ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA TYPHIMURIUM №14, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/112 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/42 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к получению штамма Salmonella typhimurium, пригодного для использования в вакцинах и диагностических препаратах против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных.

Сальмонеллез крупного рогатого скота - инфекционная болезнь, характеризующаяся явлениями бактериемии, токсемии, абортами или рождением нежизнеспособного молодняка. Наиболее подвержен молодняк в возрасте 10-30 дней. При остром течении у молодняка проявляется угнетение, отказ от корма, повышение температуры до 41^oС, затем парезы передних конечностей и при несвоевременном лечении через 36-48 ч наступает смерть. При затяжном течении болезни на 2-3 сутки у телят появляется диарея.

Заболевание распространяется по типу энзоотии, нарастает постепенно и длительное время держится на высоком уровне. Нередко переболевают до 80-90% телят при уровне летальности 20-80%.

Ущерб складывается из затрат на лечение, гибели молодняка.

Заболевание регистрируется во всех регионах страны, в связи с этим становится очевидным актуальность борьбы с данным заболеванием.

Известен штамм Salmonella typhimurium ВГНКИ 3 для изготовления "Вакцины против сальмонеллеза молодняка". Накопление микробных клеток (м.к.) штамма в вакцине составило 30-45 млрд. в 1 см³ [1].

Известен также штамм Salmonella typhimurium 159, который используется для изготовления "Инактивированной эмульсин-вакцины против сальмонеллеза телят".

Штамм Salmonella typhimurium 159 обладает следующими свойствами:
Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные, подвижные, мелкие, слегка изогнутые палочки, формирующие на МПА выпуклые колонии 1-3 мм в диаметре, прозрачные или беловатого цвета. Хорошо растут на обычных питательных средах, на МПБ образуют пленку и пристеночное кольцо.

Физико-биологические свойства. Аэроб, способный расти в микроанаэробных условиях. Оптимум рН 7,2 при температуре 37^oС.

Ферментативные свойства. Не изменяет молоко, не разжижает желатин, не выделяет индол, не разлагает мочевину; выделяет сероводород, сбраживает глюкозу, маннит, сорбит, арабинозу, инозит, мальтозу с образованием кислоты; лактозу и сахарозу не сбраживает; имеет ферменты лизиндекарбоксилазу и орнитиндекарболазу.

Агглютинирующие свойства. Агглютинируется сальмонеллезными сыворотками: "О" - 1, 4, 5, 12; Н-I; 1, 2.

Патогенные свойства. Патогенен для белых мышей: ЛД₅₀ составляет 5х10³ клеток при внутрибрюшинном заражении [2].

В задачу наших исследований входило получить штамм Salmonella typhimurium, обладающий стабильно низкой остаточной вирулентностью, высокой иммуногенностью и пригодный для использования в приготовлении вакцин против сальмонеллеза телят и пушных зверей, а также для диагностических препаратов.

Предложенный штамм Salmonella typhimurium 14 - возбудитель сальмонеллеза - отнесен к семейству Enterobacteriaceae, к роду Salmonella, выделен в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии из органов поросенка в 1988 г. в свинокомплексе "Ефремовский" Тульской обл.

Предложенный штамм депонирован 27 апреля 2001 г., регистрационный номер - "штамм Salmonella typhimurium 14 - МГАВМиБ - ДЕП" во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, Россия, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ).

Местом хранения производственного штамма Salmonella typhimurium 14, возбудителя сальмонеллеза телят, определена коллекция НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (109472, Москва, ул. Ак. Скрябина, 23), дублирующее хранение НИИ микробиологии МО РФ (610024, Россия, г.Киров, Октябрьский пр., 121, в/ч 23527).

Предложенный производственный штамм Salmonella typhimurium 14 обладает следующими свойствами:
Морфологические, культуральные и ферментативные свойства. Грамотрицательные подвижные полиморфные палочки, образуют полупрозрачные S-формы колонии через 18-24 ч роста на плотной питательной среде при температуре 36-38^oС.

