ИНГИБИТОРЫ HPK1 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C07D401/14 C07D405/14 C07D413/14 C07D471/04 C07D473/32 C07D487/04 C07D491/107 C07D498/04 A61K31/506 A61K31/519 A61K31/52 A61K31/538 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет международной патентной заявки № PCT/CN2019/094634, поданной 4 июля 2019 г. Все содержание вышеупомянутой заявки включено в настоящий документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гемопоэтическая киназа-предшественник 1 (HPK1), также известная как киназа-киназа-киназа митоген-активируемой протеинкиназы-1 (MAP4K1), является протеинкиназой, которая действует выше классического 3-уровневого пути MAPK, который включает MAP3K (MAP киназа киназа), которая активирует MAP2K (MAP-киназа киназа), которая, в свою очередь, активирует двойной Thr и Tyr член семейства MAPK JNK (c-Jun N-терминальную киназу). Первоначально клонированные в гемопоэтических клетках-предшественниках, HPK1/MAP4K1 преимущественно экспрессируются в лимфоидных органах/тканях, включая костный мозг, печень плода, лимфатические узлы, плаценту, селезенку и тимус (Hu et al., Gene & Dev. 10(18): 2251-2264, 1996; Kiefer et al., The EMBO J. 15(24): 7013-7025, 1996). На клеточном уровне, HPK1 экспрессируется во всех типах клеток гемопоэтического компартмента, включая гемопоэтические клетки-предшественники, Т-клетки, В-клетки, макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы и тучные клетки (Hu, выше; Kiefer, выше).

HPK1/MAP4K1 является одной из шести MAP4K, включающих HPK1 (MAP4K1), GCK (MAP4K2), GLK (MAP4K3), HGK/NIK (MAP4K4), KHS/GCKR (MAP4K5) и MINK (MAP4K6). Вместе эти MAP4K являются членами примерно 26 Ste20-подобных серин/треонинкиназ млекопитающих, идентифицированных к настоящему времени, которые являются гомологами белка дрожжей sterile20 (Ste20p), предполагаемого MAP4K, который активирует MAP3K в сигнальном пути дрожжевого феромона. Эти Ste20-подобные киназы млекопитающих делятся на два подсемейства на основе доменных структур: p21-активируемые киназы (PAK) и киназы зародышевого центра (GCK). Среди подсемейства GCK некоторые из них могут активировать киназный каскад MAP3K, что приводит к активации JNK.

MAP4K очень структурно похожи с N-концевым доменом киназы (KD), за которым следуют 2-4 мотива, богатых пролином, и C-концевым доменом гомологии цитрона (CNH).

Сайт связывания ATP киназного домена HPK1 включает Lys-46. Мутация этого остатка в Met (HPK1-M46) отменяет каталитическую активацию HPK1 (Hu, выше).

Существует несколько консервативных сайтов фосфорилирования Ser/Thr в киназном домене HPK1 и консервативный сайт фосфорилирования Tyr между его первыми двумя богатыми пролином мотивами. Фосфорилирование Tyr379 (у мыши или Tyr381 у человека) посредством LCK/ZAP70, по-видимому, необходимо для активации HPK1, поскольку дефицит LCK или ZAP70 отменяет фосфорилирование Tyr-379 и киназную активность HPK1 в Т-клетках Jurkat при анти-CD3-стимуляции. (Ling et al., JBC 276(22):18908-18914, 2001; Liou et al., Immunity 12(4):399-408, 2000; Sauer et al., JBC 276(48):45207, 45216, 2001). С другой стороны, аутофосфорилирование Thr-355 регулирует убиквитинирование и деградацию HPK1. Thr-355 является PP4-таргетным сайтом дефосфорилирования; это дефосфорилирование предотвращает CUL7/Fbxw8-опосредованное убиквитинирование и протеасомную деградацию активированной HPK1 (Wang et al., Cancer Res. 69(3):1063-1070, 2009), таким образом, HPK1 также стабилизируется и активируется протеинфосфатазой 4 (PP4) (Zhou et al., JBC 279(47):49551-49561, 2004).

Сайт фосфорилирования Tyr также примыкает к сайту расщепления каспазой (DDVD). Было показано, что полноразмерный HPK1 может расщепляться каспазой-3 в этом сайте в апоптотических клетках, что приводит к повышенной каталитической активности N-концевого фрагмента HPK1 (Chen et al., Oncogene 18:7370-7377, 1999).

Четыре Pro-богатых мотива HPK1 опосредуют взаимодействие HPK1 со многими доменсодержащими белками SH3 (Boomer & Tan, JCB 95(1): 34-44, 2005).

CNH домен HPK1 может быть вовлечен в HPK1-опосредованную адгезию лимфоцитов, поскольку домен гомологии цитрона в другой Ste20-подобной киназе TNIK связывается с Rap2 и регулирует актиновый цитоскелет (Taira et al., JBC 279(47):49488-49496, 2004).

MAP4K играют важную роль в иммунной системе, особенно в лимфоцитах, через регуляцию клеточной передачи сигналов, активацию иммунных клеток, трансформацию клеток и миграцию клеток. У мышей с нокаутом (KO) HPK1 наблюдается повышенная активация Т-клеток, повышенное продуцирование цитокинов и повышенное продуцирование антител после иммунизации KLH. Мыши HPK1 KO также более восприимчивы к индукции EAE. Т-клетки и В-клетки HPK1 KO демонстрируют усиленную клеточную активацию и передачу сигналов антигенного рецептора. Дендритные клетки HPK1 KO демонстрируют более высокие уровни костимулирующих молекул и провоспалительных цитокинов (Alzabin et al., J. Immunol. 182(10):6187-6194, 2009; Shui et al., Nat. Immunol. 8(1):84-91, 2007).

Сверхэкспрессия в клеточных линиях (например, клетках HEK293 и COS-1, гемопоэтических Т-клетках Jurkat и клетках лейкоза HL-60) продемонстрировала, что HPK1 может активировать MAPK JNK (но не p38 или ERK MAP киназы) через несколько MAP3K (включая TAK1, MEKK1 и MLK3), которые активируют MAP2Ks MKK4 и MKK7, которые, в свою очередь, активируют JNK.

Интересно, что регуляторные функции MAP4K в иммунных клетках, по-видимому, в значительной степени опосредованы независимыми от JNK механизмами. Было продемонстрировано, что активация киназы HPK1 необходима для активации IKK-NF-κB, и полагают, что HPK1 делает это посредством регуляции CARMA1. CARMA1 является адаптерным белком в так называемом комплексе CBM (CARMA1/BCL10/MALT1), который способствует активации IKKβ в Т-клетках Jurkat при стимуляции анти-CD3. Активированная IKK расщепляет IκB и высвобождает ассоциированный ядерный транскрипционный фактор NF-κB. В частности, HPK1 индуцибельно ассоциирован с CARMA1 и прямо фосфорилирует CARMA1 на Ser-551, что необходимо для активации NF-kB (Brenner et al., PNAS USA, 196(34):14508-14513, 2009).

В Т-клетках, при стимуляции TCR, лимфоцитарная протеинтирозинкиназа (Lck) фосфорилирует основанные на иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы (ITAM) на цитозольной стороне комплекса TCR/CD3. Затем Zap-70 рекрутируется в комплекс TCR/CD3, где он фосфорилируется и активируется. Активированный ZAP-70 фосфорилирует адапторный белок, называемый SLP-76, который транслоцируется на мембрану плазмы и способствует образованию мультибелкового комплекса сигналосомы путем связывания с рядом белков, включая HPK1. Эти белки совместно передают сигналы TCR различным эффекторным молекулам, что приводит к активации, выживанию и пролиферации Т-лимфоцитов.

Во время этого процесса, HPK1 напрямую связывается с SH2 доменом SLP-76 и, в первую очередь, служит негативным регулятором передачи сигналов TCR. Например, передача сигналов TCR усиливается в первичных Т-клетках HPK1 KO, в том, что они демонстрируют гиперпролиферацию и продуцирование IL-2 при лигировании TCR in vitro (Shui, выше). Считается, что HPK1 может подавлять передачу сигналов TCR посредством механизма отрицательной обратной связи, через фосфорилирование адаптерного белка SLP-76 на Ser-376. При фосфорилировании Ser-376 посредством HPK1, SLP-76 связывается с 14-3-3 через фосфорилированный остаток Ser-376, что приводит к убиквитинированию остатка Lys-30 (K30) SLP-76, который впоследствии таргетируется для протеасомной деградации. HPK1 также подавляет передачу сигналов TCR с помощью аналогичного механизма в других адаптерных белках, включая GADS (например, путем фосфорилирования Thr-254 GADS и способствует взаимодействию 14-3-3).

Таким образом, оказывается, что HPK1 играет двойную и противоположную роли в активации JNK и передаче сигналов TCR. Хотя было продемонстрировано, что HPK1 напрямую активирует путь JNK в различных системах сверхэкспрессии через путь MAP3K-MAP2K-MAPK, HPK1-опосредованное ингибирование активации SLP-76 также может привести к ингибированию активности JNK в передаче сигналов TCR. Это согласуется с наблюдением, что первичные Т-клетки с нокаутом HPK1 проявляют неизмененную активность JNK (Shui, выше). Точно так же, HPK1, по-видимому, регулирует активацию IKK двумя различными и контрастирующими механизмами - с одной стороны, HPK1 активирует IKK путем прямого фосфорилирования CARMA1; с другой стороны, HPK1 также негативно регулирует активацию IKK, ингибируя активацию SLP-76. Эта, казалось бы, контрастирующая двойная роль, которую играет HPK1, лучше всего понимается тем, что HPK1 облегчает активацию JNK и IKK в начальной фазе передачи сигналов TCR, но играет критическую роль в подавлении передачи сигналов TCR в поздней фазе.

HPK1 также играет аналогичную негативную регуляторную роль в BCR-индуцированной активации и пролиферации клеток в B-клетках. В-клетки используют SLP-76-подобный адаптерный белок, называемый BLNK, для трансдукции передачи сигналов BCR, включая активацию JNK и IKK. В В-клетках, Tyr киназы Syk и Lyn способствуют фосфорилированию Tyr и активации HPK1, и полученный pY379 HPK1 опосредует связывание HPK1-BLNK. Отрицательная обратная связь HPK1 BLNK осуществляется через Thr-152 BLNK. Связывание pT152 посредством 14-3-3 приводит к убиквитинированию BLNK по нескольким остаткам Lys и последующей протеасомной деградации BLNK (таким образом ослабляя передачу сигналов BCR).

Интересно, что HPK1, по-видимому, является положительным регулятором супрессивных функций регуляторных Т-клеток (T_reg) (Sawasdikosol et al., J Immunol. 188(supp. 1):163, 2012). Treg мышей Foxp3⁺ с дефицитом HPK1 были дефектны в подавлении TCR-индуцированной пролиферации эффекторных Т-клеток и парадоксальным образом приобретали способность продуцировать IL-2 после вовлечения TCR (Sawasdikosol, выше). Таким образом, HPK1 является важным регулятором функций Treg и периферической самотолерантности.

HPK1 также вовлечен в PGE2-опосредованное ингибирование активации CD4⁺ Т-клеток (Ikegami et al., J Immunol. 166(7):4689-4696, 2001). US2007/0087988 показывает, что активность HPK1 киназы повышается при воздействии физиологических концентраций PGE2 на CD4⁺ T-клетки посредством PGE2-индуцированной активации PKA. Пролиферация Т-клеток с дефицитом HPK1 была резистентна к подавляющему действию PGE2 (US 2007/0087988). Следовательно, PGE2-опосредованная активация HPK1 может являться новым регуляторным путем модуляции иммунного ответа.

Помимо TCR и BCR, HPK1 также трансдуцирует сигналы ниже TGF-R (рецептора трансформирующего фактора роста) (Wang et al., JBC 272(36):22771-22775, 1997) или Gs-связанных PGE2 рецепторов (EP2 и EP4) (Ikegami et al., J Immunol. 166(7):4689-4696, 2001).

HPK1 негативно регулирует адгезию иммунных клеток. В Т-клетках активация TCR также индуцирует активацию интегрина, что приводит к адгезии Т-клеток и образованию иммунологического синапса. Это достигается путем связывания SLP-76 с адаптерным белком, способствующим дегрануляции (ADAP), который необходим для TCR-индуцированной активации интегрина (Wang et al., J. Exp. Med. 200(8):1063-1074, 2004), хотя его конститутивно ассоциированный SKAP55 белок, который таргетирует активированную малую ГТФазу Rap1 на плазматическую мембрану, что приводит к активации интегрина (Kliche et al., MCB 26(19):7130-7144, 2006). Другими словами, тройной комплекс SLP-76/ADAP/SKAP55 передает сигналы TCR на молекулы адгезии семейства интегринов, тем самым способствуя адгезии Т-клеток. HPK1 отрицательно регулирует этот путь, не только подавляя SLP-76 (выше), но также конкурируя с ADAP за один и тот же сайт связывания SH2 на SLP-76, что, в свою очередь, ослабляет активность ADAP нижележащего эффектора Rap1 (Patzak et al., Eur. J. Immunol. 40(11):3220-3225, 2010).

HPK1 аналогичным образом негативно регулирует активацию интегрина и клеточную адгезию в В-клетках. Там HPK1 связан с гомологом SKAP55, называемым SKAP-HOM (Konigsberger et al., PloS One 5(9). pii: e12468, 2010), который необходим для адгезии В-клеток (Togni et al., MCB 25(18):8052-8063, 2005). Считается, что HPK1 индуцирует отрицательный сайт фосфорилирования на SKAP-HOM, который, в свою очередь, подавляет активацию Rap1.

Однако в нейтрофилах HPK1 положительно регулирует их адгезию. Перенос нейтрофилов, включая слабое скручивание, прочное связывание, распространение клеток и диапедез, контролируется снаружи внутрь передачей сигналов активации β2-интегрина, что индуцирует взаимодействие между актином и HIP-55 (HPK1-взаимодействующим белком 55 кДа). Это усиливает высокоаффинную конформацию β2-интегрина, способствуя адгезии нейтрофилов (Hepper et al., J. Immunol. 188(9):4590-4601, 2012; Schymeinsky et al., Blood 114(19):4209-4220, 2009). HPK1 совместно локализуется с HIP-55 и актином в ламеллиподии нейтрофилов при опосредованной β2-интегрином адгезии (Jakob et al., Blood 121(20):4184-4194, 2013). CXCL1-опосредованная адгезия нейтрофилов устраняется либо дефицитом HPK1, либо дефицитом HIP-55 in vitro и in vivo (Jakob, выше; Schymeinsky, выше).

В соответствии со своей ролью в подавлении функции TCR и BCR, HPK1 отрицательно регулирует адаптивные иммунные ответы, и потеря HPK1-опосредованной регуляции активации Т-клеток и иммунных ответов может быть решающим механизмом аутоиммунного патогенеза. У мышей HPK1 KO, хотя развитие Т- и В-клеток оказалось незатронутым (Shui, выше), Т-клетки этих животных показали резко повышенную активацию TCR проксимальной передачи сигналов и нижестоящих ERK, что приводит к гиперпролиферации этих клеток in vitro при анти-CD3 стимуляции (Shui, выше). Т-клетки иммунизированных мышей с дефицитом HPK1 гиперчувствительны к антигенной специфической стимуляции и продуцируют значительно более высокие уровни воспалительных цитокинов, таких как IL-2, IFN-γ и IL-4. Такие мыши также продуцируют гораздо более высокие уровни изоформ IgM и IgG, что предполагает усиленное функционирование В-клеток, нокаутированных по HPK1 (Shui, выше).

HPK1 также отрицательно контролирует аутоиммунитет у мышей, поскольку мыши HPK1 KO более чувствительны к индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE) (Shui, выше). Ослабление HPK1 также способствует аномальной активации Т- и В-клеток и аутоиммунитету у пациентов-людей. HPK1 подавляется в мононуклеарных клетках периферической крови пациентов с псориатическим артритом или в Т-клетках пациентов с системной красной волчанкой (SLE).

Физиологическая функция HPK1 не ограничивается лимфоцитами, так как HPK1 также отрицательно регулирует созревание и активацию дендритных клеток (DC) посредством неизвестного механизма (Alzabin, выше). У мышей HPK1 KO, дендритные клетки костного мозга (BMDC) демонстрируют повышенные уровни костимулирующих молекул CD80/CD86 и повышенное продуцирование провоспалительных цитокинов (Alzabin, выше). Следовательно, антигенпрезентирующая активность дендритных клеток более эффективна у мышей HPK1 KO (Alzabin, выше). Что еще более важно, эрадикация опухоли посредством HPK1 KO BMDC-опосредованного ответа CTL более эффективна, чем эрадикация посредством BMDC дикого типа (Alzabin, выше). Более того, HPK1 также может контролировать противоопухолевый иммунитет через механизмы, зависящие от Т- и В-лимфоцитов. Было показано, что адоптивный перенос Т-клеток с дефицитом HPK1 был более эффективным при контроле роста опухоли и метастазирования, чем Т-клетки дикого типа (Alzabin et al., Cancer Immunol Immunother 59(3):419-429, 2010). Аналогичным образом, BMDC от мышей с нокаутом HPK1 были более эффективны для усиления Т-клеточного ответа для эрадикации карциномы легкого Льюиса по сравнению с BMDC дикого типа (Alzabin et al., J Immunol. 182(10):6187-6194, 2009).

Таким образом, существует потребность в соединениях, ингибирующих HPK1, для лечения заболеваний или нарушений посредством модулирования активности HPK1.

СУЩНОСТЬ изобретения

В настоящем документе описаны соединения формул (I-0), (I-1), (I-2), (I), (II), (II-1), (II-2) или (II-2'), и соединения примеров (совокупно обозначаемые здесь как «соединения по изобретению»), которые ингибируют активность HPK1, и их фармацевтически приемлемые соли.

В одном аспекте, изобретение представляет соединение, представленное структурной формулой (I-0):

(I-0),

или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где

X является СR₂R₃ или NR₃;

A является СR₂ или N;

R является 8-10-членным бициклическим азотсодержащим гетероарилом или 8-10-членным бициклическим азотсодержащим гетероциклилом, необязательно замещенным оксо, где азотсодержащий гетероарил или азотсодержащий гетероциклил, представленный R, имеет 1-3 гетероатома, выбранных из N, O и S и необязательно замещен одним-четырьмя R_a, и где R либо соединен с пиримидиновым кольцом через атом азота кольца, либо R представлен структурой ниже:

или ;

R₁ является Н, дейтерием, галоген, OH, CN, NH₂, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-6 алкилом, фенилом, 5-6-членным гетероарилом, C_3-6 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, фенил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклил, представленный R₁ или в группе, представленной R₁ необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкил, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂; или

R и R₁, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют кольцо, представленное ниже:

или , где связи соединены с пиримидиновым кольцом;

каждый случай R₂ независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-6 алкилом, P(=O)R₁₁R₁₂, S(=O)₂R₁₁, или S(=O)₂NR₁₁R₁₂, где алкил, алкенил, алкинил или алкокси, представленный R₂ или в группе, представленной R₂, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂;

R₃ является Н, C_1-6 алкилом, C(O)C_1-6 алкилом, C_3-6 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, циклоалкил, или гетероциклил, представленный R₃ или в группе, представленной R₃, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклила и NR₁₁R₁₂;

каждый случай R₁₁ и R₁₂ независимо является H или C_1-6 алкилом, где алкил, представленный R₁₁ или R₁₂, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_3-6 циклоалкила и 3-7-членного гетероциклила, или

R₁₁ и R₁₂, вместе с атомом азота или атомом фосфора, к которому они присоединены, образуют 3-7-членный гетероциклил, необязательно замещенный одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси и C_1-4 галогеналкокси;

каждый случай R_a независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, COOH, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR₁₂, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OR₁₁, NR₁₁C(O)R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, C_3-6 циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклилом или 5-6-членным гетероарилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, циклоалкил, гетероциклил или гетероарил, представленный R_a или в группе, представленной R_a, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR₁₂, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)OR₁₁, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂ и 5-6-членного гетероарила; или

два R_a, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют C_3-6 циклоалкил или 3-7-членный гетероциклил, где циклоалкил, или гетероциклил необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси и C_1-4 галогеналкокси;

каждый случай R_b независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, COOH, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR_12, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OR₁₁, NR₁₁C(O)R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, C_3-6 циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклилом или 5-6-членным гетероарилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, циклоалкил, гетероциклил или гетероарил, представленный R_b или в группе, представленной R_b, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R_12, C(O)NR₁₁OR_12, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)OR₁₁, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂ и 5-6-членного гетероарила;

каждый случай R_c независимо является фенилом, 5-6-членным моноциклическим гетероциклилом, имеющим 1-3 гетероатома, выбранных из N и O; 5-6-членным моноциклическим гетероарилом, имеющим 1-3 гетероатома, выбранных из N и O; где фенил, гетероциклил, или гетероарил, представленный R_c, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂ и P(O)di-C_1-6 алкила;

R_a' является С_1-6 алкилом, необязательно замещенным OH, CN, 5-6-членным гетероарилом, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR₁₂, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)OR₁₁, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂;

m равно 0, 1, 2 или 3;

n равно 0, 1, 2, 3 или 4;

p равно 1, 2 или 3;

q равно 1, 2 или 3; и p+q ≤4.

в другом аспекте, в изобретении представлено соединение, представленное структурной формулой (II):

(II),

или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где

A₁ является СR’ или N;

Х является -P(=O)R_3’R_4’;

R’ является Н, дейтерием, галогеном, CN, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR_11’R_12’, C(O)NR_11’R_12’, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, где алкил, алкенил, алкинил или алкокси, представленный R’ или в группе, представленной R’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый случай R_1’ независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR_11’R_12’, C(O)NR_11’R_12’, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, C_3-7 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, циклоалкил или гетероциклил, представленный R_1’, или в группе, представленной R_1’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый случай R_2’ независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR_11’R_12’, C(O)NR_11’R_12’, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, фенилом, 5-6-членным гетероарилом, C_3-7 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, фенил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклил, представленный R_2’ или в группе, представленной R_2’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый R_3’ и R_4’ независимо является H, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, где алкил, алкенил или алкинил, представленный R_3’ или R_4’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый случай R_11’ и R_12’ независимо является H или C_1-6 алкилом, где алкил, представленный R_11’ или R_12’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_3-6 циклоалкила и 3-7-членного гетероциклила, или

R_11’ и R_12’, вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 3-7-членный гетероциклил, необязательно замещенный одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси или C_1-4 галогеналкокси;

m’ равен 0, 1 или 2; и

n’ равен 0, 1 или 2.

В настоящем документе представлены фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество соединений по изобретению или их фармацевтически приемлемых солей, и фармацевтически приемлемый носитель.

Также представлена комбинация, включающая терапевтически эффективное количество соединений по изобретению или их фармацевтически приемлемых солей, и один или несколько терапевтически активных со-агентов.

Настоящее изобретение дополнительно представляет способ ингибирования активности HPK1 у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединений по изобретению или их фармацевтически приемлемых солей.

Настоящее изобретение дополнительно представляет способ лечения субъекта с заболеванием или состоянием, описанным в настоящем документе, таким как рак (такой как рак груди, колоректальный рак, рак легких, рак яичников и рак поджелудочной железы), где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединений по изобретению или их фармацевтически приемлемых солей.

Некоторые варианты осуществления описывают соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль для применения в качестве лекарственного средства, такого как лекарственное средство, действующее как ингибитор HPK1.

Настоящее изобретение также представляет применение соединения по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, содержащей их, в любом из описанных выше способов по изобретению. В одном варианте осуществления, представлено соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, или фармацевтическая композиция, содержащая его, для применения в любом способе по настоящему изобретению, описанном в настоящем документе. В другом варианте осуществления, представлено применение соединения по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, содержащей их, для изготовления лекарственного средства для любого описанного способа по изобретению.

подробное описание изобретения

1. Обзор

Описанное в настоящем документе изобретение относится к ингибиторам HPK1/MAP4K1, их фармацевтически приемлемым солям, их фармацевтическим композициям и способам модулирования (например, ингибирования) активности HPK1/MAP4K1 с их использованием, указанный способ включает введение пациенту/субъекту, нуждающемуся в этом, ингибитора HPK1/MAP4K1 по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли. В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению или их фармацевтически приемлемые соли применимы для терапевтического введения для усиления, стимуляции и/или повышения иммунитета при лечении рака.

Например, способ лечения заболевания или нарушения, ассоциированного с ингибированием взаимодействия HPK1, может включать введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения, представленного в настоящем документе, или его фармацевтически приемлемой соли. Соединения по настоящему изобретению можно использовать отдельно, в комбинации с другими агентами или методами лечения, или в качестве адъюванта или неоадъюванта для лечения заболеваний или нарушений, включая раки.

2. Определения

Используемые здесь термины «а», «an», «the» и аналогичные термины, используемые в контексте настоящего изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), следует толковать как охватывающие как единственное, так и множественное число, если иное не указано в настоящем документе или явно противоречат контексту.

Используемый в настоящем документе термин «галоген» означает галоген и включает хлор, фтор, бром и йод.

Термин «алкил», используемый отдельно или как часть большей группы, такой как «алкокси» или «галогеналкил» и подобные, означает насыщенный алифатический одновалентный углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью. Если не указано иное, алкильная группа обычно имеет 1-4 или 1-6 атомов углерода, т.е. (C₁-C₄)алкил или (C₁-C₆)алкил. В настоящем документе «(C₁-C₄)алкильная группа» означает радикал, содержащий от 1 до 4 атомов углерода в линейной или разветвленной структуре. Примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил и т.д.

Термин «С_1-6алкилен» относится к двухвалентному полностью насыщенному одновалентному углеводородному радикалу с разветвленной или прямой цепью, имеющему от 1 до 6 атомов углерода. Аналогично, термины «С_1-4алкилен», «С_1-3алкилен» и «С_1-2алкилен» должны толковаться соответственно. Типовые примеры C_1-6алкилена включают, но не ограничены ими, метилен, этилен, н-пропилен, изопропилен, н-бутилен, втор-бутилен, изобутилен, трет-бутилен, н-пентилен, изопентилен, неопентилен, и н-гексилен.

Термин «C₁-C₆алкил, необязательно замещенный гидроксилом» относится к C₁-C₆алкилу, как определено выше, который может быть замещен одним или несколькими гидрокси. Примеры включают, но не ограничены ими, гидроксиметил, гидроксиэтил, 1,2-дигидроксиэтил, 2,3-дигидроксипропил и т.д.

Используемый в настоящем документе термин «ди-С_1-6алкиламино» относится к группе формулы -N(R_a)-R_a, где каждый R_a является C_1-6алкилом, который может быть одинаковым или разным, как определено выше, по аналогии с термином «моно-C_1-6алкиламино», который относится к группе формулы -N(H)-R_a, где R_a является C_1-6алкилом, как определено выше.

Термин «алкенил» означает одновалентный углеводородный радикал с разветвленной или прямой цепью, содержащий, по меньшей мере, одну двойную связь. Алкенил может быть моно- или полиненасыщенным и может существовать в E или Z конфигурации. Если не указано иное, алкенильная группа обычно имеет 2-6 атомов углерода, т.е. (C₂-C₆)алкенил. Например, «(C₂-C₆)алкенил» означает радикал, имеющий 2-6 атомов углерода в линейной или разветвленной структуре.

Термин «алкинил» означает одновалентный углеводородный радикал с разветвленной или прямой цепью, содержащий, по меньшей мере, одну тройную связь. Если не указано иное, алкинильная группа обычно имеет 2-6 атомов углерода, т.е. (C₂-C₆)алкинил. Например, «(C₂-C₆)алкинил» означает радикал, имеющий 2-6 атомов углерода в линейной или разветвленной структуре.

Термин «алкокси» означает алкильный радикал, присоединенный через связывающий атом кислорода, представленный -O-алкилом. Например, «C₁-C₆алкокси» относится к -O-C₁-C₆алкилу, где «алкил» такой, как определен выше, и «(C₁-C₄)алкокси» включает метокси, этокси, пропокси и бутокси, и т.д. Типовые примеры алкокси включают, но не ограничены ими, метокси, этокси, пропокси, 2-пропокси, бутокси, трет-бутокси, пентилокси, гексилокси, циклопропилокси, циклогексилокси и подобные. Обычно, алкоксигруппы содержат примерно от 1 до 6 атомов углерода, от 1 до 4 атомов углерода или от 1 до 2 атомов углерода.

Термины «галогеналкил» и «галогеналкокси» означают алкил или алкокси, в зависимости от случая, замещенный одним или несколькими атомами галогена. Примеры галогеналкила включают, но не ограничены ими, трифторметил, трихлорметил, пентафторэтил и подобные.

Таким образом, термин «C_1-6алкил, необязательно замещенный галогеном» относится к C₁-C₆алкилу, как определено выше, который может быть замещен одним или несколькими галогенами. Примеры включают, но не ограничены ими, трифторметил, дифторметил, фторметил, трихлорметил, 2,2,2-трифторэтил, 1-фторметил-2-фторэтил, 3-бром-2-фторпропил и 1-бромметил-2-бромэтил.

Используемый в настоящем документе термин «циклоалкил» включает насыщенные циклические, бициклические, трициклические или полициклические углеводородные группы, содержащие 3-14 атомов углерода, содержащие указанное число колец и атомов углерода (например, C₃-C₁₄ моноциклический, C₄-C₁₄ бициклический, C₅-C₁₄ трициклический или C₆-C₁₄ полициклический циклоалкил). В некоторых вариантах осуществления, «циклоалкилом» является моноциклический циклоалкил. Примеры моноциклических циклоалкильных групп включают циклопентил (С₅), циклогексил (С₆), циклопропил (С₃), циклобутил (С₄), циклогептил (С₇) и циклооктил (С₈). В некоторых вариантах осуществления, «циклоалкилом» является бициклический циклоалкил. Примеры бициклических циклоалкилов включают бицикло[1.1.0]бутан (С₄), бицикло[1.1.1]пентан (С₅), спиро[2.2]пентан (С₅), бицикло[2.1.0]пентан (С₅), бицикло[2.1.1]гексан (С₆), бицикло[3.3.3]ундекан (С₁₁), декагидронафталин (С₁₀), бицикло[4.3.2]ундекан (С₁₁), спиро[5.5]ундекан (C₁₁) и бицикло[4.3.3]додекан (С₁₂). В некоторых вариантах осуществления, «циклоалкилом» является трициклический циклоалкил. Примеры трициклических циклоалкилов включают адамантин (С₁₂). Если не указано иное, «циклоалкил» имеет от трех до шести атомов углерода и является моноциклическим.

Термин «арильная группа», используемый отдельно или как часть большей группы, такой как «аралкил», «аралкокси» или «арилоксиалкил», означает карбоциклическое ароматическое кольцо. Термин «арил» может использоваться взаимозаменяемо с терминами «арильное кольцо», «карбоциклическое ароматическое кольцо», «арильная группа» и «карбоциклическая ароматическая группа». Обычно арилом является моноциклический, бициклический или трициклический арил, содержащий 6-20 атомов углерода, обычно 6-14 атомов углерода в кольце. Кроме того, используемый в настоящем документе термин «арил» относится к ароматическому заместителю, которым может являться одно ароматическое кольцо или несколько ароматических колец, которые конденсированы вместе. Примеры включают фенил, нафтил, антраценил, 1,2-дигидронафтил, 1,2,3,4-тетрагидронафтил, флуоренил, инданил, инденил и подобные.

«Замещенная арильная группа» замещена на любом одном или нескольких замещаемых атомов в кольце, который является атомом углерода кольца, связанным с водородом. Замещенный арил обычно замещен 1-5 (например, одним, двумя или тремя) заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из: гидроксила, тиола, циано, нитро, C₁-C₄ алкила, C₁-C₄ алкенила, C₁-C₄ алкинила, C₁-C₄ алкокси, C₁-C₄ тиоалкила, C₁-C₄ алкенилокси, C₁-C₄ алкинилокси, галогена, C₁-C₄ алкилкарбонила, карбокси, C₁-C₄ алкоксикарбонила, амино, C₁-C₄ алкиламино, ди-C₁-C₄ алкиламино, C₁-C₄ алкиламинокарбонила, ди-C₁-C₄ алкиламинокарбонила, C₁-C₄ алкилкарбониламино, C₁-C₄ алкилкарбонила, C₁-C₄ алкиламино, сульфонила, сульфамоила, алкилсульфамоила и C₁-C₄ алкиламиносульфонила, где каждая из вышеупомянутых углеводородных групп (например, алкильные, алкенильные, алкинильные, алкоксильные остатки) может быть дополнительно замещена одним или несколькими остатками, независимо выбранными, в каждом случае, из галогена, гидроксила или C₁-C₄ алкокси.

Термин «гетероциклильная группа» или «гетероциклическая группа» означает моноциклическое неароматическое (включая частично насыщенное) кольцо, предпочтительно, содержащее 3-10 членов, предпочтительно, содержащее 1-4 гетероатома в кольце, или полициклическое кольцо, содержащее кольцо с, предпочтительно, 7-20 членами, и от предпочтительно от 1 до 4 кольцевых гетероатомов, где полициклическое кольцо имеет одно или несколько моноциклических неароматических гетероциклических колец, конденсированных с одним или несколькими ароматическими или гетероароматическими кольцами. Гетероциклильная группа обычно имеет 3-7, 3-24, 4-16, 5-10 или 5 или 6 атомов в кольце; где необязательно от одного до четырех, особенно один или два атома в кольце являются гетероатомом (остальные атомы в кольце являются углеродом). Каждый гетероатом независимо выбран из азота, четвертичного азота, окисленного азота (например, NO); кислорода; и серы, включая сульфоксид и сульфон. Гетероциклическая группа может быть присоединена к гетероатому или атому углерода. Примеры гетероциклов включают тетрагидрофуран (ТГФ), дигидрофуран, 1,4-диоксан, морфолин, 1,4-дитиан, пиперазин, пиперидин, 1,3-диоксолан, имидазоиздин, имидазолин, пирролин, пирролидин, тетрагидропиран, дигидропиран, оксатиолан, дитиолан, 1,3-диоксан, 1,3-дитиан, оксатиан, тиоморфолин и подобные.

Гетероциклильная группа может включать конденсированные или мостиковые кольца, а также спироциклические кольца. В одном варианте осуществления, гетероциклильной группой является бициклическое кольцо, имеющее моноциклическое неароматическое гетероциклическое кольцо, конденсированное с фенильной группой. Типовая полициклическая гетероциклическая группа включает тетрагидроизохинолинил (такой как 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил, 2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-6-ил и 2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-6-ил), изоиндолинил (например, 2-этилизоиндолин-5-ил, 2-метилизоиндолин-5-ил), индолинил, тетрагидробензо[f]оксазепинил (например, 2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-7-ил).

Термин «гетероцикл», «гетероциклил» или «гетероциклический», будь то насыщенный или частично ненасыщенный, также относится к кольцам, которые необязательно замещены. Замещенным гетероциклилом может быть гетероциклильная группа, независимо замещенная 1-4, например, одним, или двумя, или тремя, или четырьмя заместителями.

В некоторых вариантах осуществления, гетероциклильной группой является 3-14-членная не ароматическая кольцевая система, содержащая кольцевые атомы углерода и 1-4 кольцевых гетероатома, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода и серы («3-14-членный гетероциклил»).

Термины «гетероарил», «гетероароматический», «гетероарильное кольцо», «гетероарильная группа», «гетероароматическое кольцо» и «гетероароматическая группа», используемые отдельно или как часть большей группы, такой как «гетероаралкил» или «гетероарилалкокси», относится к ароматическим кольцевым группам, имеющим 5-14 кольцевых атомов, выбранных из углерода и, по меньшей мере, один (обычно, 1-4, более типично, 1 или 2) гетероатомов (например, кислорода, азота или серы). «Гетероарил» включает моноциклические кольца и полициклические (например, би- или тициклические) кольца, в которых моноциклическое гетероароматическое кольцо конденсировано с одним или несколькими другими карбоциклическими ароматическими или гетероароматическими кольцами. Таким образом, «5-14-членный гетероарил» включает моноциклические, бициклические или трициклические кольцевые системы.

