ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOCOCCUS EQUI, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ МЫТА ЛОШАДЕЙ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 A61K39/09 C12R1/46 

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и ветеринарной медицине и представляет собой штамм мытного стрептококка, используемый для изготовления вакцины против мыта лошадей.

Аналоги изобретения: - известен штамм бактерий Streptococcus equi, используемый для изготовления профилактических препаратов против стрептококкоза лошадей (патент США №4582798, C12N 1/20, 1986). Штамм выделен от больного стрептококкозом поросенка и относится к серологической группе С. Однако, данный штамм не пригоден для иммунизации лошадей и изготовления препаратов для диагностики мыта. Известен штамм бактерий Streptococcus equi, используемый для изготовления диагностических и профилактических препаратов при мыте лошадей (патент РФ №2080381, опубл. 27.05.97). Однако, штамм бактерий Streptococcus equi Н-34 снят из депонирования. Такого штамма в настоящее время нет. В литературе есть сообщения о выделении изолятов Streptococcus equi из носоглотки лошадей и их идентификации методом полимеразной цепной реакции (Katy Webb, Colin Barker, Tihana Harrison, Zoe Heather, Karen F. Steward, Carl Robinson, J. Richard Newton, Andrew S. Waller: Detection of Streptococcus equi subspecies equi using a triplex qPCR assay. The Veterinary Journal, 2013; 195. 300-304; A.G. Boyle, S.C. Rankin, L. Duffee, R.C. Boston, and H. Wheeler-Aceto: Streptococcus equi Detection Polymerase Chain Reaction Assay for Equine Nasopharyngeal and Guttural Pouch Wash Samples. J Vet Intern Med 2016; 30:276-281). Однако эти исследования проводились для идентификации возбудителя и диагностики мыта. Штаммы не депонированы и не использованы для разработки вакцины. Есть сведения о выделении штамма Streptococcus equi TW-928 и использовании для разработки живой вакцины (Хартфорд Орла Мари (IE), Фостер Тимоти Джеймс (IE), Якобс Антониус Арнодус Кристиаан (NL). Штамм и культура штамма Streptococcus equi tw 928 для вакцинации лошадей. http://www.findpatent.ru/219/2194752, html. FindPatent.ru - патентный поиск, 2012-2017). Однако штамм выделен в Нидерландах и нет сведений о депонировании и утверждении вакцины.

Известно использование штаммов бактерий Streptococcus equi СМ-1 и Streptococcus equi BNK для разработки вакцины против мыта в Казахстане (патент KZ №23106, опубл. 15.11.2010, бюл. №11 и патент KZ №31032, опубл. 15.04.2016, бюл. №4). Однако штаммы не депонированы.

Задачей заявляемого изобретения является получение более эффективного штамма мытного стрептококка для изготовления вакцины против мыта.

Штамм бактерий Streptococcus equi Н-5/1, выделен из секрета абсцесса подчелюстного лимфатического узла больного мытом жеребенка. Штамм обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и используется для изготовления вакцины против мыта.

Штамм бактерий Streptococcus equi Н-5/1 ВКШМ-Б-141П депонирован 22 мая 2018 г. в Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ «ВГНКИ» (Справка о депонировании от 31 мая 2018 г. Регистрационный номер ВКШМ-Б-141П).

