K_on и K_off тестируемого соединения для молекулы-мишени.

18. Мультиплексный способ количественной оценки аффинности связывания тестируемого соединения с молекулой-мишенью, включающий стадии:

(a) получения по меньшей мере трех молекул-мишеней из неочищенного экстракта, как указано на схеме ниже

Молекула-мишень Рецептор аденозина A1 Мускариновый рецептор ацетилхолина Серотонин 5-HT_2A Альфа-1A-адренергический рецептор Альфа-2A-адренергический рецептор Дофаминовый рецептор D1 Транспортер 5HT Рецептор 5HT1a Рецептор 5HT2a Ca канал Cave Рецептор PCP Опиоидный рецептор

(b) инкубации указанных молекул-мишеней во множестве смесей лигандов и тестируемых соединений, где указанные молекулы-мишени связываются с различными лигандами,

(c) удаления несвязавшихся лигандов из смесей;

(d) выделения лигандов, связанных с указанными молекулами-мишенями, после инкубации;

(e) определения количества каждого лиганда, присутствующего на указанных молекулах-мишенях, посредством измерения лигандов, полученных на стадии (d), в определенные моменты времени в реакционной смеси, с использованием масс-спектрометрии и калибровочной кривой, полученной с использованием известных концентраций лиганда;

(f) расчета аффинности тестируемого соединения для молекулы-мишени из данных, полученных на стадии (e); и

(g) расчета K_on и K_off указанного тестируемого соединения для указанной молекулы-мишени с использованием данных, полученных на стадии (e).

19. Способ по п. 18, где одинаковое тестируемое соединение используют с каждой молекулой-мишенью.

20. Способ по п. 18, включающий использование следующих молекул-мишеней и лигандов:

Молекула-мишень Лиганд Рецептор аденозина A1 CPX Мускариновый рецептор ацетилхолина M1 пирензепин Серотонин 5-HT_2A EMD281014 Альфа-1A-адренергический рецептор Празосин Альфа-2A-адренергический рецептор RX82102 Дофаминовый рецептор D1 SCH23390 Транспортер 5HT пароксетин Рецептор 5HT1a 8-OH-DPAT Рецептор 5HT2a EMD281014 Ca канал Cave D600 Рецептор PCP MK801 Опиоидный рецептор налоксон

21. Мультиплексный способ определения значений K_on и/или K_off тестируемого соединения для молекулы-мишени, включающий стадии:

(a) получения смеси молекул-мишеней из неочищенного экстракта из по меньшей мере одной из (i) здоровой или нездоровой человеческой или не относящейся к человеку ткани, и (ii) препарата синтетического белка, где указанные молекулы-мишени присутствуют в смеси молекул-мишеней, которые не существуют в природе в одном и том же препарате ткани;

(b) инкубации указанных молекул-мишеней во множестве смесей лигандов и тестируемых соединений, где указанные молекулы-мишени связываются с различными лигандами;

(c) удаления несвязавшихся лигандов из смесей молекул-мишеней;

(d) выделения лигандов, связанных с указанными молекулами-мишенями;

(e) определения количества указанного лиганда, связанного молекулой-мишенью, посредством измерения лигандов, полученных на стадии (d) в определенных временных точках в реакционной смеси, с использованием масс-спектрометрии и калибровочной кривой; и

(f) расчета K_on или K_off тестируемого соединения для молекулы-мишени с использованием данных, полученных на стадии (e).

22. Способ по п. 21, где K_on и K_off определяют в смесях мембран, содержащих различные мембраны ex vivo, с по меньшей мере двумя из препаратов мембраны: препаратов мембраны кортекса, препаратов мембраны мозжечка, вентрикулярных препаратов мембраны и печеночных препаратов мембраны.

23. Способ по п. 22, где указанные смеси мембран содержат по меньшей мере два из рецепторов A1, A2A, A3, M1, M2, Альфа 1 нс, Альфа 2 нс, D1, D2S, 5HT1a, 5HT2a, 5HT-транс, Cave, PCP, опиоидного нс, AT2, B2, CB1, CCK1, H4, и CysLT1.

24. Способ по п. 23, где смеси мембран содержат все из перечисленных рецепторов.

25. Способ по любому из пп. 21-24, где K_off определяют посредством способа вытеснения.

26. Способ по любому из пп. 21-25, где K_off определяют посредством способа разведения.