СПОСОБ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ТОКСИКОДЕРМИИ С ПОРАЖЕНИЕМ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА Российский патент 2025 года по МПК A61K31/455 A61P43/00 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к терапевтической стоматологии, экспериментальной токсикологии и гистологии, и может быть использовано для моделирования на лабораторных крысах токсического поражения слизистой оболочки полости рта с целью изучения возможностей лечения и профилактики его развития.

Актуальность. В клинических рекомендациях, утвержденных Российским обществом дерматовенерологов и косметологов, дается определение нозологической формы заболевания: Токсидермия (синоним: токсикодермия, токсико-аллергический дерматит) - острое воспалительное заболевание кожных покровов, а иногда и слизистых оболочек, развивающееся под действием гематогенного распространения аллергена, поступившего в организм пероральным, ингаляторным, внутривенным, подкожным, внутримышечным, интравагинальным путями.

Указано, что токсикодермии чаще всего развиваются в качестве побочного действия лекарственных средств. В большинстве случаев развитие токсикодермий связано с поступлением в организм антибактериальных препаратов пенициллиновой и цефалоспориной групп, сульфаниламидов, противоэпилептических средств и аллопуринола. Развитие заболевания ассоциируется с преобладанием CD4 и CD8 Т-лифмоцитов, гиперчувствительностью замедленного типа [Токсикодермия: Федеральные Клинические рекомендации по ведению больных токсикодермиями / Российское общество дерматовенерологов и косметологов. - М., 2015].

Наличие незначительного количества аллергоатопических реакций среди пациентов подтверждает то, что механизм развития токсикодермии включает два компонента: токсический - побочные эффекты лекарственных препаратов, их кумуляция, псевдоаллергии, метаболические нарушения и аллергический [Анализ факторов риска, этиологии и клинических проявлений токсикодермии / Е.В. Файзуллина, А.Р. Усманова, Д.Н. Губаева, Ю.В. Давыдов, Р.Ф. Хакимова, Р.Г. Кузнецова // Инновационные технологии в медицине. Практическая медицина. - 2014. - Т. 1, № 4 (80). - С. 134-140].

При описании токсидермий используют морфологические признаки (пятнистая, папулезная, макулопапулезная, везикулезная, буллезная, узловатая, пигментная, пурпурозная, буллезно-геморрагическия токсидермия) или сравнение с клиническими проявлениями других дерматозов (по типу аллергического васкулита или многоформной экссудативной эритемы). Токсидермия по типу многоформной экссудативной эритемы, в том числе буллезной, может быть клиническим проявлением непереносимости различных лекарственных средств, в том числе антигистаминных, а также развиваться при отравлении оксидом углерода и бензином, при алиментарных расстройствах. При этом самыми тяжелыми осложнениями токсидермии по типу многоформной экссудативной эритемы выделяют синдром Стивенса-Джонсона и синдром Лайелла [Токсикодермия: Федеральные Клинические рекомендации по ведению больных токсикодермиями / Российское общество дерматовенерологов и косметологов. - М., 2015].

Для синдрома Стивенса-Джонсона характерны: острое начало, лихорадка, насморк, конъюнктивит, прогрессирующая экзантема в виде безболезненных темно-красных пятен, папул, везикул со склонностью к слиянию. Пузыри серозно-кровянистого содержимого не содержат.

Характерным гистологическим признаком токсического эпидермального некролиза является некроз эпидермиса с последующей его отслойкой от дермы. Дерма в очагах поражения интактна, но может отмечаться отек, полиморфные периваскулярные лимфоцитарные инфильтраты с примесью гистиоцитов, реже плазматических клеток, эозинофилов, полиморфно-ядерных лейкоцитов. Обнаруживается вакуолизация и некроз кератиноцитов базального слоя, некроз отдельных клеток в толще эпидермиса. Вследствие акантолиза происходит отслойка верхних слоев эпидермиса.

Основным клиническим признаком синдрома Лайелла является буллезное поражение более 30% поверхности кожных покровов с последующим некротическим отторжением эпидермиса, метаболические нарушения и поражения внутренних органов.

Риск возникновения токсикодермии считают высоким (3-5% случаев) при применении препаратов группы пенициллина, карбамазепина, аллопуринола, препаратов золота; средним - при применении сульфаниламидов, пероральных сахароснижающих средств, диуретиков, нестероидных противовоспалительных препаратов, изониазида, хлорамфеникола, эритромицина, стрептомицина; низким - при использовании барбитуратов, бензодиазепина, фенотиазина, тетрациклина [Мельникова И.Ю. Токсико-аллергический дерматит у детей / И.Ю. Мельникова, В.М. Шайтор // Вопросы современной педиатрии. - 2008. - Т. 7, № 4. - С. 68-74].