Ферментативная активность. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, рамнозу, сорбит, маннит, не ферментирует лактозу, сахарозу, мальтозу, инозит, не гидролизует мочевину, образует сероводород, не образует индол и ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра.

Серологические свойства. Агглютинируется с сальмонеллезными сыворотками 04 (1 и 2 комплекс) и H-I.

Токсигенность. Штамм является продуцентом эндотоксинов и гемолизинов.

Вирулентные свойства. Вирулентность ЛД₅₀ для белых мышей внутрибрюшинно < 1,7х10⁶ живых м.к.

Патогенен для телят. При пероральном заражении телят 10 млрд. м.к. на 2-3 сутки отмечают профузный понос, а гибель животных наступала на 2-4 сутки, с характерными для сальмонеллеза паталогоанатомическими изменениями.

Белковая структура.

Нуклеотидный состав ДНК (% ГЦ) - 53,1.

Содержит плазмиды с м.в. 64 МД.

Лизируется с сальмонеллезным поливалентным бактериофагом.

Применяемый способ хранения и поддержания штамма. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах при минус 18-20^oС после пассажа через организм белых мышей.

Периодичность пересева на питательных средах 15-20 суток.

Условия транспортировки. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах.

Срок хранения 10 лет.

Пример. Штамм Salmonella typhimurium 14 выращивают в реакторах в казеиновом бульоне. Посевная доза составляет 150-300 млн. м.к. на 1 см³ питательной среды.

Культивирование проводят в течение 16-18 часов при температуре 36-37^oС при постоянном перемешивании и интенсивной аэрации из расчета объем стерильного воздуха на объем среды в минуту (в соотношении 1:3).

Концентрация микробных клеток через 16-18 ч составляет 40-50 млрд. м.к. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. К.А. Тарасовича, что дало возможность применить штамм для изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных и пушных зверей.

Вакцина, изготовленная с использованием предложенного штамма, обеспечивает 90%-ный защитный эффект от заражения вирулентными эпизоотическими штаммами на 5-7 сутки.

Вакцина из производственного штамма Salmonella typhimurium 14 апробирована с положительным результатом с 1995 по 2001 гг. на территории России и стран СНГ: Беларусь, Кыргызстан, Узбекистан и др. на 11550 головах стельных коров, 7290 супоросных свиноматок, 4270 овцематок, 2290 пушных зверей.

Сохранность поголовья составляет 96-99%.

Предложенный штамм может быть использован для производства сальмонеллезных вакцин и диагностикумов, а также для получения гипериммунных лечебных сывороток и глобулинов.

Источники информации:
1. Патент РФ 1197187, кл. A 61 K 39/112, 1998 г.

2. Патент РФ 2154495, кл. A 61 K 39/112, C 12 N 1/20, 2000 г.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Штамм бактерий Salmonella typhimurium 14 обладает морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами, присущими роду сальмонелла. По серологическим свойствам предложенный штамм агглютинируется с сальмонеллезными монорецепторными сыворотками 04 (1 и 2 комплекс) Н-I. Штамм является продуцентом эндотоксина и гемолизина. Штамм имеет белковую структуру. Нуклеотидный состав ДНК (% ГЦ) - 53,1. Содержит плазмиды с м.в. 64 МД. Лизируется с сальмонеллезным поливалентным бактериофагом. Вирулентность ЛД₅₀ для белых мышей внутрибрюшинно 1,7х10⁶ живых микробных клеток. Патогенен для телят, при заражении в концентрации 10 млрд. м.к. на 2 сутки отмечают профузный понос, а на 3-4 сутки - гибель животного. Концентрация микробных клеток при выращивании штамма составляет 40-50 млрд. м.к. по оптическому стандарту мутности ГИСК, защитный эффект от заражения вирулентными штаммами наступает на 5-7 сутки. Штамм пригоден для изготовления вакцин против сальмонеллеза животных, а также диагностических препаратов и для получения гипериммунных лечебных сывороток и глобулинов.

Штамм бактерий Salmonella typhimurium ВГНКИ 14 - МГАВМ и Б-ДЕП, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов.