Устройство для определения летучих алкилфенолов в водных средах Российский патент 2024 года по МПК G01N27/49 G01N27/327 B82Y5/00 

Устройство для определения летучих алкилфенолов в водных средах относится к области экологической экспертизы состояния окружающей среды и может быть использовано для контроля процессов очистки сточной воды централизованных систем водоотведения. Ввиду сложности и продолжительности стандартного метода, при котором время анализа одной пробы составляет 6 часов [ПНДФ 14.1:2.105-97. Методика выполнения измерений массовой концентрации летучих фенолов в природных и очищенных сточных водах фотометрическим методом после отгонки с водяным паром. - М.: 1997. - 19 с] разработка экспресс-анализаторов наиболее актуальна.

Известно устройство для экспресс-мониторинга фенольного индекса [Лаврова Т.В. и др. Адаптация бактериальных штаммов Pseudomonas putida BS394 (pBS216) и Pseudomonas veronii DSM 11331^T как основа формирования биосенсора для определения фенольного индекса // экотоксикология -2021. - 2021. - с. 122-124]. Устройство содержит пластмассовый корпус, в его полости располагается платиновый проводник, погруженный в угольную пасту на основе минерального масла и графитовой пудры, рабочая поверхность покрыта редокс-слоем - модифицированной угольной пасты на основе ферроцена, далее нанесен слой иммобилизованных адаптированных к фенолу бактерий Pseoudomonas putida BS394 (pBS216), которые зафиксированы диализной мембраной с помощью пластикового кольца. Нижняя граница определяемых концентраций фенола составляет 0,5 мг/дм³, время анализа одной пробы составляет 15 минут, число регистрируемых субстратов 16, включая легкоокисляемые субстраты, не входящие в фенольный индекс, долговременная стабильность - 8 суток.

Существенным недостатком устройства является низкая долговременная стабильность - 8 суток, в течение указанного непродолжительного периода можно хранить устройство после изготовления, т.е. фактически устройство необходимость изготавливать непосредственного перед анализом проб.

Наиболее близким по своим признакам, принятое за прототип, является устройство для определения фенольного индекса в водных средах [Устройство для определения фенольного индекса в водных средах: пат. ПМ№217965 Рос. Федерация: МПК C12Q 1/02, G01N 33/18 / Перчиков Р.Н., Провоторова Д.В., Харькова А. С., Арляпов В.А.; патентообладатель Федеральное государственное образовательное учреждение высшего образования «Тульский государственный университет» (ТулГУ) - №2022132782; заявл. 13.12.2022; опубл. 26.04.2023, бюл. №12; Perchikov R. N. et at. Bioanalytical System for Determining the Phenol Index Based on Pseudomonas putida BS394 (pBS216) Bacteria Immobilized in a Redox-Active Biocompatible Composite Polymer "Bovine Serum Albumin-Ferrocene-Carbon Nanotubes" // Polymers. - 2022. - T. 14. - I. 24. - №. 5366]. Устройство содержит пластмассовый корпус, в его полости располагается платиновый проводник, погруженный в угольную пасту на основе минерального масла и графитовой пудры, рабочая поверхность покрыта редокс-слоем на основе композитного материала, содержащего углеродные нанотрубки и модифицированный ферроценкарбоксальдегидом бычий сывороточный альбумин, далее нанесен слой иммобилизованного биоматериала - адаптированных к фенолу бактерий Pseoudomonas putida В S394 (pBS216), который зафиксирован диализной мембраной с помощью пластикового кольца. Устройство позволяет определять фенол в концентрациях от 0,001 мг/дм³, время анализа одной пробы составляет 10 минут, долговременная стабильность - 11 суток, относительное стандартное отклонение серии 14 последовательных аналитических сигналов составляет 15%, число регистрируемых субстратов 7, включая пять легкоокисляемых субстратов (изопропанол, 2-метилпропанол-2, сорбит, глицин, цистеин), не входящих в фенольный индекс. Замена редокс-слоя с модифицированной угольной пасты на основе ферроцена (аналог) на композитный материал, содержащий углеродные нанотрубки и модифицированный ферроценкарбоксальдегидом бычий сывороточный альбумин (прототип) позволило предотвратить вымывание электро-активного ферроцена из аналитической системы, увеличивая долговременную стабильность устройства и изменяя число регистрируемых легкоокисляемых субстратов, формируя более селективный аналитический сигнал по отношению к фенолу и его производным. Недостатком прототипа является низкая стабильность аналитического сигнала, что приводит к высокому относительному стандартному отклонению серии 14 последовательных аналитических сигналов, низкой долговременной стабильности и высокому числу легкоокисляемых субстратов, при введении которых генерируются ложно-положительный сигнал.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является улучшение технических характеристик устройства для определения летучих алкилфенолов в водных средах, в частности повышения стабильности получаемого аналитического сигнала.