Буллезная токсидермия может быть похожа на многоформную экссудативную эритему. Однако преимущественная локализация на кистях и стопах, отсутствие указаний на предшествующий прием лекарств, возникновение высыпаний на фоне простудного заболевания, сезонность рецидивов свидетельствуют в пользу многоформной экссудативной эритемы [Токсикодермия: Федеральные Клинические рекомендации по ведению больных токсикодермиями / Российское общество дерматовенерологов и косметологов. - М., 2015].

Таким образом, многоформная экссудативная эритема и токсикодермии, в том числе синдром Стивенса-Джонсона и синдром Лайелла, в настоящее время большинством авторов признаются различными нозологическими формами заболеваний, отличающимися друг от друга клинической и гистологической картинами, а также патогенезом. Однако для токсикодермии и токсико-аллергической формы МЭЭ общим является участие в патогенезе токсико-аллергического фактора. Следует подчеркнуть, что поражение слизистой оболочки однозначно признается критерием тяжести заболевания.

Для изучения возможности профилактики и лечения токсикодермии с поражением слизистой оболочки полости рта представляется важным создание модели такого поражения в эксперименте на животных. Изучение научной литературы не выявило существования такой модели.

Известны химически индуцированные экспериментальные модели болезни Крона и язвенного колита, основанные на введении в желудочно-кишечный тракт с питьевой водой 3-10% раствора декстрана сульфата натрия (ДСН), либо ректально тринитробензолсульфоновой кислоты (ТНБС), динитробензолсульфоновой кислоты (ДНБС), 4% или 10% раствора уксусной кислоты [Осиков М.В., Симонян Е.В., Бакеева А.Е., Костина А.А. Экспериментальное моделирование болезни крона и язвенного колита // Современные проблемы науки и образования. - 2016. - № 4; URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=25072 (дата обращения: 03.04.2024)].

Общим недостатком этих моделей является поражение только кишечника, слизистая оболочка пасти экспериментальных животных не поражается. Недостатком введения ДСН с питьевой водой является дороговизна и невозможность точного дозирования препарата, следствием чего является вариабельность повреждений слизистой стенки кишечника по глубине и площади распространения. При использовании ДНБС и ТНБС симптоматика также варьирует в зависимости от используемых животных, частоты введения, дозы препаратов. Применение 10% уксусной кислоты часто ведет к осложнениям: кишечным кровотечениям, развитию перфорации стенки кишки и перитониту, что приводит к летальным исходам экспериментальных животных [Осиков М.В., Симонян Е.В., Бакеева А.Е., Костина А.А. Экспериментальное моделирование болезни крона и язвенного колита // Современные проблемы науки и образования. - 2016. - № 4; URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=25072 (дата обращения: 03.04.2024)].

Известен также способ моделирования неспецифического язвенного колита путем внутрипросветного введения в слепую кишку экспериментального животного 45-50% спиртового раствора пикрилсульфоновой кислоты в дозе 0,8-1,0 мл/кг, 1-1,5% водного раствора метиленового синего в дозе 1,5-2,0 мл/кг и индерала в дозе 0,5-1,0 мг/кг [Способ моделирования неспецифического язвенного колита: патент 2316055 Российская Федерация, МПК G09B 23/28 / А.Э. Лычкова; заявитель и правообладатель А.Э. Лычкова. - № 2006112133/14A; заявл. 13.04.2006; опубл. 27.01.2008]. Недостатком способа также является поражение только кишечника, слизистая оболочка пасти экспериментальных животных не поражается, сложность выполнения: необходимость нембуталового наркоза для введения растворов в слепую кишку крыс.

Известен способ экспериментального моделирования предопухолевых поражений слизистой оболочки полости рта путем сочетанного местного воздействия на слизистую оболочку (СО) канцерогеном и механической травмой [Карпук Н.А., Рубникович С.П., Медведев М.Н. Экспериментальная модель предопухолевых поражений слизистой оболочки ротовой полости. Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия медицинских наук. 2023; 20 (1):7 1-81. https://doi.org/10.29235/1814-6023-2023-20-1-71-81 (дата обращения: 03.04.2024)]. В результате отмечаются гистопатологические изменения слизистой оболочки в форме гиперплазии, гиперкератоза и дисплазии разной степени тяжести, характерные для предопухолевых поражений слизистой оболочки, не для воспалительных поражений.

Известен способ моделирования экспериментального рецидивирующего герпетического стоматита, заключающийся во внутрибрюшинном введении экспериментальным животным (мышам) герпесвирусной суспензии в дозе 1LD₅₀ после предварительного (за 2 часа) введения 0,2 мл гидрокортизона, через 21 день производят повторное инфицирование животных путем скарификации слизистой оболочки пасти и внесения в место повреждения 30 мкл суспензии ВПГ-1 в дозе 1 LD₅₀ [Способ моделирования экспериментального рецидивирующего герпетического стоматита: патент 2709842 Российская Федерация, МПК G09B 23/28 / А.Е. Антушевич, А.Г. Климов, А.Н. Гребенюк, А.А. Ярцева, А.В. Болехан, А.В. Степанов, Н.В. Цыган; заявитель и правообладатель Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова. - № 2018143670; заявл. 10.12.2018; опубл. 23.12.2019].