Примеры моноциклических 5-6-членных гетероарильных групп включают фуранил (например, 2-фуранил, 3-фуранил), имидазолил (например, N-имидазолил, 2-имидазолил, 4-имидазолил, 5-имидазолил), изоксазолил (например, 3-изоксазолил, 4-изоксазолил, 5-изоксазолил), оксадиазолил (например, 2-оксадиазолил, 5-оксадиазолил), оксазолил (например, 2-оксазолил, 4-оксазолил, 5-оксазолил), пиразолил (например, 3-пиразолил, 4 -пиразолил), пирролил (например, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил), пиридил (например, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил), пиримидинил (например, 2-пиримидинил, 4-пиримидинил, 5-пиримидинил), пиридазинил (например, 3-пиридазинил), тиазолил (например, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил), триазолил (например, 2-триазолил, 5-триазолил), тетразолил (например, тетразолил), тиенил (например, 2-тиенил, 3-тиенил), пиримидинил, пиридинил и пиридазинил.

Обычно гетероарилом является 5-10-членная кольцевая система (например, 5-6-членный моноцикл или 8-10-членный бицикл) или 5-6-членная кольцевая система. Типовые гетероарильные группы включают 2- или 3-тиенил, 2- или 3-фурил, 2- или 3-пирролил, 2-, 4- или 5-имидазолил, 3-, 4- или 5-пиразолил, 2-, 4- или 5-тиазолил, 3-, 4- или 5-изотиазолил, 2-, 4- или 5-оксазолил, 3-, 4- или 5-изоксазолил, 3- или 5-1,2,4-триазолил, 4- или 5-1,2,3-триазолил, тетразолил, 2-, 3- или 4-пиридил, 3- или 4-пиридазинил, 3-, 4- или 5-пиразинил, 2-пиразинил и 2-, 4- или 5-пиримидинил.

Примеры полициклических ароматических гетероарильных групп включают карбазолил, бензимидазолил, бензотиенил, бензофуранил, индолил, хинолинил, бензотриазолил, бензотиазолил, бензоксазолил, бензимидазолил, изохинолинил, индолил, изоиндолил, акридинил или бензизоксазолил.

Таким образом, термин «гетероарил» также относится к группе, в которой гетероароматическое кольцо конденсировано с одним или несколькими арильными, циклоалифатическими или гетероциклильными кольцами, где радикал или точка присоединения находится на гетероароматическом кольце. Неограничивающие примеры включают 1-, 2-, 3-, 5-, 6-, 7- или 8-индолизинил, 1-, 3-, 4-, 5-, 6- или 7-изоиндолил, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- или 7-индолил, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- или 7-индазолил, 2-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-пуринил, 1-, 2-, 3-, 4-, 6-, 7-, 8- или 9-хинолизинил, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-хинолиил, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-изохинолиил, 1-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-фталазинил, 2-, 3-, 4-, 5- или 6-нафтиридинил, 2-, 3-, 5-, 6-, 7- или 8-хиназолинил, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-циннолинил, 2-, 4-, 6- или 7-птеридинил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-4аН карбазолил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-карбзаолил, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- или 9-карболинил, 1-, 2-, 3-, 4-, 6-, 7-, 8-, 9- или 10-фенантридинил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- или 9-акридинил, 1-, 2-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- или 9-перимидинил, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 8 -, 9- или 10-фенатролинил, 1-, 2-, 3-, 4-, 6-, 7-, 8- или 9-феназинил, 1-, 2-, 3-, 4-, 6-, 7-, 8-, 9- или 10-фенотиазинил, 1-, 2-, 3-, 4-, 6-, 7-, 8-, 9- или 10-феноксазинил, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- или 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- или 10-бензизохинолинил, 2-, 3-, 4- или тиено[2,3-b]фуранил, 2-, 3-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10- или 11-7H-пиразино[2,3-c]карбазолил, 2-, 3-, 5-, 6- или 7-2H-фуро[3,2-b]-пиранил, 2-, 3-, 4-, 5-, 7- или 8-5H-пиридо[2,3-d]-о-оксазинил, 1-, 3- или 5-1H-пиразоло[4,3-d]-оксазолил, 2-, 4- или 5-4H-имидазо[4,5-d]-тиазолил, 3-, 5- или 8-пиразино[2,3-d]пиридазинил, 2-, 3-, 5- или 6-имидазо[2,1-b]-тиазолил, 1-, 3-, 6-, 7-, 8- или 9-фуро[3,4-c]циннолинил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 8-, 9-, 10- или 11-4H-пиридо[2,3-c]карбазолил, 2-, 3-, 8- или 7-имидазо[1,2-b][1,2,4]триазинил, 7-бензо[b]тиенил, 2-, 4-, 5-, 6- или 7-бензоксазолил, 2-, 4-, 5-, 6- или 7-бензимидазолил, 2-, 4-, 4-, 5-, 6- или 7-бензотиазолил, 1-, 2-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- или 9-бензоксапинил, 2-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-бензоксазинил, 1-, 2-, 3-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10- или 11-1H-пирроло[1,2-b][2]бензапинил.

Типовые конденсированные гетероарильные группы включают, но не ограничены ими, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-хинолинил, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-изохинолинил, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- или 7-индолил, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- или 7-бензо[b]тиенил, 2-, 4-, 5-, 6- или 7-бензоксазолил, 2-, 4-, 5-, 6- или 7-бензимидазолил и 2-, 4-, 5-, 6- или 7-бензотиазолил.

Используемый в настоящем документе термин пиридин или пиридил, необязательно замещенный гидрокси, например, 2-пиридил, 3-пиридил или 4-пиридил, относится к соответствующему гидроксипиридину или гидроксипиридилу и может включать его таутомерную форму, такую как соответствующий пиридон. или пиридонил.

Используемый в настоящем документе термин пиридин или пиридил, необязательно замещенный оксо, например, 2-пиридил, 3-пиридил или 4-пиридил, относится к соответствующему пиридону или пиридонилу и может включать его таутомерную форму, такую как соответствующий гидроксипиридин или гидроксипиридил, при условии, что указанная таутомерная форма может быть получена. Пиридин или пиридил, необязательно замещенный оксо, может дополнительно относиться к соответствующему пиридин-N-оксиду или пиридил-N-оксиду.

«Замещенная гетероарильная группа» замещена на любом одном или нескольких замещаемых атомов в кольце, которые являются атомом углерода в кольце или атомом азота в кольце, связанным с водородом.

Термин «мостиковая бициклическая группа» относится к кольцевой системе, которая включает два кольца, которые имеют, по меньшей мере, три общих соседних атома в кольце.

Используемые в данном документе, многие группы (например, алкил, алкилен, циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклил) называются либо «замещенными», либо «необязательно замещенными». Когда группа модифицирована одним из этих терминов, если не указано иное, это означает, что любая часть группы, известная специалисту в данной области техники как доступная для замещения, может быть замещена, включая один или несколько заместителей. Если присутствует более одного заместителя, то каждый заместитель может быть выбран независимо. Такие средства для замещения хорошо известны в данной области техники и/или описаны в настоящем изобретении. Необязательными заместителями могут быть любые заместители, подходящие для присоединения к группе.

Если подходящие заместители конкретно не перечислены, типовые заместители включают, но не ограничены ими: (C₁-C₅) алкил, (C₁-C₅) гидроксиалкил, (C₁-C₅) галогеналкил, (C₁-C₅) алкокси, (C₁-C₅) галогеналкокси, галоген, гидроксил, циано, амино, -CN, -NO₂, -OR^c1, -NR^a1R^b1, -S(O)_iR^a1, -NR^a1S(O)_iR^b1, -S(O)_iNR^a1R^b1, -C(=O)OR^a1, -OC(=O)OR^a1, -C(=S)OR^a1, -O(C=S)R^a1, -C(=O)NR^a1R^b1, -NR^a1C(=O)R^b1, -C(=S)NR^a1R^b1, -C(=O)R^a1, -C(=S)R^a1, NR^a1C(=S)R^b1, -O(C=O)NR^a1R^b1, -NR^a1(C=S)OR^b1, -O(C=S)NR^a1R^b1, -NR^a1(C=O)NR^a1R^b1, -NR^a1(C=S)NR^a1R^b1, фенил или 5-6-членный гетероарил. Каждый R^a1 и каждый R^b1 независимо выбраны из -H и (C₁-C₅) алкила, необязательно замещенного гидроксилом или (C₁-C₃)алкокси; R^c1 является -H, (C₁-C₅) галогеналкилом или (C₁-C₅) алкилом, где (C₁-C₅) алкил необязательно замещен гидроксилом или (C₁-C₃) алкокси.

Описанные в настоящем документе соединения могут существовать в различных таутомерных формах. Термин «таутомеры» или «таутомерный» относится к двум или более взаимопревращаемым соединениям/заместителям, возникающим в результате, по меньшей мере, одной формальной миграции атома водорода и, по меньшей мере, одного изменения валентности (например, одинарной связи на двойную связь, тройной связи на одинарную связь, или наоборот). Типовые таутомеризации включают таутомеризации кето-енол, амид-имид, лактам-лактим, енамин-имин и енамин-(другой енамин). Настоящие идеи охватывают соединения в форме таутомеров, которые включают формы, структурно не изображенные. Все такие изомерные формы таких соединений специально включены. Если таутомер соединения является ароматическим, то это соединение является ароматическим.

Соединения любой из описанных выше формул могут проявлять один или несколько видов изомерии (например, оптическую, геометрическую или таутомерную изомерию). Соединения любой из формул, описанных выше, также могут быть мечены изотопами. Такое изменение подразумевается для соединений любой из формул, описанных выше, определенных в соответствии со ссылкой на их структурные особенности и, следовательно, в пределах объема настоящего изобретения.

Соединения любой из описанных выше формул, содержащие один или несколько асимметричных атомов углерода, могут существовать в виде двух или нескольких стереоизомеров. Если соединение любой из формул, описанных выше, содержит алкенильную или алкениленовую группу, возможны геометрические цис/транс (или Z/E) изомеры. Там, где структурные изомеры взаимопревращаемы через низкий энергетический барьер, может иметь место таутомерная изомерия («таутомерия»). Она может принимать форму протонной таутомерии в соединениях любой из описанных выше формул, содержащих, например, имино, кето или оксимную группу, или так называемой валентной таутомерии в соединениях, содержащих ароматическую группу. Из этого следует, что одно соединение может проявлять более одного типа изомерии.

Соединения, имеющие один или несколько хиральных центров, могут существовать в различных стереоизомерных формах. Стереоизомеры являются соединениями, которые отличаются только своим пространственным расположением. Стереоизомеры включают все диастереомерные, энантиомерные и эпимерные формы, а также рацематы и их смеси. Термин «геометрический изомер» относится к соединениям, имеющим, по меньшей мере, одну двойную связь, где двойные связи могут находиться в цис (также называемой syn или entgegen (Е)) или транс (также называемой anti или zusammen (Z)) форме, а также их смеси. Когда описанное соединение названо или изображено по структуре без указания стереохимии, подразумевается, что название или структура охватывает один или несколько возможных стереоизомеров, или геометрических изомеров, или смесь охватываемых стереоизомеров или геометрических изомеров.

Когда геометрический изомер изображен по названию или структуре, следует понимать, что названный или изображенный изомер существует в большей степени, чем другой изомер, то есть, что геометрическая изомерная чистота названного или изображенного геометрического изомера превышает 50%, например, чистота составляет, по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 99,9% по массе. Геометрическую изомерную чистоту определяют путем деления массы названного или изображенного геометрического изомера в смеси на общую массу всех геометрических изомеров в смеси.

Рацемическая смесь означает 50% одного энантиомера и 50% его соответствующего энантиомера. Когда соединение с одним хиральным центром названо или изображено без указания стереохимии хирального центра, подразумевается, что название или структура охватывает обе возможные энантиомерные формы (например, обе энантиомерно-чистые, энантиомерно-обогащенные или рацемические) соединения. Когда соединение с двумя или несколькими хиральными центрами названо или изображено без указания стереохимии хиральных центров, подразумевается, что название или структура охватывает все возможные диастереомерные формы (например, диастереомерно чистые, диастереомерно обогащенные и эквимолярные смеси одного или нескольких диастереомеров (например, рацемические смеси) соединения.

Энантиомерные и диастереомерные смеси можно разделить на составляющие их энантиомеры или стереоизомеры с помощью хорошо известных способов, таких как хирально-фазовая газовая хроматография, хирально-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография, кристаллизация соединения в виде хирального солевого комплекса или кристаллизация соединения в хиральном растворителе. Энантиомеры и диастереомеры также могут быть получены из диастереомерно- или энантиомерно-чистых промежуточных соединений, реагентов и катализаторов с помощью хорошо известных способов асимметричного синтеза.

Когда соединение обозначено названием или структурой, которые указывают на один энантиомер, если не указано иное, соединение имеет оптически чистоту, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 99,9% (также обозначается как «энантиомерно чистое»). Оптическая чистота представляет собой массу смеси названного или изображенного энантиомера, деленную на общую массу смеси обоих энантиомеров.

Когда стереохимия описанного соединения названа или изображена структурой, и названная или изображенная структура включает более одного стереоизомера (например, как в диастереомерной паре), следует понимать, что включены один из охватываемых стереоизомеров или любая смесь охватываемых стереоизомеров. Далее следует понимать, что стереоизомерная чистота названных или изображенных стереоизомеров составляет, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 99,9% по массе. Стереоизомерную чистоту в этом случае определяют путем деления общей массы смеси стереоизомеров, охватываемой названием или структурой, на общую массу смеси всех стереоизомеров.

Фармацевтически приемлемые соли соединений любой из описанных выше формул могут также содержать противоион, который является оптически активным (например, d-лактат или l-лизин) или рацемическим (например, dl-тартрат или dl-аргинин).

Цис/транс изомеры могут быть разделены обычными методами, хорошо известными специалистам в данной области, например, хроматографией и фракционной кристаллизацией.

Обычные методики получения/выделения индивидуальных энантиомеров включают хиральный синтез из подходящего оптически чистого предшественника или разделение рацемата (или рацемата соли или производного) с использованием, например, хиральной жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД). Альтернативно, рацемат (или рацемический предшественник) может быть подвергнут взаимодействию с подходящим оптически активным соединением, например спиртом, или, в случае, когда соединение любой из формул, описанных выше, содержит кислотную или основную группу, основанием или кислотой, например, 1-фенилэтиламином или винной кислотой. Полученная диастереомерная смесь может быть разделена хроматографией и/или фракционной кристаллизацией, и один или оба диастереоизомера превращены в соответствующие чистые энантиомеры способами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Хиральные соединения любой из описанных выше формул (и их хиральные предшественники) могут быть получены в энантиомерно-обогащенной форме с использованием хроматографии, обычно ВЭЖХ, на асимметричной смоле с подвижной фазой, состоящей из углеводорода, обычно гептана или гексана, содержащего от 0 до 50% по объему изопропанола, обычно от 2% до 20%, и от 0 до 5% по объему алкиламина, обычно 0,1% диэтиламина. Концентрация элюата дает обогащенную смесь. Можно использовать хиральную хроматографию с использованием суб- и сверхкритических жидкостей. Способы хиральной хроматографии, применимые в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, известны в данной области техники (см., например, Smith, Roger M., Loughborough University, Loughborough, UK; Chromatographic Science Series (1998), 75 (Supercritical Fluid Chromatography with Packed Columns), pp. 223-249 и цитируемые там ссылки). Колонки могут быть получены от Chiral Technologies, Inc, West Chester, Pa., USA, дочерней компании Daicel® Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan.

Следует подчеркнуть, что соединения любой из формул, описанных выше, представлены в настоящем документе в единственной таутомерной форме, все возможные таутомерные формы включены в объем настоящего изобретения.

Настоящее описание также включает все фармацевтически приемлемые изотопно-меченые соединения любой из формул, описанных выше, в которых один или несколько атомов заменены атомами, имеющими такой же атомный номер, но атомную массу или массовое число, отличное от атомной массы или массового числа, которое преобладает в природе.

Примеры изотопов, подходящих для включения в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, такие как ²H и ³H, углерода, такие как ¹¹C, ¹³C и ¹⁴C, хлора, такие как ³⁶Cl, фтора, такие как ¹⁸F, йода, такие как ¹²³I и ¹²⁵I, азота, такие как ¹³N и ¹⁵N, кислорода, такие как ¹⁵O, ¹⁷O и ¹⁸O, фосфора, такие как ³²P, и серы, такие как ³⁵S.

Определенные изотопно-меченые соединения любой из формул, описанных выше, например соединения, включающие радиоактивный изотоп, применимы в исследованиях распределения лекарственного средства и/или субстрата в тканях. Радиоактивные изотопы тритий, т.е. ³Н, и углерод-14, т.е. ¹⁴С, особенно пригодны для этой цели ввиду легкости их введения и легкости обнаружения.

Замещение более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий, т.е. ²H, может обеспечить определенные терапевтические преимущества, возникающие в результате большей метаболической стабильности, например, увеличение периода полужизни in vivo или снижение требований к дозировке.

Замещение изотопами, излучающими позитроны, такими как ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O и ¹³N, может быть полезна в исследованиях позитронно-эмиссионной топографии (ПЭТ) для изучения занятости субстрата рецептором.

Меченые изотопами соединения любой из формул, описанных выше, обычно могут быть получены обычными способами, известными специалистам в данной области техники, или способами, аналогичными описанным в прилагаемых примерах и примерах приготовления, с использованием соответствующего изотопно-меченного реагента, вместо не меченого реагента, использовавшегося ранее.

Фармацевтически приемлемые сольваты в соответствии с настоящим изобретением включают сольваты, в которых растворитель кристаллизации может быть изотопно замещен, например, D₂O, d₆-ацетон, d₆-ДМСО.

Следует понимать, что когда соединение в настоящем документе представлено структурной формулой или обозначено в настоящем документе химическим названием, все другие таутомерные формы, которые могут существовать для соединения, охватываются структурной формулой.

Любая приведенная в настоящем документе формула также предназначена для представления не меченых форм, а также изотопно-меченых форм соединений, таких как 2H. Кроме того, замена дейтерием (т.е. 2H или D) может обеспечить определенные терапевтические преимущества в результате большей метаболической стабильности, например, увеличение периода полужизни in vivo или снижение требований к дозировке или улучшение терапевтического индекса, если понимать, что дейтерий в этом контексте рассматривается как заместитель соединения формулы (I-0), (I-1) или (I-2). Концентрация такого более тяжелого изотопа, в частности дейтерия, может определяться коэффициентом изотопного обогащения. Используемый в настоящем документе термин «коэффициент изотопного обогащения» означает соотношение между изотопным содержанием и естественным содержанием определенного изотопа. Если заместитель в соединении по данному изобретению обозначен как дейтерий, то такое соединение имеет коэффициент изотопного обогащения для каждого указанного атома дейтерия, по меньшей мере, 3500 (включение 52,5% дейтерия на каждый указанный атом дейтерия), по меньшей мере, 4000 (включение 60% дейтерия), по меньшей мере, 4500 (включение дейтерия 67,5%), по меньшей мере, 5000 (включение 75% дейтерия), по меньшей мере, 5500 (включение 82,5% дейтерия), по меньшей мере, 6000 (включение 90% дейтерия), по меньшей мере, 6333,3 (включение 95% дейтерия), по меньшей мере, 6466,7 (включение дейтерия 97%), по меньшей мере, 6600 (включение дейтерия 99%) или по меньшей мере, 6633,3 (включение дейтерия 99,5%).

Соединения по данному изобретению могут существовать в свободной форме для лечения или, при необходимости, в форме фармацевтически приемлемой соли.

Используемые в настоящем документе термины «соль» или «соли» относятся к кислотно-аддитивной или основно-аддитивной соли по изобретению. «Соли» включают, в частности, «фармацевтически приемлемые соли». Термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединений по данному изобретению и, которые обычно не являются биологически или иным образом нежелательными, во многих случаях, соединения по настоящему изобретению способны образовывать кислотные и/или основные соли благодаря наличию амино и/или карбоксильных групп или групп, подобных им.

Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть образованы с неорганическими кислотами и органическими кислотами, например, ацетат, аспартат, бензоат, безилат, бромид/гидробромид, бикарбонат/карбонат, бисульфат/сульфат, камфорсульфонат, хлорид/гидрохлорид, хлортеофилионат, цитрат, этандисульфонат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкуронат, гиппурат, гидройодид/йодид, изотионат, лактат, лактобионат, лаурилсуифат, малат, малеат, малонат, миндалят, мезилат, метилсульфат, нафтоат, напсилат, никотинат, нитрат, октадеканоат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, фосфат/гидрофосфат/дигидрофосфат, полигайактуронат, пропионат, стеарат, сукцинат, субсалицилат, тартрат, тозилат и трифторацетат.

Неорганические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и подобные.

Органические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, толуолсульфоновую кислоту, сульфосалициловую кислоту и подобные. Фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли могут быть образованы с неорганическими и органическими основаниями. Неорганические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, соли аммония и металлов из столбцов с I по XI I периодической таблицы, в некоторых вариантах осуществления, соли получают из натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, серебра, цинка и меди. В некоторых вариантах осуществления, подходящие соли включают соли аммония, калия, натрия, кальция и магния.

Органические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, включая встречающиеся в природе замещенные амины, циклические амины, основные ионообменные смолы, и подобные. Некоторые органические амины включают изопропиламин, бензатин, холинат, диэтаноламин, диэтиламин, лизин, меглумин, пиперазин и трометамин.

Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению могут быть синтезированы из основной или кислотной группы обычными химическими способами. Как правило, такие соли могут быть получены путем взаимодействия свободных кислотных форм этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания (например, гидроксида Na, Ca, Mg или K, карбоната, бикарбоната и подобного) или путем взаимодействия форм свободного основания этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующей кислоты. Такие реакции обычно проводят в воде, или в органическом растворителе, или в их смеси. Как правило, там, где это возможно, желательно использовать не водные среды, такие как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Списки дополнительных подходящих солей можно найти, например, в «Remington’s Pharmaceutical Sciences,» 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, (1985); и в «Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use» by Stahl and Wermuth (Wiley- VCH, Weinheim, Germany, 2002).

Термины «композиция» и «состав» используются взаимозаменяемо.

«Субъектом» является млекопитающее, предпочтительно человек, но также может быть животное, нуждающееся в ветеринарном лечении, например, домашние животные (например, собаки, кошки и подобные), сельскохозяйственные животные (например, коровы, овцы, свиньи, лошади и подобные) и лабораторные животные (например, крысы, мыши, морские свинки и подобные).

Как используется в настоящем документе, субъект «нуждается» в лечении, если такой субъект получит биологическую, медицинскую пользу или улучшение качества жизни от такого лечения.

Термин «вводить», «введение» или «введение» относится к способам введения соединения по изобретению или его композиции в или на субъекта. Эти способы включают, но не ограничены ими, внутрисуставные (в суставы), внутривенные, внутримышечные, внутриопухолевые, внутрикожные, внутрибрюшинные, подкожные, пероральные, местные, интратекальные, ингаляционные, чрескожные, ректальные и подобные. Техники введения, которые можно использовать с агентами и способами, описанными в настоящем документе, можно найти, например, в Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current ed.; Pergamon; and Remington’s, Pharmaceutical Sciences (current edition), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania.

Используемый в настоящем документе термин «ингибировать», «ингибирование» или «ингибирование» относится к уменьшению или подавлению данного состояния, симптома или нарушения или заболевания, или к значительному снижению исходной активности биологической активности или процесса.

Термины «лечение», «лечить» и «лечение» относятся к обращению вспять, облегчению или ингибированию прогрессирования заболевания, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, лечение может быть назначено после того, как один или несколько признаков или симптомов заболевания развились или наблюдались (т.е. терапевтическое лечение). В других вариантах осуществления, лечение можно проводить при отсутствии признаков или симптомов заболевания. Например, лечение может быть назначено восприимчивому субъекту до появления симптомов (т.е. профилактическое лечение) (например, в свете симптомов в анамнезе и/или в свете воздействия патогена). Лечение также можно продолжать после исчезновения симптомов, например, чтобы отсрочить или предотвратить рецидив.

Термины «состояние», «заболевание» и «нарушение» используются взаимозаменяемо.

Как правило, эффективное количество соединения, указанное в настоящем документе, варьируется в зависимости от различных факторов, таких как конкретное лекарственное средство или соединение, фармацевтический состав, способ введения, тип заболевания или нарушения, личность субъекта или хозяина, которого лечат, и подобных, но, тем не менее, может быть определено специалистом в данной области техники обычным способом. Эффективное количество соединения по настоящему изобретению может быть легко определено специалистом в данной области техники обычными способами, известными в данной области техники.

Термин «эффективное количество» означает количество при введении субъекту, которое приводит к благоприятным или желаемым результатам, включая клинические результаты, например, ингибирует, подавляет или уменьшает симптомы состояния, подвергаемого лечению, у субъекта, по сравнению с контролем. Например, эффективное количество можно давать в виде стандартной дозированной формы (например, от 1 мг до примерно 50 г в сутки, например, от 1 мг до примерно 5 г в сутки).

Термин «терапевтически эффективное количество» соединения по настоящему изобретению относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ субъекта, например снижение или ингибирование активности фермента или белка, или облегчение симптомов, облегчение состояний, замедление или задержку прогрессирования заболевания или предотвращение заболевания и т.д. В одном неограничивающем варианте осуществления, термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении субъекту эффективно для (1) по меньшей мере, частичного облегчения, ингибирования, предотвращения и/или или улучшения состояния, или нарушения, или заболевания, (i) опосредованного HPK1, или (ii) связанного с активностью HPK1, или (iii) характеризующегося активностью (нормальной или аномальной) HPK1; или (2) снижения или ингибирования активности HPK1; или (3) снижения или ингибирования экспрессии HPK1; или (4) изменения уровней белка HPK1. В другом неограничивающем варианте осуществления термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении в клетку, или ткань, или не клеточный биологический материал, или среду, эффективно для, по меньшей мере, частичного снижения или ингибирования активности HPK1; или снижения или ингибирования экспрессии HPK1 частично или полностью.

Все способы, описанные в настоящем документе, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящем документе или иным образом явно не противоречит контексту. Использование любых и других примеров или вводных слов (например, «такой как»), представленных в настоящем документе, предназначено только для лучшего освещения изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, заявленного иным образом.

Общие химические термины, используемые в приведенных выше формулах, имеют свои обычные значения.

Используемые в настоящем документе «ч» или «ч» относятся к часу или часам, «мин» относятся к минутам или минутам, «MCL» относится к мантийноклеточной лимфоме, «AML» относится к острому миелоидному лейкозу, «CML» относится к хроническому миелоидному лейкозу, «Boc» относится к N-трет-бутоксикарбонилу, «EA» относится к этилацетату, «ДХМ» относится к дихлорметану, «ДМСО» относится к диметилсульфоксиду, «ДМА» относится к диметилацетамиду, «ТГФ» относится к тетрагидрофурану, «MtBE» относится к метил-трет-бутиловому эфиру, «ТЭА» относится к триэтиламину, «FBS» относится к эмбриональной бычьей сыворотке, «PBS» относится к забуференному фосфатом солевому раствору, «BSA» относится к бычьему сывороточному альбумину, «КТ» относится к при комнатной температуре, «мг/кг» означает миллиграммы на килограмм, «п.о.» относится к per os (перорально), «qd» означает дозирование один раз в день, «ЖХВД» означает жидкостную хроматографию высокого давления, «q2d» означает однократную дозу каждые 2 дня, «q2dx10» означает однократную дозу каждые 2 дня, умноженную на 10, «VSMC» относится к клеткам гладкой мускулатуры сосудов, и «ПРД» относится к дифракции рентгеновских лучей.

Используемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), изотонические агенты, агенты, замедляющие абсорбцию, соли, консерванты, стабилизаторы лекарственных средств, связующие вещества, эксципиенты, разрыхлители, смазывающие вещества, подсластители, ароматизаторы, красители и подобные, а также их комбинации, как должно быть известно специалистам в данной области техники (см., например, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). За исключением случаев, когда любой обычный носитель несовместим с активным ингредиентом, рассматривается его использование в терапевтических или фармацевтических композициях.

Кроме того, соединения по настоящему изобретению, включая их соли, также могут быть получены в виде их гидратов, или включают другие растворители, используемые для их кристаллизации. Соединения по настоящему изобретению могут по своей природе или по замыслу образовывать сольваты с фармацевтически приемлемыми растворителями (включая воду); поэтому предполагается, что изобретение охватывает как сольватированные, так и не сольватированные формы. Термин «сольват» относится к молекулярному комплексу соединения по настоящему изобретению (включая его фармацевтически приемлемые соли) с одной или несколькими молекулами растворителя. Такие молекулы растворителя являются молекулами, обычно используемыми в области фармацевтики, которые, как известно, безвредны для реципиента, например, вода, этанол и подобные. Термин «гидрат» относится к комплексу, в котором молекулой растворителя является вода.

Соединения по настоящему изобретению, включая их соли, гидраты и сольваты, могут по своей природе или по замыслу образовывать полиморфы. В другом аспекте, настоящее изобретение представляет фармацевтическую композицию, содержащую соединение по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может быть составлена для конкретных путей введения, таких как пероральное введение, парентеральное введение, ректальное введение и т.д. Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены в твердой форме (включая, без ограничений, капсулы, таблетки, пилюли, гранулы, порошки или суппозитории) или в жидкой форме (включая, без ограничений, растворы, суспензии или эмульсии). Фармацевтические композиции могут быть подвергнуты обычным фармацевтическим операциям, таким как стерилизация и/или могут содержать обычные инертные разбавители, смазывающие агенты или буферные агенты, а также адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы и буферы и т.д.

Как правило, фармацевтическими композициями являются таблетки или желатиновые капсулы, содержащие активный ингредиент вместе с а) разбавителями, например, лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином; b) смазывающими веществами, например, диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, их солями магния или кальция и/или полиэтиленгликолем; для таблеток также c) связующими веществами, например, алюмосиликатом магния, крахмальной пастой, желатином, трагакантом, метилцеллюлозой, карбоксиметилцеллюлозой натрия и/или поливинилпирролидоном; при желании d) разрыхлителями, например, крахмалами, агаром, альгиновой кислотой или ее натриевой солью или шипучими смесями; и/или e) абсорбентами, красителями, ароматизаторами и подсластителями. Таблетки могут быть покрыты либо пленкой, либо энтеросолюбильным покрытием в соответствии со способами, известными в данной области техники.

Подходящие композиции для перорального введения включают эффективное количество соединения по изобретению в форме таблеток, пастилок, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсии, твердых или мягких капсул или сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального применения, готовят в соответствии с любым способом, известным в данной области техники, для производства фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из подсластителей, ароматизаторов, красителей и консервантов для того, чтобы обеспечить фармацевтически элегантные и приятные на вкус препараты. Таблетки могут содержать активный ингредиент в смеси с не токсичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, пригодными для изготовления таблеток. Такими эксципиентами являются, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и разрыхляющие агенты, например, кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связующие агенты, например, крахмал, желатин или аравийская камедь; и смазывающие агенты, например стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки не имеют покрытия или покрыты известными методами для замедления разрыхления и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, обеспечивают устойчивое действие в течение более длительного периода времени. Например, может быть использован материал с временной задержкой, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Составы для перорального применения могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водной или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.

Некоторые композиции для инъекций представляют собой водные изотонические растворы или суспензии, и суппозитории преимущественно готовят из жировых эмульсий или суспензий. Указанные композиции могут быть стерилизованы и/или содержать адъюванты, такие как консервирующие, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие агенты, промоторы растворения, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут содержать и другие терапевтически ценные вещества. Указанные композиции готовят в соответствии с обычными способами смешивания, гранулирования или нанесения покрытия, соответственно, и они содержат примерно 0,1-75% или содержат примерно 1-50% активного ингредиента. Подходящие композиции для чрескожного применения включают эффективное количество соединения по изобретению с подходящим носителем. Носители, подходящие для чрескожной доставки, включают абсорбируемые фармакологически приемлемые растворители для облегчения прохождения через кожу хозяина. Например, трансдермальные устройства имеют форму бандажа, содержащего подложку, резервуар, содержащий соединение, необязательно с носителями, необязательно барьер, контролирующий скорость, для доставки соединения в кожу хозяина с контролируемой и заданной скоростью в течение длительного периода времени, и средства для закрепления устройства на коже.

Подходящие композиции для местного применения, например, на кожу и в глаза, включают водные растворы, суспензии, мази, кремы, гели или составы для распыления, например, для доставки в виде аэрозоля и подобные. Такие системы местной доставки будут, в частности, подходящими для кожного применения, например, для лечения рака кожи, например, для профилактического применения в солнцезащитных кремах, лосьонах, спреях и подобных. Таким образом, они особенно подходят для использования в местных составах, включая косметические составы, хорошо известные в данной области техники. Они могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, агенты, повышающие тоничность, буферы и консерванты.

Используемое в настоящем документе местное применение может также относиться к ингаляции или интраназальному применению. Их удобно доставлять в форме сухого порошка (либо отдельно, в виде смеси, например, сухой смеси с лактозой, либо в виде частиц смешанного компонента, например, с фосфолипидами) из ингалятора для сухого порошка или в виде аэрозольного спрея из контейнера под давлением, насоса, спрея, распылителя или небулайзера, с или без использования подходящего пропеллента.

Настоящее изобретение дополнительно представляет безводные фармацевтические композиции и дозированные формы, содержащие соединения по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов, поскольку вода может способствовать разложению некоторых соединений.

Безводные фармацевтические композиции и дозированные формы по изобретению могут быть приготовлены с использованием безводных ингредиентов или ингредиентов с низким содержанием влаги и в условиях с низким содержанием влаги или низкой влажности. Безводная фармацевтическая композиция может быть приготовлена и храниться таким образом, чтобы сохранялась ее безводная природа. Соответственно, безводные композиции упаковывают с использованием материалов, которые, как известно, предотвращают воздействие воды, так что они могут быть включены в подходящие формулярные наборы. Примеры подходящей упаковки включают, но не ограничены ими, герметически запечатанную фольгу, пластмассу, контейнеры со стандартными дозами (например, флаконы), блистерные упаковки и ленточные упаковки.

Изобретение дополнительно представляет фармацевтические композиции и дозированные формы, которые содержат один или несколько агентов, снижающих скорость разложения соединения по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Такие агенты, которые упоминаются в настоящем документе как «стабилизаторы», включают, но не ограничиваются ими, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, рН-буферы или солевые буферы и т.д.

3. Соединения

В настоящем документе описаны варианты осуществления соединения, имеющего общую структуру формулы (I-0) или (II):

(I-0) или (II).

В первом варианте осуществления изобретения представлено соединение, представленное формулой (I-0) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где

X является СR₂R₃ или NR₃;

A является СR₂ или N;

R является 8-10-членным бициклическим азотсодержащим гетероарилом или 8-10-членным бициклическим азотсодержащим гетероциклилом, необязательно замещенным оксо, где азотсодержащий гетероарил или азотсодержащий гетероциклил, представленный R, имеет 1-3 гетероатома, выбранных из N, O и S и необязательно замещен одним-четырьмя R_a, и где R либо соединен с пиримидиновым кольцом через атом азота кольца, либо R представлен структурой ниже:

или ;

R₁ является Н, дейтерием, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-6 алкилом, фенилом, 5-6-членным гетероарилом, C_3-6 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, фенил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклил, представленный R₁ или в группе, представленной R₁, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂; или

R и R₁, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют кольцо, представленное ниже:

или , где связи соединены с пиримидиновым кольцом;

каждый случай R₂ независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-6 алкилом, P(=O)R₁₁R₁₂, S(=O)₂R₁₁ или S(=O)₂NR₁₁R₁₂, где алкил, алкенил, алкинил или алкокси, представленный R₂ или в группе, представленной R₂, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂;

R₃ является Н, C_1-6 алкилом, C(O)C_1-6 алкилом, C_3-6 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, циклоалкил или гетероциклил, представленный R₃ или в группе, представленной R₃, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклила и NR₁₁R₁₂;

каждый случай R₁₁ и R₁₂ независимо является H или C_1-6 алкилом, где алкил, представленный R₁₁ или R₁₂, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_3-6 циклоалкила и 3-7-членного гетероциклила, или

R₁₁ и R₁₂, вместе с атомом азота или атомом фосфора, к которому они присоединены, образуют 3-7-членный гетероциклил, необязательно замещенный одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси и C_1-4 галогеналкокси;

каждый случай R_a независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, COOH, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR₁₂, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OR₁₁, NR₁₁C(O)R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, C_3-6 циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклилом или 5-6-членным гетероарилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, циклоалкил, гетероциклил или гетероарил, представленный R_a или в группе, представленной R_a, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR₁₂, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)OR₁₁, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂ и 5-6-членного гетероарила; или

два R_a, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют C_3-6 циклоалкил или 3-7-членный гетероциклил, где циклоалкил или гетероциклил необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси и C_1-4 галогеналкокси;

каждый случай R_b независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, COOH, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR_12, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OR₁₁, NR₁₁C(O)R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, C_3-6 циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклилом или 5-6-членным гетероарилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, циклоалкил, гетероциклил или гетероарил, представленный R_b или в группе, представленной R_b, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R_12, C(O)NR₁₁OR_12, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)OR₁₁, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂ и 5-6-членным гетероарилом;

каждый случай R_c независимо является фенилом, 5-6-членным моноциклическим гетероциклилом, имеющим 1-3 гетероатома, выбранных из N и O; 5-6-членным моноциклическим гетероарилом, имеющим 1-3 гетероатома, выбранных из N и O; где фенил, гетероциклил или гетероарил, представленный R_c, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂ и P(O)ди-C_1-6 алкила;

R_a' является С_1-6 алкилом, необязательно замещенным OH, CN, 5-6-членным гетероарилом, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR₁₂, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)OR₁₁, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂;

m равно 0, 1, 2 или 3;

n равно 0, 1, 2, 3 или 4;

p равно 1, 2 или 3;

q равно 1, 2 или 3; и p+q ≤4.