Данная задача решается за счет того, что заявленное устройство для определения летучих алкилфенолов в водных средах содержит платиновый проводник, погруженный в угольную пасту на основе минерального масла и графитовой пудры, рабочая поверхность которой покрыта редокс-слоем на основе углеродных нанотрубок и модифицированного бычьего сывороточного альбумина. На редокс-слой нанесен слой иммобилизованного биоматериала, которые зафиксированы диализной мембраной с помощью пластикового кольца, причем редокс-слой сформирован из последовательно нанесенных слоев углеродных нанотрубок и модифицированного сафранином О бычьего сывороточного альбумина, в качестве биоматериала использован фермент тирозиназа.

На иллюстрации показано устройство для определения летучих алкилфенолов в водных средах. В таблице представлены характеристики прототипа и заявляемого устройства для определения летучих алкилфенолов в водных средах.

Технический результат заявляемого устройства заключается в улучшении технических характеристик, за счет повышения стабильности получаемого аналитического сигнала, в частности, относительное стандартное отклонение серии 14 последовательных аналитических сигналов уменьшается с 15% (прототип) до 10% (заявляемое техническое решение), увеличена долговременная стабильность с 11 суток (прототип) до 22 суток (заявляемое техническое решение), заявляемое техническое решение не генерирует сигнал при введении легкоокисляемых субстратов (изопропанол, 2-метилпропанол-2, сорбит, глицин, цистеин), на которые прототип давал ложно-положительный сигнал. При этом устройство позволяет определять сумму летучих алкилфенолов в пересчете на фенол, значение концентрации которых более 0,5 мг/дм³.

Стабилизация сигнала при последовательных измерениях, связанная с величиной относительного стандартного отклонения последовательных измерений, является следствием формирования редокс-слоя послойным нанесением углеродных нанотрубок и редокс-активного полимера модифицированного сафранином О бычьего сывороточного альбумина. В тонких электрокаталитических слоях определяющую роль в формировании аналитического сигнала оказывает скорость ферментативных реакций в приэлектродном пространстве и, таким образом, разброс результатов анализа определяется изменением активности фермента, любые флуктуации рН внутри слоя изменяют активность биоматериала и вызывают разброс результатов измерений. Увеличение толщины редокс-слоя снижает роль кинетической составляющей генерации аналитического сигнала, приводя к увеличению влияния диффузии субстрата на формирование аналитического сигнала, минимизируя влияние флуктуаций рН на аналитический сигнал [Stikoniene О., Ivanauskas F., Laurinavicius V. The influence of external factors on the operational stability of the biosensor response // Talanta. - 2010. - T. 81. - №.4-5. - C. 1245-1249].