Недостатками способа являются сложность, длительность и необходимость использования живой культуры вирусов герпеса.

Известен способ моделирования кандидозного стоматита путем обработки слизистой оболочки пасти мышей ежедневно в течение 7-10 дней кортикостероидным препаратом в количестве 5 стандартных доз с последующим заражением животных, вводя в поилку с водой суспензию клеток грибов рода Cаndida [Способ моделирования кандидозного стоматита: патент SU1469515, МПК G09B 23/28 / В.Л. Быков, З.О. Караев. - № 3965204; заявл. 19.08.1985; опубл. 30.03.1989], а также способ моделирования кандидозных поражений путем помещения крыс и мышей на 3-5-е сутки после рождения в ванночку с суспензией клеток грибов рода Cаndida на срок до 4 суток Cаndida [Способ моделирования кандидозных поражений: патент SU1400611, МПК G09B 23/28, А61В10/ В.Л. Быков, З.О. Караев. - № 3860496; заявл. 20.02.1985; опубл. 07.06.1988].

Недостатками способа являются сложность, длительность и необходимость использования живой культуры грибов рода Cаndida.

Прототипом изобретения является известный способ получения модели стоматита путем иммунизации полуторамесячных крыс антигенной смесью, состоящей из равных частей гомогенизированной гомологичной ткани слизистой оболочки пасти животных и стимулятора, состоящего из вазелина и ланолина с добавлением автоклавированной сухой вакцины БЦЖ, для чего к стимулятору добавляют в количестве 1% от его объема автоклавированную ткань слизистой оболочки пасти крыс, эту антигенную смесь в количестве 1 мл вводят животным двукратно подкожно с интервалом в 8 суток, на 30-35 дни эксперимента развивается изолированное поражение слизистой оболочки пасти у животных, не отягощенное какой-либо другой патологией и имеющее конкретную, а именно аутоиммунную, основу [Cпособ получения модели стоматита: патент 606169SU, МПК G09B 23/28 /А.И. Марченко, В.Е. Скляр, О.И. Сукманский, А.Н. Намятый. - № 2387944; заявл. 22.07.1976; опубл. 05.05.1978].

Достоинством способа достижение чисто аутоиммунного механизма развития поражения слизистой оболочки пасти экспериментальных животных без какого-либо местного химического или механического воздействия. Недостатками способа являются сложность, длительность и необходимость забоя животных для забора слизистой оболочки пасти с целью приготовления антигенной смеси в количестве 1 особь на 2 экспериментальных особи.

Известен также способ получения состава для моделирования афтозного стоматита у животных. Получают гомогенат ткани слизистой оболочки пасти животных, смешивая ее с равным количеством физиологического раствора и измельчая в гомогенизаторе, и смешивают его в соотношении 1:1 со стимулятором, состоящим из вазелинового масла, ланолина и автоклавированной сухой вакцины ВЦЖ. Гомогенат перед смешиванием со стимулятором подвергают двукратному центрифугированию с последующими периодами отстоя. После первого периода отстоя удаляют верхнюю прозрачную фракцию гомогената. Оставшийся состав повторно центрифугируют и отстаивают. После чего верхнюю фракцию отделяют и смешивают со стимулятором, в который предварительно добавляют автоклавированную высушенную нижнюю фракцию гомологичной ткани. Первое и второе центрифугирование проводят при различных частотах вращения [Способ получения состава для моделирования афтозного стоматита у животных: патент 2104588 Российская Федерация, МПК G09B 23/28 / Т.С. Чемикосова, В.В. Сперанский, Е.К. Алехин, Г.Г. Мингазов: заявитель и правоообладатель Чемикосова Т.С. - № 96122663/13; заявл. 28.11.1996; опубл. 10.02.1998].

Недостатками способа также являются сложность, длительность и необходимость забоя животных для забора слизистой оболочки пасти с целью приготовления состава.

Техническим результатом изобретения является достижение воспроизводимой экспериментальной токсикодермии слизистой оболочки пасти экспериментальных животных.

Технический результат достигается тем, что крысам-самцам осуществляют ежедневное внутримышечное введение раствора изониазида в дозе 60 мг/кг в течение 14 суток. После этого при проведении патоморфологического исследования отмечают поражение слизистой оболочки пасти экспериментальных животных, проявляющееся в виде папул и пузырьков.