Штамм бактерий Streptococcus equi Н-5/1 получен из секрета абсцесса подчелюстного лимфатического узла больного мытом жеребенка в ООО «Немюгю», Республика Саха (Якутия) в 2016 г.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические свойства. При микроскопии мазков, изготовленных из бульонной культуры и агаровой культуры стрептококков, обнаруживают типичные грамположительные бактериальные клетки шаровидной или овальной формы, расположенные попарно или в виде цепочек разной длины. На поверхности плотной питательной среды (Колумбийский агар с добавлением 5% взвеси эритроцитов барана), штамм образует мелкие полупрозрачные «росинчатые» колонии S-формы, окруженные зоной β-гемолиза. На жидкой питательной среде (Триптон-соевый бульон) растет с образованием придонного осадка, оставляя среду прозрачной. Неподвижны, каталазоотрицательны. Штамм хорошо растет на 1% МПБ с 10% лошадиной сыворотки с равномерным помутнением с выпадением мелкодисперсного белого осадка, при встряхивании поднимающего косичкой вверх. На 1% МПА с 10% лошадиной сыворотки образует мелкие слизистые росинчатые колонии. На кровяном агаре с содержанием 1% глюкозы и 10% крови дает β-гемолиз. Не растет в жидких питательных средах с содержанием 40% желчи и 6,5% хлорида натрия. Штамм сохраняется в лиофилизированном виде при температуре 4-6°С, в течение 1 года. Нативная культура поддерживается на мясопептонном бульоне с сывороткой и глюкозой в течение 10 суток.

Биохимические свойства. Штамм продуцирует ферменты: β-глюкозидазу; β-глюкоронидазу и лейцинариламидазу. Ферментирует с образованием кислоты без газа эскулин, крахмал и гликоген. Аргинин, рибозу, арабинозу, маннит, сорбит, лактозу, трегалозу, инулин и раффинозу не сбраживает. Штамм стрептококков не образует ацетоин и не гидролизует гиппурат (Идентификация штамма стрептококков проводится с использованием стрипа «API 20 Step» тест системы «API^®» bioMerieux (Франция).

Молекулярно-генетическое тестирование. Нуклеотидная последовательность штамма бактерий Streptococcus equi «Н-5/1» 100% идентичен нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16 S рРНК Streptococcus equi.

Вирулентные свойства. Вирулентная активность LD₅₀ (50% летальная доза) штамма бактерий Штамм бактерий Streptococcus equi «Н-5/1» для белых мышей составляет - 1×10² микробных клеток (КОЕ) при парентеральном введении.

Антигенные свойства. Штамм преципитируется специфической стрептококковой сывороткой серогруппы С.

Антигенная активность. Титр антител у кроликов, иммунизированных штаммом бактерий Streptococcus equi «Н-5/1» составил 1:64, что в два раза выше по сравнению с штаммом №25.

Иммуногенную активность проверяют по эффективности вакцины приготовленной из штамма бактерий Streptococcus equi «Н-5/1» в хозяйстве, неблагополучном по мыту лошадей. Заболеваемость мытом среди жеребят, иммунизированных вакциной из штамма бактерий Streptococcus equi «Н-5/1» составляет 8,6%, что на 71,8% ниже, чем у невакцинированных.

Штамм бактерий Streptococcus equi «Н-5/1» выращивают в мясопептонном бульоне, содержащем 10% сыворотки крови лошади и 1% глюкозы до накопления 3 млрд. микробных клеток в 1 мл. Бактериальную массу инактивируют формалином в течение 72 ч., затем добавляют 3%-ный раствор гидроокиси алюминия из расчета 10% к объему культуры. Через 3 сут после внесения адъюванта вакцину расфасовывают во флаконы и контролируют на безвредность, стерильность и активность.

При введении жеребятам полученной вакцины заболеваемость снижается до 8,6% по сравнению с невакцинированными животными.

Штамм бактерий Streptococcus equi «Н-5/1» ВКШМ-Б-141П депонирован в Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ «ВГНКИ». Дата депонирования 22 мая 2018 г. Регистрационный номер ВКШМ-Б-141П. Место хранения ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм бактерий Streptococcus equi для изготовления вакцины против мыта лошадей. Штамм депонирован в ФГБУ «ВГНКИ» под регистрационным номером ВКШМ-Б-141П. Изобретение обеспечивает снижение заболеваемости мытом при иммунизации вакциной, содержащей предложенный штамм.

Штамм бактерий Streptococcus equi, депонированный в ФГБУ «ВГНКИ» под регистрационным номером ВКШМ-Б-141П, для изготовления вакцины против мыта лошадей.