Увеличение долговременной стабильности обусловлено использованием в составе редокс-слоя модифицированного сафранином О бычьего сывороточного альбумина. При модификации бычьего сывороточного альбумина производными феназина (заявляемое техническое решение) количество электроактивного вещества в редокс-полимере меньше, чем при модификации ферроценкарбоксальдегидом (прототип) [Arlyapov V. A., Kharkova A.S., Kurbanaliyeva S.K., Kuznetsova L.S., Machulin A. V., Tarasov S.E., Melnikov P. V., Ponamoreva O.N., Alferov V.A., Reshetilov A.N. Use of biocompatible redox-active polymers based on carbon nanotubes and modified organic matrices for development of a highly sensitive BOD biosensor // Enzyme and Microbial Technology. - 2021. - V. 143. - No. 109706], низкое содержание редокс-частиц в полимере оказывает менее токсичное влияние на биоматериал, что увеличивает долговременную стабильность.

Отсутствие сигнала при введении легкоокисляемых субстратов (изопропанола, 2-метилпропанола-2, сорбита, глицина, цистеина) связано с использованием в качестве иммобилизованного биоматериала фермента тирозиназы, которая в отличие от клеток микроорганизмов не катализирует реакции окисления указанных субстратов [Zolghadri S. et al. A comprehensive review on tyrosinase inhibitors // Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry. - 2019. - T. 34. -№. 1. - C. 279-309].

Заявляемое устройство состоит из следующих элементов: пластмассового корпуса 1; платинового проводника 2; угольной пасты 3 на основе минерального масла и графитовой пудры; редокс-слоя 4, состоящего из углеродных нанотрубок 5 и модифицированного сафранином О бычьего сывороточного альбумина 6; иммобилизованного биоматериала - фермента тирозиназы 7; диализной мембраны 8 и пластикового кольца 9.

Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является повышение стабильности получаемого аналитического сигнала, в частности, снижение относительного стандартного отклонения серии последовательных аналитических сигналов, увеличение долговременной стабильности, сокращение влияния мешающих компонентов легкоокисляемых субстратов (изопропанол, 2-метилпропанол-2, сорбит, глицин, цистеин) на аналитический сигнал, что связано с использованием редокс-слоя, состоящего из углеродных нанотрубок и модифицированного сафранином О бычьего сывороточного альбумина, и иммобилизованного биоматериала - фермента тирозиназы.

Устройство собирают следующим образом: готовят угольную пасту 3 следующего состава: графитовая пудра - 100 мг, минеральное масло - 40 мкл. Угольной пастой 3 заполняют пластмассовый корпус 1. Платиновый проводник 2 погружают в угольную пасту 3. Затем поверхность электрода модифицируют редокс-слоем 4, для этого поверхность угольной пасты 3 покрывают 10 мкл суспензии углеродных нанотрубок 5, сформированной на основе 0,25 г дисперсии на водной основе 2,5% (масс.) одностенных улеродных нанотрубок, растровенных в 1 мл деионизационной воды. Затем наносят редокс-активный полимер на основе модифицированного сафранином О бычьего сывороточного альбумина 6. Для этого в 50 мкл фосфатного буферного раствора с рН=6,8 растворяют 0,0035 г бычьего сывороточного альбумина, добавляют 5 мкл водного насыщенного раствора сафранина О, тщательно перемешивают, затем добавляют 7,5 мкл глутарового альдегида, перемешивают не более 30 секунд и в количестве 10 мкл добавляют к нанесенному слою углеродных нанотрубок 5. Слой модифицированного сафранином О бычьего сывороточного альбумина 6 высушивают при комнатной температуре. Поверх редокс-слоя 4 наносят раствор фермента тирозиназы 7 250 мг/см³, 10 мкл, высушивают и закрепляют на электроде диализной мембраной 8 с помощью пластикового кольца 9.

Принцип работы устройства для определения летучих алкилфенолов в водных средах заключается в следующем: для регистрации аналитического сигнала используют измерительную кювету объемом 5 мл, содержащую калий-натрий фосфатный буферный раствор (рН=7,8). В измерительную кювету погружают хлорсеребряный электрод и пластмассовый корпус 1 устройства, таким образом, чтобы калий-натрий фосфатный буферный раствор контактировал с иммобилизованным биоматериалом - ферментом тиразиназой 7, который расположен на поверхности редокс-слоя 4, состоящего из углеродных нанотрубок 5 и модифицированного сафранином О бычьего сывороточного альбумина 6. Биоматериал - фермент тиразиназа 7 - зафиксирована диализной мембраной 8 с помощью пластикового кольца 9.