Во втором варианте осуществления изобретения, соединение представлено структурной формулой (I-1):

(I-1)

или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, и оставшиеся переменные такие, как определены в первом варианте осуществления.

В третьем варианте осуществления изобретения, соединение представлено структурной формулой (I-2):

(I-2),

или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер и оставшиеся переменные такие, как определены в первом и/или втором вариантах осуществления.

В четвертом варианте осуществления изобретения, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R является ,

или , где связь соединяет с пиримидиновым кольцом, и оставшиеся переменные такие, как определены в первом, втором и/или третьем вариантах осуществления.

В пятом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где каждый случай R_a независимо является H, галогеном, OH, CN, C_1-4 алкилом, C_1-4 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR₁₂, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)C_1-4 алкилом, C(O)OR₁₁, NR₁₁C(O)C_1-4 алкилом, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, C_3-6 циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклилом или 5-6-членным гетероарилом, где алкил, алкокси, циклоалкил, гетероциклил или гетероарил, представленный R_a или в группе, представленной R_a, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR₁₂, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)OR₁₁, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂ и 5-6-членного гетероарила, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем и/или четвертом вариантах осуществления.

В шестом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R₁ является Н, галогеном, CN, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-6 алкилом, где алкил, алкенил или алкокси, представленный R₁ или в группе, представленной R₁, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом и/или пятом вариантах осуществления.

В седьмом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где каждый случай R₂ независимо является H, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, C_1-4 алкилом, C_1-4 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-4 алкилом, C(O)OC_1-4 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-4 алкилом, P(=O)R₁₁R₁₂, S(=O)₂R₁₁ или S(=O)₂NR₁₁R₁₂, где алкил или алкокси, представленный R₂ или в группе, представленной R₂, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂ и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом и/или шестом вариантах осуществления.

В восьмом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R₃ является Н, C_1-6 алкилом или C(O)C_1-6 алкилом, где алкил, представленный R₃ или в группе, представленной R₃, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом и/или седьмом вариантах осуществления.

В девятом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где каждый случай R_a независимо является H, галогеном, OH, CN, C_1-4 алкилом, C_3-6 циклоалкилом, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR₁₂, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)OR₁₁, N(R₁₁)S(=O)₂R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂, P(O)R₁₁R₁₂ или 5-6-членным гетероарилом, где алкил или циклоалкил, представленный R_a или в группе, представленной R_a, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁OR₁₂, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, C(O)OR₁₁, NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂ и 5-6-членного гетероарила; каждый случай R₁₁ и R₁₂ независимо является H или C_1-6 алкилом, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом и/или восьмом вариантах осуществления.

В десятом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R₁ является Н, галогеном, CN, C_1-4 алкилом, C_1-4 галогеналкилом, C_2-4 алкенилом, C_1-4 алкокси или C_1-4 галогеналкокси, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом и/или девятом вариантах осуществления.

В одиннадцатом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R является ,

или , где связь соединяет с пиримидиновым кольцом, и n равно 0-4 и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом и/или десятом вариантах осуществления.

В двенадцатом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R является , или , где связь соединяет с пиримидиновым кольцом и n равно 0-2, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом и/или десятом вариантах осуществления.

В тринадцатом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R является , или , где связь соединяет с пиримидиновым кольцом и n равно 0-2, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом и/или десятом вариантах осуществления.

В четырнадцатом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где

каждый случай R_a независимо является H, галогеном, C_1-4 алкилом, -(CHR_aa)_kOH, -(CHR_aa)_kCN, -(CHR_aa)_kC(O)OR₁₁, -(CHR_aa)_kC(O)NR₁₁R₁₂, -(CHR_aa)_kC(O)NR₁₁OR₁₂, -(CHR_aa)_kS(=O)₂R₁₁, -(CHR_aa)_kC(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, -(CHR_aa)_kS(=O)₂NR₁₁R₁₂, -(CHR_aa)_kNR₁₁S(=O)₂R₁₂, -(CHR_aa)_k-5-6-членным гетероарилом или -(CHR_aa)_kP(=O)R₁₁R₁₂;

R_aa независимо является H или C_1-3 алкилом, необязательно замещенным галогеном;

R₁₁ и R₁₂ независимо являются H или C_1-4 алкилом; и

k равно 0 или 1 и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом, десятом, одиннадцатом, двенадцатом и/или тринадцатом вариантах осуществления.

В пятнадцатом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R₁ является Н, F, Cl, CN или CF₃ и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом, десятом, одиннадцатом, двенадцатом, тринадцатом и/или четырнадцатом вариантах осуществления.

В шестнадцатом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R является , или , где связь соединяет с пиримидиновым кольцом и n равно 0-4, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом, десятом, одиннадцатом, двенадцатом, тринадцатом, четырнадцатом и/или пятнадцатом вариантах осуществления.

В семнадцатом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где

R является , где связь соединяет с пиримидиновым кольцом,

R_a1 независимо является H, C_1-4 алкилом или C_1-4гидроксиалкилом;

R_a1^’ независимо является -(CHR_aa)_kOH, -(CHR_aa)_kCN, -(CHR_aa)_kC(O)OR₁₁, -(CHR_aa)_kS(=O)₂R₁₁, -(CHR_aa)_kC(O)NR₁₁R₁₂, -(CHR_aa)_kC(O)NR₁₁OR₁₂, -(CHR_aa)_kC(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, -(CHR_aa)_kS(=O)₂NR₁₁R₁₂, -(CHR_aa)_kNR₁₁S(=O)₂R₁₂, -(CHR_aa)_k-5-6-членным гетероарилом или -(CHR_aa)_kP(=O)R₁₁R₁₂;

R_aa независимо является H или C_1-3 алкилом, необязательно замещенным галогеном;

R_a независимо является H, F или Cl;

R₁₁ и R₁₂ независимо являются H или C_1-4 алкилом;

k равно 0 или 1, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом и/или десятом вариантах осуществления.

В восемнадцатом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где

R_a1 независимо является H, CH₃ или CH₂OH;

R_a1^’ независимо является -(CHR_aa)_kOH, -(CHR_aa)_kCN, -(CHR_aa)_kC(O)OR₁₁, -(CHR_aa)_kS(=O)₂R₁₁, -(CHR_aa)_kC(O)NR₁₁R₁₂, -(CHR_aa)_kC(O)NR₁₁OR₁₂, -(CHR_aa)_kC(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, -(CHR_aa)_kS(=O)₂NR₁₁R₁₂, -(CHR_aa)_kNR₁₁S(=O)₂R₁₂, -(CHR_aa)_k-тетразолом или -(CHR_aa)_kP(=O)R₁₁R₁₂;

R_aa независимо является H, CH₃ или CF₃;

R₁₁ и R₁₂ независимо являются H или C_1-2 алкилом; и

k равно 0 или 1, и остальные переменные такие, как определены в семнадцатом варианте осуществления.

В девятнадцатом варианте осуществления изобретения, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где каждый случай R_a независимо является H или F, и остальные переменные такие, как определены в восемнадцатом варианте осуществления.

В двадцатом варианте осуществления изобретения, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R₁ является Сl, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом, десятом, одиннадцатом, двенадцатом, тринадцатом, четырнадцатом, пятнадцатом, шестнадцатом, семнадцатом, восемнадцатом и/или девятнадцатом вариантах осуществления.

В двадцать первом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R и R¹, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют кольцо, представленное ниже:

или , где связи соединены с пиримидиновым кольцом и остальные переменные такие, как определены в первом, втором и/или третьем вариантах осуществления.

В двадцать втором варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где

каждый случай R_b независимо является H, галогеном, OH, CN, NH₂, COOH, C_1-4 алкилом, C_1-4 галогеналкилом, C_1-4 гидроксиалкилом, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_1-4 гидроксиалкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-4 алкилом, C(O)OC_1-4 алкилом, C(O)NR₁₁OR₁₂, S(=O)₂R₁₁, S(=O)₂NR₁₁R₁₂, NR₁₁(S=O)₂R₁₂, C(O)NR₁₁S(=O)₂R₁₂, P(=O)R₁₁R₁₂, 5-6-членным гетероарилом или NR₁₁C(O)C_1-4 алкилом; и

каждый случай R_c является фенилом или пиридинилом, каждый из которых необязательно замещен одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂ и P(=O)ди-C_1-6 алкила, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем и/или двадцать первом вариантах осуществления.

В двадцать третьем варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R и R¹, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют кольцо, представленное ниже:

или , где связи соединены с пиримидиновым кольцом и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, двадцать первом и/или двадцать втором вариантах осуществления.

В двадцать четвертом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где

каждый случай R_b независимо является H, галогеном, CN, COOH, C_1-2 алкилом или C_1-2 галогеналкилом;

каждый случай R_c является фенилом или пиридинилом, каждый из которых необязательно замещен одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂ и P(=O)ди-C_1-6 алкила, и

каждый случай R₁₁ и R₁₂ независимо является H или C_1-6 алкилом, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, двадцать первом, двадцать втором и/или двадцать третьем вариантах осуществления.

В двадцать пятом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где

каждый случай R_b независимо является H, CN или COOH; и

каждый случай R_c является фенилом или пиридинилом, каждый из которых необязательно замещен одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из C_1-4 алкила, C(O)N(CH₃)₂ и P(=O)(CH₃)₂, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, двадцать первом, двадцать втором, двадцать третьем и/или двадцать четвертом вариантах осуществления.

В двадцать шестом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где m равно 0 или 1 и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом, десятом, одиннадцатом, двенадцатом, тринадцатом, четырнадцатом, пятнадцатом, шестнадцатом, семнадцатом, восемнадцатом, девятнадцатом, двадцатом, двадцать первом, двадцать втором, двадцать третьем, двадцать четвертом и/или двадцать пятом вариантах осуществления.

В двадцать седьмом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где является , и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом, десятом, одиннадцатом, двенадцатом, тринадцатом, четырнадцатом, пятнадцатом, шестнадцатом, семнадцатом, восемнадцатом, девятнадцатом, двадцатом, двадцать первом, двадцать втором, двадцать третьем, двадцать четвертом, двадцать пятом и/или двадцать шестом вариантах осуществления.

В двадцать восьмом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где каждый случай R₂ является Н, галогеном, C_1-4 алкилом, C_1-4 галогеналкилом, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси; и R₃ является Н, C_1-6 алкилом, C_1-6 гидроксиалкилом или COCH₂NR₁₁R₁₂, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом, десятом, одиннадцатом, двенадцатом, тринадцатом, четырнадцатом, пятнадцатом, шестнадцатом, семнадцатом, восемнадцатом, девятнадцатом, двадцатом, двадцать первом, двадцать втором, двадцать третьем, двадцать четвертом, двадцать пятом, двадцать шестом и/или двадцать седьмом вариантах осуществления.

В двадцать девятом варианте осуществления, представлено соединение формулы (I-0), (I-1) или (I-2) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где каждый случай R₂ является Н, F, Cl или OCH₃; и R₃ является Н или C_1-4 алкилом, и остальные переменные такие, как определены в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом, десятом, одиннадцатом, двенадцатом, тринадцатом, четырнадцатом, пятнадцатом, шестнадцатом, семнадцатом, восемнадцатом, девятнадцатом, двадцатом, двадцать первом, двадцать втором, двадцать третьем, двадцать четвертом, двадцать пятом, двадцать шестом, двадцать седьмом и/или двадцать восьмом вариантах осуществления.

В тридцатом варианте осуществления изобретения, представлено соединение, представленное формулой (II) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер,

(II), где

A₁ является СR’ или N;

Х является -P(=O)R_3’R_4’;

R’ является Н, дейтерием, галогеном, CN, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR_11’R_12’, C(O)NR_11’R_12’, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, где алкил, алкенил, алкинил или алкокси, представленный R’ или в группе, представленной R’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый случай R_1’ независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR_11’R_12’, C(O)NR_11’R_12’, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, C_3-7 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, циклоалкил или гетероциклил, представленный R_1’ или в группе, представленной R_1’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый случай R_2’ независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR_11’R_12’, C(O)NR_11’R_12’, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, фенилом, 5-6-членным гетероарилом, C_3-7 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, фенил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклил, представленный R_2’ или в группе, представленной R_2’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый R_3’ и R_4’ независимо является H, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, где алкил, алкенил или алкинил, представленный R_3’ или R_4’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый случай R_11’ и R_12’ независимо является H или C_1-6 алкилом, где алкил, представленный R_11’ или R_12’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_3-6 циклоалкила и 3-7-членного гетероциклила, или

R_11’ и R_12’, вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 3-7-членный гетероциклил, необязательно замещенный одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси или C_1-4 галогеналкокси;

m’ равно 0, 1 или 2; и

n’ равно 0, 1 или 2.

В тридцать первом варианте осуществления изобретения, соединение формулы (II) представлено структурной формулой (II-1):

(II-1),

или его фармацевтически приемлемая солью или стереоизомером, где R’ является Н, галогеном, NR_11’R_12’ или C_1-6 алкилом, необязательно замещенным одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’, и остальные переменные такие, как определены в тридцатом варианте осуществления.

В тридцать втором варианте осуществления, соединение формулы (II) или (II-1) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R_3’ и R_4’ независимо являются H или C_1-6 алкилом, необязательно замещено одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’, и остальные переменные такие, как определены в тридцатом и/или тридцать первом варианте осуществления.

В тридцать третьем варианте осуществления, соединение формулы (II) или (II-1) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где

каждый случай R_1’ независимо является H, галогеном, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_3-7 ом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил или гетероциклил, представленный R_1’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый случай R_2’ независимо является H, галогеном, OH, NO₂, C_1-6 алкилом, C_1-6 алкокси, NR_11’R_12’, C(O)NR_11’R_12’, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, 5-6-членным гетероарилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкокси, гетероарил или гетероциклил, представленный R_2’или в группе, представленной R_2’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’, и остальные переменные такие, как определены в тридцатом, тридцать первом и/или тридцать втором вариантах осуществления.

В тридцать четвертом варианте осуществления, соединение формулы (II) или (II-1) представлено структурной формулой (II-2) или (II-2’):

(II-2) или (II-2’)

или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R’ является Н, галогеном или NH₂, и остальные переменные такие, как определены в тридцатом, тридцать первом, тридцать втором и/или тридцать третьем вариантах осуществления.

В тридцать пятом варианте осуществления, соединение формулы (II), (II-1), (II-2) или (II-2’) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где каждый случай R_2’ независимо является H, галогеном, OH, C_1-4 алкилом, необязательно замещенным галогеном или OH или NR_11’R_12’, C_1-4 алкокси, C(O)OC_1-6 алкилом, C(O)NR_11’R_12’, NR_11’R_12’, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, 5-6-членным гетероциклилом или 5-6-членным гетероарилом; и каждый случай R_1’ независимо является H или C_1-4 алкилом, и остальные переменные такие, как определены в тридцатом, тридцать первом, тридцать втором, тридцать третьем и/или тридцать четвертом вариантах осуществления.

В тридцать шестом варианте осуществления, соединение формулы (II), (II-1), (II-2) или (II-2’) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R_3’ и R_4’ независимо являются C_1-6 алкилом; и каждый случай R_2’ независимо является H, галогеном, OH, C_1-4 алкилом, необязательно замещенным галогеном или OH, или NR_11’R_12’, C_1-4 алкокси, C(O)OC_1-4 алкилом, C(O)NR_11’R_12’, NR_11’R_12’, NHC(O)C_1-6 алкилом, пирролидинилом, пирролидин-2-оном, оксазолом, где каждый случай R_11’ и R_12’ независимо является H или C_1-4 алкилом, и остальные переменные такие, как определены в тридцатом, тридцать первом, тридцать втором, тридцать третьем, тридцать четвертом и/или тридцать пятом вариантах осуществления.

В тридцать седьмом варианте осуществления, соединение формулы (II), (II-1), (II-2) или (II-2’) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где Х является -P(O)(CH₃)₂ и каждый случай R_2’ независимо является H, F, Cl, OH, CH_3, NH₂ или NHCOCH₃, и остальные переменные такие, как определены в тридцатом, тридцать первом, тридцать втором, тридцать третьем, тридцать четвертом, тридцать пятом и/или тридцать шестом вариантах осуществления.

1. Соединение, представленное структурной формулой (I):

(I),

или его фармацевтически приемлемая соль, где

A является СR₂ или N;

R является 8-10-членным бициклическим азотсодержащим гетероарилом или 8-10-членным бициклическим азотсодержащим гетероциклилом необязательно замещенным оксо, где азотсодержащий гетероарил или азотсодержащий гетероциклил, представленный R имеет 1-3 гетероатома, выбранных из N, O и S, и необязательно замещен одним-четырьмя R_a;

R₁ является Н, дейтерием, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-6 алкилом, фенилом, 5-6-членным гетероарилом, C_3-6 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, фенил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклил, представленный R₁ или в группе, представленной R₁, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂; или

R и R₁, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют кольцо, представленное ниже:

или где связи соединены с пиримидиновым кольцом;

R₂ является Н, дейтерием, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-6 алкилом, -P(=O)R₁₁R₁₂, -S(=O)₂R₁₁ или -S(=O)₂NR₁₁R₁₂, где алкил, алкенил, алкинил или алкокси, представленный R₂ или в группе, представленной R₂, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂;

R₃ является H, C_1-6 алкилом, C(O)C_1-6 алкилом, C_3-6 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, циклоалкил или гетероциклил представленный R₃ или в группе, представленной R₃ необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклила и NR₁₁R₁₂;

каждый случай R₁₁ и R₁₂ независимо является H или C_1-6 алкилом, где алкил, представленный R₁₁ или R₁₂, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_3-6 циклоалкила и 3-7-членного гетероциклила, или

R₁₁ и R₁₂, вместе с атомом азота или атомом фосфора, к которому они присоединены, образуют 3-7-членный гетероциклил, необязательно замещенный одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси или C_1-4 галогеналкокси;

каждый случай R_a независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, COOH, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-6 алкилом, -P(=O)R₁₁R₁₂, -S(=O)₂R₁₁ или -S(=O)₂NR₁₁R₁₂, C_3-6 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил или алкокси, циклоалкил или гетероциклил, представленный R_a или в группе, представленной R_a, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂; или

два R_a, вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C_3-6 циклоалкил или 3-7-членным гетероциклилом, где циклоалкил или гетероциклил необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси и C_1-4 галогеналкокси;

каждый случай R_b независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом или NR₁₁C(O)C_1-6 алкилом, где алкил, алкенил, алкинил или алкокси, представленный R_b или в группе, представленной R_b, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂;

R_c является фенилом, 5-6-членным моноциклическим гетероциклилом, имеющим 1-3 гетероатома, выбранных из N и O; 5-6-членным моноциклическим гетероарилом, имеющим 1-3 гетероатома, выбранных из N и O; где фенил, гетероциклил или гетероарил, представленный R_c, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, -C(O)NR₁₁R₁₂ и -P(O)ди-C_1-6 алкила; и

m равно 0, 1, 2 или 3.

2. Соединение по параграфу 1 или его фармацевтически приемлемая соль, где R является

или , где связь соединяет с пиримидиновым кольцом и n равно 0-4.

3. Соединение по параграфу 1 или 2 или его фармацевтически приемлемая соль, где

каждый случай R_a независимо является H, галогеном, OH, NH₂, CN, COOH, C_1-4 алкилом, C_1-4 галогеналкилом, C_1-4 гидроксиалкилом, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_1-4 гидроксиалкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-4 алкилом, C(O)OC_1-4 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-4 алкилом, -P(=O)R₁₁R₁₂, -S(=O)₂R₁₁, -S(=O)₂NR₁₁R₁₂, C_3-6 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, или

два R_a, вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C_3-6 циклоалкил или 3-7-членный гетероциклил, где циклоалкил или гетероциклил необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси и C_1-4 галогеналкокси.

4. Соединение по любому из параграфов 1-3 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₁ является Н, галогеном, C_1-6 алкилом, C_1-6 алкокси, C_2-6 алкенилом, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-6 алкилом, где алкил, алкенил или алкокси, представленный R₁ или в группе, представленной R₁, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂.

5. Соединение по любому из параграфов 1-4 или его фармацевтически приемлемая соль, где каждый случай R_a независимо является H, галогеном, OH, C_1-4 алкилом, COOH, C(O)NR₁₁R₁₂ или -P(O)R₁₁R₁₂, где каждый случай R₁₁ и R₁₂ независимо является H или C_1-6 алкилом.

6. Соединение по любому из параграфов 1-5 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₁ является Н, галогеном, C_1-4 алкилом, C_1-4 галогеналкилом, C_2-4 алкенилом, C_1-4 алкокси или C_1-4 галогеналкокси.

7. Соединение по любому из параграфов 1-6 или его фармацевтически приемлемая соль, где R является , или , где связь соединяет с пиримидиновым кольцом и n равно 0-2.

8. Соединение по любому из параграфов 1-7 или его фармацевтически приемлемая соль, где R является или , где связь соединяет с пиримидиновым кольцом и n равно 0-2.

9. Соединение по любому из параграфов 1-8 или его фармацевтически приемлемая соль, где каждый случай R_a независимо является H, F, Cl, C_1-4 алкилом, COOH, CONH₂, C(O)N(CH₃)₂ или -P(O)(CH₃)₂.

10. Соединение по любому из параграфов 1-9 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₁ является Н, Cl или CF₃.

11. Соединение по параграфу 1 или его фармацевтически приемлемая соль, где R и R¹, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют кольцо, представленное ниже:

или где связи соединены с пиримидиновым кольцом.

12. Соединение по параграфу 1 или 11 или его фармацевтически приемлемая соль, где

каждый случай R_b независимо является H, галогеном, OH, NH₂, C_1-4 алкилом, C_1-4 галогеналкилом, C_1-4 гидроксиалкилом, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_1-4 гидроксиалкокси, NR₁₁R₁₂, C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-4 алкилом, C(O)OC_1-4 алкилом или NR₁₁C(O)C_1-4 алкилом; и

каждый случай R_c является фенилом или пиридинилом, каждый из которых необязательно замещен одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, -C(O)NR₁₁R₁₂ и -P(O)ди-C_1-6 алкила.

13. Соединение по любому из параграфов 1, 11 и 12 или его фармацевтически приемлемая соль, где

каждый случай R_b независимо является H, галогеном, C_1-2 алкилом, C_1-2 галогеналкилом; и

каждый случай R_c является фенилом или пиридинилом, каждый из которых необязательно замещен одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, NR₁₁R₁₂, -C(O)NR₁₁R₁₂ и -P(O)ди-C_1-6 алкила, и

каждый случай R₁₁ и R₁₂ независимо является H или C_1-6 алкилом.

14. Соединение по любому из параграфов 1 и 11-13 или его фармацевтически приемлемая соль, где

каждый случай R_b независимо является H; и

каждый случай R_c является фенилом или пиридинилом, каждый из которых необязательно замещен одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из C_1-4 алкила, -C(O)N(CH₃)₂ и -P(O)(CH₃)₂.

15. Соединение по любому из параграфов 1-14 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₂ является Н, галогеном, OH, CN, NH₂, NO₂, C_1-4 алкилом, C_1-4 алкокси, NR₁₁R₁₂, -C(O)NR₁₁R₁₂, C(O)C_1-4 алкилом, C(O)OC_1-4 алкилом, NR₁₁C(O)C_1-4 алкилом, -P(=O)R₁₁R₁₂, -S(=O)₂R₁₁ или -S(=O)₂NR₁₁R₁₂, где алкил или алкокси, представленный R₂ или в группе, представленной R₂, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂; и m равно 0 или 1.

16. Соединение по любому из параграфов 1-15 или его фармацевтически приемлемая соль, где является или .

17. Соединение по любому из параграфов 1-16 или его фармацевтически приемлемая соль, где каждый случай R₂ является Н, галогеном, C_1-4 алкилом, C_1-4 галогеналкилом, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси; и R₃ является Н, C_1-6 алкилом, C_1-6 гидроксиалкил или COCH₂NR₁₁R₁₂, где каждый случай R₁₁ и R₁₂ независимо является H или C_1-6 алкилом.

18. Соединение по любому из параграфов 1-17 или его фармацевтически приемлемая соль, где каждый случай R₂ является Н, Cl или OCH₃; и R₃ является Н, C_1-4 алкилом, C_1-4 гидроксиалкилом или COCH₂N(CH₃)₂.

19. Соединение, представленное структурной формулой (II):

(II),

или его фармацевтически приемлемая соль, где

A₁ является СR’ или N;

Х является -P(=O)R_3’R_4’ или -S(O)₂NR_5’R_6’;

R’ является Н, дейтерием, галогеном, CN, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR_11’R_12’, C(O)NR_11’R_12’, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, где алкил, алкенил, алкинил или алкокси, представленный R’ или в группе, представленной R’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый случай R_1’ независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR_11’R_12’, C(O)NR_11’R_12’, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, C_3-7 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, циклоалкил или гетероциклил, представленный R_1’ или в группе, представленной R_1’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый случай R_2’ независимо является H, дейтерием, галогеном, OH, CN, NO₂, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_1-6 алкокси, NR_11’R_12’, C(O)NR_11’R_12’, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, фенилом, 5-6-членным гетероарилом, C_3-7 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил, алкокси, фенил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклил, представленный R_2’ или в группе, представленной R_2’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый R_3’ и R_4’ независимо является H, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, где алкил, алкенил или алкинил, представленный R_3’ или R_4’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’;

каждый R_5’ и R_6’ независимо является H, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, где алкил, алкенил или алкинил, представленный R_5’ или R_6’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’; или

R_5’ и R_6’, вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 3-7-членный гетероциклил, необязательно замещенный одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси или C_1-4 галогеналкокси;

каждый случай R_11’ и R_12’ независимо является H или C_1-6 алкилом, где алкил, представленный R_11’ или R_12’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси, C_3-6 циклоалкила и 3-7-членного гетероциклила, или

R_11’ и R_12’, вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 3-7-членный гетероциклил, необязательно замещенный одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси или C_1-4 галогеналкокси;

m’ равно 0, 1 или 2; и

n’ равно 0, 1 или 2.

20. Соединение по параграфу 19, где соединение представлено структурной формулой (II-1):

(II-1),

или его фармацевтически приемлемая соль, где

A₁ является СR’ или N; и

R’ является Н, галогеном, NR_11’R_12’ или C_1-6 алкилом, необязательно замещенным одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’.

21. Соединение по параграфу 19 или 20 или его фармацевтически приемлемая соль, где

Х является -P(=O)R_3’R_4’ или -S(O)₂NR_5’R_6’;

каждый R_3’ и R_4’ независимо являются H или C_1-6 алкилом, необязательно замещенным одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR₁₁R₁₂; и

каждый R_5’ и R_6’ независимо являются H или C_1-6 алкилом, или

R_5’ и R_6’, вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 3-7-членный гетероциклил, необязательно замещенный одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси или C_1-4 галогеналкокси.

22. Соединение по любому из параграфов 19-21 или его фармацевтически приемлемая соль, где каждый случай R_1’ независимо является H, галогеном, C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_3-7 циклоалкилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил или гетероциклил, представленный R_1’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’.

23. Соединение по любому из параграфов 19-22 или его фармацевтически приемлемая соль, где каждый случай R_2’ независимо является H, галогеном, OH, NH₂, C_1-6 алкилом, C_1-6 алкокси, NR_11’R_12’, C(O)NR_11’R_12’, C(O)C_1-6 алкилом, C(O)OC_1-6 алкилом, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, 5-6-членным гетероарилом или 3-7-членным гетероциклилом, где алкил, алкокси, гетероарил или гетероциклил, представленный R_2’ или в группе, представленной R_2’, необязательно замещен одним-тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OH, CN, C_1-4 алкила, C_1-4 галогеналкила, C_1-4 алкокси, C_1-4 галогеналкокси и NR_11’R_12’.

24. Соединение по любому из параграфов 19-23, где соединение представлено структурной формулой (II-2) или (II-2’):

(II-2) или (II-2’)

или его фармацевтически приемлемая соль, где A₁ является СR’ или N; и R’ является Н, галогеном или NH₂.

25. Соединение по любому из параграфов 19-24 или его фармацевтически приемлемая соль, где каждый случай R_2’ независимо является H, галогеном, OH, C_1-4 алкилом, необязательно замещенным галогеном или OH, или NR_11’R_12’, C_1-4 алкокси, C(O)OC_1-6 алкилом, C(O)NR_11’R_12’, NR_11’R_12’, NR_11’C(O)C_1-6 алкилом, 5-6-членным гетероциклилом (пирролидинилом или пирролидин-2-оном) или гетероарилом (оксазолом).

26. Соединение по любому из параграфов 19-25 или его фармацевтически приемлемая соль, где

Х является -P(=O)R_3’R_4’ или -S(O)₂NR_5’R_6’;

R_3’ и R_4’ независимо являются C_1-6 алкилом; и

R_5’ и R_6’ независимо являются H или C_1-6 алкилом.

27. Соединение по любому из параграфов 19-26 или его фармацевтически приемлемая соль, где каждый случай R_1’ независимо является H или C_1-4 алкилом.

28. Соединение по любому из параграфов 19-27 или его фармацевтически приемлемая соль, где каждый случай R_2’ независимо является H, галогеном, OH, C_1-4 алкилом, необязательно замещенным галогеном или OH, или NR_11’R_12’, C_1-4 алкокси, C(O)OC_1-4 алкилом, C(O)NR_11’R_12’, NR_11’R_12’, NHC(O)C_1-6 алкилом, пирролидинилом, пирролидин-2-оном, оксазолом, где каждый случай R_11’ и R_12’ независимо является H или C_1-4 алкилом.

29. Соединение по любому из параграфов 19-28 или его фармацевтически приемлемая соль, где Х является -P(O)(CH₃)₂ или -S(O)₂NHMe.

30. Соединение по любому из параграфов 19-29 или его фармацевтически приемлемая соль, где каждый случай R_2’ независимо является H, F, Cl, OH, CH_3, NH₂ или -NHCOCH₃.

31. Соединение по любому из параграфов 19-30 или его фармацевтически приемлемая соль, где Х является -P(=O)(CH₃)₂.

В одном варианте осуществления, соединение или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер выбрано из соединений формулы (I-0), (I-1), (I-2), (I), (II), (II-1), (II-2) или (II-2’) или в примерах.

В определенных вариантах осуществления, ингибиторы HPK1 (соединения по изобретению) являются селективными против одной или нескольких киназ, выбранных из: Lck, ZAP70, JAK3, PKC тэта, TBK1 и MAP4K3. В определенных вариантах осуществления, ингибиторы HPK1 по изобретению селективны против одной или нескольких киназ, выбранных из: Lck, ZAP70 и JAK3. В определенных вариантах осуществления, ингибиторы HPK1 по изобретению селективны против JAK3.

Например, данные ингибиторы HPK1 селективны против Lck настолько, что IC50 против Lck, по меньшей мере, 2-, 3-, 5-, 10-, 20-, 40-, 50-, 75-, 100-, 150-, 200-, 300-, 400-, 500-, 600-, 750- или 1000-кратно выше, чем IC50 против HPK1.

В определенных вариантах осуществления, ингибитор HPK1 является селективными против ZAP70 так, что IC50 против ZAP70, по меньшей мере, 2-, 3-, 5-, 10-, 20-, 40-, 50-, 75-, 100-, 150-, 200-, 300-, 400-, 500-, 600-, 750- или 1000-кратно выше, чем IC50 против HPK1.

В определенных вариантах осуществления, ингибитор HPK1 является селективными против JAK3 так, что IC50 против JAK3, по меньшей мере, 2-, 3-, 5-, 10-, 20-, 40-, 50-, 75-, 100-, 150-, 200-, 300-, 400-, 500-, 600-, 750- или 1000-кратно выше, чем IC50 против HPK1.

В определенных вариантах осуществления, ингибитор HPK1 является селективными против PKC тэта так, что IC50 против PKC тэта, по меньшей мере, 2-, 3-, 5-, 10-, 20-, 40-, 50-, 75-, 100-, 150-, 200-, 300-, 400-, 500-, 600-, 750- или 1000-кратно выше, чем IC50 против HPK1.

В определенных вариантах осуществления, ингибитор HPK1 является селективными против TBK1 так, что IC50 против TBK1, по меньшей мере, 2-, 3-, 5-, 10-, 20-, 40-, 50-, 75-, 100-, 150-, 200-, 300-, 400-, 500-, 600-, 750- или 1000-кратно выше, чем IC50 против HPK1.

В определенных вариантах осуществления, ингибитор HPK1 является селективными против MAP4K3 так, что IC50 против MAP4K3, по меньшей мере, 2-, 3-, 5-, 10-, 20-, 40-, 50-, 75-, 100-, 150-, 200-, 300-, 400-, 500-, 600-, 750- или 1000-кратно выше, чем IC50 против HPK1.

Активность против HPK1, Lck, ZAP70, PKC тэта, JAK3, TBK1 и MAP4K3 может быть измерена (например, измерена по значениям IC50) с применением любого признанного в данной области техники способов, описанных в биологических примерах, таких как биологические примеры 1-7 (все включены в настоящий документ посредством ссылки).

4. Лечимые заболевания

Ингибиторы HPK1, их фармацевтически приемлемые соли, их фармацевтические композиции можно использовать в способах модулирования (т.е. ингибирования) активности HPK1, где указанный способ включает введение пациенту/субъекту, нуждающемуся в этом, соединения-ингибитора HPK1 по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, как описано в настоящем документе.

В частности, настоящее изобретение представляет применение соединений по изобретению или их стереоизомеров, таутомеров, N-оксидов, гидратов, сольватов и солей, в частности, их фармацевтически приемлемых солей или их смесей, для применения в лечении или профилактике заболеваний, в частности рака (в частности, гемопоэтических и солидных опухолей) или состояний с нарушением регуляции иммунных ответов или других нарушений, связанных с аберрантной передачей сигналов MAP4K1. Фармацевтическая активность соединений по изобретению может быть, по меньшей мере, частично объяснена их активностью в качестве ингибиторов MAP4K1.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению или их фармацевтически приемлемые соли полезны для терапевтического введения субъекту, нуждающемуся в этом, для лечения заболевания или показания, включая, но не ограничиваясь этим, доброкачественную гиперплазию, атеросклеротическое нарушение, сепсис, аутоиммунное нарушение, сосудистое нарушение, вирусную инфекцию, нейродегенеративное нарушение, воспалительное нарушение и нарушения контроля мужской фертильности.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению или их фармацевтически приемлемые соли применимы для терапевтического введения для усиления, стимуляции и/или повышения иммунитета при лечении рака.

Соединения ингибитора HPK1 по изобретению можно использовать отдельно или в комбинации с другими агентами или методами лечения, или в качестве адъюванта или неоадъюванта для лечения заболеваний или нарушений, включая рак.

В некоторых вариантах осуществления, способы по изобретению могут применяться для лечения раков, которые включают, но не ограничены ими, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или интраокулярную злокачественную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак яичка, рак матки, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, рак эндометрия, рак шейки матки, рак влагалища, рак вульвы, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркому мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, хронические или острые лейкозы, включая острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, солидные опухоли детского возраста, лимфоцитарную лимфому, рак мочевого пузыря, рак почки или уретры, карциному почечной лоханки, новообразование центральной нервной системы (ЦНС), первичную лимфому ЦНС, ангиогенез опухоли, опухоль оси позвоночника, глиому ствола головного мозга, аденому гипофиза, саркому Капоши, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, Т-клеточную лимфому, раки, вызванные окружающей средой, включая раки, вызванные асбестом, и комбинации вышеуказанных видов рака.

