Рекомбинантная плазмида pET21-GST-ND, обеспечивающая синтез и секрецию эктодомена Gn гликопротеина вируса Хантаан, и рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21-GST-ND - продуцент белка Gn - эктодомена гликопротеина вируса Хантаан Российский патент 2023 года по МПК C12N15/33 C12N15/70 C12N1/21 A61P31/14 C12R1/19 

Изобретение относится к рекомбинантной плазмиде pET21-GST-ND, обеспечивающей синтез и секрецию белка Gn, рекомбинантной плазмиде pET21-GST-ND, обеспечивающей синтез и секрецию белка Gn, - эктодоменов гликопротеина вируса Хантаан и рекомбинантному штамму Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21-GST-ND - продуценту белка Gn и может быть использовано в молекулярной генетике и биотехнологии для получения субъединичной вакцины.

Уровень техники. Вирус Хантаан (HTNV) является причиной возникновения у человека геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), характеризующейся высокой степенью летальности и тяжестью протекания болезни [1]. Для борьбы с ГЛПС разработано множество средств профилактики и терапии:

а) цельновирионные и инактивированные вакцины, широко распространенные в Китае (бивалентная вакцина против HTNV и вируса Сеул [2]) и Южной Корее (Hantavax™ [3]). В Российской Федерации прошла доклинические испытания бивалентная, цельновирионная, инактивированная, концентрированная, сорбированная вакцина «КомбиГЛПС-Вак» [4]. Цельновирионные и инактивированные вакцины являются эффективным методом борьбы с ГЛПС, однако процесс их производства трудозатратен, инактивированный вирус не обеспечивает высокого уровня антител и длительного иммунитета [5, 6].

б) для профилактики хантавирусных инфекций разрабатываются ДНК-вакцины, кодирующие преимущественно М, а также S сегмент вирусного генома. Основным преимуществом ДНК-вакцин является безопасность, недостатком - невысокая иммуногенность [5-7].

в) антитела против хантавирусов. На данный момент нет одобренных препаратов антител для терапии ГЛПС, однако в лабораторных исследованиях показали высокую специфичность и протективность антитела 3D8 [8], SAB-159 [9], М7, Y5, Y22 [5].

г) Одним из перспективных направлений в разработке вакцинных препаратов является создание субъединичных вакцин с использованием эктодоменов рекомбинантных гликопротеинов Gn и Gc, вызывающих появление нейтрализующих антител у иммунизированных животных [10, 11].

Основными преимуществами субъединичных белковых вакцин являются безопасность и простота производства, высокие титры нейтрализующих антител [2]. Основной недостаток - ограниченность систем наработки рекомбинантных белков Gn и Gc. В большинстве случаев эти белки нарабатываются в бакуловирусной системе, что представляет собой трудоемкий процесс. Токсичность Gn и Gc для бактериальных клеток затрудняет их наработку в Е. coli [12, 13].

Ближайшие аналоги. Известен способ получения рекомбинантного антигена G2 (Gc) Хантавируса Добрава в клетках E.coli (патент РФ №2509805, МПК C12N 15/70, опубл. 20.03.2014 г.) с характеристиками, позволяющими улучшить воспроизводимость и чувствительность иммуноферментного анализа при диагностике ГЛПС. В качестве антигена авторы использовали рекомбинантный антиген НТ-Δ12, представляющий собой фрагмент белка G2 хантавируса Добрава, сохраняющий иммуногенность полноразмерного продукта, но не проявляющий токсичности по отношению к клеткам продуцента. Особенностью плазмидной конструкции, кодирующей белок G2, является наличие гена мини-домена фолдона фибритина колифага JS98C3, стабилизирующего глобулярную структуру белка G2, что повышает растворимость последнего и его конечный выход.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения рекомбинантного антигена G2 (Gc) вируса Добрава в клетках E.coli (патент РФ №2495938, МПК C12N 15/70, опубл. 20.10.2013 г.). Для получения указанного антигена авторами получена ДНК конструкция рНК6, кодирующая слитой белок из трех частей, где N-концевое положение занимает зеленый флуоресцентный белок GFP, центральное - пептид длиной 73 а.о. с последовательностью аминокислот SRKKCNFATTPICEYDGNMVSGYKKVMATIDSFQAFNTSYIHYTDEQIEWKDPDGMLKDHLNILVTKDIDFDT, а концевое - легкая цепь двуцепочечного белкового ингибитора типа Кунитца из клубней картофеля. Культивируют трансформированные данной конструкцией клетки E.coli, лизируют биомассу, отделяют нерастворимую фракцию лизата, продукт экспрессии в форме телец включения солюбилизируют, проводят хроматографическую очистку. Используют полученный продукт для выявления специфических антител в сыворотке больных ГЛПС. Достоинством изобретения является увеличенный выход рекомбинантного антигена G2 хантавируса Добрава в клетках E.coli.