Изобретение поясняется следующими фигурами. При проведении гистологического исследования определяют характерные для токсикодермии явления акантолиза эпителия, образование везикул (фиг. 1). На фиг.2 представлен эпителий слизистой оболочки щеки, пораженной токсидермией, с характерными для токсидермии явлениями гибели эпителиоцитов шиповатого слоя. На фиг. 3 показана для сравнения слизистая оболочка щеки крысы в норме.

Работа выполнена на белых беспородных крысах-самцах (36 голов). При проведении исследования соблюдали правила экспериментальной работы с использованием лабораторных животных [Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. НП объединение специалистов по работе с лабораторными животными. Санкт-Петербург: Rus-LASA, 2012]. Выведение животных из эксперимента осуществляли путем передозировки раствора тилетамина+золазепама (Золетил 100, Virbak, Франция).

Животных подразделили на группы (n=6 в группе): контроль 1, интоксикация 1, контроль 2, интоксикация 2, контроль 3, интоксикация 3.

Животным групп интоксикация 1, интоксикация 2, интоксикация 3 внутримышечно вводили раствор изониазида в дозах 20, 40 и 60 мг/кг соответственно, один раз в сутки, в течение 14 суток. Животным контрольных групп вводили стерильный физиологический раствор в эквивалентных объёмах.

На 14 сутки после воздействия животных выводили из эксперимента, исследовали ткани щеки (слизистую оболочку и мышцу). Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

Состояние животных, подвергшихся воздействию изониазида, в течение 14 суток наблюдения не отличалось от животных групп контроль. При проведении патоморфологического исследования у 83±17% животных группы интоксикация 3 определили появление на слизистой оболочке пасти многочисленных элементов поражения в форме папул и пузырьков. Схожие изменения определили у 17±17% животных группы интоксикация 2. У животных контрольных групп и группы интоксикация 1 патоморфологических изменений в исследуемой области выявлено не было (таблица 1). Доля животных, у которых сформировались патоморфологические изменения, была выше по сравнению с животными группы контроль 3 (р=0,004) и интоксикация 2 (р=0,17).

Таблица 1 - Патоморфологические изменения в слизистой оболочке пасти крыс, выявленные на 14 сутки после введения раствора изониазида в различных концентрациях

Группа n, голов N, голов X±s_x, % Контроль 1 6 0 0±17 Интоксикация 1 6 0 0±17 Контроль 2 6 0 0±17 Интоксикация 2 6 1 17±17 Контроль 3 6 0 0±17 Интоксикация 3 6 5 83±17* Примечания: n - количество животных в группе; N - количество животных, у которых выявили изменения; * - различия значимы по сравнению с контролем 3, p<0,05.

На гистологическом препарате щеки экспериментального животного (фиг. 1) визуализируется утолщение и расслоение слоев эпителия слизистой оболочки полости рта (явления акантолиза), образование везикул. Отмечается миграция тучных клеток в верхние слои слизистой оболочки к базальной мембране эпителия. Расслоение поперечнополосатой мышечной ткани щеки, вакуольная дистрофия саркоплазмы мышечных волокон. Выявляется поперечная и продольная деструкция симпластов. Лейкоцитарная инфильтрация выражена слабо, отмечаются единичные лимфоциты. Выявлена дегрануляция тучных клеток в слизистой оболочке щеки.

В эпителии слизистой оболочки щеки (фиг. 2) встречаются гибнущие шиповатые эпителиоциты. Из внутренних слоев слизистой оболочки к базальной мембране эпидермиса отмечается миграция тучных клеток, лимфоцитов и фибробластов, что свидетельствует о продолжающемся воспалительном процессе. Выявляется вакуолизация tunica media в крупных сосудах, нарушение целостности эндотелия, разрушение внутренней эластической мембраны, деструкция наружной оболочки сосудов.

На фиг. 3, представляющей гистологическую картину слизистой оболочки щеки крысы в норме, описанные выше явления отсутствуют.

Таким образом, предлагаемый способ экспериментального моделирования токсикодермии с поражением слизистой оболочки полости рта обеспечивает формирование макроскопической и гистологической картины поражения слизистой оболочки пасти экспериментальных животных, имеющей общие черты с токсикодермией с поражением слизистой оболочки полости рта человека.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к терапевтической стоматологии, экспериментальной токсикологии и гистологии. Белым крысам ежедневно внутримышечно вводят раствор изониазида в дозе 60 мг/кг на протяжении 14 суток. Способ обеспечивает формирование макроскопической и гистологической картины токсикодермии с поражением слизистой оболочки пасти экспериментальных животных, что, в свою очередь, дает возможность изучить способы лечения и профилактики токсикодермии. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ экспериментального моделирования токсикодермии с поражением слизистой оболочки полости рта, отличающийся тем, что производят ежедневное введение белым крысам на протяжении 14 суток раствора изониазида в дозе 60 мг/кг внутримышечно.