В некоторых вариантах осуществления раки, поддающиеся лечению соединениями по изобретению, включают меланому (например, метастатическую злокачественную меланому), рак почки (например, светлоклеточную карциному), рак предстательной железы (например, гормонорезистентную аденокарциному предстательной железы), рак молочной железы, трижды негативный рак молочной железы, рак толстой кишки и рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого и мелкоклеточный рак легкого). Кроме того, также поддаются лечению рефрактерные или рецидивирующие злокачественные новообразования, рост которых можно ингибировать с помощью соединений по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления раки, которые поддается лечению с использованием соединений по изобретению, включают, но не ограничены ими, солидные опухоли (например, рак предстательной железы, рак толстой кишки, рак пищевода, рак эндометрия, рак яичников, рак матки, рак почки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак молочной железы, рак легких, дыхательных путей, рак головного мозга, рак глаз, рак щитовидной и паращитовидной желез, рак кожи, рак головы и шеи, рак репродуктивных органов, рак пищеварительных путей, рак мочевыводящих путей, глиобластому, саркому, рак мочевого пузыря и т.д.), гематологические раки (например, лимфому, лейкоз, такой как острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелогенный лейкоз (CML), DLBCL, мантийно-клеточную лимфому, неходжкинскую лимфому (включая рецидивирующую или рефрактерную NHL и рецидивирующую фолликулярную), лимфому Ходжкина или множественную миелому), саркому и их отдаленные метастазы.

В некоторых вариантах осуществления, заболевания и показания, которые поддаются лечению с использованием соединений по изобретению, включают, но не ограничены ими, гематологические раки, саркому, раки легких, раки желудочно-кишечного тракта, раки мочеполового тракта, раки печени, раки костей, раки нервной системы, гинекологические раки и раки кожи.

Типовые гематологические раки включают лимфомы и лейкозы, такие как острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелогенный лейкоз (AML), острый промиелоцитарный лейкоз (APL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелогенный лейкоз (CML), диффузная В-крупноклеточная лимфома (DLBCL), мантийно-клеточная лимфома, неходжкинская лимфома (включая рецидивирующую или рефрактерную NHL и рецидивирующую фолликулярную), лимфому Ходжкина, миелопролиферативные заболевания (например, первичный миелофиброз (PMF), истинная полицитемия (PV), эссенциальный тромбоцитоз (ET), миелодиспластический синдром (MDS), Т-клеточная острая лимфобластная лимфома (T-ALL), множественная миелома, кожная Т-клеточная лимфома, макроглобулинемия Вальденстрема, волосатоклеточная лимфома, хроническая миелогенная лимфома и лимфома Беркитта.

Примеры сарком включают хондросаркому, саркому Юинга, остеосаркому, рабдомиосаркому, ангиосаркому, фибросаркому, липосаркому, миксому, рабдомиому, рабдосаркому, фиброму, липому, гарматому и тератому.

Примеры раков легкого включают немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), мелкоклеточный рак легкого, бронхогенную карциному (плоскоклеточную, недифференцированную мелкоклеточную, недифференцированную крупноклеточную, аденокарциному), альвеолярную (бронхиолярную) карциному, бронхиальную аденому, хондроматозную гамартому и мезотелиому.

Примеры раков желудочно-кишечного тракта включают раки пищевода (плоскоклеточную карциному, аденокарциному, лейомиосаркому, лимфому), желудка (карциному, лимфому, лейомиосаркому), поджелудочной железы (протоковую аденокарциному, инсулиному, глюкагоному, гастриному, карциноидные опухоли, випому), тонкой кишки (аденокарциному, лимфому, карциноидные опухоли, саркому Капоши, лейомиому, гемангиому, липому, нейрофиброму, фиброму), толстой кишки (аденокарциному, тубулярную аденому, ворсинчатую аденому, гамартому, лейомиому) и колоректальный рак.

Примеры раков мочеполового тракта включают раки почки (аденокарциному, опухоль Вильмса [нефробластому]), мочевого пузыря и уретры (плоскоклеточную карциному, переходно-клеточную карциному, аденокарциному), предстательной железы (аденокарциному, саркому) и яичка (семиному, тератому, эмбриональную карциному, тератокарциному, хориокарциному, саркому, карциному из интерстициальных клеток, фиброму, фиброаденому, аденоматоидные опухоли, липому).

Примеры раков печени включают гепатому (гепатоцеллюлярную карциному), холангиокарциному, гепатобластому, ангиосаркому, гепатоцеллюлярную аденому и гемангиому.

Примеры раков костей включают, например, остеогенную саркому (остеосаркому), фибросаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, хондросаркому, саркому Юинга, злокачественную лимфому (ретикулосаркому), множественную миелому, хордому злокачественной гигантоклеточной опухоли, остеохронфрому (костно-хрящевую экзостозную болезнь), доброкачественную хондрому, хондробластому, хондромиксофиброму, остеоид-остеому и гигантоклеточные опухоли.

Примеры раков нервной системы включают раки черепа (остеому, гемангиому, гранулему, ксантому, деформирующий остит), мозговых оболочек (менингиому, менингиосаркому, глиоматоз), головного мозга (астроцитому, медуобластому, глиому, эпендимому, герминому (пинеалому), глиобластому, мультиформную глиобластому, олигодендроглиому, шванному, ретинобластому, врожденные опухоли) и спинного мозга (нейрофиброму, менингиому, глиому, саркому), а также нейробластому и болезнь Лермитта-Дюкло.

Типичные гинекологические раки включают раки матки (карциному эндометрия), шейки матки (карциному шейки матки, предопухолевую дисплазию шейки матки), яичников (карциному яичников (серозную цистаденокарциному, муцинозную цистаденокарциному, неклассифицированную карциному), гранулезо-текальноклеточные опухоли, опухоли клеток Сертоли-Лейдига, дисгерминому, злокачественную тератому), вульвы (плоскоклеточную карциному, внутриэпителиальную карциному, аденокарциному, фибросаркому, меланому), влагалища (светлоклеточную карциному, плоскоклеточную карциному, ботриоидную саркому (эмбриональную рабдомиосаркому) и фаллопиевых труб (карциному).

Примеры рака кожи включают меланому, базально-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному, саркому Капоши, рак кожи из клеток Меркеля, родинки, диспластические невусы, липому, ангиому, дерматофиброму и келоиды. В некоторых вариантах осуществления, заболевания и показания, которые поддаются лечению с использованием соединений по изобретению, включают, но не ограничены ими, серповидноклеточное заболевание (например, серповидноклеточную анемию), трижды негативный рак молочной железы (TNBC), миелодиспластические синдромы, рак яичка, рак желчных протоков, рак пищевода и уротелиальную карциному.

Примеры раков головы и шеи включают глиобластому, меланому, рабдосаркому, лимфосаркому, остеосаркому, плоскоклеточные карциномы, аденокарциномы, рак ротовой полости, рак гортани, рак носоглотки, раки носа и околоносовых пазух, а также раки щитовидной железы и околощитовидной железы.

В некоторых вариантах осуществления, заявленные ингибиторы HPK1 можно применять для лечения опухолей, продуцирующих PGE2 (например, опухоли со сверхэкспрессией Cox-2) и/или аденозин (опухоли со сверхэкспрессией CD73 и CD39). Сверхэкспрессия Cox-2 была обнаружена в ряде опухолей, таких как колоректальный рак, раки молочной железы, поджелудочной железы и легких, где она коррелирует с плохим прогнозом. Сообщалось о сверхэкспрессии COX-2 в гематологических моделях рака, таких как RAJI (лимфома Беркитта) и U937 (острый промоноцитарный лейкоз), а также в бластных клетках пациента. CD73 активируется в различных карциномах человека, в том числе карциномах толстой кишки, легких, поджелудочной железы и яичников. Более высокие уровни экспрессии CD73 связаны с неоваскуляризацией, инвазивностью и метастазированием опухоли, а также с более коротким временем выживания пациентов при раке молочной железы.

Примеры поддающихся лечению раков молочной железы включают, но не ограничены ими, трижды отрицательный рак молочной железы, инвазивную протоковую карциному, инвазивную дольковую карциному, протоковую карциному in situ и дольковую карциному in situ.

Примеры раков дыхательных путей включают, но не ограничены ими, мелкоклеточную и немелкоклеточную карциному легкого, а также бронхиальную аденому и плевропульмонарную бластому.

Примеры поддающихся лечению раков головного мозга включают, но не ограничены ими, глиому ствола головного мозга и гипоталамуса, мозжечковую и церебральную астроцитому, глиобластому, медуллобластому, эпендимому, а также нейроэктодермальную опухоль и опухоль шишковидной железы.

Поддающиеся лечению опухоли мужских репродуктивных органов включают, но не ограничены ими, рак предстательной железы и яичек.

Поддающиеся лечению опухоли женских репродуктивных органов включают, но не ограничены ими, рак эндометрия, шейки матки, яичников, влагалища и вульвы, а также саркому матки.

Поддающийся лечению рак яичников включает, но не ограничен ими, серозную опухоль, эндометриоидную опухоль, муцинозную цистаденокарциному, гранулезоклеточную опухоль, опухоль из клеток Сертоли-Лейдига и арренобластому.

Поддающийся лечению рак шейки матки включает, но не ограничен ими, плоскоклеточную карциному, аденокарциному, аденосквамозную карциному, мелкоклеточную карциному, нейроэндокринную опухоль, стекловидноклеточную карциному и виллогландулярную аденокарциному.

Поддающиеся лечению опухоли пищеварительного тракта включают, но не ограничены ими, раки анального отверстия, толстой кишки, прямой и ободочной кишки, пищевода, желчного пузыря, желудка, поджелудочной железы, прямой кишки, тонкого кишечника и слюнных желез.

Поддающийся лечению рак пищевода включает, но не ограничивается ими, карциному клеток пищевода и аденокарциному, а также плоскоклеточный рак, лейомиосаркому, злокачественную меланому, рабдомиосаркому и лимфому.

Поддающийся лечению рак желудка включает, но не ограничен ими, аденокарциному желудка кишечного типа и диффузного типа.

Поддающийся лечению рак поджелудочной железы включает, но не ограничен ими, протоковую аденокарциному, аденосквамозную карциному и эндокринные опухоли поджелудочной железы.

Поддающиеся лечению опухоли мочевыводящих путей включают, но не ограничены ими, раки мочевого пузыря, полового члена, почки, почечной лоханки, мочеточника, уретры и папиллярный рак почки человека.

Поддающийся лечению рак почки включает, но не ограничен ими, почечно-клеточную карциному, карциному клеток уротелия, опухоль юкстагломерулярных клеток (рениному), ангиомиолипому, почечную онкоцитому, карциному протока Беллини, светлоклеточную саркому почки, мезобластную нефрому и опухоль Вильмса.

Поддающийся лечению рак мочевого пузыря включает, но не ограничен ими, переходно-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному, аденокарциному, саркому и мелкоклеточную карциному.

Поддающиеся лечению виды рака глаза включают, но не ограничены ими, внутриглазную меланому и ретинобластому.

Поддающиеся лечению раки печени включают, но не ограничены ими, гепатоцеллюлярную карциному (карциному клеток печени с или без фиброламеллярного варианта), холангиокарциному (карциному внутрипеченочных желчных протоков) и смешанную гепатоцеллюлярную холангиокарциному.

Поддающиеся лечению раки кожи включают, но не ограничены ими, плоскоклеточную карциному, саркому Капоши, злокачественную меланому, рак кожи из клеток Меркеля и немеланомный рак кожи.

Поддающиеся лечению раки головы и шеи включают, но не ограничены ими, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак гортани, гортаноглотки, носоглотки, ротоглотки, рак слюнных желез, рак губы и ротовой полости и плоскоклеточный рак.

Поддающиеся лечению лимфомы включают, но не ограничены ими, лимфому, связанную со СПИД, неходжкинскую лимфому, кожную Т-клеточную лимфому, лимфому Беркитта, болезнь Ходжкина и лимфому центральной нервной системы.

Поддающиеся лечению саркомы включают, но не ограничены ими, саркому мягких тканей, остеосаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, лимфосаркому и рабдомиосаркому.

Поддающиеся лечению лейкозы включают, но не ограничены ими, острый миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз и волосатоклеточный лейкоз.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по настоящему изобретению могут применяться для лечения ряда других нарушений, в которые вовлечена MAP4K1, таких как сердечно-сосудистые заболевания и заболевания легких.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению могут применяться в лекарственных средствах для лечения и/или профилактики сердечно-сосудистых, воспалительных и фиброзных нарушений, почечных нарушений, в частности, острой и хронической почечной недостаточности, а также острой и хронической почечной недостаточности.

В настоящем документе термин «почечная недостаточность» включает как острые, так и хронические проявления почечной недостаточности, а также лежащие в основе или связанные с ними заболевания почек, такие как диабетические и не диабетические нефропатии, гипертензивные нефропатии, ишемические почечные нарушения, почечную гипоперфузию, интрадиалитическую гипотензию, обструктивную уропатию, почечные стенозы, гломерулопатии, гломерулонефрит (такой как, например, первичный гломерулонефрит; болезнь минимальных изменений (липоидный нефроз); мембранозный гломерулонефрит; фокальный сегментарный гломерулосклероз (FSGS); мембранопролиферативный гломерулонефрит; серповидный гломерулонефрит; мезангиопролиферативный гломерулонефрит (IgA нефрит, болезнь Бергера); постинфекционный гломерулонефрит, вторичный гломерулонефрит), сахарный диабет, красная волчанка, амилоидоз, синдром Гудпасчера, гранулематоз Вегенера, пурпура Шенлейна-Геноха, микроскопический полиангиит, острый гломерулонефрит, пиелонефрит (например, являющийся результатом: мочекаменной болезни, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, диабета, пороков развития, злоупотребления анальгетиками, болезни Крона), гломерулосклероз, артериолононекроз почек, тубулоинтерстициальные заболевания, нефропатические нарушения, такие как первичные и врожденные или приобретенные заболевания почек, синдром Альпорта, нефрит, иммунологические заболевания почек, такие как отторжение почечного трансплантата и почечные нарушения, вызванные иммунокомплексом, нефропатия, вызванная токсическими веществами, нефропатия, вызванная контрастными агентами, диабетическая и не диабетическая нефропатия, почечные кисты, нефросклероз, гипертонический нефросклероз и нефротический синдром, которые можно охарактеризовать диагностически, например, с помощью аномально сниженного выделения креатинина и/или воды, аномально повышенные концентрации мочевины, азота, калия и/или креатинина в крови, измененная активность почечных ферментов, например, глутамилсинтетазы, измененная осмоляльность мочи или объем мочи, повышенная микроальбуминурия, макроальбуминурия, поражения клубочков и артериол, дилатация канальцев, гиперфосфатемия и/или потребность в диализе.

В некоторых вариантах осуществления соединения по изобретению могут применяться для лечения и/или профилактики последствий почечной недостаточности, например отека легких, сердечной недостаточности, уремии, анемии, нарушений электролитного баланса (например, гиперкалиемии, гипонатриемии) и нарушений костного и углеводного метаболизма.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики последствий почечной недостаточности, например, отека легких, сердечной недостаточности, уремии, анемии, нарушений электролитного баланса (например, гиперкалиемии, гипонатриемии) и нарушений костного и углеводного метаболизма.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению дополнительно подходят для лечения и/или профилактики поликистозной болезни почек (PCKD) и синдрома неадекватной секреции ADH (SIADH).

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению также подходят для лечения и/или профилактики метаболического синдрома, гипертензии, резистентной гипертензии, острой и хронической сердечной недостаточности, ишемической болезни сердца, стабильной и нестабильной стенокардии, нарушений периферических и сердечных сосудов, аритмии, предсердных и желудочковых аритмий и ухудшенной проводимости, например, атриовентрикулярных блокад l-lll степени (АВ-блокада l-lll), наджелудочковой тахиаритмии, мерцательной аритмии, трепетания предсердий, фибрилляции желудочков, трепетания желудочков, желудочковой тахиаритмии, двунаправленной тахикардии, предсердная и желудочковая экстрасистолы, AV-атриовентрикулярной экстрасистолы, синдрома слабости синусового узла, обмороков, AV-узловой реципрокной тахикардии, синдрома Вольфа-Паркинсона-Уайта, острого коронарного синдрома (ACS), аутоиммунных сердечных нарушений (перикардита, эндокардита, вальволита, аортита, кардиомиопатий), шока, такого как кардиогенный шок, септический шок и анафилактический шок, аневризм, кардиомиопатии боксеров (преждевременное сокращение желудочков (PVC)), для лечения и/или профилактики тромбоэмболических заболеваний и ишемии, таких как ишемия миокарда, инфаркта миокарда, инсульта, гипертрофии сердца, транзиторных и ишемических приступов, преэклампсии, воспалительных сердечно-сосудистых нарушений, спазмов коронарных артерий и периферических артерий, образования отеков, например отека легких, отека головного мозга, отека почек или отека, вызванного сердечной недостаточностью, нарушений периферического кровообращения, реперфузионного повреждения, артериальных и венозных тромбозов, миокардиальной недостаточности, эндотелиальной дисфункции, для профилактики рестенозов, например, после терапии тромболизисом, чрескожной транслюминальной ангиопластики (PTA), транслюминальной коронарной ангиопластики (PTCA), трансплантатов сердца и операций шунтирования, а также микро- и макрососудистых повреждений (васкулитов), повышенных уровней фибриногена и липопротеинов низкой плотности (LDL) и повышенных концентраций ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1), а также для лечения и/или профилактики эректильной дисфункции и женской сексуальной дисфункции.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению также подходят для лечения и/или профилактики астматических заболеваний, легочной артериальной гипертензии (PAH) и других форм легочной гипертензии (РН), включая заболевание левых отделов сердца, HIV, серповидноклеточную анемию, тромбоэмболии (CTEPH), саркоидоз, COPD или легочную гипертензию, связанную с фиброзом легких, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), острое повреждение легких (ALI), дефицит альфа-1-антитрипсина (AATD), легочный фиброз, эмфизему легких (например, эмфизему легких, вызванную сигаретным дымом) и кистозный фиброз (CF).

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению также эффективны для контроля нарушений центральной нервной системы, характеризующихся нарушениями системы NO/cGMP. Они подходят, в частности, для улучшения восприятия, концентрации, обучения или памяти после когнитивных нарушений, подобных тем, которые возникают, в частности, в связи с ситуациями/заболеваниями/синдромами, такими как легкие когнитивные нарушения, возрастные нарушения обучения и памяти, возрастные потери памяти, сосудистая деменция, черепно-мозговая травма, инсульт, деменция после инсульта (постинсультная деменция), посттравматическая черепно-мозговая травма, общие нарушения концентрации внимания, нарушения концентрации внимания у детей с проблемами обучения и памяти, болезнь Альцгеймера, деменция с тельцами Леви, деменция с дегенерацией лобных долей, включая синдром Пика, болезнь Паркинсона, прогрессирующую деменцию с кортико-базальной дегенерацией, амиолатеральный склероз (ALS), болезнь Хантингтона, демиелинизация, рассеянный склероз, таламическая дегенерация, деменция Крейтцфельда-Якоба, деменция при HIV, шизофрения с деменцией или психоз Корсакова.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению также подходят для лечения и/или профилактики нарушений центральной нервной системы, таких как состояния тревоги, напряжения и депрессии, связанные с ЦНС сексуальные дисфункции и нарушения сна, а также для контроля патологических нарушений поглощения пищи, стимуляторов и веществ, вызывающих привыкание.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению, кроме того, также подходят для контроля мозгового кровотока и, таким образом, представляют эффективные агенты для контроля мигрени.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению также подходят для профилактики и контроля последствий инфаркта головного мозга (церебральной апоплексии), таких как инсульт, церебральная ишемия и черепно-мозговая травма. Соединения по изобретению можно также использовать для контроля состояния боли и шума в ушах.

В определенных вариантах осуществления, соединения по изобретению обладают противовоспалительным действием и поэтому могут применяться в качестве противовоспалительных агентов для лечения и/или профилактики сепсиса (SIRS), полиорганной недостаточности (MODS, MOF), воспалительных заболеваний почек, хронических воспалений кишечника (IBD, болезнь Крона, UC), панкреатита, перитонита, ревматоидных нарушений, воспалительных кожных нарушений и воспалительных глазных нарушений.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению также можно использовать для лечения и/или профилактики аутоиммунных заболеваний.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению также подходят для лечения и/или профилактики фиброзных нарушений внутренних органов, например легких, сердца, почек, костного мозга и, в частности, печени, а также дерматологических фиброзов и фиброзных глазных нарушений.

Используемый в настоящем документе термин «фиброзные нарушения» включает, в частности, следующее: фиброз печени, цирроз печени, легочный фиброз, эндомиокардиальный фиброз, нефропатию, гломерулонефрит, интерстициальный почечный фиброз, фиброзное повреждение, возникающее в результате диабета, фиброз костного мозга и аналогичные фиброзные нарушения, склеродермию, кольцевидную склеродермию, келоиды, гипертрофические рубцы (также после хирургических процедур), невусы, диабетическую ретинопатию, пролиферативную витроретинопатию и нарушения соединительной ткани (например, саркоидоза).

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению также подходят для борьбы с послеоперационным рубцеванием, например, в результате оперативного лечения глаукомы.

В определенных вариантах осуществления, соединения по изобретению также можно использовать в косметических целях для стареющей и ороговевшей кожи.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению подходят для лечения и/или профилактики гепатита, новообразований, остеопороза, глаукомы и гастропареза.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению подходят для лечения и/или профилактики вирусных инфекций (например, ВИЧ и саркомы Капоши); воспалительных и аутоиммунных заболеваний (например, колита, артрита, болезни Альцгеймера, гломерулонефрита и заживления ран); бактериальных, грибковых и/или паразитарных инфекций; кожных заболеваний (например, псориаза); заболеваний, основанных на гиперплазии, которые характеризуются увеличением количества клеток (например, фибробластов, гепатоцитов, клеток костей и костного мозга, клеток хрящей или гладкой мускулатуры или эпителиальных клеток (например, гиперплазии эндометрия)); заболеваний костей и сердечно-сосудистых заболеваний (например, рестеноза и гипертрофии).

В другом варианте осуществления, соединения по изобретению можно также применять для лечения или профилактики маточных фиброидов (лейомиомы матки или миомы матки) у женщин. Маточные фиброиды являются доброкачественными опухолями миометрия, гладкомышечного слоя матки. Маточные фиброиды растут медленно в течение жизни женщины, и их рост зависит от женских половых гормонов эстрадиола и прогестерона. Поэтому наибольшая распространенность маточных фиброидов с приблизительно 70% и >80% у белых и афроамериканских женщин, соответственно, обнаружена в возрасте от 35 лет и до менопаузы, когда они уменьшаются в размерах из-за снижения уровня гормонов. Приблизительно 30% и 45% белых и афроамериканских женщин, соответственно, проявляют клинически значимые симптомы из-за их фиброидов, которыми являются обильные менструальные кровотечения и боль, связанная с менструальным циклом (David et al., Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 199:137-140, 2016). Тяжелые менструальные кровотечения в этом отношении определяются кровопотерей более 80 мл в период менструального кровотечения. Подслизистое расположение маточных фиброидов, например, расположенных непосредственно под эндометрием, по-видимому, оказывает еще более серьезное влияние на маточное кровотечение, которое может привести к анемии у пораженных женщин. Кроме того, маточные фиброиды, из-за их симптомов, серьезно влияет на качество жизни пораженных женщин.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению полезны для лечения и/или профилактики хронических заболеваний почек, острой и хронической почечной недостаточности, диабетических, воспалительных или гипертонических нефропатий, фиброзных нарушений, сердечной недостаточности, стенокардии, гипертензии, легочной гипертензии, ишемий, сосудистых нарушений, тромбоэмболических нарушений, атеросклероза, серповидно-клеточной анемии, эректильной дисфункции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, дизурии, ассоциированной с доброкачественной гиперплазией предстательной железы, Хантингтона, деменции, Альцгеймера и Крейтцфельда-Якоба.

Настоящее изобретение представляет способ лечения и/или профилактики хронических заболеваний почек, острой и хронической почечной недостаточности, диабетических, воспалительных или гипертонических нефропатий, фиброзных нарушений, сердечной недостаточности, стенокардии, гипертонии, легочной гипертензии, ишемий, сосудистых нарушений, тромбоэмболических нарушений, атеросклероза, серповидноклеточной анемии, эректильной дисфункции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, дизурии, ассоциированной с доброкачественной гиперплазией предстательной железы, Хантингтона, деменции, Альцгеймера и Крейтцфельда-Якоба.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению соединений по изобретению для лечения и/или профилактики нарушений, в частности, нарушений, упомянутых выше.

Настоящее изобретение дополнительно представляет способ лечения и/или профилактики заболеваний, в частности нарушений, упомянутых выше, с использованием эффективного количества, по меньшей мере, одного из соединений по изобретению.

Таким образом, соединения по настоящему изобретению могут быть использованы для ингибирования, блокирования, снижения или уменьшения активации MAP4K1 экзогенными и/или эндогенными лигандами для снижения роста опухоли и модулирования нарушенной регуляции иммунных ответов, например, для блокирования иммунодепрессии и увеличения активации и инфильтрации иммунных клеток в контексте рака и иммунотерапии рака. Этот способ включает введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, включая человека, некоторого количества соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, изомера, полиморфа, метаболита, гидрата, сольвата или сложного эфира; который эффективен для лечения нарушения.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения ряда других заболеваний, в которые вовлечена MAP4K1, таких как, но не ограниченных ими, нарушения с нарушенной регуляцией иммунного ответа, воспаление, вакцинация против инфекции и рака, вирусные инфекции, ожирение и ожирение, вызванное диетой, ожирение, нарушения обмена веществ, стеатоз печени и маточные фиброиды. Эти расстройства были хорошо охарактеризованы у людей, но также существуют с аналогичной этиологией у других млекопитающих, и их можно лечить путем введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению.

5. Комбинированная терапия

Соединения по настоящему изобретению можно использовать в комбинированной терапии с одним или несколькими дополнительными/вторичными терапевтическими агентами, подходящими для лечения заболевания или показания, поддающегося лечению рассматриваемыми соединениями.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, например, способы по изобретению с использованием соединений по изобретению могут включать введение субъекту, нуждающемуся в этом, дополнительного терапевтического агента. Дополнительным терапевтическим агентом может быть: (i) иммуномодулирующий агент, который блокирует или ингибирует контрольную точку иммунной системы, где эта контрольная точка может быть или не быть компонентом пути NF-κB; и/или (ii) агент, который непосредственно стимулирует иммунный эффекторный ответ, такой как цитокин, или опухолеспецифическая адоптивно перенесенная популяция Т-клеток, или антитело, специфичное к белку, экспрессируемому опухолевой клеткой; и/или (iii) композиция, содержащая опухолевый антиген или его иммуногенный фрагмент; и/или (iv) химиотерапевтический агент.

В некоторых вариантах осуществления, второй терапевтический агент содержит ингибитор пути PI3K-AKT-mTOR, ингибитор пути Raf-MAPK, ингибитор пути JAK-STAT, ингибитор пути бета катенина, ингибитор пути notch, ингибитор пути hedgehog, ингибитор Pim киназ и/или ингибитор белков теплового шока и прогрессирования клеточного цикла. В некоторых вариантах осуществления, комбинированная терапия по изобретению снижает вероятность возникновения лекарственной резистентности в клеточной популяции и/или снижает токсичность лечения.

В некоторых вариантах осуществления, соединения-ингибиторы HPK1 по изобретению могут быть скомбинированы с одним или несколькими ингибиторами следующих киназ для лечения рака: Akt1, Akt2, Akt3, TGF-βΡν, PKA, PKG, PKC, CaM-киназа, фосфорилаза киназа, MEKK, ERK, MAPK, mTOR, EGFR, HER2, HER3, HER4, INS-R, IGF-1R, IR-R, PDGFαR, PDGFβR, CSFIR, KIT, FLK-II, KDR/FLK-1, FLK-4, flt-1, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, c-Met, Ron, Sea, TRKA, TRKB, TRKC, FLT3, VEGFR/Flt2, Flt4, EphAl, EphA2, EphA3, EphB2, EphB4, Tie2, Src, Fyn, Lck, Fgr, Btk, Fak, SYK, FRK, JAK, ABL, ALK и B-Raf.

В некоторых вариантах осуществления, соединения-ингибиторы HPK1 по изобретению могут быть скомбинированы с одним или несколькими из следующих ингибиторов для лечения рака, включая ингибитор FGFR (FGFR1, FGFR2, FGFR3 или FGFR4, например, AZD4547, BAY 1187982, ARQ087, BGJ398, BIBF1120, TKI258, луцитаниб, довитиниб, TAS-120, J J-42756493, Debiol347, INCB54828, INCB62079 и INCB63904), ингибитор JAK (JAK1 и/или JAK2, например, руксолитиниб, барицитиниб или итацитиниб (INCB39110)), ингибитор IDO (например, эпакадостат и NLG919), ингибитор LSD1 (например, GSK2979552, INCB59872 и INCB60003), ингибитор TDO, ингибитор PI3K-дельта (например, INCB50797 и INCB50465), ингибитор PI3K-гамма, такой как селективный ингибитор PI3K-гамма, ингибитор CSF1R (например, PLX3397 и LY3022855), рецепторные тирозинкиназы ТАМ (Tyro-3, Axl и Mer), модулятор арилуглеводородного рецептора (AhR) (такой как лаквинимод, аминофлавон, CB7993113, CH223191, 6,2',4'-триметоксифлавон (TMF), GNF351 (N-(2-(1H-индол-3-ил)этил)-9-изопропил-2-(5-метилпиридин-3-ил)-9H-пурин-6-амин), аминофлавон, NKI150460, индол-3-карбинол, β-нафтофлавон и его димер, дииндолилметан (DIM), 4-гидрокситамоксифен, лефлуномид, ралоксифен, траниласт, флутамид, мексилетин, нимодифин, омепразол, сулиндак, траниласт и TCDD (2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин)), ингибитор ангиогенеза, ингибитор рецептора интерлейкина, ингибиторы членов бромо- и экстратерминального семейства (например, ингибиторы бромодомена или ингибиторы BET, такие как OTX015, CPI-0610, INCB54329 и INCB57643), и антагонист аденозинового рецептора, или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления, соединения-ингибиторы HPK1 по изобретению можно комбинировать с ингибиторами HDAC, такими как панобиностат и вориностат.

В некоторых вариантах осуществления, соединения-ингибиторы HPK1 по изобретению можно комбинировать с ингибиторами c-Met, такими как онартумзумаб, тивантниб и капматиниб (INC-280).

В некоторых вариантах осуществления, соединения-ингибиторы HPK1 по изобретению можно комбинировать с ингибиторами BTK, такими как ибрутиниб.

В некоторых вариантах осуществления, соединения-ингибиторы HPK1 по изобретению можно комбинировать с ингибиторами mTOR, например, рапамицином, сиролимусом, темсиролимусом и эверолимусом.

В некоторых вариантах осуществления, соединения-ингибиторы HPK1 по изобретению можно комбинировать с ингибиторами MEK, такими как траметиниб, селуметиниб и GDC-0973.

В некоторых вариантах осуществления, соединения-ингибиторы HPK1 по изобретению можно комбинировать с ингибиторами Hsp90 (например, танеспимицином), циклинзависимых киназ (например, палбоциклибмо), PARP (например, олапарибом) и Pim киназ (LGH447, INCB053914 и SGI-1776).

В некоторых вариантах осуществления, соединения-ингибиторы HPK1 по изобретению можно комбинировать с агонистом ДНК сенсора (c-GAS) и/или его нижестоящим адапторным белком STING.

Путь cGAS (циклическая GMP-AMP-синтаза)-STING (стимулятор генов интерферона) является компонентом врожденной иммунной системы, который функционирует для обнаружения присутствия цитозольной ДНК и, в ответ, запускает экспрессию воспалительных генов, которые могут привести к старению или к активации защитных механизмов. Локализация ДНК из обычной ядерной локализации до цитозоля связана с онкогенезом или вирусной инфекцией. cGAS находится в цитозоле, и при прямом связывании с цитозольной ДНК, cGAS образует димеры для катализа продуцирования 2'3'-cGAMP из ATP и GTP. Полученный cGAMP затем действует как вторичный мессенджер, связывая STING и вызывая активацию фактора транскрипции IRF3. Активированный IRF3 приводит к транскрипции IFN-β типа 1 и ряда нижестоящих генов-мишеней, чтобы инициировать разнообразные биологические ответы, такие как вирусный ответ, надзор за опухолью, аутоиммунитет и клеточное старение. Во многих опухолевых клетках, конститутивно активный ответ на повреждение ДНК приводит к накоплению цитоплазматической ДНК и активации пути cGAS/STING. В клетках лимфомы было показано, что NKG2D лиганд, Rae1, активируется STING/IRF3-зависимым образом, чтобы способствовать NK-опосредованному удалению опухоли. Было показано, что активация пути c-GAS-STING в антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки, усиливает их функцию и повышает противоопухолевый иммунитет.

В некоторых вариантах осуществления, соединения-ингибиторы HPK1 по изобретению можно комбинировать с одним или несколькими ингибиторами иммунных контрольных точек.

Активация эффекторных Т-клеток обычно запускается TCR, распознающим антигенный пептид, презентированный комплексом MHC. Затем тип и уровень достигнутой активации определяют через баланс между сигналами, которые стимулируют, и сигналами, которые ингибируют ответ эффекторных Т-клеток. «Контрольная точка иммунной системы» используется в настоящем документе для обозначения любого молекулярного взаимодействия, которое изменяет баланс в пользу ингибирования ответа эффекторных Т-клеток. То есть, молекулярное взаимодействие, которое, когда оно происходит, отрицательно регулирует активацию эффекторной Т-клетки. Такое взаимодействие может быть прямым, например взаимодействие между лигандом и рецептором клеточной поверхности, который передает ингибирующий сигнал в эффекторную Т-клетку. Или он может быть косвенным, таким как блокирование или ингибирование взаимодействия между лигандом и рецептором клеточной поверхности, которое в противном случае передало бы активирующий сигнал в эффекторную Т-клетку, или взаимодействие, которое способствует усилению регуляции ингибирующей молекулы или клетки, или истощение ферментом метаболита, необходимого эффекторной Т-клетке, или любое их сочетание.

Примеры контрольных точек иммунной системы включают: а) взаимодействие между индоламин-2,3-диоксигеназой (IDO1) и ее субстратом; b) взаимодействие между PD1 и PD-L1 и/или PD1 и PD-L2; с) взаимодействие между CTLA-4 и CD86 и/или CTLA-4 и CD80; d) взаимодействие между B7-H3 и/или B7-H4 и их соответствующими лигандами; e) взаимодействие между HVEM и BTLA; f) взаимодействие между GAL9 и TIM3; g) взаимодействие между MHC класса I или II и LAG 3; и h) взаимодействие между MHC класса I или II и KIR; i) взаимодействие между OX40 (CD134) и OX40L (CD252); j) взаимодействие между CD40 и CD40L (CD154); k) взаимодействие между 4-1 BB (CD137) и лигандами, включая 4-1 BBL; l) Взаимодействие между GITR и лигандами, включая GITRL.

Таким образом, типовые ингибиторы иммунных контрольных точек включают ингибиторы молекул иммунных контрольных точек, таких как CD20, CD27, CD28, CD39, CD40, CD 122, CD96, CD73, CD47, OX40, GITR, CSF1R, JAK, PI3K дельта, PI3K гамма, ТАМ, аргиназа, CD137 (также известный как 4-1BB), ICOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, LAG3, TIM3, VISTA, PD-1, PD-L1 и PD-L2.

Типовой контрольной точкой для целей настоящего изобретения является контрольная точка (b), а именно взаимодействие между PD1 и любым из его лигандов PD-L1 и PD-L2. PD1 экспрессируется на эффекторных Т-клетках. Взаимодействие с любым из лигандов приводит к сигналу, подавляющему активацию. Лиганды экспрессируются некоторыми опухолями. В частности, PD-L1 экспрессируется многими солидными опухолями, включая меланому. Таким образом, эти опухоли могут подавлять иммуноопосредованные противоопухолевые эффекты через активацию ингибирующих рецепторов PD-1 на Т-клетках. При блокировании взаимодействия между PD1 и одним или обоими его лигандами, контрольная точка иммунного ответа может быть удалена, что приводит к усилению противоопухолевого Т-клеточного ответа. Таким образом, PD1 и его лиганды являются примерами компонентов контрольной точки иммунной системы, которые могут быть таргетированы в способе по изобретению.