Устройство посредством платинового проводника 2 подключают к гальванопотенциостату «Cortest», регистрирующего зависимость силы тока от времени. К потенциостату подключают хлорсеребряный электрод. Измерения проводят при постоянном потенциале +350 мВ и непрерывном перемешивании раствора с помощью магнитной мешалки (300 об/мин) при комнатной температуре.

После установления стабильного уровня тока в измерительную кювету микропипеткой вводят необходимое количество раствора анализируемого вещества. После каждого измерения производят промывку измерительной кюветы калий-натрий фосфатный буферный раствор (рН=7,8). Скорость окисления фенола и его гомологов рассчитывают по амплитуде силы тока (ответ сенсора, ΔI, мкА) и определяют концентрацию летучих алкилфенолов, в пересчете на фенол, по предварительно построенной с помощью стандартного раствора фенола калибровочной кривой.

Таким образом, заявляемое устройство для определения летучих алкилфенолов в водных средах позволяет определять содержание летучих алкилфенолов в водных средах, генерируя стабильный аналитический сигнал: относительное стандартное отклонение серии 14 последовательных аналитических сигналов уменьшается 10%, долговременная стабильность - 22 суток, при этом устройство не генерирует ложно-положительные сигналы при введении легкоокисляемых субстратов, таких как изопропанол, 2-метилпропанол-2, сорбит, глицин, цистеин. Нижняя граница определяемых концентраций устройства для определения летучих алкилфенолов в водных средах составляет 0,5 мг/дм³, что позволяет проводить мониторинг качества сточных вод централизованных систем водоотведения, для которых установлена предельно-допустимая концентрация суммы фенолов - 5 мг/дм³ [Постановление Правительства РФ от 29.07.2013 N644 (ред. от 30.11.2021) "Об утверждении Правил холодного водоснабжения и водоотведения и о внесении изменений в некоторые акты Правительства Российской Федерации". Приложение №5 к Правилам холодного водоснабжения и водоотведения].

Изобретение относится к области экологической экспертизы состояния окружающей среды. Раскрыто устройство для определения летучих алкилфенолов в водных средах, содержащее платиновый проводник, погруженный в угольную пасту на основе минерального масла и графитовой пудры, рабочая поверхность которой покрыта редокс-слоем на основе углеродных нанотрубок и модифицированного бычьего сывороточного альбумина, на редокс-слой нанесен слой иммобилизованного биоматериала, который зафиксирован диализной мембраной с помощью пластикового кольца. При этом редокс-слой сформирован из последовательно нанесенных слоев углеродных нанотрубок и модифицированного сафранином О бычьего сывороточного альбумина, в качестве биоматериала использован фермент тирозиназа. Изобретение обеспечивает повышение стабильности получаемого аналитического сигнала, в частности снижение относительного стандартного отклонения серии последовательных аналитических сигналов, увеличение долговременной стабильности и уменьшение влияния мешающих компонентов легкоокисляемых субстратов на аналитический сигнал. 1 ил., 1 табл.

Устройство для определения летучих алкилфенолов в водных средах, содержащее платиновый проводник, погруженный в угольную пасту на основе минерального масла и графитовой пудры, рабочая поверхность которой покрыта редокс-слоем на основе углеродных нанотрубок и модифицированного бычьего сывороточного альбумина, на редокс-слой нанесен слой иммобилизованного биоматериала, который зафиксирован диализной мембраной с помощью пластикового кольца, отличающееся тем, что редокс-слой сформирован из последовательно нанесенных слоев углеродных нанотрубок и модифицированного сафранином О бычьего сывороточного альбумина, в качестве биоматериала использован фермент тирозиназа.