Штамм бактерий Salmonella abortus equi, используемый в качестве бактерии-мишени для идентификации бактериофагов Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 A61K35/76 C12R1/42 

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и ветеринарной медицине и представляет собой штамм Salmonella abortus equi, используемый для идентификации бактериофагов.

Сальмонеллезный аборт лошадей остается серьезной проблемой ветеринарной медицины в России и мире. Для профилактики сальмонеллеза используют вакцины, а для лечения антибиотики. В связи с распространением антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов актуальным становится поиск альтернативных средств терапии инфекционных болезней, в том числе сальмонеллезного аборта лошадей. В настоящее время наиболее перспективными биологическими средствами лечения являются бактериофаги. Однако бактериофаги к возбудителям сальмонеллезного аборта не выделены.

Аналоги изобретения: - известен штамм бактерий Salmonella abortus equi БН-12, используемый для изготовления профилактического препарата против сальмонеллезного аборта лошадей (патент РФ №2218924, опубл. 20.12.2003). Однако данный штамм не использован в качестве бактерии-мишени для идентификации бактериофагов.

Известно использование штаммов сероваров Salmonella enteretidis, Salmonella typhimurium, Salmonella heidelberg, Salmonella choleraesuis, Salmonella gallinarum-pullorum, Salmonella dublin в качестве индикаторных бактерий при выделении бактериофагов, используемых для профилактики и лечения сальмонеллеза животных (патент РФ №2232808, С 12 № 7/00,2004, опубл. 20.07.2004). Однако эти штаммы не используются для определения специфичности бактериофагов к штаммам бактерий Salmonella abortus equi.

Описан способ получения штамма бактериофага, специфических штаммов бактериофагов и их применение. Полученные бактериофаги обладали литической активностью к штаммам Salmonella spp (патент № 2573934, С/2 № 7/00, опубл. 27.01.2016). Однако также нет информации о литической активности к штамму бактерий Salmonella abortus equi, вызывающего сальмонеллезный аборт лошадей.

Есть сведения об использовании штаммов бактерий E-coli АВ-259, Salmonella typhimurium TA 1537, Salmonella typhimurium TA 100 для идентификации бактериофага Salmonella typhimurium S-394 (патент РФ №2412243, С12 №7/00, опубл. 20.02.2011). Однако специфичность данного бактериофага к штамму Salmonella abortus equi не изучена.

Задачей заявляемого изобретения является получение специфичного штамма Salmonella abortus equi в качестве бактерии-мишени для идентификации бактериофага.

Штамм бактерий Salmonella abortus equi БН-12, выделен из паренхиматозных органов абортированного плода кобылы. Штамм обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и используется для изготовления вакцины против сальмонеллезного аборта лошадей.

Штамм бактерий Salmonella abortus equi БН-12 ВКШМ-Б-01ПД депонирован 16 ноября 2022 г. в Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ «ВГНКИ» (справка о депонировании от 16 ноября 2022 г. Регистрационный номер ВКШМ-Б-01ПД).

Штамм характеризуется следующими признаками.

Штамм хорошо растет на универсальных питательных средах в аэробных и факультативно -аэробных условиях.

Оптимальная температура роста +37°С, при рН - 7,2-7,4. По биохимическим свойствам не разлагает лактозу, сахарозу, рафинозу, ксилозу, салицин, инулин, адонит, инозит. Ферментирует с выделением кислоты и газа глюкозу, маннит, дульцит, рамнозу, галактозу. Штамм не свертывает молоко, желатин не разжижает. Ферментативные свойства культуры не постоянны, могут изменяться под действием различных условий в процессе хранения.

На МПА образует сероватые округлые колонии, в МПБ дает равномерное помутнение, на полужидком агаре имеет диффузный рост, на среде Эндо растут в виде круглых бесцветных или слегка розоватых прозрачных или полупрозрачных колоний. Дает положительную реакцию с метилротом и отрицательную реакцию Фогес - Проскауэра. На стекле дает положительную реакцию агглютинизации (РА) с монорецепторными сальмонеллезными сыворотками 04. Патогенен для белых мышей. Летальная доза составляет 400 млн. микробных клеток в 1 мл. При микроскопии видны подвижные короткие грамотрицательные палочки.