Другой контрольной точкой для целей настоящего изобретения является контрольная точка (с), а именно взаимодействие между Т-клеточным рецептором CTLA-4 и его лигандами, белками В7 (В7-1 и В7-2). CTLA-4 обычно активируется на поверхности Т-клеток после первоначальной активации, и связывание лиганда приводит к сигналу, который ингибирует дальнейшую/продолжающуюся активацию. CTLA-4 конкурирует за связывание с белками B7 с рецептором CD28, который также экспрессируется на поверхности Т-клеток, но который усиливает активацию. Таким образом, блокируя взаимодействие CTLA-4 с B7 белками, но не взаимодействие CD28 с B7 белками, можно удалить одну из нормальных контрольных точек иммунного ответа, что приведет к усилению противоопухолевого Т-клеточного ответа. Таким образом, CTLA-4 и его лиганды являются примерами компонентов контрольной точки иммунной системы, которые могут быть таргетированы в способе по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, молекулой иммунной контрольной точки является стимулирующая молекула контрольной точки, выбранная из CD27, CD28, CD40, ICOS, OX40, GITR и CD137.

В некоторых вариантах осуществления, молекулой иммунной контрольной точки является молекула ингибиторной контрольной точки, выбранная из A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, HM3 и VISTA.

В некоторых вариантах осуществления, соединения, представленные в настоящем документе, можно использовать в комбинации с одним или несколькими агентами, выбранными из ингибиторов KIR, ингибиторов TIGIT, ингибиторов LAIR1, ингибиторов CD 160, ингибиторов 2B4 и ингибиторов TGFR бета.

В некоторых вариантах осуществления, соединения, представленные в настоящем документе, можно использовать в комбинации с ингибиторами иммунных контрольных точек, которыми являются низкомолекулярные ингибиторы (SMI), которые обычно являются малыми органическими молекулами. Например, в некоторых вариантах осуществления, ингибиторы IDO1 включают эпакадостат (INCB24360), индоксимод, GDC-0919 (NLG919) и F001287. Другие ингибиторы IDO1 включают 1-метилтриптофан (1 МТ).

В некоторых вариантах осуществления, ингибитор молекулы контрольной точки иммунной системы также известен как «иммуномодулирующий агент», который включает любой агент, который при введении субъекту блокирует или ингибирует действие контрольной точки иммунной системы, что приводит к активации ответа иммунного эффектора у субъекта, обычно ответ Т-клеточного эффектора, который может включать противоопухолевый ответ Т-клеточного эффектора.

Иммуномодулирующий агент, используемый в способе по настоящему изобретению, может блокировать или ингибировать любую из контрольных точек иммунной системы, описанных выше. Агентом может быть антитело или любой другой подходящий агент, который приводит к указанному блокированию или ингибированию. Таким образом, агент можно в целом назвать ингибитором указанной контрольной точки.

Используемый в настоящем документе термин «антитело» включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или их отдельные цепи. Антитело может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом и может быть получено любым подходящим способом. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающая часть» антитела, включают Fab фрагмент, F(ab')₂ фрагмент, Fab' фрагмент, F_d фрагмент, Fv фрагмент, dAb фрагмент и выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Одноцепочечные антитела, такие как scFv, и антитела с тяжелой цепью, такие как VHH и верблюжьи антитела, также охватываются термином «антигенсвязывающая часть» антитела.

В некоторых вариантах осуществления, иммуномодулирующим агентом, применяемым с ингибитором HPK1 по изобретению, является анти-PD1 антитело, анти-PD-L1 антитело или анти-CTLA-4 антитело.

В некоторых вариантах осуществления, ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор PD-1, например, анти-PD-1 моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-PD-1 моноклональным антителом является ниволумаб (MDX-1106), пембролизумаб (Merck 3475 или ламбролизумаб), пидилизумаб (CT-011), тислелизумаб (BGB-A317), камрелизумаб (SHR-1210), спартализумаб (PDR001) или AMP-514 (MEDI0680). В некоторых вариантах осуществления, анти-PD-1 моноклональным антителом является ниволумаб или пембролизумаб. В некоторых вариантах осуществления, анти-PD1 антителом является пембролизумаб. В некоторых вариантах осуществления, анти-PD-1 антителом является камрелизумаб (SHR-1210). В некоторых вариантах осуществления, ингибитором PD-1 является AMP-224 (PD-L2 F_c слитый белок, который связывает PD-1) или AUNP-12 (анти-PD-1 пептид).

В некоторых вариантах осуществления, ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор PD-L1, например, анти-PD-L1 моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-PD-L1 моноклональным антителом является BMS-935559, BMS-936559 (MDX-1105), MEDI-4736 (дурвалумаб), MPDL3280A (также известный как RG7446), YW243.55.S70 (HPAB-0381-WJ) или MSB0010718C. В некоторых вариантах осуществления, анти-PD-L1 моноклональным антителом является MPDL3280A или MEDI-4736. В некоторых вариантах осуществления, анти-PD-L1 антитела включают атезолизумаб, авелумаб, дурвалумаб или MEDI-4736 и MPDL3280A.

В некоторых вариантах осуществления, ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор CTLA-4, например, анти-CTLA-4 антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-CTLA-4 антителом является ипилимумаб, тремелимумаб или любое из антител, описанных в WO 2014/207063 (включенной в настоящий документ посредством ссылки). Другие молекулы включают полипептиды или растворимые мутантные CD86 полипептиды. В некоторых вариантах осуществления, антителом является ипилимумаб.

В некоторых вариантах осуществления, ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является комбинация двух или нескольких модуляторов, описанных в настоящем документе, например комбинацию, таргетирующую на две или несколько различных мишеней (например, PD-1, PD-L1 и PD-L2). Примеры комбинаций включают: α-PD-1 и α-PD-L1; α-CTLA-4, α-PD-L1 и α-CD20; и т.п.

В некоторых вариантах осуществления, ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является антитело, которое блокирует или ингибирует взаимодействие между 4-1 BB и его лигандом, включая утомилумаб.

В некоторых вариантах осуществления, ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор CSFIR, например, анти-CSF1R антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-CSF1R антителом является IMC-CS4 или RG7155.

В некоторых вариантах осуществления, ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор LAG3, например, анти-LAG3 антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-LAG3 антителом является BMS-986016, LAG525, IMP321 или GSK2831781.

В некоторых вариантах осуществления, ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор GITR, например, анти-GITR антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-GITR антителом является TRX518, MK-4166, MK1248, BMS-986156, MEDI1873 или GWN323.

В некоторых вариантах осуществления, ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор OX40, например, анти-OX40 антитело или слитый белок OX40L. В некоторых вариантах осуществления, анти-OX40 антителом является MEDI0562, MEDI6469, MOXR0916, PF-04518600 или GSK3174998. В некоторых вариантах осуществления, слитым белком OX40L является MEDI6383.

В некоторых вариантах осуществления, ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор TIM3, например, анти-TIM3 антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-TIM3 антителом является MBG-453.

В некоторых вариантах осуществления, ингибитором молекулы иммунной контрольной точки является ингибитор CD20, например, анти-CD20 антитело. В некоторых вариантах осуществления, анти-CD20 антителом является обинутузумаб или ритуксимаб.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению можно использовать в комбинации с одним или несколькими ингибиторами метаболических ферментов. В некоторых вариантах осуществления, ингибитором метаболического фермента является ингибитор IDO 1, TDO или аргиназы. Примеры ингибиторов IDO1 включают эпакадостат и NGL919. Примером ингибитора аргиназы является CB-1158.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению можно использовать в комбинации с биспецифическими антителами. В некоторых вариантах осуществления, один из доменов биспецифического антитела таргетирует рецептор PD-1, PD-L1, CTLA-4, GITR, OX40, TIM3, LAG3, CD137, ICOS, CD3 или TGFβ.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению можно использовать в комбинации с одним или несколькими агентами для лечения таких заболеваний, как рак. В некоторых вариантах осуществления, агентом является алкилирующий агент, ингибитор протеасом, кортикостероид или иммуномодулирующий агент. Примеры алкилирующих агентов включают бендамустин, азотистый иприт, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомочевины и триазены, урациловый иприт, хлорметин, циклофосфамид (Cytoxan™), ифосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, пипоброман, триэтилен-меламин, триэтилентиофосфорамин, бусульфан, кармустин, ломустин, стрептозоцин, дакарбазин и темозоломид. В некоторых вариантах осуществления, ингибитором протеасомы является карфилзомиб. В некоторых вариантах осуществления, кортикостероидом является дексаметазон (DEX). В некоторых вариантах осуществления, иммуномодулирующим агентом является леналидомид (LEN) или помалидомид (POM).

Соединения по настоящему изобретению могут быть дополнительно использованы в комбинации с другими способами лечения рака, например, с химиотерапией, радиационной терапией, опухоль-таргетной терапией, адъювантной терапией, иммунотерапией или хирургией. Примеры иммунотерапии включают лечение цитокинами (например, интерферонами, GM-CSF, G-CSF, IL-2), иммунотерапию CRS-207, противораковую вакцину, моноклональное антитело, адоптивный перенос Т-клеток, онколитическую виротерапию и иммуномодулирующие малые молекулы, включая талидомид или ингибитор JAK1/2, и подобные.

Соединения по изобретению можно вводить в комбинации с одним или несколькими противораковыми лекарственными средствами, такими как химиотерапевтические агенты. Примеры химиотерапевтических агентов включают любой из: абареликса, абиратерона, афатиниба, афлиберцепта, альдеслейкина, алемтузумаба, алитретиноина, аллопуринола, альтретамина, анастрозола, триоксида мышьяка, аспарагиназы, акситиниба, азацитидина, бевацизумаба, бексаротена, барицитиниба, бикалутамида, блеомицина, бортезомби, бортезомиба, бриваниба, бупарлисиба, внутривенного бусульфана, перорального бусульфана, калустерона, капецитабина, карбоплатина, кармустина, цедираниба, цетуксимаба, хлорамбуцила, цисплатина, кладрибина, клофарабина, кризотиниба, циклофосфамида, цитарабина, дакарбазина, дакомитиниба, дактиномицина, далтепарина натрия, дазатиниба, дактиномицина, даунорубицина, децитабина, дегареликса, денилейкина, денилейкина дифтитокса, дезоксикоформицина, дексразоксана, доцетаксела, доксорубицина, дролоксафина, дромостанолонаа пропионата, экулизумаба, энзалутамида, эпидофиллотоксина, эпирубицина, эрлотиниба, эстрамустина, этопозида фосфата, этопозида, экземестана, фентанила цитрата, фиграстима, флоксуридина, флударабина, фторурацила, флутамида, фулвестранта, гефитиниба, гемцитабина, гемтузумаба озогамицина, гозерелинаа ацетата, гистрелина ацетата, ибритумомаба тиуксетана, идарубицина, иделализиба, ифосфамида, иматиниба мезилата, интерферона альфа 2а, иринотекана, лапатиниба дитозилата, леналидомида, летрозола, лейковорина, лейпролида ацетата, левамизола, ломустина, меклоретамина, мегестрола ацетата, мелфалана, меркаптопурина, метотрексата, метоксалена, митрамицина, митомицина С, митотана, митоксантрона, нандролона фенпропионата, навелбена, нецитумумаба, неларабина, нератиниба, нилотиниба, нилутамида, нофетумомаба, осерелина, оксалиплатина, паклитаксела, памидроната, панитумумаба, пазопаниба, пегаспаргазы, пегфилграстима, пеметрекседа динатрия, пентостатина, пиларалисиба, пипобромана, пликамицина, понатиниба, преднизона, прокарбазина, хинакрина, расбуриказы, регорафениба, релоксафина, ритуксимаба, руксолитиниба, сорафениба, стрептозоцина, сунитиниба, сунитиниба малеата, тамоксифена, тегафура, темозоламида, тенипозида, тестолактона, талидомида, тиогуанина, тиотепа, топотекана, торемифена, тозитумомаба, трастузумаба, третиноина, трипторелина, урамустина, валрубицина, вандетаниба, винбластина, винкристина, винорелбина, вориностата и золедроната.

Другие противораковые агенты включают терапевтические антитела, такие как трастузумаб (герцептин), антитела к костимулирующим молекулам, таким как CTLA-4 (например, ипилимумаб или тремелимумаб), 4-1BB, антитела к PD-1 и PD-L1, или антитела к цитокинам (IL-10, 10, TGF-β и т.д.). Примеры антител к PD-1 и/или PD-L1, которые можно комбинировать с соединениями по настоящему описанию для лечения рака или инфекций, таких как вирусные, бактериальные, грибковые и паразитарные инфекции, включают, но не ограничены ими, ниволумаб, пембролизумаб, MPDL3280A, MEDI-4736 и SHR-1210.

Другие противораковые средства включают ингибиторы киназ, ассоциированных с клеточным пролиферативным нарушением. Эти киназы включают, но не ограничены ими, Aurora-A, CDK1, CDK2, CDK3, CDK5, CDK7, CDK8, CDK9, киназы эфриновых рецепторов, CHK1, CHK2, SRC, Yes, Fyn, Lck, Fer, Fes, Syk, Itk, Bmx, GSK3, JNK, PAKl, PAK2, PAK3, PAK4, PDKl, PKA, PKC, Rsk и SGK.

Другие противораковые агенты также включают те, которые блокируют миграцию иммунных клеток, такие как антагонисты хемокиновых рецепторов, включая CCR2 и CCR4. Соединения по настоящему изобретению можно дополнительно использовать в комбинации с одним или несколькими противовоспалительными агентами, стероидами, иммунодепрессантами или терапевтическими антителами.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с дополнительным терапевтическим агентом, который непосредственно стимулирует иммунный эффекторный ответ, таким как цитокин или опухолеспецифическая адоптивно перенесенная популяция Т-клеток, или антитело, специфичное к белку, экспрессируемому опухолевой клеткой.

Используемый в настоящем документе термин «агент, который непосредственно стимулирует иммунный эффекторный ответ» означает любой подходящий агент, но обычно относится к цитокину или хемокину (или к агенту, который стимулирует продуцирование любого из них), опухолеспецифической адоптивно перенесенной популяции Т-клеток, или антитело, специфичное к белку, экспрессируемому опухолевой клеткой.

Цитокином может быть интерферон, выбранный из IFNα, ΙΡΝβ, IFNγ и IFNA, или интерлейкин, такой как IL-2. Хемокином может быть воспалительный медиатор, например, выбранный из CXCL9, 10 и 11, который привлекает Т-клетки, экспрессирующие CXCR3. Агентом, который стимулирует продуцирование цитокина или хемокина, может быть адъювант, подходящий для введения людям. Одним из примеров является Bacille Calmette-Guerin (BCG), которую обычно вводят внутрипузырно (т.е. через уретральный катетер) для лечения рака мочевого пузыря. Типовой схемой дозирования BCG при раке мочевого пузыря является один раз в неделю в течение шести недель, но, учитывая его долгую историю безопасности, его также вводят на неопределенный срок в качестве поддерживающей терапии. Было показано, что BCG стимулирует иммунные ответы на рак мочевого пузыря. BCG также применяют в качестве адъюванта в комбинации с композициями, которые содержат опухолевые антигены (т.е. с противораковыми вакцинами), особенно при раке толстой кишки, когда ее обычно вводят внутрикожно. Такое применение BCG также предусмотрено в настоящем изобретении. Опухолеспецифическая адоптивно перенесенная популяция Т-клеток непосредственно увеличивает размер опухолеспецифической популяции Т-клеток у индивидуума и может быть получена любым подходящим способом. Однако, как правило, процесс включает выделение опухолеспецифических Т-клеток из образца опухоли, взятого у пациента, и выборочное культивирование этих клеток перед возвращением размноженной популяции опухолеспецифических Т-клеток пациенту. Альтернативно, популяция специфичных для опухоли Т-клеток может быть получена путем генной инженерии локуса Т-клеточного рецептора с последующим размножением измененной клетки.

Антитела, специфичные к белкам, экспрессируемым опухолевой клеткой, обычно стимулируют иммунную активность, связываясь с опухолевой клеткой и способствуя разрушению клетки посредством антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Примеры антител этого типа включают анти-CD20 антитела, такие как офатумумаб или ритуксимаб, и анти-CD52 антитела, такие как алемтузумаб.

Таким образом, в некоторых типовых вариантах осуществления, соединения по изобретению можно использовать в комбинации с ингибитором кальциневрина, например, циклоспорином А или FK 506; ингибитором mTOR, например, рапамицином, 40-0-(2-гидроксиэтил)рапамицином, биолимус-7 или биолимус-9; аскомицином, обладающим иммунодепрессивными свойствами, например, ABT-281, ASM981; кортикостероидом; циклофосфамидом; азатиопреном; метотрексатом; лефлуномидом; мизорибином; микофеноловой кислотой или солью; микофенолата мофетилом; ингибитор IL-1β.

В другом варианте осуществления, соединения по изобретению комбинируют с со-агентом, которым является ингибиторы киназы PI3.

В другом варианте осуществления, соединения по изобретению комбинируют с со-агентом, влияющим на ВТК (тирозинкиназу Брутона).

Для лечения онкологических заболеваний, соединения по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с В-клеточными модулирующими агентами, например, ритуксимабом, ингибиторами BTK или Syk, ингибиторами PKC, PI3 киназ, PDK, PIM, JAK и миметиками mTOR и BH3.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению, включая их соли, можно комбинировать с другим иммуногенным агентом, таким как раковые клетки, очищенные опухолевые антигены (включая рекомбинантные белки, пептиды и молекулы углеводов), клетки и клетки, трансфицированные генами, кодирующими иммуностимулирующие цитокины. Неограничивающие примеры противоопухолевых вакцин, которые можно использовать, включают пептиды антигенов меланомы, такие как пептиды gp100, антигены MAGE, Trp-2, MARTI и/или тирозиназу, или опухолевые клетки, трансфицированные для экспрессии цитокина GM-CSF.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению или их соли также можно использовать в комбинации с протоколом вакцинации для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления, опухолевые клетки трансдуцированы для экспрессии GM-CSF. В некоторых вариантах осуществления, противоопухолевые вакцины включают белки вирусов, вовлеченных в раки человека, таких как папилломавирусы человека (HPV), вирусы гепатита (HBV и HCV) и вирус герпеса саркомы Капоши (KHSV). В некоторых вариантах осуществления, соединения по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с опухолеспецифическим антигеном, таким как белки теплового шока, выделенные из самой опухолевой ткани. В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению или их соли можно комбинировать с иммунизацией дендритных клеток для активации сильных противоопухолевых ответов.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению можно использовать в комбинации с биспецифическими макроциклическими пептидами, которые таргетируют эффекторные клетки, экспрессирующие рецептор Fe α или Fe γ, на опухолевые клетки. Соединения по изобретению также можно комбинировать с макроциклическими пептидами, которые активируют иммунную реакцию хозяина.

В некоторых вариантах осуществления, соединения по изобретению можно применять в комбинации с трансплантатом костного мозга для лечения различных опухолей гемопоэтического происхождения.

Подходящие противовирусные агенты, предполагаемые для применения в комбинации с соединениями по изобретению, могут включать нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы (NRTI), не нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NNRTI), ингибиторы протеазы и другие противовирусные лекарственные средства. Примеры подходящих NRTI включают зидовудин (AZT); диданозин (ddl); зальцитабин (ddC); ставудин (d4T); ламивудин (3TC); абакавир (1592U89); адефовир дипивоксил [bis(POM)-PMEA]; лобукавир (BMS-180194); BCH-10652; эмитрицитабин [(-)-FTC]; бета-L-FD4 (также называемый бета-L-D4C или бета-L-2',3'-диклеокси-5-фторцитиден); DAPD ((-)-бета-D-2,6,-диаминопуриндиоксолан); и лоденозин (FddA). Типовые подходящие NNRTI включают невирапин (BI-RG-587); делавирадин (BHAP, U-90152); эфавиренз (DMP-266); PNU-142721; AG-1549; MKC-442 (1-(этоксиметил)-5-(1-метилэтил)-6-(фенилметил)-(2,4(1H,3H)-пиримидиндион) и (+)-каланолид A (NSC-675451) и B. Типовые подходящие ингибиторы протеазы включают саквинавир (Ro 31-8959), ритонавир (ABT-538), индинавир (MK-639), нелфнавир (AG-1343), ампренавир (141W94), лазинавир (BMS-234475), DMP-450, BMS-2322623, ABT-378 и AG-1549.Другие противовирусные агенты включают гидроксимочевину, рибавирин, IL-2, IL-12, пентафузид и Yissum Project No.11607.

Следует понимать, что многие из дополнительных терапевтических агентов, используемых в способах по изобретению, могут быть биологическими препаратами, требующими внутривенного, внутрибрюшинного или депо введения. В другом варианте осуществления, соединение по изобретению вводят перорально, и дополнительный терапевтический агент вводят парентерально, например, внутривенно, внутрибрюшинно или в виде депо.

В любой из описанных в настоящем документе комбинированных терапий, когда пациенту вводят более одного фармацевтического агента, их можно вводить одновременно, по отдельности, последовательно или в комбинации (например, для более чем двух агентов).

В одном варианте осуществления, изобретение относится к продукту, содержащему соединение по изобретению, такое как рассматриваемое соединение или любая его подгруппа, и, по меньшей мере, один другой терапевтический агент в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии. Продукты, представленные в виде комбинированного препарата, включают композицию, содержащую соединение по изобретению, или любую его подгруппу и другие терапевтические агенты вместе в одной и той же фармацевтической композиции, или рассматриваемое соединение или любую его подгруппу и другие терапевтические агенты в отдельной форме, например, в форме набора.

В одном варианте осуществления, в изобретении представлен набор, включающий две или несколько отдельных фармацевтических композиций, по меньшей мере, одна из которых содержит рассматриваемое соединение, и другая содержит второй обсуждаемый в настоящем документе терапевтический агент. В одном варианте осуществления, набор содержит средства для раздельного хранения указанных композиций, такие как контейнер, разделенная бутылка или разделенный пакет из фольги. Примером такого набора является блистерная упаковка, обычно используемая для упаковки таблеток, капсул и подобных. Набор по изобретению можно использовать для введения различных дозированных форм, например пероральных и парентеральных, для введения отдельных композиций с различными интервалами дозирования, или для титрования отдельных композиций относительно друг друга. Чтобы облегчить соблюдение схемы, набор по изобретению обычно содержит инструкции по введению.

6. Скрининг соединений/методы анализа

Соединения по изобретению ингибируют киназную активность HPK1, где киназная активность может быть определена непосредственно с использованием многочисленных биохимических анализов, таких как анализ, описанный в примере 1. Значения IC50 любых соединений могут быть определены соответствующим образом в диапазоне концентраций ингибитора. Кроме того, ингибирующее действие соединений также можно оценить с помощью биологического анализа, для определения действия соединений на секрецию цитокинов Т-клетками после стимуляции TCR и CD28.

Например, в примере 5 описан такой функциональный анализ для определения действия ингибитора HPK1 на высвобождение IL-2 и IFN-γ при стимуляции Pan Т-клеток. Секретируемые IL-2 и IFN-γ могут быть измерены/количественно определены с помощью стандартного анализа ELISA. Коротко, pan T-клетки могут быть выделены из мононуклеарных клеток (MNC) периферической крови (PB) или PBMC с использованием коммерчески доступных наборов, таких как набор для выделения Pan T MACS (Miltenyl Biotec) (кат. № 130-096-535). Первичные pan-Т-клетки человека включают CD4 и CD8 Т-клетки, а также некоторые подмножества гамма/дельта Т-клеток. Pan-Т-клетки могут быть выделены с использованием метода негативной иммуномагнитной сепарации без использования колонок.

Изолированные pan-Т-клетки можно распределять в 96-луночные планшеты по 100000 клеток/лунку и стимулировать иммобилизованным анти-CD3 антителом и растворимым анти-CD28 антителом или РМА/иономицином в качестве положительного контроля (или культуральной средой в качестве отрицательного контроля). Различные концентрации тестируемых соединений могут быть добавлены к клеткам для оценки действия соединения на секрецию цитокинов после стимуляции TCR/костимуляции CD28. Стимулированные клетки инкубируют еще в течение 2 дней, после чего супернатант (содержащий цитокины, секретируемые pan-T-клетками) собирают из каждой лунки для анализа ELISA и количественного определения IL-2 и IFN-γ.

Дополнительные анализы также могут быть использованы для оценки способности любого ингибитора HPK1 ингибировать HPK1 или для скрининга соединений, обладающих ингибиторной активностью HPK1.

Например, в одном анализе, ингибирование активности киназы HPK1 может быть проанализировано с использованием анализа Treg (анализа пролиферации регуляторных Т-клеток), описанного ниже. В частности, первичные CD4⁺/CD25^- Т-клетки и CD4⁺/CD25⁺ регуляторные Т-клетки выделяют из донорских мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) человека с использованием подходящего набора, такого как набор от Thermo Fisher Scientific (кат. № 11363D). CD4⁺/CD25^- Т-клетки метят CFSE (Thermo Fisher Scientific, C34554) в соответствии с протоколом, предоставленным поставщиком. Меченые CFSE Т-клетки и регуляторные CD4⁺/CD25⁺ Т-клетки ресуспендируют в концентрации 1×10⁶ клеток/мл в среде RPMI-1640. 100 мкл CFSE-меченных Т-клеток смешивают с или без 50 мкл CD4⁺/CD25⁺ регуляторных Т-клеток, обработанных 5 мкл анти-CD3/CD28 гранул (Thermo Fisher Scientific, 11132D) и различными концентрациями соединений, разведенных в 50 мкл среды RPMI-1640. Смешанные популяции клеток культивируют в течение 5 дней (37°C, 5% CO₂) и пролиферацию CFSE-меченных Т-клеток анализируют с помощью BD LSRFortessa X-20 с использованием канала FITC на 5 день. Ожидается, что ингибирование HPK1 рассматриваемыми соединениями будет усиливать функцию Treg и ингибировать пролиферацию CFSE-меченных первичных CD4⁺/CD25^- T-клеток.

В другом примере, ингибирование активности киназы HPK1 можно проанализировать с использованием p-SLP-76 S376 HTRF анализа (Cisbio), описанного ниже. Этот клеточный анализ HTRF обеспечивает быстрое количественное обнаружение SLP-76, фосфорилированного на серине 376 с помощью HPK1. Фосфо-SLP-76 создает каркас, на котором строятся ключевые сигнальные комплексы, и является маркером активации Т-лимфоцитов. По данным производителя, в анализе Phospho-SLP-76 (Ser376) используются два меченых антитела: одно с донорным флуорофором, другое с акцепторным. Первое антитело является специфическим к связыванию с фосфорилированным мотивом S376 на SLP-76, и второе является специфическим к способности распознавать SLP-76 независимо от его состояния фосфорилирования. Фосфорилирование белка обеспечивает образование иммунного комплекса, включающего оба меченых антитела, что приводит к тому, что донорный флуорофор оказывается в непосредственной близости от акцепторного, тем самым генерируя сигнал FRET. Его интенсивность прямо пропорциональна концентрации фосфорилированного белка, присутствующего в образце, и предоставляет средства оценки состояния фосфорилирования белка в формате анализа без промывки.

Вкратце, клетки Jurkat (культивируемые в среде RPMI1640 с 10% FBS) собирают и центрифугируют с последующим ресуспендированием в подходящей среде в концентрации 3×10⁶ клеток/мл. Затем клетки Jurkat (35 мкл) вносят в каждую лунку 384-луночного планшета. Тестируемые соединения разводят средой для культивирования клеток для 40-кратного разведения (добавлением 39 мкл среды для культивирования клеток на 1 мкл соединения). Клетки Jurkat в луночном планшете обрабатывают тестируемыми соединениями в различных концентрациях (добавляя 5 мкл разведенного соединения в 35 мкл клеток Jurkat, и начиная с 3 мкМ при разведении 1:3) в течение 1 часа при 37°C, 5% CO₂), с последующей обработкой анти-CD3 (5 мкг/мл, клон OKT3) в течение 30 мин для активации TCR и HPK1. Готовят разведение 1:25 100х блокирующего реагента (из набора p-SLP76 ser376HTRF) с 4х лизисным буфером (LB), в каждую лунку добавляют 15 мкл 4х LB буфера с блокирующим реагентом и инкубируют при комнатной температуре в течение 45 минут при осторожном встряхивании. Лизат клеток (16 мкл) добавляют в белый планшет Greiner, обрабатывают реагентами p-SLP76 Ser376 HTRF (2 мкл донора, 2 мкл акцептора) и инкубируют при 4°C в течение ночи. На следующий день измеряют однородную флуоресценцию с временным разрешением (HTRF) на планшетном ридере PHERAstar. Определение IC50 проводят путем подгонки кривой доли ингибирования к логарифму концентрации ингибитора с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0.

Любой из описанных выше анализов можно масштабировать для крупномасштабного или высокопроизводительного скрининга (HTS). Используя любой из анализов, описанных выше, можно определить значения IC50 рассматриваемых соединений.

7. Фармацевтические композиции

В изобретении представлены фармацевтические композиции, которые содержат любое из описанных в настоящем документе соединений или его фармацевтически приемлемую соль и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов.

«Фармацевтически приемлемый эксципиент» и «фармацевтически приемлемый носитель» относятся к веществу, которое способствует приготовлению и/или введению активного агента, и/или абсорбции субъектом, и может быть включено в композиции по настоящему изобретению, не вызывая значительного неблагоприятного токсикологического воздействия на субъекта. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей и эксципиентов включают воду, NaCl, физиологические растворы, лактатированный Рингер, нормальную сахарозу, нормальную глюкозу, связующие агенты, наполнители, разрыхлители, смазывающие агенты, покрытия, подсластители, ароматизаторы, растворы солей (такие, как раствор Рингера), спирты, масла, желатины, углеводы, такие как лактоза, амилоза или крахмал, сложные эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидин и красители и подобные. Такие препараты можно стерилизовать и, при желании, смешивать со вспомогательными агентами, такими как смазывающие агенты, консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, соли для воздействия на осмотическое давление, буферы, красители и/или ароматические вещества и подобные, которые не реагируют пагубно или не препятствуют активности соединений, представленных в настоящем документе. Специалисту в данной области техники будет понятно, что другие фармацевтические носители и эксципиенты подходят для использования с описанными соединениями.

Эти композиции необязательно дополнительно содержат один или несколько дополнительных терапевтических агентов. Альтернативно, соединение по изобретению можно вводить пациенту, нуждающемуся в этом, в сочетании с введением одной или нескольких других терапевтических схем (например, гливека или других ингибиторов киназы, интерферона, трансплантата костного мозга, ингибиторов фарнезилтрансферазы, бисфосфонатов, талидомида, противораковых вакцин, гормональной терапии, антител, радиации и т.д.). Например, дополнительные терапевтические агенты для совместного введения или включения в фармацевтическую композицию с соединением по данному изобретению могут быть еще одним или несколькими противораковыми агентами.

Как описано в настоящем документе, композиции по настоящему изобретению содержат соединение по настоящему изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем, который, как он используется в настоящем документе, включает любые и все растворители, разбавители или другие носители, добавки для дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители или эмульгаторы, консерванты, твердые связующие агенты, смазывающие агенты и подобные, подходящие для конкретной желаемой дозированной формы. Remington’s Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975) описывает различные носители, используемые при составлении фармацевтических композиций, и известные методы их получения. За исключением случаев, когда любая обычная среда-носитель несовместима с соединениями по настоящему изобретению, например, вызывает какой-либо нежелательный биологический эффект или иным вредным образом взаимодействует с любыми другими компонентами фармацевтической композиции, ее использование рассматривается в объеме настоящего изобретения. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают, но не ограничены ими, сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; порошковый трагакант; солод; желатин; тальк; эксципиенты, такие как масло какао и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло; сафлоровое масло; кунжутное масло; оливковое масло; кукурузное масло и соевое масло; гликоли; такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновую кислоту; апирогенную воду; изотонический раствор; раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы, а также другие нетоксичные совместимые смазывающие агенты, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, агенты, способствующие высвобождению, покрывающие агенты, подсластители, ароматизаторы и отдушки, консерванты и антиоксиданты также могут присутствовать в композиции.

8. Составы

Это изобретение также охватывает класс композиций, содержащих активные соединения по настоящему изобретению в ассоциации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, и/или разбавителями, и/или адъювантами (совместно именуемые в настоящем документе материалами «носителями») и, при желании, другими активными ингредиентами.

В некоторых вариантах осуществления, в изобретении представлен фармацевтический состав для лечения рака, в частности рака, описанного в настоящем документе, содержащий соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

В некоторых вариантах осуществления, в изобретении представлен фармацевтический состав для лечения рака, выбранный из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака легких, рака яичников и рака поджелудочной железы, содержащий соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить любым подходящим путем, предпочтительно, в форме фармацевтической композиции, адаптированной для такого пути, и в дозе, эффективной для предполагаемого лечения. Соединения и композиции по настоящему изобретению можно, например, вводить перорально, мукозально, местно, ректально, легочно, например, с помощью ингаляционного спрея, или парентерально, включая внутрисосудистое, внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное, внутримышечное, чрескожное, интраорбитальное, подоболочечное, внутрижелудочковое, внутриопухолевое, интраназальное, интрастернальное введение, путем имплантации, путем ингаляции и путем инфузии, в стандартных дозированных формах, содержащих обычные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и наполнители.

Как правило, фармацевтическими композициями являются таблетки или желатиновые капсулы, содержащие активный ингредиент вместе с а) разбавителями, например, лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином; b) смазывающими агентами, например, диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее магниевой или кальциевой солью и/или полиэтиленгликолем; для таблеток также c) связующими веществами, например, алюмосиликатом магния, крахмальной пастой, желатином, трагакантом, метилцеллюлозой, карбоксиметилцеллюлозой натрия и/или поливинилпирролидоном; при желании d) разрыхлителями, например, крахмалами, агаром, альгиновой кислотой или ее натриевой солью или шипучими смесями; и/или e) абсорбентами, красителями, ароматизаторами и подсластителями. Таблетки могут быть покрыты либо пленкой, либо энтеросолюбильным покрытием в соответствии со способами, известными в данной области техники.

Подходящие композиции для перорального введения включают эффективное количество соединения изобретения в форме таблеток, пастилок, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсии, твердых или мягких капсул или сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального применения, готовят в соответствии с любым способом, известным в данной области техники для производства фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из подсластителей, ароматизаторов, красителей и консервантов для того, чтобы получать фармацевтически элегантные и приятные на вкус препараты. Таблетки могут содержать активный ингредиент в смеси с не токсичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, пригодными для изготовления таблеток. Этими эксципиентами являются, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и разрыхляющие агенты, например кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связующие агенты, например, крахмал, желатин или аравийская камедь; и смазывающие агенты, например стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки не имеют покрытия или покрыты известными способами для замедления разложения и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, обеспечивают устойчивое действие в течение более длительного периода времени. Например, может быть использован материал с временной задержкой, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Препараты для перорального применения могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водной или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.

Некоторые композиции для инъекций представляют собой водные изотонические растворы или суспензии, и суппозитории преимущественно готовят из жировых эмульсий или суспензий. Указанные композиции могут быть стерилизованы и/или содержать адъюванты, такие как консервирующие, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие агенты, активаторы растворения, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут содержать и другие терапевтически ценные вещества. Указанные композиции готовят в соответствии с обычными способами смешивания, гранулирования или покрытия, соответственно, и они содержат примерно 0,1-75% или содержат примерно 1-50% активного ингредиента. Подходящие композиции для чрескожного применения включают эффективное количество соединения по изобретению с подходящим носителем. Носители, подходящие для чрескожной доставки, включают абсорбируемые фармакологически приемлемые растворители для облегчения прохождения через кожу хозяина. Например, чрезкожные устройства имеют форму бандажа, содержащего подложку, резервуар, содержащий соединение, необязательно с носителями, необязательно барьер, контролирующий скорость, для доставки соединения с кожи хозяина с контролируемой и заданной скоростью в течение длительного периода времени, и средства для закрепления устройства на коже.