Представленные выше аналог и прототип позволяют получать белок G2 (Gc) вируса Добрава в клетках E.coli. Однако в азиатской части России ввиду территориальной близости с Китаем существует угроза заражения вирусом Хантаан, что требует создания аналогичных средств профилактики заболеваний, вызванных этим вирусом. Из литературы известно, что и белок G1 (Gn) и белок G2 (Gc) хантавирусов обладают схожей иммуногенностью [2], поэтому в качестве иммуногена возможно использование обоих белков или один из них. Также авторами указанных изобретений использованы фрагменты белка G2 (Gc) вируса Добрава. В заявляемом изобретении в отличие от аналога и прототипа использован полноразмерный ген белка Gn.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание плазмидной генетической конструкции pET21-GST-ND, обеспечивающей синтез и секрецию целевого полноразмерного белка Gn - эктодомена гликопротеина вируса Хантаан, распространенного в дальневосточном регионе России, и рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21(DE3)pLysE рЕТ21-GST-ND - продуцента белка Gn - эктодомена гликопротеина вируса Хантаан.

Указанный технический результат достигается тем, что плазмидная генетическая конструкция pET21-GST-ND, обеспечивающая синтез и секрецию целевого белка Gn - эктодомена гликопротеина вируса Хантаан в клетках E.coli, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на аиг.1, следующие элементы:

- f1 ori (12-467 п.н.) представляет собой фаговый ori, который обеспечивает репликацию и упаковку одноцепочечной ДНК в фаговые частицы;

- ген устойчивости к антибиотику ампициллин AmpR (599-1459 п.н.) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину AmpR promoter (494-598 п.н.), позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в E.coli;

- участок начала репликации ori (1630-2218 п. н.);

- rop (2648-2839 п.н.) - димерный белок, участвующий в механизме, контролирующем количество копий плазмиды;

- lacI (3648-4730) lacI promoter (4731-4808 п. н.);

- Т7 promoter (5115-5135 п.н.) - сильный промотор, обеспечивающий высокий уровень транскрипции;

- lac operator (5136-5160 п.н.);

- RBS (5191-5196 п.н.) - сайт связывания рибосомы;

- GST (5205-5857 п.н.) - ген белка-помощника глутатион-S-трансферазы из Scihistosoma japonicum, обеспечивающий выход целевого белка в периплазму;

- ND (5865-7184 п.н.) - ген, кодирующий эктодомен Gn гликопротеина вируса Хантаан;

- MCS (7237-7241 п.н.) - мультиклональный сайт;

- 6xHis (7242-7259 п.н.) для хроматографической очистки.

Указанный технический результат достигается созданием рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21-GST-ND -продуцента белка Gn - эктодомена гликопротеина вируса Хантаан, полученного трансформацией рекомбинантной плазмидой рЕТ21-GST-ND, и депонированного в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером В-1385.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами. На фиг. 1 представлена физическая и генетическая карта плазмидной конструкции pET21-GST-ND. На фиг. 2 представлены результаты дот-блот анализа. Полученный белок Gn взаимодействует с сывороткой переболевшего вирусом Хантаан. Gc - взаимодействие с белком Gc, Gn -взаимодействие с белком Gn, К+ - положительный контроль, человеческое антитело 15742, против вируса Эбола, К- - отрицательный контроль, культуральная среда. На фиг. 3 представлена электрофореграмма разделения хроматографических фракций в 15% ПААГ: 1 - балластные (примесные) белки, полученные при очистке Gc, не связавшиеся с сорбентом (проскок нанесения), 2 - фракция примесных белков, полученная при очистке Gc, после промывки колонки промывочными буферами А, В, С, 3 - фракция целевого белка Gc, элюирующий буфер содержит 500 мМ имидазола, 4 - фракция целевого белка Gc, элюирующий буфер содержит 150 мМ имидазола, М - маркер молекулярного веса, 5 - фракция целевого белка Gn, элюирующий буфер содержит 150 мМ имидазола, 6 - фракция целевого белка Gn, элюирующий буфер содержит 500 мМ имидазола, 7 - фракция примесных белков, полученная при очистке Gn, после промывки колонки промывочными буферами А, В, С, 8 - балластные (примесные) белки, полученные при очистке Gn, не связавшиеся с сорбентом (проскок нанесения).

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры (1-4) его осуществления.

Пример 1. Получение плазмидной генетической конструкции pET21-GST-ND

В качестве базиса плазмидных генетических конструкций была выбрана плазмида pET-GST-3CL-GPG (Патент РФ №2774333 С1) на основе коммерческого вектора рЕТ21а(-), обеспечивающего высокий уровень синтеза и секреции целевого белка в клетках E.coli, штамм BL21(DE3)pLysE, содержащая ген глутатион-S-трансферазы (GST).

С помощью праймеров:

CDH-F (36-mer): aaaaaaGGATCCtcagagacaccattaactcctgtc

CDH-R (59-mer):aaaaaaAAGCTTTTAGTGGTGATGGTGATGATGattaccactgaatatccctgaaatcc

NDH-F (42-mer): aaaaaaGGATCCctgagaaatgtctatgacatgaaaattgag

NDH-R (71-mer): aaaaaaAAGCTTTTAGTGGTGATGGTGATGATGgcttgttatagtatatatacactgtccaataactagagc конструкции pcDNA-Han, содержащей полноразмерный ген поверхностного гликопротеина вируса Хантаан, был амплифицирован ген Gn размером 1365 п.н. соответственно. ПЦР продукты и плазмиду pET-GST-3CL-GPG обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII в соответствии с инструкциями производителя (ООО «СибЭнзайм»). Далее проводили лигирование гидролизованных фрагментов лигазой фага Т4 (ООО «СибЭнзайм») в соответствии с инструкциями производителя. Полученной ДНК методом heat-shock трансформировали клетки E.coli, штамм NebStable, клоны инокулировали в среде LB (1%, триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, рН 7,0±0,2), нарабатывали клеточную биомассу и выделяли ДНК с помощью набора Plasmid Miniprep (ЗАО «Евроген») в соответствии с инструкциями производителя. В результате была получена конструкция рЕТ21-GST-ND, ее идентичность спроектированной конструкции, приведенной на фиг. 1 и последовательности SEQ ID No. 1 доказана секвенированием.

Рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21-GST-ND - продуцент белка Gn получен трансформацией с помощью CaCl₂ по общепринятой методике рекомбинантной плазмидой pET21-GST-ND клеток E.coli, штамм BL21(DE3)pLysE и депонирован в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером В-1385.

Пример 2. Культивирование штамма-продуцента Escherichia coli Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21-GST-ND, трансформированного плазмидной генетической конструкцией pET21-GST-ND, обеспечивающей синтез и секрецию целевого белка Gn - эктодомена гликопротеина вируса Хантаан

Первым этапом процесса культивирования была постановка ночной культуры продуцента Escherichia coli Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21-GST-ND. Для этого 100 мкл культуральной жидкости соответствующего штамма-продуцента добавляли в 10 мл среды LB, содержащей антибиотик ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Культивировали ночь при температуре 30°С, 160 об/мин.

Далее ночную культуру пересевали в колбы Эрленмейера объемом 750 мл, заполненные 150 мл среды 2xYT (1,6% триптон, 1% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, рН 7,0±0,2), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, в соотношении 1:100, нарабатывали культуру до плотности 0,6-0,7 при 37°С, 200 об/мин, добавляли IPTG до концентрации 1 mM и культивировали ≈ 20 ч при 17°С. Центрифугировали на скорости 3000 g 15 мин. Осадок ресуспендировали в 30 мл охлажденного буфера А (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, глицерин 2%, 10 mM имидазол), добавляли 100х лизоцим для разрушения бактериальной стенки (25 мг/мл водный раствор), инкубировали 30 мин на льду, добавляли 100х ингибитор протеаз PMSF (17,4 мг/мл, спиртовой раствор), озвучивали 8x1 мин, центрифугировали 20000 g 20 мин, отбирали супернатант. Наличие белка Gn в супернатанте определяли дот-блотом с использованием сывороток переболевших вирусом Хантаан (фиг. 3).

Пример 3. Выделение и очистка целевого белка Gn - эктодомена гликопротеина вируса Хантаан, полученного с помощью штамма-продуцента E.coli-BL21-pET21-GST-ND, трансформированного плазмидной генетической конструкцией pET21-GST-ND

1. К полученному супернатанту, содержащему белок белок Gn, добавляли сорбент Ni-sepharose (≈1 мл) с нанесенным 0,2 М NiCl₂x6H₂O, инкубировали в качалке с охлаждением (+4°С) в течение ночи.

2. Далее через пустую хроматографическую колонку пропускали лизат с сорбентом.

3. Осевший в колонке сорбент, связавший белок, промывали 10 объемами буфера А.

4. Затем последовательно промывали 10 объемами буфера В (буфер А+0,1% Tritonx100) и 10 объемами буфера С (буфер А+1М NaCl).

5. Целевой белок Gn элюировали в 5 мл буфера А, содержащего 150 мМ имидазола, и в 5 мл буфера А, содержащего 500 мМ имидазола.

6. Наличие и чистоту целевого белка Gn (72 kDa) оценивали с помощью электрофореза в ПААГ. Результаты очистки представлены на фиг. 4.

Пример 4. Проверка специфического взаимодействия белка Gn с сыворотками переболевших вирусом Хантаан

Препарат белка Gn, а также положительный контроль - человеческое антитело 15742 против вируса Эболы и отрицательный контроль - культуральную среду наносили на нитроцеллюлозную бумагу, блокировали буфером PbS+0,1%TWEEN20+1%BSA в течение 5 минут. Далее промывали буфером PbS+0,1%TWEEN20. После удаления промывочного буфера вакуумом добавляли раствор сыворотки переболевшего вирусом Хантаан в 10 мл блокирующего буфера в соотношении 1:5000, инкубировали 10 мин, раствор удаляли вакуумом. Промывали буфером PbS+0,1%TWEEN20, раствор удаляли вакуумом. Далее образцы инкубировали в течение 10 мин с раствором антител AntiHuman Alkaline Phosphatase в блокирующем буфере в соотношении 1:1000, промывали буфером PbS+0,1%TWEEN20, раствор удаляли вакуумом. Инкубировали образцы на нитроцеллюлозной бумаге с реактивом Pierce 1-Step NBT/BCIP Substrate Solution (ThermoFisher) 10 мин. Результаты представлены на фиг. 3. Показано специфическое взаимодействие белка Gn с сывороткой переболевшего вирусом Хантаан.

Источники научно-технической и патентной информации

1. Пат. РФ 2294563 С2 Способ моделирования заболевания, вызываемого вирусом хантаан - возбудителем геморрагической лихорадки с почечным синдромом, на экспериментальном животном / Логинова, С.Я., Ковальчук, А.В., Борисевич, С.В., Хамитов Р.А., Максимов В.А. Заявка: 2005102233/14, 01.02.2005. Опубликовано: 27.02.2007 Бюл. №6.

2. Liu R., Ma Н., Shu J., Zhang Q., Han M., Liu Z., Jin X., Zhang F., Wu X. Vaccines and Therapeutics Against Hantaviruses // Frontiers in Microbiology. -2020. - T. 10 - C. 1-19.

3. Song J. Y., Jeong H. W., Yun J. W., Lee J., Woo H. J, Bae J.-Y., Park M.-S., Choi W. S., Park D. W., Noh J. Y., Cheong H. J., Kim W.J. Immunogenicity and safety of a modified three-dose priming and booster schedule for the Hantaan virus vaccine (Hantavax): A multi-center phase III clinical trial in healthy adults // Vaccine - 2020. - T. 38 - C. 8016-8023.

4. Бархалева O.A., Воробьева M.C., Ладыженская И.П. Вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Биопрепараты - 2011. - №1 - С. 27-30.

5. Engdahl Т.В., Crowe J.E. Humoral Immunity to Hantavirus Infection // mSphere - 2020. - T. 5 - №4 - C.e00482-20.

6. Ткаченко E.A., Ишмухаметов A.A., Дзагурова Т.К., Синюгина А.А., Коротина Н.А., Набатников П.А., Соцкова С.Е., Баловнева М.В., Малкин А.Е. Разработка экспериментально-промышленной технологии производства вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Ремедиум. Журнал о российском рынке лекарств и медицинской технике - 2015. - С. 47-53.

7. Синюгина А.А., Ишмухаметов А.А., Дзагурова Т.К., Баловнева М.В., Егорова М.С., Курашова С.С., Коротина Н.А., Леонович О.А., Балкина А.С., Ткаченко Е.А. Вакцины для профилактики хантавирусных лихорадок // Эпидемиология и вакцинопрофилактика - 2019. - Т. 7 - №495 - С. 98-108.

8. Xu Z., Wei L., Wang L., Wang H., Jiang S. The in vitro and in vivo protective activity of monoclonal antibodies directed against Hantaan virus: Potential application for immunotherapy and passive immunization // Biochemical and Biophysical Research Communications - 2002. - T. 298 - №4 - C. 552-558.

9. Perley C.C., Brocato R.L., Wu H., Bausch C, Karmali P.P., Vega J.B., Cohen M. V., Somerville В., Kwilas S.A., Principe L.M., Shamblin J., Chivukula P., Sullivan E., Hooper J.W. Anti-HFRS Human IgG Produced in Transchromosomic Bovines Has Potent Hantavirus Neutralizing Activity and Is Protective in Animal Models // Frontiers in Microbiology - 2020. - Т. 11 - C. l-13.

10. Guardado-Calvo P., Bignon E.A., Stettner E., Jeffers S.A., Perez-Vargas J., Pehau-Arnaudet G., Tortorici M.A., Jestin J.L., England P., Tischler N.D., Rey F.A. Mechanistic Insight into Bunyavirus-Induced Membrane Fusion from Structure-Function Analyses of the Hantavirus Envelope Glycoprotein Gc // PLoS Pathogens - 2016. - T. 12 - №10.

11. Rissanen I., Krumm S.A., Stass R., Whitaker A., Voss J.E., Bruce E.A., Rothenberger S. Structural Basis for a Neutralizing Antibody Response Elicited by a Recombinant Hantaan Virus Gn Immunogen // mBio - 2021. - T. 12 - №4 -C.e02531-20.

12. Пат. РФ 2539836. Способ получения рекомбинантного ферментативно-меченного антигена G2 хантавируса в клетках E.coli с целью его применения в иммуноферментном анализе при диагностике ГЛПС Опубликовано: 27.01.2015 Бюл. №3 / Смирнова М.С., Леонович О.А., Казеева Т.Н., Кузьмин В.А., Дурандин Н.А., Шибаева А.В., Гра О.А., Елагина Е.М., Маракасова Е.С., Белякова А.В., Зылькова М.В., Шевелев А.Б. -2006. - №19 - С. 146-156.

13. Пат. РФ 2509805. Способ получения рекомбинантного антигена G2 хантавируса добрава в клетках E.coli. Опубликовано: 20.03.2014 Бюл. №8 (56) / Смирнова М.С., Леонович О.А., Казеева Т.Н., Мутных Е.С., Папуниди К.Ф., Маракасова Е.С., Филимонова Н.А., Осипенко О.В., Белякова А.В., Зылькова М.В., Шевелев А.Б. - 2012. - №19.

14. Пат. РФ 2774333 С1 Рекомбинантная плазмида pET-GST-3CL-GPG, обеспечивающая синтез протеазы 3CL SARS-CoV-2 в клетках E.coli в растворимой форме / Щербаков Д.Н., Беленькая С.В., Волосникова Е.А., Назаров К.Д. Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) (RU) Дата подачи заявки: 27.12.2021 Опубликовано: 17.06.2022 Бюл. №17. 16 С.

--->

Перечень последовательностей

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="Послед_рекомб плазмида pET21-GST-ND_белок

Gn_01.02.2023.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-02-01">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1234567</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-02-01</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1234567</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1234567</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-02-01</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

«Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Роспотребнадзора)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe byudzhetnoe uchrezhdenie nauki

"Gosudarstvennyj nauchnyj tsentr virusologii i biotekhnologii

"Vektor" Federalnoj sluzhby po nadzoru v sfere zashchity prav

potrebitelej i blagopoluchiya cheloveka (FBUN GNTS VB "Vektor"

Rospotrebnadzora) (RU)</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Рекомбинантная плазмида

pET21-GST-ND, обеспечивающая синтез и секрецию эктодомена Gn

гликопротеина вируса Хантаан и рекомбинантный штамм Escherichia coli

BL21(DE3)pLysE pET21-GST-ND – продуцент белка Gn - эктодомена

гликопротеина вируса Хантаан</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>7398</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7398</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtg

gttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcct

ttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttag

tgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctga

tagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaa

caacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggtt

aaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggt

ggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatc

cgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaaca

tttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctg

gtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcg

gtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatg

tggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaat

gacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgca

gtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaagga

gctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaat

gaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactat

taactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgc

aggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgt

gggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacga

cggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagca

ttggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaa

aggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccact

gagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctg

cttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactcttttt

ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggcc

accacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgc

cagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcg

ggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctac

agcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcag

ggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcggg

tttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacg

ccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgtt

atcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacg

accgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatc

tgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagc

cagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctga

cgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgc

atgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggt

cgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaa

tgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtg

taagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggtta

ctgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcggga

ccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagc

cagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagacttt

acgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct

tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtc

ctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgc

cgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaag

cgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggc

acctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgccc

accggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgag

ctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcat

taatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcacc

agtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgc

tggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttc

ggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcatt

gcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgca

tggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcg

agtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagc

gcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaa

taatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttc

cacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaaga

ttgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcaccca

gttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggc

aacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctcc

gccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaa

cggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccct

gaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccggg

atctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagc

accgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgcca

ccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtc

ggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagagg

atcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccc

tctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgtcccctatactaggttattggaaaa

ttaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgta

tgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttcct

tattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagctgacaagcaca

acatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttggatattag

atacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaagcta

cctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaaccc

atcctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgtt

cccaaaattagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagc

aagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaaggat

ccctgagaaatgtctatgacatgaaaattgagtgcccccatacagtaagttttgggggaaacagtgtgat

aggttatgtagaattaccccccgtgccattggccgacacagcacagatggtgcctgagagttcttgtagc

atggataatcaccaatcgttgaatacaataacaaaatatacccaagtaagttggagaggaaaggctgatc

agtcacagtctagtcaaaattcatttgagacagtgtccactgaagttgacttgaaaggaacatgtgttct

aaaacacaaaatggtggaagaatcataccgtagtaggaaatcagtaacctgttacgacctgtcttgcaat

agcacttactgcaagccaacactatacatgattgtaccaattcatgcatgcaatatgatgaaaagctgtt

tgattgcattgggaccatacagagtacaggtggtttatgagagaacttactgtatgacaggagtcctgat

tgaagggaaatgctttgtcccagatcaaagtgtggtcagtattatcaagcatgggatctttgatattgca

agtgttcatattgtatgtttctttgttgcagttaaagggaatacttataaaatttttgaacaggttaaga

aatcctttgaatcaacatgcaatgatacagagaataaagtgcaaggatattatatttgtattgtaggggg

aaactctgcaccaatatatgttccaacacttgatgatttcagatccatggaagcatttacaggaatcttc

agatcaccacatggggaagatcatgatctggctggagaagaaattgcatcttattctatagtcggacctg

ccaatgcaaaagttcctcatagtgctagctcagatacattgagcttgattgcctattcaggtataccatc

ttattcttcccttagcatcctaacaagttcaacagaagctaagcatgtattcagccctgggttgttccca

aaacttaatcacacaaattgtgataaaagtgccataccactcatatggactgggatgattgatttacctg

gatactacgaagctgtccacccttgtacagttttttgcgtattatcaggtcctggggcatcatgtgaagc

cttttctgaaggcgggattttcaacataacctctcccatgtgcttagtgtcaaaacaaaatcgattccgg

ttaacagaacagcaagtgaattttgtgtgtcagcgagtggacatggacattgttgtgtactgcaacgggc

agaggaaagtaatattaacaaaaactctagttattggacagtgtatatatactataacaagccatcatca

ccatcaccactaaaagcttaagtttaaaccgctgatcagcctcgtcgagcaccaccaccaccaccactga

gatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcat

aaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat</IN

SDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена рекомбинантная плазмидная генетическая конструкция рЕТ21-GST-ND, обеспечивающая синтез и секрецию белка Gn - эктодомена гликопротеина вируса Хантаан в клетках E.coli, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NО: 1 размером 7398 п.н. Предложен также рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE рЕТ21-GST-ND - продуцент указанного белка Gn, полученный трансформацией указанной плазмидой и депонированный в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером В-1385. Изобретения обеспечивают продукцию полноразмерного эктодомена Gn гликопротеина вируса Хантаан. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

1. Рекомбинантная плазмидная генетическая конструкция pET21-GST-ND, обеспечивающая синтез и секрецию целевого белка Gn - эктодомена гликопротеина вируса Хантаан в клетках E.coli для получения нейтрализующих антител в организме против указанного вируса, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NО: 1 размером 7398 п.н. и содержащая в соответствии с физической и генетической картой, следующие элементы:

- f1 ori представляет собой фаговый ori, который обеспечивает репликацию и упаковку одноцепочечной ДНК в фаговые частицы и имеет координаты 12-467 п.н.;

- ген устойчивости к антибиотику ампициллин AmpR с координатами 599-1459 п.н. и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину AmpR promoter с координатами 494-598 п.н., позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в E.coli;

- участок начала репликации ori, имеющий координаты 1630-2218 п.н.;

- rop - димерный белок, участвующий в механизме, контролирующем количество копий плазмиды и имеющий координаты 2648-2839 п.н.;

- lacI с координатами 3648-4730 и lacI promoter с координатами 4731-4808 п.н.;

- Т7 promoter - сильный промотор, обеспечивающий высокий уровень транскрипции и имеющий координаты 5115-5135 п. н.;

- lac operator, имеющий координаты 5136-5160 п.н.;

- RBS - сайт связывания рибосомы, имеющий координаты 5191-5196 п н.;

- GST - ген белка-помощника глутатион-S-трансферазы, обеспечивающий выход целевого белка в периплазму и имеющий координаты 5205-5857 п.н.;

- ND - ген, кодирующий эктодомен Gn гликопротеина вируса Хантаан, имеющий координаты 5865-7184 п.н.;

- MCS - мультиклональный сайт, имеющий координаты 7237-7241 п.н.;

- 6xHis, предназначенный для хроматографической очистки белка Gn-эктодомена гликопротеина вируса Хантаан и имеющий координаты 7242-7259 п.н.

2. Рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE рЕТ21-GST-ND - продуцент белка Gn - эктодомена гликопротеина вируса Хантаан для получения нейтрализующих антител в организме против указанного вируса, полученный трансформацией рекомбинантной плазмидой рЕТ21-GST-ND и депонированный в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером В-1385.