Молекулярно-генетические тестирования штамма бактерий Salmonella abortus equi БН-12 показали 100% идентичность анализируемой последовательности образца с нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК Salmonella enterica (GenBank СР104638.1). Результаты исследований позволили штамм бактерий Salmonella abortus equi БН-12 депонировать во «Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» ФГБУ «ВГНКИ» под номером ВКШМ-Б-01ПД в ампулах в лиофилизированном под вакуумом виде, при температуре хранения +2 - +8°С.

Штамм бактерий Salmonella abortus equi БН-12 высевают на мясо-пептонный агар в чашках Петри и мясо-пептонном бульоне в пробирках и инкубируют в термостате при 37° в течение 18-20 ч. Выращенную культуру используют для постановки спот-теста и метода «обогащения с подсевом».

1 способ: На МПА в чашках Петри накапают выросшую на МПБ суточную культуру Salmonella abortus equi БН-12 (0,1 мл) и растирают по всей поверхности среды. Культуре дают впитаться и ждут до полного высыхания (до 10 минут).

2 способ: Колонии суточной культуры Salmonella abortus equi БН-12, выросших на МПА в чашках Петри, бактериологической петлей густо набирают и газоном сеют по всей поверхности среды равномерно. Ждут впитания культуры в агар и высыхания.

Дно чашки Петри с засеянной культурой штамма бактерии Salmonella abortus equi БН-12 расчерчивают на секторы и наносят номера фильтратов. На каждый сектор капают 1 каплю исследуемого фильтрата. Ждут полного высыхания фильтрата, затем переворачивают чашки и инкубируют при температуре +37°С в термостате в течение 18-20 ч.

В работе используют коммерческий фаг (Интестифаг П12, П19, Н193); сальмонеллезные фаги МНИИЭМ им. Габричевского: Se40 (Salmonella enteriditis М4), Si3 (Salmonella infantis 1271), ST11 (Salmonella typhimurium), SL11 (Salmonella London 11), SL26 (Salmonella London 26).

Установлено, что культура штамма бактерий Salmonella abortus equi БН-12 лизируется коммерческими бактериофагами и сальмонеллезными фагами МНИИЭМ им. Габричевского (Таблица 1).

Таблица 1 - Результат постановки спот-теста

№ проб Sal.abort. equi БН-12 Интестифаг
П12 Интестифаг
Пермь
П19 Интестифаг Н.Новгоро д
Н193 SE40 Si
-3 ST11 SL11 SL26 1 1нк + + + + + + + +

Примечание: 1нк - 1 негативная колония бактериофага; - - не выявлено; + - лизис культуры штамма бактерий Sal.ab.equi БН-12 коммерческими бактериофага; ± - подозрение на наличие бактериофага.

Следовательно, штамм бактерий Salmonella abortus equi БН-12 подходит в качестве бактерии-мишени для выделения и идентификации бактериофагов к возбудителям сальмонеллезного аборта кобыл.

Штамм бактерий Salmonella abortus equi БН-12 ВКШМ-Б-01ПД депонирован в Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ «ВГНКИ». Дата депонирования 16 ноября 2022 г. Регистрационный номер ВКШМ-Б-01ПД. Место хранения ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение штамма бактерий Salmonella abortus equi ВКШМ-Б-01ПД в качестве бактерии-мишени для идентификации бактериофагов к возбудителям сальмонеллезного аборта лошадей. Изобретение обеспечивает идентификацию выделенных бактериофагов для разработки лечебных и диагностических препаратов при сальмонеллезном аборте кобыл. 1 табл.

Применение штамма бактерий Salmonella abortus equi, депонированного в ФГБУ «ВГНКИ» под регистрационным номером ВКШМ-Б-01ПД, для идентификации бактериофагов к возбудителям сальмонеллезного аборта лошадей.