Подходящие композиции для местного применения, например, на кожу и в глаза, включают водные растворы, суспензии, мази, кремы, гели или составы для распыления, например, для доставки в виде аэрозоля, и подобные. Такие системы доставки для местного применения будут, в частности, подходящими для кожного применения, например, для лечения рака кожи, например, для профилактического применения в солнцезащитных кремах, лосьонах, спреях и подобных. Таким образом, они особенно подходят для использования в составах для местного применения, в том числе в косметических препаратах, хорошо известных в данной области техники. Они могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, агенты, повышающие тоничность, буферы и консерванты.

Используемое в настоящем документе местное применение может также относиться к ингаляции или интраназальному применению. Их удобно доставлять в форме сухого порошка (либо отдельно, в виде смеси, например, сухой смеси с лактозой, либо в виде частиц смешанного компонента, например, с фосфолипидами) из ингалятора для сухого порошка или в виде аэрозольного спрея из контейнера под давлением, насоса, спрея, распылителя или небулайзера с или без использования подходящего пропеллента.

Настоящее изобретение дополнительно представляет безводные фармацевтические композиции и дозированные формы, содержащие соединения по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов, поскольку вода может способствовать разложению некоторых соединений.

Безводные фармацевтические композиции и дозированные формы по изобретению могут быть приготовлены с использованием безводных ингредиентов или ингредиентов с низким содержанием влаги и в условиях с низким содержанием влаги или низкой влажностью. Безводная фармацевтическая композиция может быть получена и храниться таким образом, чтобы сохранялась ее безводная природа. Соответственно, безводные композиции упаковывают с использованием материалов, которые, как известно, предотвращают воздействие воды, так что они могут быть включены в подходящие наборы рецептур. Примеры подходящей упаковки включают, но не ограничены ими, герметически запечатанную фольгу, пластмассу, контейнеры с единичными дозами (например, флаконы), блистерные упаковки и ленточные упаковки.

Изобретение дополнительно представляет фармацевтические композиции и дозированные формы, которые содержат один или несколько агентов, снижающих скорость разложения соединения по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Такие агенты, которые упоминаются в настоящем документе как «стабилизаторы», включают, но не ограничены ими, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, рН буферы или солевые буферы и т.д.

Фармацевтически активные соединения по данному изобретению могут быть переработаны в соответствии с обычными способами фармации для получения лекарственных средств для введения пациентам, включая людей и других млекопитающих.

Количество вводимых соединений и схема дозирования для лечения болезненного состояния с помощью соединений и/или композиций по настоящему изобретению зависит от множества факторов, включая возраст, вес, пол и состояние здоровья субъекта, тип заболевания, тяжесть заболевания, способ и частоту введения и конкретное применяемое соединение. Таким образом, схема дозирования может широко варьироваться, но ее можно определить рутинно с использованием стандартных способов. Как упоминалось ранее, суточную дозу можно вводить за одно введение, или ее можно разделить на 2, 3, 4 или несколько введений.

Для терапевтических целей, активные соединения по настоящему изобретению обычно комбинируют с одним или несколькими адъювантами, эксципиентами или носителями, соответствующими указанному пути введения. При пероральном введении, соединения могут быть смешаны с лактозой, сахарозой, крахмальным порошком, сложными эфирами целлюлозы и алкановых кислот, алкиловыми эфирами целлюлозы, тальком, стеариновой кислотой, стеаратом магния, оксидом магния, натриевыми и кальциевыми солями фосфорной и серной кислот, желатином, аравийской камедью, альгинатом натрия, поливинилпирролидоном и/или поливиниловым спиртом, и затем таблетированы или инкапсулированы для удобного введения. Такие капсулы или таблетки могут содержать состав с контролируемым высвобождением, который может быть представлен в виде дисперсии активного соединения в гидроксипропилметилцеллюлозе.

В случае кожных заболеваний, может быть предпочтительным нанесение местного препарата соединений по настоящему изобретению на пораженный участок от двух до четырех раз в сутки. Составы, подходящие для местного введения, включают жидкие или полужидкие препараты, подходящие для проникновения через кожу (например, линименты, лосьоны, мази, кремы или пасты), и капли, подходящие для введения в глаза, уши или нос. Для местного применения, активный ингредиент может составлять от 0,001% до 10% масс./масс., например, от 1% до 2% масс. состава, хотя он может составлять не более 10% масс./масс., но предпочтительно, не более 5% масс./масс., и более предпочтительно, от 0,1% до 1% от состава.

Соединения по настоящему изобретению можно также вводить с помощью чрескожного устройства. Предпочтительно, чрезкожное введение будет осуществляться с использованием пластыря либо типа резервуара и пористой мембраны, либо типа твердой матрицы. В любом случае, активный агент доставляется - непрерывно из резервуара или микрокапсул через мембрану в клей, проницаемый для активного агента, который контактирует с кожей или слизистой оболочкой реципиента. Если активный агент всасывается через кожу, реципиенту вводят контролируемый и заданный поток активного агента. В случае микрокапсул, инкапсулирующий агент может также выполнять функцию мембраны. Масляная фаза эмульсий по настоящему изобретению может быть составлена из известных ингредиентов известным способом.

Хотя фаза может содержать только эмульгатор, она может содержать смесь, по меньшей мере, одного эмульгатора с жиром или маслом или и с жиром, и с маслом. Предпочтительно, гидрофильный эмульгатор включают вместе с липофильным эмульгатором, который действует как стабилизатор. Также предпочтительно включать и масло, и жир. Вместе, эмульгаторы с или без стабилизаторов составляют так называемый эмульгирующий воск, и воск вместе с маслом и жиром составляют так называемую эмульгирующую мазевую основу, которая образует маслянистую диспергированную фазу кремовых составов. Эмульгаторы и стабилизаторы эмульсий, подходящие для использования в составе по настоящему изобретению, включают Tween 60, Span 80, цетостеариловый спирт, миристиловый спирт, глицерилмоностеарат, лаурилсульфат натрия, глицерилдистеарат отдельно или с воском или другие материалы, хорошо известные в данной области техники.

Выбор подходящих масел или жиров для состава основан на достижении желаемых косметических свойств, поскольку растворимость активного соединения в большинстве масел, которые, вероятно, будут использоваться в составах фармацевтических эмульсий, очень низка. Таким образом, крем предпочтительно должен быть нежирным, не оставляющим пятен и моющимся продуктом с подходящей консистенцией, чтобы избежать утечки из тюбиков или других контейнеров. Могу применяться сложные одноосновные или двухосновные алкиловые эфиры с прямой или разветвленной цепью, такие как диизоадипат, изоцетилстеарат, диэфир пропиленгликоля кокосовых жирных кислот, изопропилмиристат, децилолеат, изопропилпальмитат, бутилстеарат, 2-этилгексилпальмитат или смесь сложных эфиров с разветвленной цепью. Их можно использовать по отдельности или в комбинации в зависимости от требуемых свойств.

Альтернативно, можно использовать липиды с высокой температурой плавления, такие как белый мягкий парафин и/или жидкий парафин, или другие минеральные масла.

Составы, подходящие для местного введения в глаза, также включают глазные капли, в которых активные ингредиенты растворены или суспендированы в подходящем носителе, особенно в водном растворителе для активных ингредиентов.

Активные ингредиенты предпочтительно присутствуют в таких составах в концентрации от 0,5 до 20%, преимущественно, от 0,5 до 10% и особенно примерно 1,5% масс./масс.

Составы для парентерального введения могут быть в форме водных или не водных изотонических стерильных инъекционных растворов или суспензий. Эти растворы и суспензии могут быть приготовлены из стерильных порошков или гранул с использованием одного или нескольких носителей или разбавителей, упомянутых для применения в составах для перорального введения, или с использованием других подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Соединения могут быть растворены в воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле, кукурузном масле, хлопковом масле, арахисовом масле, кунжутном масле, бензиловом спирте, хлориде натрия, трагакантовой камеди и/или различных буферах. Другие адъюванты и способы введения хорошо и широко известны в области фармацевтики. Активный ингредиент можно также вводить путем инъекции в виде композиции с подходящими носителями, включая солевой раствор, декстрозу или воду, или с циклодекстрином (например, каптизолом), солюбилизацией сорастворителем (например, пропиленгликолем) или мицеллярной солюбилизацией (например, Tween 80).

Стерильным препаратом для инъекций может также быть стерильный раствор или суспензия для инъекций в не токсичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. В число приемлемых носителей и растворителей, которые можно использовать, входят вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные нелетучие масла. Для этой цели может быть использовано любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, находят применение при приготовлении инъекционных препаратов.

Для легочного введения, фармацевтическую композицию можно вводить в форме аэрозоля или с помощью ингалятора, включающего аэрозоль в виде сухого порошка.

Суппозитории для ректального введения лекарственного средства могут быть приготовлены путем смешивания лекарственного средства с подходящим нераздражающим наполнителем, таким как масло какао и полиэтиленгликоли, которые являются твердыми при обычной температуре, но жидкими при ректальной температуре и, следовательно, плавятся в прямой кишке и высвобождают лекарственное средство.

Фармацевтические композиции могут быть подвергнуты обычным фармацевтическим операциям, таким как стерилизация, и/или могут содержать обычные адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, буферы и т.д. Таблетки и пилюли могут быть дополнительно изготовлены с энтеросолюбильным покрытием. Такие композиции могут также содержать адъюванты, такие как смачивающие агенты, подсластители, ароматизаторы и отдушки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают соединение описанных в настоящем документе формул или его фармацевтически приемлемую соль; дополнительный агент, выбранный из агента, ингибирующего киназу (малой молекулы, полипептида, антитела и т.д.), иммунодепрессанта, противоракового агента, противовирусного агента, противовоспалительного агента, противогрибкового агента, антибиотика или соединения против гиперпролиферации сосудов; и любой фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель.

Альтернативные композиции по настоящему изобретению включают соединение описанных в настоящем документе формул или его фармацевтически приемлемую соль; и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель. Такие композиции могут необязательно содержать одно или несколько дополнительных терапевтических агентов, включая, например, агенты, ингибирующие киназу (малые молекулы, полипептиды, антитела и т.д.), иммунодепрессанты, противораковые агенты, противовирусные агенты, противовоспалительные агенты, противогрибковые агенты, антибиотики или соединения против гиперпролиферации сосудов.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель или адъювант» относится к носителю или адъюванту, который можно вводить пациенту вместе с соединением по настоящему изобретению, который не нарушает его фармакологическую активность и нетоксичен при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения. Фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и наполнители, которые могут применяться в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, включают, но не ограничены ими, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, самоэмульгирующиеся системы доставки лекарственных средств (SEDDS), такие как d-атокоферол полиэтиленгликоль 1000 сукцинат, поверхностно-активные вещества, используемые в фармацевтических дозированных формах, такие как Tweens или другие подобные полимерные матрицы для доставки, белки сыворотки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, неполные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат динатрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный оксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу натрия, полиакрилаты, воски, полиэтилен-полиоксипропиленовые блок-полимеры, полиэтиленгликоль и ланолин. Циклодекстрины, такие как u-, P- и y-циклодекстрин, или химически модифицированные производные, такие как гидроксиалкилциклодекстрины, включая 2- и 3-гидроксипропилциклодекстрины, или другие солюбилизированные производные, также могут быть успешно использованы для улучшения доставки соединений формул, описанных в настоящем документе.

Фармацевтические композиции можно вводить перорально в любой приемлемой для перорального применения дозированной форме, включая, но не ограничиваясь ими, капсулы, таблетки, эмульсии и водные суспензии, дисперсии и растворы. В случае таблеток для перорального применения, обычно используемые носители включают лактозу и кукурузный крахмал. Также обычно добавляют смазывающие агенты, такие как стеарат магния. Для перорального введения в форме капсул, полезные разбавители включают лактозу и высушенный кукурузный крахмал. Когда водные суспензии и/или эмульсии вводят перорально, активный ингредиент может быть суспендирован или растворен в масляной фазе в комбинации с эмульгирующими и/или суспендирующими агентами.

При желании могут быть добавлены определенные подсластители, ароматизаторы и/или красители. Фармацевтические композиции могут включать составы, в которых используются методы липосом или микрокапсулирования, различные примеры которых известны в данной области техники.

Фармацевтические композиции можно вводить с помощью назального аэрозоля или ингаляции. Такие композиции готовят в соответствии с методами, хорошо известными в области составления фармацевтических препаратов, и могут быть приготовлены в виде растворов в солевом растворе с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, промоторов абсорбции для повышения биодоступности, фторуглеродов и/или других солюбилизирующих или диспергирующих агентов, примеры из которых также хорошо известны в данной области техники.

9. Лечебные наборы

Один аспект настоящего изобретения относится к набору для удобного и эффективного осуществления способов или применений в соответствии с настоящим изобретением. Как правило, фармацевтическая упаковка или набор содержат один или несколько контейнеров, наполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций по изобретению. Такие наборы особенно подходят для доставки твердых пероральных форм, таких как таблетки или капсулы. Такой набор предпочтительно включает ряд стандартных дозировок, и может также включать карточку с дозировками, ориентированными в порядке их предполагаемого использования. При желании, может быть предусмотрена памятка, например, в виде цифр, букв или других маркировок или с календарной вставкой, обозначающей дни в схеме лечения, в которые можно вводить дозы. С такими контейнерами необязательно может быть предоставлено уведомление в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических продуктов, которое отражает одобрение органом производства, использования или продажи для введения человеку.

Следующие типовые примеры содержат важную дополнительную информацию, примеры и рекомендации, которые могут быть адаптированы к практике настоящего изобретения в его различных вариантах осуществления и их эквивалентах. Эти примеры предназначены для иллюстрации изобретения и не предназначены и не должны толковаться как ограничивающие его объем. Действительно, различные модификации изобретения и многие другие его варианты осуществления, в дополнение к показанным и описанным в настоящем документе, станут очевидными для специалистов в данной области техники после ознакомления с этим документом, включая следующие примеры и ссылки на научную и патентную литературу, цитируемую в настоящем документе.

Содержание цитируемых ссылок включено в настоящий документ посредством ссылки, чтобы помочь проиллюстрировать уровень техники.

Кроме того, для целей настоящего изобретения химические элементы идентифицированы в соответствии с Периодической таблицей элементов, версия CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75^th Ed, на внутренней стороне обложки. Кроме того, общие принципы органической химии, а также конкретные функциональные группы и реакционная способность описаны в «Organic Chemistry,» Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, и «Organic Chemistry,» Morrison & Boyd (3d Ed), полное содержание обоих включено в настоящий документ посредством ссылки.

10. Схемы синтеза

Соединения по изобретению могут быть получены специалистом в данной области техники в соответствии с признанными в данной области методами и процедурами. Более конкретно, соединения по настоящему изобретению могут быть получены в соответствии со схемами, способами и примерами, изложенными ниже. Специалисту в данной области будет понятно, что отдельные стадии на следующих схемах могут быть изменены для получения соединений по изобретению. Реагенты и исходные материалы легко доступны специалистам в данной области техники. Все заместители, если не указано иное, являются такими, как определено выше.

ПРИМЕРЫ

Ниже представлены используемые сокращения и их значения в спецификации.

EtOAc: Этилацетат

ДХМ: Дихлорметан

АЦН: ацетонитрил

ТГФ: тетрагидрофуран

ДМСО: диметилсульфоксид

MeOH: метанол

EtOH: этанол

ДМФ: N, N-диметилформамид

ДМА: N, N-диметилацетамид

ДМФ ДМА: N, N-диметилформамид диметилацеталь

NCS: N-хлорсукцинимид

NBS: N-бромсукцинимид

NIS: N-йодсукцинимид

Pd-C : палладий на угле

ДАЛ: диизопропиламид лития

ТФК: трифторуксусная кислота

ПТСК: п-толуолсульфоновая кислота

DIBAL-H: гидрид диизобутилалюминия

АГЛ: алюмогидрид лития

Py: пиридин

ДФФА: дифенилфосфорил азид

КДИ: 1,1-карбонилдиимидазол

ТЭА:триэтиламин

ДИПЭА: N, N-диизопропилэтиламин

ДМАП: 4-(диметиламино)пиридин

EDCI: N-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодиимида гидрохлорид

HATU: гексафторфосфат (1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиния 3-оксида

ГОБТ: 1-гидроксибензотриазол

TfOH: трифторметансульфоновая кислота

dppf: 1,1 ферроцендиил-бис(дифенилфосфин)

ТДАС: трифторид (диэтиламино)серы

Pd2(dba)3: трис(дибензилиденацетон) дипалладий(0)

Boc: трет-бутоксикарбонил

Ac: ацетил

ТМСИ: триметилсилилйодид

ИТБА: йодид тетрабутиламмония

PPh₃: трифенилфосфин

dba: дибензилиденацетон

BINAP: 2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-бинафтил

MsCl: метансульфонилхлорид

TsCl: толуолсульфонилхлорид

ДМАП: 4-диметиламинопиридин

LiHMDS: бис(триметилсилил)амид лития

NaHMDS: бис(триметилсилиламид) натрия

ДМС: диметилсульфид

ДМЭ: диметоксиэтан

ДХЭ: дихлорэтан

ЯМР: ядерный магнитный резонанс

ЖХ-МС: жидкостная хроматография масс спектрометрия

ИЭР-МС: ионизация электрораспылением масс спектрометрия

ГХ-МС: газовая хроматография масс спектрометрия

ТСХ: тонкослойная хроматография

TCR: T-клеточный рецептор

BCR: B-клеточный рецептор

CARD: домен активации и рекрутинга каспазы

мМ: миллимоль

мкМ: микромоль

мл: микролитр

нг: нанограмм

нМ: наномоль

нм: нанометр

IC₅₀: полумаксимальная ингибирующая концентрация

ОП: оптическая плотность

А. Биологические примеры

Биологический пример 1. HPK1 биохимический анализ

В этом примере используют ADP-Glo™ Kinase Assay для измерения действия потенциальных соединений-ингибиторов HPK1 на активность киназы HPK1.

ADP-Glo™ Kinase Assay (Promega Corp., Madison, WI) измеряет ADP, образующийся в результате киназной реакции. Согласно производителю, ADP, образующийся в киназном анализе, сначала превращается в ATP, который затем используется для создания света в люциферазной реакции. Создаваемая люминесценция коррелирует с активностью киназы. Типовые установки эксперимента описаны ниже, хотя в отдельные анализы могут быть внесены незначительные корректировки.

Материалы и оборудование

1. Реагенты:

Реагенты Поставщик Каталог поставщика HPK-1 Signal Chem M23-11G-10 MBP Signal Chem M42-51N ATP Из ADP-Glo kinase Kit - ADP-Glo™ kinase Kit Promega V9102 10% BSA исходный раствор Miltenyi 130-091-376 DTT Sigma D0632 MgCl₂ Sigma 208337 Trizma основание Sigma T1503

2. Оборудование и поставщики:

Оборудование Источник Кат. № 96-луночный V-донный планшет Greiner 651201 384-луночный планшет Greiner 6007290 LDV планшет Labcyte LP0200 Bravo Agilent - Envision PerkinElmer - Водная система Millipore Milli-Q эталонная система - Bravo 10 мкл кончики Axygen VT-384-10uL-R Bravo 30 мкл кончики Axygen VT-384-31uL-R Ручная одноканальная пипетка RAININ - Многоканальная электронная пипетка Thermo/RAININ -

3. Установки планшета

Серийное 3-кратное разведение соединений от 10 мкМ (максимальная концентрация) до 0,508 нМ (наименьшая концентрация). Положительным контролем является 10 мкМ эталон+фермент+субстрат. Отрицательным контролем является 1% ДМСО+фермент+субстрат.

4. Процедуры

1. Подготовка буфера

40 мМ Трис pH 7,5; 20 мМ MgCl₂, 0,1 мг/мл BSA, 50 мкМ DTT

Исходный буфер

1M Tris, PH7,5, 121,14 г/моль Добавляют 6,057 г к 50 мл H₂O, доводят PH до 7,5 1M MgCl₂, 95,21 г/моль Добавляют 4,7605 г к 50 мл H₂O

Добавляют 20 мл 1M Tris и 10 мл 1M MgCl₂ к 470 мл ddH₂O с получением буферного исходного раствора и исходного раствора при КТ.

2. Получение аналитического буфера Fresh 1*

Реагент [Исходный] [Конечный] Кратность Добавление (мл) DTT (мМ) 10 0,05 200 0,015 BSA (мг/мл) 100 0,1 1000 0,003 исходный буфер 3

3. Получение соединений

1) Соединения разбавляют до 1 мМ путем смешивания 10 мкл 10 мМ соответствующих исходных растворов соединений с 90 мкл ДМСО.

2) Затем соединения разводят в 3-кратно для получения 10 доз (разведение от 5 мкл до 10 мкл) с помощью BRAVO. Максимальная концентрация соединения составляет 1 мМ (100×), конц. ДМСО составляет 100%.

3) Переносят 100 нл каждого разведенного образца соединения в 384-луночный планшет (Corning-4512) с помощью ECHO.

4) Центрифугируют планшет при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

4. Получение смеси 2× ATP-MBP:

20 мкМ ATP, 0,2 мкг/мкл MBP в киназном буфере (конечная концентрация: 10 мкМ ATP, 0,1 мкг/мкл MBP)

Реагент [Исходный] [Рабочий] [Конечный] Кратность Добавка (мкл) Аналитический буфер (мкл) Всего (мкл) ATP (мкМ) 10,000 20 10 500 0,2 79,8 100 MBP (мг/мл) 1 0,2 0,1 5 20,00

5. Получение 2× HPK1 рабочего раствора с аналитическим буфером.

Конечная концентрация HPK1 составляет 0,6 нг/мкл. Для соединений с высокой эффективностью используют более низкую концентрацию HPK1 (0,26 нг/мкл-0,065 нг/мкл).

6. Добавляют 5 мкл/лунку рабочего раствора 2× HPK1. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

7. Добавляют 5 мкл/лунку 2× АТР-субстрата, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

8. Инкубируют при 25°C в течение 1 часа (или 6 часов для соединений с высокой эффективностью).

9. Добавляют 5 мкл/лунку реагента ADP-GLO™ чтобы остановить киназную реакцию и истощить неизрасходованный АТР. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

10. Добавляют 10 мкл реагента для обнаружения киназ, чтобы превратить ADP в АТР. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

11. Записывают люминесцентный сигнал на планшетном ридере Envision (384-CTG).

5. Анализ данных

Долю (%) ингибирования при каждой концентрации соединения рассчитывают на основании и относительно сигнала в лунках с высоким и низким контролем, содержащихся в каждом планшете для анализа. Лунки с высоким контролем служат как 0% ингибирования, и лунки с низким контролем, которые не содержат каких-либо соединений, но скорее ДМСО (конечная концентрация=0,5%), служат как 100% ингибирования. Концентрации и значения % ингибирования для тестируемых соединений наносят на график, и концентрацию соединения, необходимую для 50% ингибирования (IC50), определяют с помощью трехпараметрического логистического уравнения доза-ответ. Значение конечной точки (IC50) для эталонного пептида/соединения оценивают в каждом эксперименте в качестве меры контроля качества. Если значение конечной точки находится в пределах 3-кратного от ожидаемого значения, то эксперимент считают приемлемым.

Биологический пример 2. Биохимический анализ PKC-тета.

В этом примере используют ADP-Glo™ Kinase Assay для измерения влияния потенциальных соединений-ингибиторов HPK1 на активность PKC-тета киназы. Типовые установки эксперимента описаны ниже, хотя в отдельные анализы могут быть внесены незначительные корректировки.

Материалы и оборудование

1. Реагенты:

Описание Поставщик Каталог PKC тэта Signal Chem P74-10G-10 PKCтид Signal Chem P15-58-1MG ATP Из ADP-Glo kinase Kit - PKC жировой активатор (10×, 500 мкл) Signal Chem L51-39-500 ADP-Glo™ kinase Kit Promega V9102 10% BSA исходный раствор Miltenyi 130-091-376 DTT Sigma D0632 MgCl₂ Sigma 208337 Trizma основание Sigma T1503

2. Оборудование и поставщики:

Оборудование Источник Кат. № 96-луночный V-донный планшет Greiner 651201 384-луночный планшет Corning 4512 LDV планшет Labcyte LP0200 Bravo Agilent - Envision PerkinElmer - Водная система Millipore Milli-Q эталонная система - Bravo 10 мкл кончики Axygen VT-384-10uL-R Bravo 30 мкл кончики Axygen VT-384-31uL-R Ручная одноканальная пипетка RAININ - Многоканальная электронная пипетка Thermo/RAININ -

3. Установки планшета

Серийное 3-кратное разведение соединений от 10 мкМ (максимальная концентрация) до 0,508 нМ (наименьшая концентрация). Положительным контролем является 10 мкМ эталон+фермент+субстрат. Отрицательным контролем является 1% ДМСО+фермент+субстрат.

4.Процедуры

1. Подготовка буфера

40 мМ Трис pH 7,5; 20 мМ MgCl₂, 0,1 мг/мл BSA, 50 мкМ DTT

Исходный буфер

1M Tris, PH7,5, 121,14 г/моль Добавляют 6,057 г к 50 мл H₂O, доводят PH до 7,5 1M MgCl₂, 95,21 г/моль Добавляют 4,7605 г к 50 мл H₂O

Добавляют 20 мл 1M Tris и 10 мл 1M MgCl₂ к 470 мл ddH₂O с получением буферного исходного раствора и исходного раствора при КТ.

2. Получение аналитического буфера Fresh 1*

Реагент [Исходный] [Конечный] Кратность Добавление (мл) DTT (мМ) 10 0,05 200 0,015 BSA (мг/мл) 100 0,1 1000 0,003 PKC жировой активатор 10 1 10 0,3 исходный буфер 3

3. Получение соединений

1) Соединения разводят до 1 мМ путем смешивания 10 мкл 10 мМ исходных растворов соответствующих соединений с 90 мкл ДМСО.

2) Затем соединения разводят 3-кратно для получения 10 доз (разведение от 5 мкл до 10 мкл) с помощью BRAVO. Максимальная концентрация соединения составляет 1 мМ (100×), конц. ДМСО составляет 100%.

3) Переносят 50 нл каждого разведенного образца соединения в 384-луночный планшет (Corning-4512) с помощью ECHO.

4) Центрифугируют планшет при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

4. Получение 2× рабочего раствора фермента в киназном буфере:

Фермент [Исход ный] [Рабо чий] [Конеч ный] Крат ность Добавка (мкл) Аналитичес кий буфер (мкл) Всего (мкл) PKC тэта (нг/мкл) 100 0,25 0,125 400,0 1,0 399,0 400

5. Получение 2× ATP-sub смеси:

Фермент [Исход ный] [Рабо чий] [Конеч ный] Крат ность Добавка (мкл) Аналитичес кий буфер (мкл) Всего (мкл) ATP (мкМ) 10,000 60 30 167 2,40 237,6 400 PKCтид (мкг/мл) 1 0,4 0,2 2,50 160,00

6. Добавляют 2,5 мкл/лунку 2× рабочего раствора фермента. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

7. Добавляют 2,5 мкл/лунку 2× АТФ-субстрата, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

8. Инкубируют при 25°C в течение 60 мин.

9. Добавляют 5 мкл/лунку реагента ADP-Glo™, чтобы остановить киназную реакцию и истощить неизрасходованный АТР через 1 час. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

10. Добавляют 10 мкл реагента для обнаружения киназ, чтобы преобразовать ADP в АТР. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

11. Записывают сигнал люминесценции на планшетном ридере Envision (384-USL).

5. Анализ данных

Долю (%) ингибирования при каждой концентрации соединения рассчитывают на основании и относительно сигнала в лунках с высоким и низким контролем, содержащихся в каждом планшете для анализа. Лунки с высоким контролем служат как 0% ингибирования, и лунки с низким контролем, которые не содержат каких-либо соединений, но скорее ДМСО (конечная концентрация=0,5%), служат как 100% ингибирования. Концентрации и значения % ингибирования для тестируемых соединений наносят на график, и концентрацию соединения, необходимую для 50% ингибирования (IC50), определяют с помощью трехпараметрического логистического уравнения доза-ответ. Значение конечной точки (IC50) для эталонного пептида/соединения оценивают в каждом эксперименте в качестве меры контроля качества. Если значение конечной точки находится в пределах 3-кратного от ожидаемого значения, то эксперимент считают приемлемым.

Биологический пример 3. Биохимический анализ TBK1.

В этом примере используют ADP-Glo™ Kinase Assay для измерения влияния потенциальных соединений-ингибиторов HPK1 на активность TBK1 киназы. Типовые установки эксперимента описаны ниже, хотя в отдельные анализы могут быть внесены незначительные корректировки.

Материалы и оборудование

1. Реагенты:

Описание Поставщик Каталог TBK1 Signal Chem T02-10G-10 MBP Signal Chem M42-51N ATP Из ADP-Glo kinase Kit - ADP-Glo™ kinase Kit Promega V9102 10% BSA исходный раствор Miltenyi 130-091-376 DTT Sigma D0632 MgCl₂ Sigma 208337 Trizma основание Sigma T1503

2. Оборудование и поставщики:

Оборудование Источник Кат. № 96-луночный V-донный планшет Greiner 651201 384-луночный планшет Corning 4512 LDV планшет Labcyte LP0200 Bravo Agilent - Envision PerkinElmer - Водная система Millipore Milli-Q эталонная система - Bravo 10 мкл кончики Axygen VT-384-10uL-R Bravo 30 мкл кончики Axygen VT-384-31uL-R Ручная одноканальная пипетка RAININ - Многоканальная электронная пипетка Thermo/RAININ -

3. Установки планшета

См. выше.

4.Процедуры

1. Подготовка буфера

40 мМ Трис pH 7,5; 20 мМ MgCl₂, 0,1 мг/мл BSA, 50 мкМ DTT

Исходный буфер

1M Tris, PH7,5, 121,14 г/моль Добавляют 6,057 г к 50 мл H₂O, доводят PH до 7,5 1M MgCl₂, 95,21 г/моль Добавляют 4,7605 г к 50 мл H₂O

Добавляют 20 мл 1M Tris и 10 мл 1M MgCl₂ к 470 мл ddH₂O с получением буферного исходного раствора и исходного раствора при КТ (комнатной температуре).

2. Получение аналитического буфера Fresh 1*

Реагент [Исходный] [Конечный] Кратность Добавление (мл) DTT (мМ) 10 0,05 200 0,015 BSA (мг/мл) 100 0,1 1000 0,003 исходный буфер 3

3. Получение соединений

1) Соединения разводят до 1 мМ путем смешивания 10 мкл 10 мМ исходных растворов соответствующих соединений с 90 мкл ДМСО.

2) Затем соединения разводят 3-кратно для получения 10 доз (разведение от 5 мкл до 10 мкл) с помощью BRAVO. Максимальная концентрация соединения составляет 1 мМ (100×), конц. ДМСО составляет 100%.

3) Переносят 50 нл каждого разведенного образца соединения в 384-луночный планшет (Corning-4512) с помощью ECHO.

4) Центрифугируют планшет при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

4. Получение 2× рабочего раствора фермента в киназном буфере:

Фермент [Исход ный] [Рабо чий] [Конеч ный] Крат ность Добавка (мкл) Аналитичес кий буфер (мкл) Всего (мкл) TBK1 (нг/мкл) 100 1,6 0,8 62,5 6,4000 393,6 400

5. Получение 2× ATP-sub смеси:

Фермент [Исход ный] [Рабо чий] [Конеч ный] Крат ность Добавка (мкл) Аналитичес кий буфер (мкл) Всего (мкл) ATP (мкМ) 10,000 50 25 200 2,00 318,0 400 MBP (мкг/мл) 1 0,2 0,1 5 80,00

6. Добавляют 2,5 мкл/лунку 2× рабочего раствора фермента. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

7. Добавляют 2,5 мкл/лунку 2× АТФ-субстрата, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

8. Инкубируют при 25°C в течение 60 мин.

9. Добавляют 5 мкл/лунку реагента ADP-Glo™, чтобы остановить киназную реакцию и истощить неизрасходованный АТР через 1 час. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

10. Добавляют 10 мкл реагента для обнаружения киназ, чтобы преобразовать ADP в АТР. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

11. Записывают сигнал люминесценции на планшетном ридере Envision (384-USL).

5. Анализ данных

Долю (%) ингибирования при каждой концентрации соединения рассчитывают на основании и относительно сигнала в лунках с высоким и низким контролем, содержащихся в каждом планшете для анализа. Лунки с высоким контролем служат как 0% ингибирования, и лунки с низким контролем, которые не содержат каких-либо соединений, но скорее ДМСО (конечная концентрация=0,5%), служат как 100% ингибирования. Концентрации и значения % ингибирования для тестируемых соединений наносят на график, и концентрацию соединения, необходимую для 50% ингибирования (IC50), определяют с помощью трехпараметрического логистического уравнения доза-ответ. Значение конечной точки (IC50) для эталонного пептида/соединения оценивают в каждом эксперименте в качестве меры контроля качества. Если значение конечной точки находится в пределах 3-кратного от ожидаемого значения, то эксперимент считают приемлемым.

Биологический пример 4. Биохимический анализ JAK3.

В этом примере используют ADP-Glo™ Kinase Assay для измерения влияния потенциальных соединений-ингибиторов HPK1 на активность JAK3 киназы. Типовые установки эксперимента описаны ниже, хотя в отдельные анализы могут быть внесены незначительные корректировки.

Материалы и оборудование

1. Реагенты:

Описание Поставщик Каталог JAK3 Thermo fisher PV3855 Poly(E4Y1) Signal Chem P61-58 Ультра чистая ATP Promega Из ADP-Glo kinase Kit ADP-Glo™ kinase Kit Promega V9102 10% BSA исходный раствор Miltenyi 130-091-376 DTT Sigma 3483-12-3 MgCl₂ Sigma M1028 Tris основание Sigma T1503

2. Оборудование и поставщики:

Оборудование Источник Кат. № Echo Qualified 384-Well Low Dead Volume Microplate Perkinelmer LP0200 Аналитический планшет, Corning® 384-луночный планшет, низкий объем Corning С4512 Микропланшет, 96-луночный, ПП, V-донный Greiner 651201 Bravo 10 мкл кончики Axygen 301-78-401 Bravo 30 мкл кончики Axygen 301-78-301 ECHO Perkinelmer - Envision PerkinElmer - BRAVO - - Водная система Millipore Milli-Q эталонная система - Инкубатор Cimo SPX-60BSH-II E1-clipTip многоканальная электронная пипетка (1-30 мкл) Thermo Fisher 4671030BT

3. Процедуры

1. Получение JAK3 киназного буфера.

Добавляют свежий DTT и BSA в буфер (конечная концентрация: 40 мМ трис, pH 7,5; 20 мМ MgCl₂, 0,1 мг/мл BSA, 50 мкМ DTT).

Реагент [Исходный]) [Конечный] Кратность Добавка (мкл) ДТТ (мМ) 10 0,05 200 15 BSA (мг/мл) 100 0,1 1000 3 1× Киназный буфер 1× 1× 1 2982 Всего 3000

2. Получение соединений

Для тестируемых соединений: соединения разбавляют до 1 мМ путем смешивания 5 мкл 10 мМ исходных соединений с 45 мкл ДМСО. Затем растворы соединений серийно разводят 3-кратно для получения 10 доз. Максимальная концентрация соединения составляет 1 мМ (100×), концентрация ДМСО составляет 100%.

50 нл каждой из 10 доз разведенного соединения добавляют в 384-луночный планшет для анализа (Corning #4512) с помощью ECHO.

Для положительного контроля, 50 нл 1 мМ эталонного соединения добавляют в 384-луночный планшет для анализа (Corning #4512) с помощью ECHO.

Для отрицательного контроля: 50 нл ДМСО переносят в 384-луночный планшет для анализа в качестве отрицательного контроля.

Планшет для анализа центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

3. Соединения переносят с помощью ECHO в соответствии со схемой, приведенной ниже:

Эталонные и тестируемые соединения 1-15: серийное 3-кратное разведение от 10 мкМ до 0,508 нМ (10 доз); отрицательным контролем является 0,78 нг JAK3, 4 мкМ ATP и 0,2 мкг/мкл поли, 1% ДМСО; положительным контролем является максимальная доза эталонного соединения, 0,78 нг JAK3, 0,2 мкг/мкл Poly(E4Y1), 4 мкМ АТР, 1% ДМСО.

4. Добавляют 2,5 мкл/лунку 2× рабочего раствора JAK3 с помощью пипетки (Thermo, 30 мкл, многоканальная). Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

5. Добавляют 2,5 мкл/лунку 2× рабочей смеси ATP-Poly(E4Y1) с помощью пипетки (Thermo, 30 мкл, многоканальная). Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

6. Инкубируют планшет для анализа при 25°C в течение 60 мин.

7. Добавляют 5 мкл/лунку реагента ADP-Glo™ от BRAVO, чтобы остановить киназную реакцию и истощить неизрасходованный ATP через 1 час. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

8. Добавляют 10 мкл реагента для обнаружения киназ от BRAVO, чтобы превратить ADP в АТР. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

9. Записывают сигнал люминесценции на планшетном ридере Envision (384-USL).

10. Обрабатывают данные с помощью XL-fit. Ингибирование%=[1-(тестируемая лунка - отрицательный контроль) / (положительный контроль - отрицательный контроль)] * 100%.

5. Анализ данных

Долю (%) ингибирования при каждой концентрации соединения рассчитывают на основании и относительно сигнала в лунках с отрицательным и положительным контролем, содержащихся в каждом планшете для анализа. Лунки с отрицательным контролем служат как 0% ингибирования, и лунки с положительным контролем служат как 100% ингибирования. Концентрации и значения % ингибирования для тестируемых соединений наносят на график, и концентрацию соединения, необходимую для 50% ингибирования (IC50), определяют с помощью трехпараметрического логистического уравнения доза-ответ. Значение конечной точки (IC50) для эталонного пептида/соединения оценивают в каждом эксперименте в качестве меры контроля качества. Если значение конечной точки находится в пределах 3-кратного от ожидаемого значения, то эксперимент считают приемлемым.

Биологический пример 5. Протокол биохимического анализа ZAP70.

В этом примере используют ADP-Glo™ Kinase Assay для измерения влияния потенциальных соединений-ингибиторов HPK1 на активность ZAP70 киназы. Типовые установки эксперимента описаны ниже, хотя в отдельные анализы могут быть внесены незначительные корректировки.

Материалы и оборудование

1. Реагенты:

Описание Поставщик Каталог ZAP70 Sigma Chem Z02-10G Poly(E4Y1) Signal Chem P61-58 Ультра чистая ATP Promega Из ADP-Glo kinase Kit ADP-Glo™ kinase Kit Promega V9102 10% BSA исходный раствор Miltenyi 130-091-376 DTT Sigma 3483-12-3 ДМСО Sigma D5879 MnCl₂ Sigma M5505 MgCl₂ Sigma M1028 Tris основание Sigma T1503

2. Оборудование и поставщики:

Оборудование Источник Кат. № Echo Qualified 384-Well Low Dead Volume Microplate Perkinelmer LP0200 Аналитический планшет, Corning® 384-луночный планшет, низкий объем Corning С4512 Микропланшет, 96-луночный, ПП, V-донный Greiner 651201 Bravo 10 мкл кончики Axygen 301-78-401 Bravo 30 мкл кончики Axygen 301-78-301 ECHO Perkinelmer - Envision PerkinElmer - BRAVO - - Водная система Millipore Milli-Q эталонная система - Инкубатор Cimo SPX-60BSH-II E1-clipTip многоканальная электронная пипетка (1-30 мкл) Thermo Fisher 4671030BT

3. Процедуры

1. Получение ZAP70 киназного буфера.

Добавляют свежий DTT и BSA в буфер (конечная концентрация: 40 мМ трис, pH 7,5; 20 мМ MgCl₂, 0,1 мг/мл BSA, 50 мкМ DTT, 2 мМ MnCl₂).

Реагент [Исходный] [Конечный] (мМ) Кратность Добавка (мкл) ДТТ (мМ) 10 0,05 200 15 BSA (мг/мл) 100 0,1 1000 3 MnCl₂ 500 мМ 2 250 12 1× Киназный буфер 1× 1× 1 2970 Всего 3000

2. Получение соединений

Для тестируемых соединений: соединения сначала разводят до 1 мМ путем смешивания 5 мкл 10 мМ исходных соединений с 45 мкл ДМСО. Эти соединения затем разводят 3-кратно для получения 10 доз. Максимальная концентрация соединения составляет 1 мМ (100×), концентрация ДМСО составляет 100%.

50 нл каждой из 10 доз разведенного соединения добавляют в 384-луночный планшет для анализа (Corning #4512) с помощью ECHO.

Для положительного контроля, 50 нл 1 мМ стауроспорина переносят в 384-луночный планшет для анализа в качестве положительного контроля.

Для отрицательного контроля: 50 нл ДМСО переносят в 384-луночный планшет для анализа в качестве отрицательного контроля. Центрифугируют планшет для анализа при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

3. Соединения переносят с помощью ECHO в соответствии со схемой, приведенной ниже:

Стауроспорин и тестируемые соединения 1-15: серийное 3-кратное разведение от 10 мкМ до 0,508 нМ (10 доз); отрицательным контролем является 6,25 нг ZAP70, 10 мкМ ATP и 0,4 мкг/мкл поли, 1% ДМСО; положительным контролем является 10 мкМ стауроспорина, 6,25 нг ZAP70, 10 мкМ АТР и 0,4 мкг/мл poly, 1% ДМСО.

4. Получают смесь 2× АТР-Poly(E4Y1): 20 мкМ АТР, 0,8 мкг/мкл poly(E4Y1) в киназном буфере (конечная концентрация: 10 мкМ АТР, 0,4 мкг/мкл poly(E4Y1).

5. Получают рабочий раствор 2× ZAP70: (2,5 нг/мкл) в киназном буфере (конечная концентрация 1,25 нг/мкл).

6. Добавляют 2,5 мкл/лунку 2× рабочего раствора ZAP70 с помощью пипетки (Thermo, 30 мкл, многоканальная). Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

7. Добавляют 2,5 мкл/лунку 2× рабочей смеси ATP-Poly(E4Y1) с помощью пипетки (Thermo, 30 мкл, многоканальная). Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

8. Инкубируют планшет для анализа при 25°C в течение 60 мин.

9. Добавляют 5 мкл/лунку реагента ADP-Glo™ от BRAVO, чтобы остановить киназную реакцию и истощить неизрасходованный ATP через 1 час. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

10. Добавляют 10 мкл реагента для обнаружения киназ от BRAVO, чтобы превратить ADP в АТР. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

11. Записывают сигнал люминесценции на планшетном ридере Envision (384-USL).

12. Обрабатывают данные с помощью XL-fit. Ингибирование%=[1-(тестируемая лунка - отрицательный контроль) / (положительный контроль - отрицательный контроль)] * 100%.

5. Анализ данных

Долю (%) ингибирования при каждой концентрации соединения рассчитывают на основании и относительно сигнала в лунках с отрицательным и положительным контролем, содержащихся в каждом планшете для анализа. Лунки с отрицательным контролем служат как 0% ингибирования, и лунки с положительным контролем служат как 100% ингибирования. Концентрации и значения % ингибирования для тестируемых соединений наносят на график, и концентрацию соединения, необходимую для 50% ингибирования (IC50), определяют с помощью трехпараметрического логистического уравнения доза-ответ. Значение конечной точки (IC50) для эталонного пептида/соединения оценивают в каждом эксперименте в качестве меры контроля качества. Если значение конечной точки находится в пределах 3-кратного от ожидаемого значения, то эксперимент считают приемлемым.

Биологический пример 6. Протокол биохимического анализа LCK.

В этом примере используют ADP-Glo™ Kinase Assay для измерения влияния потенциальных соединений-ингибиторов HPK1 на активность Lck киназы. Типовые установки эксперимента описаны ниже, хотя в отдельные анализы могут быть внесены незначительные корректировки.

Материалы и оборудование

1. Реагенты:

Описание Поставщик Каталог LCK Sigma Chem Z03-10G Poly(E4Y1) Signal Chem P61-58 Ультра чистая ATP Promega Из ADP-Glo kinase Kit ADP-Glo™ kinase Kit Promega V9102 10% BSA исходный раствор Miltynyl Biotec 130-091-376 DTT Sigma 3483-12-3 ДМСО Sigma D5879 MnCl₂ Sigma M5505 MgCl₂ Sigma M1028 Tris основание Sigma T1503

2. Оборудование и поставщики:

Оборудование Источник Кат. № Echo Qualified 384-Well Low Dead Volume Microplate Perkinelmer LP0200 Аналитический планшет, Corning® 384-луночный планшет, низкий объем Corning С4512 Микропланшет, 96-луночный, ПП, V-донный Greiner 651201 Bravo 10 мкл кончики Axygen 301-78-401 Bravo 30 мкл кончики Axygen 301-78-301 ECHO Perkinelmer - Envision PerkinElmer - BRAVO - - Водная система Millipore Milli-Q эталонная система - Инкубатор Cimo SPX-60BSH-II E1-clipTip многоканальная электронная пипетка (1-30 мкл) Thermo Fisher 4671030BT

3. Процедуры

1. Получение LCK киназного буфера.

Добавляют свежий DTT и BSA в буфер (конечная концентрация: 40 мМ трис, pH 7,5; 20 мМ MgCl₂, 0,1 мг/мл BSA, 50 мкМ DTT, 2 мМ MnCl₂).

Реагент [Исходный] [Конечный] (мМ) Кратность Добавка (мкл) ДТТ (мМ) 10 0,05 200 15 BSA (мг/мл) 100 0,1 1000 3 MnCl₂ 500 мМ 2 250 12 1× Киназный буфер 1× 1× 1 2970 Всего 3000

2. Получение соединений

Для тестируемых соединений: соединения сначала разводят до 1 мМ путем смешивания 5 мкл 10 мМ исходных соединений с 45 мкл ДМСО. Эти соединения затем серийно разводят 3-кратно для получения 10 доз. Максимальная концентрация соединения составляет 1 мМ (100×), концентрация ДМСО составляет 100%.

Для положительного контроля: стауроспорин разводят до 300 мкМ смешиванием 3 мкл 10 мМ исходного раствора с 98 мкл ДМСО.

50 нл растворов соединений и 300 мкМ стауроспорина переносят в 384-луночный планшет для анализа (Corning #4512) в качестве положительного контроля.

Для отрицательного контроля: 50 нл ДМСО переносят в 384-луночный планшет для анализа в качестве отрицательного контроля. Центрифугируют планшет для анализа при 1500 об/мин в течение 1 минуты.

3. Соединения переносят с помощью ECHO в соответствии со схемой, приведенной ниже:

Стауроспорин и тестируемые соединения 1-15: серийное 3-кратное разведение от 10 мкМ до 0,508 нМ (10 доз); отрицательным контролем является 7 нг LCK, 20 мкМ ATP и 0,4 мкг/мкл поли, 1% ДМСО; положительным контролем является 3 мкМ стауроспорина, 7 нг LCK, 20 мкМ АТР и 0,4 мкг/мл poly, 1% ДМСО.

4. Получают смесь 2× АТР-Poly(E4Y1): 40 мкМ АТР, 0,8 мкг/мкл poly(E4Y1) в киназном буфере (конечная концентрация: 20 мкМ АТР, 0,4 мкг/мкл poly(E4Y1).

5. Получают рабочий раствор 2× LCK: (2,8 нг/мкл) в киназном буфере (конечная концентрация 1,4 нг/мкл).

6. Добавляют 2,5 мкл/лунку 2× рабочего раствора LCK с помощью пипетки (Thermo, 30 мкл, многоканальная). Центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1 минуты.

7. Добавляют 2,5 мкл/лунку 2× рабочей смеси ATP-Poly(E4Y1) с помощью пипетки (Thermo, 30 мкл, многоканальная). Центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1 минуты.

8. Инкубируют планшет для анализа при 25°C в течение 60 мин.

9. Добавляют 5 мкл/лунку реагента ADP-Glo™ от BRAVO, чтобы остановить киназную реакцию и истощить неизрасходованный ATP через 1 час. Центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

10. Добавляют 10 мкл реагента для обнаружения киназ от BRAVO, чтобы превратить ADP в АТР. Центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируют при 25°С в течение 40 мин.

11. Записывают сигнал люминесценции на планшетном ридере Envision (384-USL).

12. Обрабатывают данные с помощью XL-fit. Ингибирование%=[1-(тестируемая лунка - отрицательный контроль) / (положительный контроль - отрицательный контроль)] * 100%.

4. Анализ данных

Долю (%) ингибирования при каждой концентрации соединения рассчитывают на основании и относительно сигнала в лунках с отрицательным и положительным контролем, содержащихся в каждом планшете для анализа. Лунки с отрицательным контролем служат как 0% ингибирования, и лунки с положительным контролем служат как 100% ингибирования. Концентрации и значения % ингибирования для тестируемых соединений наносят на график, и концентрацию соединения, необходимую для 50% ингибирования (IC50), определяют с помощью трехпараметрического логистического уравнения доза-ответ. Значение конечной точки (IC50) для эталонного пептида/соединения оценивают в каждом эксперименте в качестве меры контроля качества. Если значение конечной точки находится в пределах 3-кратного от ожидаемого значения, то эксперимент считают приемлемым.

Биологический пример 7. Анализ протеинкиназы MAP4K3.

В этом примере представлен протокол анализа для измерения фосфорилирования пептидного субстрата протеинкиназой MAP4K3.

Коротко, MAP4K3, ее субстрат и кофакторы (АТР и Mg²⁺) объединяют в лунке титровального микропланшета и инкубируют в течение 5 часов при 25ºC. В конце инкубации реакцию гасят добавлением буфера, содержащего ЭДТК. Субстрат и продукт разделяют и количественно определяют электрофоретически с использованием основанной на микрожидкости системы LabChip 3000 Drug Discovery System от Caliper Life Sciences.

Для этого анализа, субстратом MAP4K3 является FAM-GAGRLGRDKYKTLRQIRQ-NH2 (FAM является карбоксифлуоресцеином). Пептидный субстрат предпочтительно имеет чистоту >98% по данным капиллярного электрофореза.

Типовая установка и условия анализа приведены ниже.

1. В лунку 384-луночного планшета добавляют 5 мкл 2× ферментного буфера (или контроля).

2. Добавляют 100 нл 100× соединения. Фермент и соединение могут быть предварительно инкубированы в это время, если это желательно.

3. Добавляют 5 мкл 2× буфера для субстрата.

4. Инкубируют планшет при 25°C в течение 5 часов.

5. Завершают реакцию добавлением 40 мкл 1,25× останавливающего буфера.

6. Создают задание в Caliper LabChip® 3000 Drug Discovery System, используя значения из таблицы ниже.

Условия разделения для 12 Sipper Chip

Время исходной задержки Sip 50 сек Время после образца буфера Sip 40 сек Время после красителя буфера Sip 40 сек Время образца Sip 0,2 сек Время конечной задержки Sip 120 сек Время красителя Sip 0,2 сек Давление -2 ф./кв.д. Нисходящее напряжение -3000 вольт Восходящее напряжение -800 вольт

7. Загружают планшет и начинают электрофорез с использованием синего лазера (480 нм) для возбуждения и зеленого CCD (520 нм) для обнаружения (CCD2).

Вышеупомянутый анализ проводят при следующих условиях реакции: всего 5 часов; при 25°С в присутствии 20 мМ 100% ингибитора ЭДТК.

Конечная реакционная смесь для анализа: 100 мМ HEPES, pH 7,5; 0,1% BSA; 0,01% Triton X-100; 1 мМ DTT; 5 мМ MgCl₂, 10 мкМ ортованадата натрия, 10 мкМ бета-глицерофосфата, 20 мкМ АТР; 1% ДМСО (из соединения); 0,5 мкМ FAM-GAGRLGRDKYKTLRQIRQ-NH2; 0,5 нМ фермента MAP4K3.

Следует отметить, что удельная активность MAP4K3 варьируется от партии к партии, и может потребоваться корректировка концентрации фермента, чтобы обеспечить превращение субстрата в продукт на ~10-20%.

Пептиды субстрата и продукта, присутствующие в каждом образце, разделяют электрофоретически с использованием прибора для капиллярного электрофореза LabChip 3000. При разделении пептидов субстрата и продукта наблюдаются два пика флуоресценции. Изменение относительной интенсивности флуоресценции пиков субстрата и продукта является измеряемым параметром, отражающим активность фермента. Капиллярные электрофореграммы (файлы сбора RDA) анализируют с использованием программного обеспечения HTS Well Analyzer (Caliper Life Sciences). Активность киназы в каждом образце определяют как отношение произведения к сумме (PSR): P/(S+P), где P является высотой пика пептида продукта, и S является высота пика пептида субстрата.

Для каждого соединения активность фермента измеряют при различных концентрациях (12 концентраций соединения, разделенных 3х интервалами разведения). Образцы отрицательного контроля (ингибирование 0% в отсутствие ингибитора) и образцы положительного контроля (ингибирование 100% в присутствии 20 мМ ЭДТК) собирают в четырех повторах и используют для расчета значений % ингибирования для каждого соединения при каждой концентрации.

Долю ингибирования (P_inh) определяют с использованием следующего уравнения:

P_inh= (PSR_0% - PSR_inh)/(PSR_0%- PSR₁₀₀%)*100, где PSR_inh является отношением произведения к сумме в присутствии ингибитора, PSR_0% является средним отношением произведения к сумме в отсутствие ингибитора, и PSR_100% является средним отношением произведения к сумме в контрольных образцах со 100% ингибированием.

Значения IC50 ингибиторов определяют путем подгонки кривых ингибирования (Pinh к концентрации ингибитора) с помощью четырехпараметрической сигмоидальной модели доза-ответ с использованием программного обеспечения XLfit 4 (IBDS).

Некоторые материалы и буферы, использованные в анализе, перечислены ниже для справки.

НАИМЕНОВАНИЕ ПОСТАВЩИК АРТИКУЛ Фермент МАР4К3 Invitrogen Invitrogen-PV6349-1763523 Субстрат FAM-GAGRLGRDKYKTLRQIRQ-NH2 Nanosyn Произвольный синтез Ингибитор контроля «Стауроспорин» «LKT» «S7600» Компоненты буфера HEPES, свободная кислота Calbiochem 391338 HEPES, натриевая соль Calbiochem 391333 Triton X-100 Sigma T8787 BSA Sigma A3059 Хлорид магния Fluka 63020 Динатриевая соль АТР Sigma A7699 DTT (реагент Клеланда) Calbiochem 233153 Ортованадат натрия Sigma S6508 Бета-глицерофосфат Calbiochem 35675 ЭДТК, динатриевая соль, дигидрат VWR VW1474-01 ДМСО VWR BJ081-4 Реагент покрытия 3 Caliper Life Sci. 760050 Гидроксид натрия, 50% VWR VW3246-1 Хлористоводородная кислота, концентрированная JT Baker 9530-33 Карбонат натрия Mallinckrodt 7521 Бикарбонат натрия Sigma S-6297

Биологический пример 8. Исследование эффективности соединения в отношении IL2 и IFN-γ, высвобождаемых Pan Т-клетками человека.

В этом примере представлен способ анализа, который можно использовать для определения действия соединения на высвобождение IL2 и IFN-γ с использованием pan Т-клеток и формата анализа ELISA.

Материалы и оборудование

1. Реагенты:

Наименование Источник Кат. № RPMI 1640 ATCC 30-2001 FBS Gibco 10099141 ДМСО Sigma D8418 Pen/Strep (100×) Gibco 15140122 Раствор не незаменимых аминокислот для анализа Gibco 11140050 Набор А для ELISA IL-2 человека (содержащий моноклональное антитело (mAb) к IL-2 человека, биотинилированное mAb к IL-2 человека, конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена (Sav-HRP), рекомбинантный IL-2 человека) BD Набор B для ELISA (содержащий буфер для покрытия, разбавитель для анализа, субстратные реагенты A и B, останавливающий раствор и 20× промывочный буфер) BD 550534 Набор А для ELISA IFN-γ человека (содержащий mAb к IFN-γ человека, биотинилированные mAb к IFN-γ человека, конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена (Sav-HRP), рекомбинантный IFN-γ человека) BD 555142 Бета-меркаптоэтанол Gibco 21985023 РМА Sigma P8139-1mg Иономицин Sigma 407951-1MG Анти-человеческий CD3 BioXcell BE0001-2 Анти-человеческий CD28 BioXcell BE0291 Набор изолята Pan T MACS 130-096-535 LS Разделительные колонны MACS 130-042-401 Раствор для ополаскивания auto MACS® MACS 130-091-222 BSA Sigma B2064 0,5 М ЭДТК ThermoFisher 15575020 PBS GE Healthcare
Life Sciences SH30256.01 PE анти-CD3 BD 555333 FITC анти-CD4 BD 555346 BV421 анти-CD8 BD 562428 РВМС человека Allcells PB007-3
РВ006-С

2. Оборудование и поставщики:

Имя Источник Кот# МИКРОПЛАШЕТ, 96-ЛУНОЧНЫЙ, ПП, V-ДОННЫЙ Greiner 651201 96-луночные планшеты для клеток Greiner 655180 96-луночный планшет с плоским дном (планшет с высоким связыванием) Greiner 655061 96-луночный планшет для разведения супернатанта Corning 3599 384 микропланшет для CTG анализа PerkinElmer 6007290 Планшетный ридер Envision PerkinElmer - Клеточный инкубатор Thermo Fisher - Автоматический счетчик клеток Count star-IC-1000 - Мойка планшетов Ex-50 BioTek ELx50/8 Центрифуга Thermo Centrifuge ST 40R - Водная система Millipore Milli-Q эталонная система -

3. Процедуры

Процедуры выделения Pan T и получения реагентов (день 0):

1. Среда для роста клеток:

RPMI1640: ATCC, кат. № 30-2001

10% FBS: Gibco, кат. № 10099141

1% Pen-Strep: Gibco, кат. № 15140122

1% не незаменимых аминокислот: Gibco, кат. № 11140050

Бета-меркаптоэтанол: Gibco, кат. № 21985023

2. Получение буфера для выделения Pan T:

Получают раствор, содержащий забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), pH 7,2, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ ЭДТК разведением исходного раствора MACS® BSA (# 130-091-376) в 20 раз промывочным раствором autoMACS®. Хранят буфер при 4°C. Дегазируют буфер перед использованием, так как пузырьки воздуха могут заблокировать колонку.

Содержание [Исходный] [Конечная конц.] Кратность Объем (мл) BSA 10% 0,5% 20 5 мл ЭДТК 0,5 М 2 мМ 250 0,4 мл PBS, рН 7,2 1× 1× 1 94,6 мл Всего 100 мл

3. Размораживание замороженных РВМС

1) Предварительно нагревают среду на водяной бане при 37°C.

2) Быстро размораживают клетки на водяной бане при 37°C.

3) Добавляют предварительно нагретую среду в 15 мл пробирку. Переносят клетки в пробирку.

4) Центрифугируют 300×g в течение 8 мин. (центрифуга увеличение 0, уменьшение 0).

5) Промывают РВМС, используя промывочный буфер.

6) Центрифугируют РВМС при 300×g в течение 8 мин, дважды промывают (центрифуга увеличение 9, уменьшение 1).

7) Ресуспендируют клетки в буфере для выделения клеток Pan T и подсчет количества клеток.

4. Выделение pan Т-клеток:

Окрашивание клеток коктейлем микрогранул

1) Готовят клетки и определяют количество клеток. Фильтруют клетки на 70 мкм клеточном фильтре.

2) Ресуспендируют клеточный дебрис в 40 мкл буфера на 10⁷ всего клеток.

3) Добавляют 10 мкл коктейля Pan T Cell Biotin-Antibody Cocktail на 10⁷ всего клеток.

4) Хорошо перемешивают и инкубируют 10 минут в холодильнике (лед).

5) Добавляют 30 мкл буфера на 10⁷ всего клеток.

6) Добавляют 20 мкл коктейля Pan T Cell MicroBead на 10⁷ всего клеток.

7) Хорошо перемешивают и инкубируют 15 минут в холодильнике (лед).

8) Приступают к последующему магнитному разделению клеток.

Примечание: а. Работайте быстро, сохраняйте клетки холодными и используйте предварительно охлажденные растворы (2-8°C). b. Объемы для магнитного мечения даны для вплоть до 10⁷ всего клеток. При работе с меньшим количеством клеток используйте указанные объемы. с. При работе с большим количеством клеток увеличьте соответственно все объемы реагентов и общие объемы. d. Для оптимальной работы важно получить одноклеточную суспензию перед магнитным мечением.

Последующее ручное разделение клеток:

1) Помещают колонку LS в магнитное поле подходящего сепаратора MACS. Для получения подробной информации см. соответствующее техническое описание колонки MACS.

2) Готовят колонку промыванием 3 мл буфера.

3) Наносят суспензию клеток на колонку. Собирают протекающую жидкость, которая представляет собой обогащенные Т-клетки.

4) Промывают колонку 5 мл буфера. Собирают не меченые клетки, которые проходят сквозь, представляющие собой обогащенные Т-клетки.

Напоминание: Всегда ждите, пока резервуар колонки не опустеет, прежде чем переходить к следующей стадии.

5. FACS Pan T клеток:

1) Помещают 50 мкл PBMC и Pan T клеток в пробирки FACS соответственно.

2) Инкубируют клетки с анти-человеческими CD3/CD4/CD8 антителами (1 мкл/1 мкл/1 мкл/пробирка) в течение 20 мин при 4°C. Для неокрашенного контроля инкубируют клетки с буфером для окрашивания FACS.

3) Промывают 2 раза буфером для холодного окрашивания (PBS с 0,2% BSA и 1 мМ ЭДТК).

4) Запускают FACS. Гейт CD3⁺, CD3⁺CD4⁺ и CD3⁺CD8⁺ популяция для % анализа.

5) Если чистота Pan T клеток выше 90%, разводят клеточную суспензию до 1 миллиона клеток/мл соответствующим объемом среды для культивирования клеток.

6) Переливают клеточную суспензию в стерильный одноразовый резервуар для использования в будущем.

Процедуры получения соединений и анти-человеческих CD3/CD28 (день 0):

1. Получение соединения

Серийное разведение соединения (исходный планшет 1000×)

Соединения растворяют в 100% ДМСО до концентрации 10 мМ. Затем их серийно разводят в 3 раза до 8-точечных доз.

Приготовление 4× дозы соединения (промежуточный планшет: Corning-3599):

Готовят 4× раствор соединения в культуральной среде. Пипетируют вверх и вниз. Для контроля ZPE готовят 0,4% ДМСО (4×) в культуральной среде. Для контроля HPE готовят 0,4 мкМ RGT003-026 (4×) в культуральной среде.

2. Анти-человеческий CD3 (исходная конц. 6,76 мг/мл): хранят при 4°C.

1) Разбавляют анти-человеческий CD3 PBS до конечной конц. 0,5 мкг/мл.

2) Добавляют 50 мкл/ лунку CD3 в каждую лунку, кроме лунок с положительным и отрицательным контролем. Лунки с положительным и отрицательным контролем не стимулируют CD3/CD28.

3) Инкубируют при 37°С в инкубаторе с 5% CO₂ в течение 2 часов.

4) Удаляют 50 мкл раствора антитела из планшета для культивирования клеток. Промывают каждую лунку дважды 200 мкл стерильного PBS каждый раз.

3. Получение анти-человеческого CD28 (4×)

Антитело разводили культуральной средой от исходной концентрации 11,07 мг/мл до 2 мкг/мл (4×).

4. Получение PMA/Иномицина (4×)

1) Разбавляют PMA до 400 нг/мл (8×) в среде.

2) Разводят иномицин до 8 мкМ (8×) в среде.

3) Смешивают равный объем РМА с иономицином с получением 4× смесь.

Процедуры стимуляции клеток (День 0)

1. Переносят 1×10⁵ клеток/лунку (100 мкл/лунку) клеточной суспензии в 96-луночный планшет (планшет для клеток: greiner-655180).

2. Добавляют 50 мкл/лунку анти-человеческого CD28 для тестируемых соединений и контролей ZPE/HPE. Для положительного или отрицательного контроля добавляют 50 мкл/лунку 4x раствора PMA/Иномицина или культуральной среды, соответственно.

3. Добавляют 50 мкл/лунку соединений в планшет для клеток в соответствии с картой планшета, показанной ниже. Для контроля ZPE/HPE добавляют 50 мкл/лунку 0,4% раствора ДМСО или 0,4 мкМ RGT003-026 (4×), соответственно. Для положительного или отрицательного контроля добавляют 50 мкл/лунку культуральной среды.

4. Инкубируют планшет в течение 48 часов.

Процедуры для IL-2 и IFN-γ ELISA:

День 1: Покрывание планшетов:

1) Покрывают микролунки 100 мкл на лунку захватывающего антитела IL-2 и IFN-γ, разведенного в буфере для покрытия. Информацию о рекомендуемом разведении покрытия антитела см. в инструкции/сертификате анализа для конкретной партии. Герметично закрывают планшет и инкубируют в течение ночи при 4°C.

День 2: Сбор образцов:

1) После инкубации в инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ в течение 48 часов центрифугируют клеточные планшеты при 1000 об/мин в течение 10 мин. Собирают 100 мкл/лунку супернатанта, и затем проводят анализ IL-2 и IFN-γ ELISA. Супернатант может храниться при -80°C, и анализ IL-2 и IFN-γ ELISA можно провести на следующий день. Может потребоваться разведение супернатанта в 30-40 раз, чтобы анализ не превышал линейный диапазон стандартной кривой IL-2 и IFN-γ.

2) Добавляют новую среду (содержащую анти-CD28, P/I и соединения) в планшет, 100 мкл/лунку.

3) Карта планшета:

День 3-4: IL-2 & IFN-γ ELISA:

1) Отсасывают лунки и промывают 3 раза ≥ 300 мкл/лунку промывочным буфером. После последней промывки переворачивают планшет и промокают на впитывающей бумаге, чтобы удалить остатки буфера.

2) Блокируют планшеты с ≥ 200 мкл/лунку разбавителя для анализа. Инкубируют при КТ в течение 1 часа.

3) Отсасывают/промывают, как на стадии 2.

4) Получают стандарты в разбавителе для анализа.

Получение стандартного исходного IL-2:

добавляют 1 мл деионизированной воды во флакон (235 нг/флакон), исходная конц. составляет 235 нг/мл. Аликвотируют стандартный исходный раствор по 10 мкл/флакон, замораживают при -80°C.

Получение стандартного исходного IFN-γ:

добавляют 1 мл деионизированной воды во флакон (145 нг/флакон), исходная конц. составляет 145 нг/мл. Аликвотируют стандартный исходный раствор по 10 мкл/флакон, замораживают при -80°С.

Получение стандартной кривой для IL-2/IFNγ:

Разводят стандартный образец до максимальной концентрации 500 пг/мл. Затем проводят 2-кратное серийное разведение до 10-точечных доз (включая пустой контроль). Переносят различные концентрации стандартов на планшет для ELISA, 100 мкл/лунку.

1) Пипетируют 100 мкл каждого стандарта, образца и контроля в соответствующие лунки. Герметично закрывают планшет и инкубируют в течение 2 часов при КТ.

2) Отсасывают/промывают, как на стадии 2, всего 5 промывок.

3) Добавляют 100 мкл рабочего детектора (определяющее антитело+реагент SAv-HRP) в каждую лунку. Герметично закрывают планшет и инкубируют в течение 1 часа при КТ.

4) Отсасывают/промывают, как на стадии 2, всего 7 промывок. ПРИМЕЧАНИЕ. На этом последнем этапе промывки замочите лунки в промывочном буфере на время от 30 секунд до 1 минуты для каждой промывки.

5) Добавляют в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата. Инкубируют планшет (без герметика) в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.

6) Добавляют в каждую лунку по 50 мкл останавливающего раствора.

7) Измеряют оптическую плотность при 450 нм в течение 30 минут после остановки реакции. ОП 450 нм нормализуют к значению ОП при 570 нм.

4. Анализ данных:

Для биохимических анализов долю (%) ингибирования при каждой концентрации соединения рассчитывают на основании и относительно сигнала в лунках HPE и ZPE, содержащихся в каждом планшете для анализа. Лунки HPE считают эффективными на 100%, и лунки ZPE, которые не содержат никакого соединения, а содержат ДМСО (конечная концентрация=0,1%), считают эффективными на 0%.

Для клеточного анализа рассчитывают ответ IL-2 или IFN- γ (данные не показаны) на контроль ДМСО при каждой концентрации соединения. См. Таблицу 2. EC2x является концентрацией соединения, которая дает 200% ответ (в 2 раза), и EC50 рассчитывают с помощью GraphPad Prism.

Биохимические и клеточные данные, полученные для типовых соединений, перечислены в таблицах 1 и 2 ниже.

Таблица 1

Номер примера Структура соединения HPK1 IC50 (нМ) относительная JAK3 IC50 (нМ) относительная Отношение IC50 JAKs/HPK1 B* N* B* N* B* N* 1 (1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)диметилфосфин оксид ++++ ++++ + + 285 >558 2 N-(5-хлор-4-(1H-индол-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ ++++ + 642 3 N-(4-(1H-индол-1-ил)-5-(трифторметил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 408 4 N-(5-Хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ ++++ + +++ 337 601 5 N-(5-хлор-4-(3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин +++ 6 N-(5-хлор-4-(3,4-дигидрохинолин-1(2H)-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 7 N-(5-хлор-4-(2,3-дигидро-4H-бензо[b][1,4]оксазин-4-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + >118 8 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N, N-диметил-1H-индолe-3-карбоксамид ++++ ++++ + >2457 9 N-(4-(1H-бензо[d]имидазол-1-ил)-5-хлорпиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ ++++ + 571 10 N-(4-(1H-индол-1-ил)-5-(трифторметил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + >298 11 N-(5-Хлор-4-(3-фтор-1H-индол-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ 12 N-(5-хлор-4-(4-хлориндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин +++ 13 N-(5-хлор-4-(5-хлориндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ ++ 62 14 N-(5-Хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ ++++ ++++ ++++ 6 11 15 6-Хлор-N-(5-хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 174 16 N-(5-хлор-4-(2,3-дигидро-1H-пирроло[3,2-b]пиридин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 17 N-(5-хлор-4-(2,3-дигидро-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин +++ 18 N-(5-хлор-4-(6-хлориндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + >446 19 N-(5-хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-2-метокси-6-метил-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин-3-амин ++++ ++++ ++ +++ 20 N-(5-хлор-4-(5-фториндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ +++ 88 21 N-(5-хлор-4-(6-фториндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 280 22 N-(5-хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-2-изопропил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 223 23 N-(5-хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ +++ 59 24 N-(5-Хлор-4-(1H-индазол-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 79 25 N-(5-Хлор-4-(3,3-диметилиндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ +++ 218 26 1-(7-((5-Хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)амино)-6-метокси-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-2-(диметиламино)этан-1-он ++++ 27 2-(7-((5-Хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)амино)-6-метокси-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)этан-1-ол ++++ 28 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N, N-диметил-1H-индолe-2-карбоксамид + 29 N-(5-Хлор-4-(2,3-дигидро-1H-пирроло[3,2-b]пиридин-1-ил)пиримидин-2-ил)-2-метокси-6-метил-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин-3-амин ++++ ++++ ++ +++ 223 286 31 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-2,3-дигидроимидазо[1,2-a]пиридин-5(1H)-он +++ + 31 32 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота ++++ ++++ 90 33 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоксамид ++++ ++++ 140 34 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-карбоксамид ++++ ++ 101 35 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-карбоновая кислота ++++ +++ 78 36 6-Метокси-2-метил-N-(7-фенил-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ ++++ + 287 37 6-Метокси-2-метил-N-(7-(пиридин-2-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ ++++ + 608 38 2-(2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-7-ил)-N, N-диметилбензамид +++ ++++ + >163 39 (2-(2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-7-ил)фенил)диметилфосфин оксид ++ + >18 40 6-Метокси-2-метил-N-(7-(пиридин-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ 41 6-Метокси-2-метил-N-(7-(2-метилпиридин-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ +++ 30 43 6-Метокси-2-метил-N-(9-фенил-9H-пурин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин + + + >10 44 2-(2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)-9H-пурин-9-ил)-N, N-диметилбензамид + + + >10 45 (2-(2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)-9H-пурин-9-ил)фенил)диметилфосфин оксид + 46 N-(6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)-8-фенил-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b][1,4]оксазин-2-амин +++ 47 (2-(2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)-6H-пиримидо[5,4-b][1,4]оксазин-8(7H)-ил)фенил)диметилфосфин оксид +++ + >22 48 N-(5-хлор-4-(изохинолин-4-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + >179 49 N-(5-хлор-4-(хинолин-4-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин +++ 50 (5-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-2-метилфенил)диметилфосфин ++++ ++++ + + 163 101 51 (5-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-2-фторфенил)диметилфосфин оксид ++++ + 51 52 (2-Хлор-5-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)диметилфосфин оксид ++++ 53 (3-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)диметилфосфин оксид +++ 54 (5-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-2-метоксифенил)диметилфосфин оксид +++ 55 (5-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-2-гидроксифенил)диметилфосфин оксид ++++ +++ 20 56 (3-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-5-метилфенил)диметилфосфин оксид ++ 57 (3-Амино-5-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)диметилфосфин оксид ++++ ++ 22 58 N-(2-(диметилфосфорил)-4-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)ацетамид ++++ +++ 4 59 N-(2-бром-4-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)ацетамид +++ 60 (2-Амино-3-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-6-фторфенил)диметилфосфин оксид ++++ + 25 61 (2-(Дифторметил)-5-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)диметилфосфин оксид +++ + 15 62 (3-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-2-фтор-6-метилфенил)диметилфосфин оксид ++++ + 54 63 (5-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-2-(оксазол-2-ил)фенил)диметилфосфин оксид +++ + 19 64 (6-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-3-метилпиридин-2-ил)диметилфосфин оксид ++++ + 44 65 (2-((Диметиламино)метил)-5-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)диметилфосфин оксид ++ + >10 66 1-(2-(Диметилфосфорил)-4-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)пирролидин-2-он +++ + 3 67 2-(Диметилфосфорил)-4-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)бензамид +++ + 10 68 N-(3-(диметилфосфорил)-5-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)ацетамид ++ + 2 69 (2-Амино-5-(2-хлор-3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)диметилфосфин оксид ++++ ++++ ++ 52 70 (2-Амино-5-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)диметилфосфин оксид ++++ ++++ ++ ++ 70 50 71 (5-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-2-(метиламино)фенил)диметилфосфин оксид +++ 72 Метил 2-(диметилфосфорил)-4-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)бензоат +++ + 11 73 (5-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-2-(гидроксиметил)фенил)диметилфосфин оксид +++ ++ 5 74 (5-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-2-(фторметил)фенил)диметилфосфин оксид +++ + 19 75 (3-Амино-6-(3-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)пиридин-2-ил)диметилфосфин оксид ++++ + 59 76 (5-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-2-(оксетан-3-иламино)фенил)диметилфосфин оксид ++ + 4 77 (2-Амино-5-(3-изопропил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)фенил)диметилфосфин оксид ++++ + 76 78 (5-(3-Этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)-2-(трифторметил)фенил)диметилфосфин оксид ++ + >15 80 N-(5-хлор-4-(3-(метилсульфонил)-1H-индол-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + >1172 81 N-(5-хлор-4-(3-(метилсульфонил)индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ ++ 444 82 N-(5-хлор-4-(3-((метилсульфонил)метил)-1H-индол-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 800 83 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-сульфонамид ++++ + 232 84 N-(5-хлор-4-(спиро[циклопропан-1,3'-индолин]-1'-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ +++ 250 85 N-(4-(5-броминдолин-1-ил)-5-хлорпиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 178 86 (1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-5-ил)диметилфосфин оксид ++++ + 67 87 (1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино) пиримидин-4-ил)индолин-3-ил)метанол ++++ +++ 275 88 (1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-ил)диметилфосфин оксид ++++ + >1292 89 N-(5-хлор-4-(4-метоксииндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 944 90 N-(5-хлор-4-(5-(дифторметил)индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 413 91 N-(5-хлор-4-(6-(дифторметил)индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + >1500 92 N-(5-хлор-4-(4-(дифторметил)индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ + 393 93 3-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)оксетан-3-ол +++ + Н.О. 94 N-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)метансульфонамид ++++ + 449 95 (S)-1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота ++++ + 150 96 (R)-1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота ++++ ++++ 80 97 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N-метилиндолин-3-карбоксамид ++++ + 800 98 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N-(метилсульфонил)индолин-3-карбоксамид ++++ + 508 99 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино) пиримидин-4-ил)индолин-3-карбонитрил ++++ ++++ 100 100 N-(4-(3-(2H-тетразол-5-ил)индолин-1-ил)-5-хлорпиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ +++ 200 101 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N-гидроксииндолин-3-карбоксамид ++++ + 373 102 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N-гидрокси-N-метилиндолин-3-карбоксамид ++++ + >2603 103 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N-метоксииндолин-3-карбоксамид ++++ ++ 540 104 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5-фториндолин-3-карбоновая кислота ++++ ++++ 45 105 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фториндолин-3-карбоновая кислота ++++ +++ 140 106 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5-метоксииндолин-3-карбоновая кислота ++++ ++++ 11 107 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-метоксииндолин-3-карбоновая кислота ++++ + 2200 108 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-4-метоксииндолин-3-карбоновая кислота ++++ + 886 109 1-(5-Фтор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота ++++ ++ 269 110 1-(5-Циано-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота ++++ + 477 111 1-(5-Хлор-2-((6-изопропокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота ++++ + >236 112 Метил 1-(5-(дифторметил)-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоксилат ++++ + >3309 113 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индазол-3-карбоновая кислота ++++ + 293 114 Метил 1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино) пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-карбоксилат ++++ + >118 115 Метил 1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино) пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоксилат ++++ + 1275 116 Метил 1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбоксилат ++++ + 890 117 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбоновая кислота ++++ ++++ 5 118 (R)-1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбоновая кислота ++++ + 80 119 (S)-1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбоновая кислота ++++ ++++ 10 120 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбоксамид ++++ ++++ 120 121 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбонитрил ++++ ++++ 50 122 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N,3-диметилиндолин-3-карбоксамид ++++ ++++ 100 123 (1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)метанол ++++ ++++ 60 124 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино) пиримидин-4-ил)-3-(гидроксиметил)индолин-3-карбоновая кислота ++++ ++++ 20 125 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5-фтор-3-метилиндолин-3-карбоновая кислота ++++ ++++ 6 126 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фтор-3-метилиндолин-3-карбоновая кислота ++++ ++++ 9 127 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбоновая кислота ++++ ++++ 4 128 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-ил)уксусная кислота ++++ +++ 280 129 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)уксусная кислота ++++ ++ 640 130 Изопропил 2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)ацетат ++++ + >243 131 2-Этилбутил 2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)ацетат +++ + >82 132 Этил 2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино) пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)ацетат ++++ + >426 133 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино) пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)ацетамид ++++ + 870 134 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино) пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)ацетонитрил ++++ ++ 243 135 N-(4-(3-((2H-тетразол-5-ил)метил)-1H-индол-1-ил)-5-хлорпиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин ++++ ++ 269 136 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)-N-метилацетамид ++++ ++ 438 137 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)-N-(цианометил)ацетамид ++++ + 1304 138 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5-фтор-1H-индол-3-ил)уксусная кислота ++++ +++ 382 139 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фтор-1H-индол-3-ил)уксусная кислота ++++ +++ 520 140 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5,6-дифтор-1H-индол-3-ил)уксусная кислота ++++ ++ 783 141 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индазол-3-ил)уксусная кислота ++++ + 541 142 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)пропановая кислота ++++ ++ 117 143 1-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)циклопропан-1-карбоновая кислота ++++ + 433 144 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)-3,3,3-трифторпропановая кислота ++++ + 250 145 Метил 2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)ацетат ++++ + 476 146 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ ++++ 90 147 (R)-2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ + 132 148 (S)-2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ ++++ 209 149 Этил 2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)ацетат ++++ + >944 150 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5-фтор-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ +++ 171 151 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фтор-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ ++++ 187 152 (S)-2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фтор-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ +++ 253 153 (R)-2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фтор-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ + 358 154 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5,6-дифтор-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ +++ 430 155 2-(1-(5-Хлор-2-((2-метокси-6-метил-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин-3-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ + >111 156 2-(1-(5-Хлор-2-((6-фтор-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ ++++ 29 157 2-(1-(5-Хлор-2-((2-этил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ +++ 176 158 2-(1-(5-Хлор-2-((2-изопропил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ +++ 192 159 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метилизoиндолин-5-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота ++++ ++++ 71 160 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота метансульфоновая кислота ++++ ++++ 97 161 2-(3-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-1-ил)уксусная кислота ++++ ++ 510 162 2-(3-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индазол-1-ил)уксусная кислота ++++ + 415 163 1-(2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота ++++ + 456 164 2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)-7-фенил-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-6-карбонитрил ++++ ++ 306 165 2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)-7-фенил-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-6-карбоновая кислота ++++ + 421 166 2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)-7-метил-9-фенил-7,9-дигидро-8H-пурин-8-он +++ + Н.О. 167 2-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-2-азапиро[4.5]декан-4-карбоновая кислота ++++ + 995 168 2-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-8-окса-2-азапиро[4.5]декан-4-карбоновая кислота ++++ + 737 169 2-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-2-азапиро[4.4]нонан-4-карбоновая кислота ++++ + 1482 170 N-(5-хлор-4-(2-окса-6-азапиро[3.4]октан-6-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин +++ + 77 171 2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)-8-фенилпиридо[2,3-d]пиримидин-7(8H)-он ++++ + 121 172 (2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)хиназолин-7-ил)диметилфосфин оксид +++

Н.О.: не определено.

B*: Тестирование проводят в первом устройстве для тестирования. N*: Тестирование проводят во втором устройстве для тестирования.

Таблица 2

Пример Структура соединения Макс. кратность ответа IL-2 EC2x (нМ) EC50 (нМ) 1 (1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)диметилфосфин оксид <2 Н.Д. Н.Д. 2 N-(5-хлор-4-(1H-индол-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. Н.Д. 3 N-(4-(1H-индол-1-ил)-5-(трифторметил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин >2 ++ +++ 4 N-(5-Хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин >2 +++ +++ 8 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N, N-диметил-1H-индол-3-карбоксамид <2 Н.Д. Н.Д. 9 N-(4-(1H-бензо[d]имидазол-1-ил)-5-хлорпиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин >2 ++ +++ 10 N-(4-(1H-индол-1-ил)-5-(трифторметил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. Н.Д. 11 N-(5-Хлор-4-(3-фтор-1H-индол-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. Н.Д. 13 N-(5-хлор-4-(5-хлориндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. + 14 N-(5-Хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. Н.Д. 15 6-Хлор-N-(5-хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин >2 + + 16 N-(5-хлор-4-(2,3-дигидро-1H-пирроло[3,2-b]пиридин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. +++ 18 N-(5-хлор-4-(6-хлориндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. +++ 19 N-(5-хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-2-метокси-6-метил-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин-3-амин >2 +++ +++ 20 N-(5-хлор-4-(5-фториндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин >2 +++ +++ 21 N-(5-хлор-4-(6-фториндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин >2 +++ +++ 22 N-(5-хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-2-изопропил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин >2 +++ ++ 23 N-(5-хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. +++ 24 N-(5-Хлор-4-(1H-индазол-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. ++ 25 N-(5-Хлор-4-(3,3-диметилиндолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин >2 +++ ++ 27 2-(7-((5-Хлор-4-(индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)амино)-6-метокси-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)этан-1-ол >2 + + 29 N-(5-Хлор-4-(2,3-дигидро-1H-пирроло[3,2-b]пиридин-1-ил)пиримидин-2-ил)-2-метокси-6-метил-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин-3-амин <2 Н.Д. ++ 32 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота >2 +++ +++ 33 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоксамид <2 Н.Д. Н.Д. 34 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-карбоксамид <2 Н.Д. Н.Д. 35 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-карбоновая кислота >2 + ++ 36 6-Метокси-2-метил-N-(7-фенил-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. Н.Д. 37 6-Метокси-2-метил-N-(7-(пиридин-2-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. +++ 81 N-(5-хлор-4-(3-(метилсульфонил)индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин >2 +++ ++ 83 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-сульфонамид <2 Н.Д. +++ 84 N-(5-хлор-4-(спиро[циклопропан-1,3'-индолин]-1'-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. ++ 86 (1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-5-ил)диметилфосфин оксид >2 + +++ 87 (1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-ил)метанол <2 Н.Д. +++ 88 (1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-ил)диметилфосфин оксид <2 Н.Д. ++ 90 N-(5-хлор-4-(5-(дифторметил)индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. + 91 N-(5-хлор-4-(6-(дифторметил)индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. Н.Д. 92 N-(5-хлор-4-(4-(дифторметил)индолин-1-ил)пиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. Н.Д. 93 3-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)оксетан-3-ол <2 Н.Д. Н.Д. 96 (R)-1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота >2 +++ +++ 97 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N-метилиндолин-3-карбоксамид >2 ++ +++ 98 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N-(метилсульфонил)индолин-3-карбоксамид <2 Н.Д. Н.Д. 99 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбонитрил <2 Н.Д. Н.Д. 100 N-(4-(3-(2H-тетразол-5-ил)индолин-1-ил)-5-хлорпиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин >2 + + 101 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N-гидроксииндолин-3-карбоксамид <2 Н.Д. Н.Д. 102 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N-гидрокси-N-метилиндолин-3-карбоксамид <2 Н.Д. Н.Д. 103 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N-метоксииндолин-3-карбоксамид <2 Н.Д. Н.Д. 104 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5-фториндолин-3-карбоновая кислота >2 +++ +++ 105 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фториндолин-3-карбоновая кислота >2 +++ ++++ 107 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-метоксииндолин-3-карбоновая кислота <2 Н.Д. Н.Д. 108 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-4-метоксииндолин-3-карбоновая кислота <2 Н.Д. + 109 1-(5-Фтор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота >2 ++ +++ 110 1-(5-Циано-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота <2 Н.Д. Н.Д. 112 Метил 1-(5-(дифторметил)-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоксилат <2 Н.Д. Н.Д. 113 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индазол-3-карбоновая кислота <2 Н.Д. + 115 Метил 1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоксилат >2 +++ +++ 116 Метил 1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбоксилат >2 ++ ++ 118 (R)-1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбоновая кислота <2 Н.Д. + 119 (S)-1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбоновая кислота >2 ++++ ++++ 120 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбоксамид <2 Н.Д. Н.Д. 121 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-карбонитрил <2 Н.Д. Н.Д. 122 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-N,3-диметилиндолин-3-карбоксамид <2 Н.Д. Н.Д. 123 (1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)метанол <2 Н.Д. +++ 125 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5-фтор-3-метилиндолин-3-карбоновая кислота >2 ++++ ++++ 126 1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фтор-3-метилиндолин-3-карбоновая кислота >2 ++++ ++++ 128 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-ил)уксусная кислота >2 +++ +++ 129 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)уксусная кислота >2 +++ +++ 130 Изопропил 2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)ацетат <2 Н.Д. Н.Д. 133 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)ацетамид <2 Н.Д. + 134 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)ацетонитрил <2 Н.Д. + 135 N-(4-(3-((2H-тетразол-5-ил)метил)-1H-индол-1-ил)-5-хлорпиримидин-2-ил)-6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин <2 Н.Д. + 136 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)-N-метилацетамид <2 Н.Д. ++ 137 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)-N-(цианометил)ацетамид <2 Н.Д. ++ 138 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5-фтор-1H-индол-3-ил)уксусная кислота >2 +++ +++ 139 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фтор-1H-индол-3-ил)уксусная кислота >2 ++++ ++++ 140 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5,6-дифтор-1H-индол-3-ил)уксусная кислота >2 +++ +++ 141 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индазол-3-ил)уксусная кислота >2 ++ + 142 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-3-ил)пропановая кислота <2 Н.Д. +++ 145 Метил 2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)ацетат <2 Н.Д. Н.Д. 146 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота >2 ++++ ++++ 147 (R)-2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота <2 Н.Д. ++ 148 (S)-2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота >2 ++++ ++++ 149 Этил 2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)ацетат <2 Н.Д. Н.Д. 150 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5-фтор-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота >2 ++++ ++++ 151 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фтор-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота >2 ++++ ++++ 152 (S)-2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фтор-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота >2 ++++ ++++ 153 (R)-2-(1-(5-хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-6-фтор-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота >2 +++ +++ 154 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-5,6-дифтор-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота >2 ++++ ++++ 156 2-(1-(5-Хлор-2-((6-фтор-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота >2 ++++ ++++ 157 2-(1-(5-Хлор-2-((2-этил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота >2 ++++ ++++ 158 2-(1-(5-Хлор-2-((2-изопропил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота >2 ++++ ++++ 159 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метилизoиндолин-5-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота >2 ++++ ++++ 160 2-(1-(5-Хлор-2-((6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-3-метилиндолин-3-ил)уксусная кислота метансульфоновая кислота >2 ++++ ++++ 161 2-(3-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индол-1-ил)уксусная кислота >2 + + 162 2-(3-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-1H-индазол-1-ил)уксусная кислота <2 Н.Д. Н.Д. 163 1-(2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)индолин-3-карбоновая кислота >2 + + 164 2-((6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)-7-фенил-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-6-карбонитрил <2 Н.Д. ++++ 167 2-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-2-азапиро[4.5]декан-4-карбоновая кислота >2 +++ ++ 169 2-(5-Хлор-2-((6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино)пиримидин-4-ил)-2-азапиро[4.4]нонан-4-карбоновая кислота >2 ++ +

Н.Д.: не доступно.

В таблицах 1 и 2, значения IC50, EC2x и EC50 обозначены как «++++», для значений менее или равных 100 нМ; «+++», для значений выше, чем «++++», но меньше или равных 500 нМ; «++», для значений выше, чем «+++», но меньше или равных 1 мкМ; и «+», для более 1 мкМ, соответственно.

B. Примеры синтеза

Описание оборудования

Спектры ЯМР измеряют на спектрометре Varian Mercury, работающем на частоте 400 МГц (¹H), 376 МГц (¹⁹F) или 75 МГц (¹³C). Растворители, используемые для образцов, указаны в экспериментальных процедурах для каждого соединения. Химические сдвиги выражаются в частях на миллион (ч./млн., δ единицы). Константы сочетания указаны в герцах (Гц). Паттерны расщепления описывают кажущуюся мультиплетность и обозначаются как с (синглет), д (дублет), т (триплет), кв (квартет), квинт (квинтет), м (мультиплет), ш (широкий).

Для ЖХ-МС используют следующую систему: Agilent 6120 (насос Binary Gradient Module), аналитическую колонку XBridge C₁₈, 5 мкм, 4,6 × 50 мм, 25ºC, вводимый объем 5 мкл, 2 мл/мин, с градиентом ацетонитрила в водном растворе 0,1% ацетата аммония в соответствии со следующими сроками:

Время (мин) Ацетонитрил (%) 0,1% водный раствор ацетата аммония (%) 0,50 5 95 4,50 95 5 6,00 95 5

Экспериментальные процедуры: Все реакции проводят в атмосфере сухого азота, если не указано иное. ТСХ пластины визуализируют в у.ф. свете. Флэш-хроматография относится к колоночной хроматографии на силикагеле (40-60 мкм) с использованием стеклянных колонок. Альтернативно, автоматическую хроматографию проводят с использованием систем Biotage SP1 или Biotage Isolera с УФ-определением при 220 или 254 нм и с использованием картриджей с силикагелем Biotage с нормальной или обращенной фазой. Более подробную информацию можно найти в соответствующей экспериментальной процедуре.

Общие способы и препараты

Соединения, включая соединения общей формулы (I-0), (I-1), (I-2), (I), (II), (II-1), (II-2) или (II-2'), промежуточные соединения и конкретные примеры получают описанными в настоящем документе способами синтеза. В экспериментальных процедурах, модификации условий реакции, таких как температура, концентрация растворов, объем растворителей, применение микроволновых условий, продолжительность реакции или их комбинации, предусмотрены как часть настоящего изобретения и, помимо специально упомянутых кислот, оснований, реагентов, реагентов сочетания, растворителей и т.д., могут быть использованы альтернативные подходящие кислоты, основания, реагенты, реагенты сочетания, растворители и т.д., и они включены в объем настоящего изобретения. Все возможные геометрические изомеры, стереоизомеры, формы солей входят в объем настоящего изобретения.

Общая схема и методики синтеза соединений пиримидина:

Условия A1: К раствору Пр. E (или коммерчески доступного реагента) (1,0 экв.) в ДМФ добавляют гидрид натрия (60% дисперсию в минеральном масле, 1,2 экв.) при 0°С и смесь перемешивают при 0°С в течение 30 минут. К полученной выше смеси добавляют 5-R₁ замещенный 2,4-дихлорпиримидин (1,0-1,3 экв.) при 0°С и полученную смесь затем перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа, охлаждают до 0°С и гасят льдом-H₂O. Неочищенный продукт очищают с получением 4-R и 5-R₁ замещенного 2-Cl-пиримидина.

Условия A2: К раствору 5-R₁ замещенного 2,4-дихлорпиримидина (1,0-1,5 экв.) в ДМФ добавляют карбонат калия (2,0 экв.) и Пр. E (или коммерчески доступного реагента) (1,0 экв.). Смесь перемешивают при 80°C в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры, разбавляют H₂O и экстрагируют ЭА. Неочищенный продукт очищают с получением 4-R и 5-R₁ замещенного 2-Cl-пиримидина.

Условия A3: К раствору Пр. E (или коммерчески доступного реагента) (1,0 экв.) в н-бутаноле добавляют 5-R₁ замещенный 2,4-дихлорпиримидин (1,0-1,5 экв.) и ДИПЭА (1,0-2,0 экв.) последовательно. Реакционную смесь перемешивают при 100°C в течение 18 часов, разбавляют водой и экстрагируют ЭА. Неочищенный продукт очищают с получением 4-R и 5-R₁ замещенного 2-Cl-пиримидина.

Условия B1: К раствору Пр. W (1,0-1,4 экв.) в 2-метоксиэтаноле добавляют 4-R и 5-R₁ замещенный 2-Cl-пиримидин (1,0 экв.) и HCl в растворе EtOH (3,0 экв.). Полученную смесь перемешивают при 120°С в течение 20 часов и концентрируют в вакууме. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле и/или преп-ЖХВД.

Условия B2: К раствору 4-R и 5-R₁ замещенного 2-Cl-пиримидина (1,0 экв.) и Пр. W (1-1,3 экв.) в изопропаноле добавляют трифторуксусную кислоту (1,0-3,0 экв.). Смесь перемешивают под N₂ при 100°С в течение 20 часов, охлаждают до комнатной температуры, подщелачивают насыщенным NaHCO₃ водным раствором до pH ~8, экстрагируют ДХМ. Органические фазы промывают насыщенным раствором соли, сушат над безводным Na₂SO₄ и фильтруют. Фильтрат концентрируют в вакууме, и остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле и/или преп-ЖХВД.

Условия B3: К раствору 4-R и 5-R₁ замещенного 2-Cl-пиримидина (1,0 экв.) и Пр. W (1-1,3 экв.) в изопропаноле добавляют TsOH^.H₂O (1,0-1,2 экв.). Смесь перемешивают при 100°C в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры, подщелачивают насыщенным NaHCO₃ водным раствором до pH ~8, экстрагируют ДХМ. Органические фазы промывают насыщенным раствором соли, сушат над безводным Na₂SO₄ и фильтруют. Фильтрат концентрируют в вакууме, и остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле, и/или преп-ЖХВД.

Условия B4: К раствору 4-R и 5-R₁ замещенного 2-Cl-пиримидина (1,0 экв.) в диоксане добавляют Пр. W (1,0-1,2 экв.), Pd₂(dba)₃ (0,2 экв.), Xantphos (0,2 экв.) и карбонат калия (2,0 экв.). Смесь перемешивают при 100°C под N₂ в течение 12 часов, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле, и/или преп-ЖХВД.

Существуют дополнительные превращение 4-R и 5-R₁ замещенного 2-Cl-пиримидина между условиями A и B и дополнительные превращения после условий B, в зависимости от конкретных примеров.

Промежуточные соединения

Пр. W1

6-Метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин

Стадия 1: К смеси 2-(3-метоксифенил)этанамина (20,0 г, 132,27 ммоль, 19,23 мл) в водном растворе HCl (1 N, 192 мл, 192 ммоль) добавляют водный раствор формальдегида (37% масс., 41,64 г, 529,08 ммоль). Смесь перемешивают при 60°С в течение 1 часа, охлаждают до 0°С и подщелачивают добавлением по каплям 50% водного раствора NaOH (17,44 г, 218 ммоль) при 0°С. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и фильтруют. Фильтрат концентрируют с получением бис(6-метокси-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)метана в виде белого твердого вещества (23 г, 100% выход).

Стадия 2: К суспензии бис(6-метокси-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)метана (28 г, 82,73 ммоль) в i-PrOH (200 мл) добавляют по каплям концентрированную HCl (15,20 г, 182,01 ммоль, 15,3 мл) при 0°С и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. МТБЭ (70 мл) добавляют в вышеуказанную смесь и суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение еще 4 часов. После фильтрации, лепешку промывают смесью МТБЭ/i-PrOH (100 мл, 1/1 об/об) и сушат с получением 6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорида в виде белого твердого вещества, которое суспендируют в ДХМ (300 мл). К смеси добавляют насыщенный водный раствор NaHCO₃ (500 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов. После разделения, водный слой экстрагируют ДХМ (50 мл x 4). Объединенные органические слои сушат над безводным Na₂SO₄, фильтруют и концентрируют с получением 6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина в виде желтого масла (10 г, 75% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 164 [M+H]⁺.

Стадия 3: К раствору 6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (1,63 г, 9,99 ммоль) в MeOH (30 мл) добавляют водный формальдегид (37% масс./масс., 4,8 г, 59,92 ммоль, 1,67 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 минут и охлаждают до 0°С, туда добавляют NaBH₄ (1,13 г, 29,96 ммоль) порциями. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов, гасят льдом-водой (10 мл) и экстрагируют ДХМ (20 мл x 5). Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ/MeOH=10/1 об/об) с получением 6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина в виде желтого масла (1,7 г, 96% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 178 [M+H]⁺.

Стадия 4: К предварительно охлажденному раствору (0°С) концентрированной серной кислоты (4 мл) последовательно добавляют 6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин (2 г, 11,28 ммоль) и нитрат гуанидина (1,17 г, 9,59 ммоль) при 0°C. Полученную смесь перемешивают при 0°C в течение 30 минут, гасят льдом-водой (20 мл), подщелачивают до pH 10-11 водным раствором NaOH (4 N) и экстрагируют ДХМ (50 мл x 4). Объединенные органические слои сушат над безводным Na₂SO₄, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (ПЭ 100% об/об, ПЭ/ЭА=1/1 об/об, ЭА 100% об/об и затем ДХМ/MeOH=20/1, об/об) с получением 6-метокси-2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина в виде желтого твердого вещества (0,9 г, 36% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 223 [M+H]⁺.

Стадия 5: К раствору 6-метокси-2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (4,2 г, 14,40 ммоль) в ЭА (32 мл), H₂O (16 мл) и EtOH (144 мл) добавляют порошок Fe (5,5 г, 93,99 ммоль) и хлорид аммония (793,96 мг, 13,08 ммоль). Смесь перемешивают при 60°C в течение 48 часов, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Лепешку промывают метанолом (30 мл x 3) и фильтрат концентрируют. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ/MeOH=20/1-10/1 об/об) с получением 6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амина гидрохлорида в виде желтого твердого вещества (4,5 г, 100% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 193 [M+H]⁺.

Альтернативный способ синтеза:

Стадия 1: К раствору триэтиламина (13,38 г, 132,27 ммоль, 18,44 мл), 2-(3-метоксифенил)этанамина (10 г, 66,13 ммоль) и ДМАП (807,96 мг, 6,61 ммоль) в ДХМ (100 мл) добавляют Boc₂O (15,88 г, 72,75 ммоль, 16,70 мл) медленно при 0°C. Смесь затем перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов, разбавляют ледяной водой (200 мл) и экстрагируют EtOAc (3×200 мл). Объединенную органическую фазу промывают насыщенным раствором соли (100 мл), сушат над безводным Na₂SO₄, фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток очищают флэш-хроматографией (SiO₂, петролейный эфир/этил ацетат=10/1) с получением трет-бутил (3-метоксифенэтил)карбамата (14,6 г, 79,06% выход, 90% чистота) в виде бесцветной жидкости. ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 196 [M+H-56]⁺.

Стадия 2: К раствору трет-бутил (3-метоксифенэтил)карбамата (7 г, 27,85 ммоль) и 2-хлорпиридина (4,74 г, 41,78 ммоль, 3,92 мл) в CH₂Cl₂ (50 мл) добавляют раствор Tf₂O (8,64 г, 30,64 ммоль, 5,15 мл) в CH₂Cl₂ (5 мл) при -78 ºC. Через 20 минут, BH₃^.Et₂O (19,77 г, 139,26 ммоль) добавляют по каплям к вышеуказанному раствору. Реакционную смесь затем нагревают до комнатной температуры, перемешивают в течение 2 часов и осторожно гасят насыщенным раствором NaHCO₃. Полученную смесь экстрагируют CH₂Cl₂ (3×100 мл). Объединенный органический слой промывают насыщенным раствором соли (50 мл), сушат над безводным Na₂SO₄, фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток очищают флэш-хроматографией (SiO₂, петролейный эфир/этил ацетат/метанол=5/1/0 to 10/10/1) с получением 6-метокси-3,4-дигидроизохинолин-1(2H)-она (3,4 г, 68,89% выход) в виде беловатого твердого вещества. ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 178 [M+H]⁺.

Стадия 3: К раствору 6-метокси-3,4-дигидроизохинолин-1(2H)-она (3,8 г, 21,44 ммоль, 9,62 мл) в концентрированной H₂SO₄ (50 мл) добавляют HNO₃ (2,16 г, 22,29 ммоль, 65% чистота) по каплям при -20°C. Смесь перемешивают при -20°C ~-25°C в течение 3 часов и выливают в ледяную воду (300 мл). Водный слой экстрагируют дихлорметаном (3×200 мл). Объединенные органические слои концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (SiO₂, Петролейный эфир/этил ацетат/метанол=10/1/0~10/10/1) с получением 6-метокси-7-нитро-3,4-дигидроизохинолин-1(2H)-она (2,02 г, 40,78% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 223 [M+H]⁺.

Стадия 4: К раствору 6-метокси-7-нитро-3,4-дигидроизохинолин-1(2H)-она (2,02 г, 9,09 ммоль) в ТГФ (200 мл) добавляют 1M BH₃/ТГФ (45,46 ммоль, 45,5 мл). Смесь перемешивают при кипении с обратным холодильником в течение 20 часов и осторожно гасят метанолом (30 мл). Полученный раствор концентрируют в вакууме. Остаток нагревают в 2N HCl (50 мл) при 80°C в течение 3 часов, охлаждают, подщелачивают водным гидроксидом аммония и экстрагируют дихлорметаном (3×100 мл). Объединенный органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют с получением 6-метокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (1,89 г, 100,00% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 209 [M+H]⁺.

Стадия 5: К раствору 6-метокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (1,89 г, 9,08 ммоль, 9,62 мл) в метаноле (30 мл) добавляют формальдегид (1,64 г, 54,46 ммоль, 1,51 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 минут и охлаждают до 0°С. Затем NaBH₄ (1,03 г, 27,23 ммоль) добавляют к вышеуказанной смеси порциями. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов, гасят льдом-водой (10 мл) и экстрагируют ДХМ (20 мл x 5). Объединенный органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ/MeOH=10/1, об/об) с получением 6-метокси-2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (1,4 г, 69,40% выход) в виде желтого масла. ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 223 [M+H]⁺.

Стадия 6: К раствору 6-метокси-2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (1,3 г, 5,85 ммоль) в EtOAc (2 мл), H₂O (1 мл) и EtOH (10 мл) добавляют Fe (2,19 г, 39,19 ммоль) и хлорид аммония (284,74 мг, 5,32 ммоль). Смесь перемешивают при 60°C в течение 16 часов, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Лепешку промывают метанол (30 мл x 3) и фильтрат концентрируют. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ/MeOH=20/1 to 10/1 об/об) с получением 6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амина гидрохлорида в виде желтого твердого вещества (0,85 г, 75,6% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 193 [M+H]⁺.

Пр. W2

2-Метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин

Стадия 1: К ледяному раствору 1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (4,8 г, 36,04 ммоль) в концентрированной серной кислоте (20 мл) добавляют нитрат калия (4,01 г, 47,21 ммоль) небольшими порциями, сохраняя температуру ниже 5°C. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, выливают в лед (100 г), доводят до pH ~9 с NH₃^.H₂O и экстрагируют CH₂Cl₂ (50 мл x 3). Объединенные органические слои сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Остаток кристаллизуют в метаноле с получением 7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорида в виде желтого твердого вещества (4,2 г, 54% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/: 179 [M+H]⁺.

Стадия 2: К перемешиваемой смеси 7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорида (5,0 г, 23,29 ммоль) в сухом 1,2-дихлорэтанe (200 мл) добавляют формалин (37% водный формальдегид, 2,0 мл, 25,86 ммоль), затем триацетоксиборгидрид (19,81 г, 104,82 ммоль). Реакционную смесь энергично перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов и концентрируют. Остаток разбавляют EtOAc (400 мл), медленно гасят насыщенный водный раствор NaHCO₃ (400 мл) и перемешивают в течение 30 минут. Смесь экстрагируют ЭА (100 мл x 4). Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют с получением 2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина в виде коричневого твердого вещества (3,8 г, 85% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/: 193 [M+H]⁺.

Стадия 3: Суспензию 2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (3,8 г, 19,77 ммоль), Fe (5,52 г, 98,85 ммоль), NH₄Cl (15,86 г, 296,54 ммоль) в ЭА (10 мл), EtOH (100 мл) и H₂O (20 мл) перемешивают энергично при 70°C в течение 24 часов. После фильтрации, лепешку промывают смешанным растворителем ЭА/EtOH (100 мл, 10/1, об/об) и фильтрат концентрируют. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (MeOH в ДХМ, от 0% до 25% об/об) с получением 2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амина в виде желтого твердого вещества (1,84 г, 57% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 163 [M+H]⁺.

Пр. W3

6-Хлор-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин

Стадия 1: К раствору 6-хлоризохинолина (2,0 г, 12,22 ммоль) в MeCN (15 мл) добавляют MeI (5,21 г, 36,67 ммоль) при комнатной температуре. Смесь перемешивают при 50°С в герметично закрытой пробирке в течение 2 дней. После охлаждения до комнатной температуры, твердое вещество собирают фильтрацией, сушат с получением 6-хлор-2-метилизохинолин-2-ия йодида в виде желтого твердого вещества (3,2 г, 86% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 178 [M]⁺.

Стадия 2: К раствору 6-хлор-2-метилизохинолин-2-ия йодида (200 мг, 0,65 ммоль) в MeOH (8 мл) добавляют NaBH₄ (127,06 мг, 3,36 ммоль) порциями при 0°С. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов, доводят до pH ~9 насыщенным водным раствором NaHCO₃ и экстрагируют ДХМ (30 мл x 3). Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают преп-ТСХ (ДХМ/MeOH=20/1, об/об) с получением 6-хлор-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина в виде желтого твердого вещества (90 мг, 44% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 182 [M+H]⁺.

Стадии 3&4: Процедуры те же, что и для Стадии 4&5 of Пр. W1, с применением 6-хлор-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина вместо 6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина. ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 197 [M+H]⁺.

Пр. W4

2-Метокси-6-метил-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин-3-амин

Стадия 1: Раствор 1-метил-3,5-динитро-пиридин-2-она (4,5 г, 22,60 ммоль) и 1-метилпиперидин-4-она (2,81 г, 24,86 ммоль) в NH₃/MeOH (7 N, 50 мл) перемешивают в герметично закрытой пробирке при 50°C в течение ночи. После охлаждения до комнатной температуры, смесь концентрируют и остаток разделяют между ДХМ (100 мл) и насыщенным водным раствором NaHCO₃ (50 мл). Слои разделяют, и водный слой экстрагируют ДХМ (50 мл x 2). Объединенные органические слои сушат над безводным Na₂SO₄, фильтруют и концентрируют с получением 6-метил-3-нитро-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридина в виде красного твердого вещества (2,84 г, 65% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 194 [M+H]⁺.

Стадия 2: К раствору 6-метил-3-нитро-7,8-дигидро-5H-1,6-нафтиридина (1,3 г, 6,73 ммоль) в этаноле (35 мл) и ТГФ (35 мл) добавляют 10% Pd/C (817,20 мг) и смесь перемешивают под H₂ (1 атм) в течение 2 часов. После фильтрации, лепешку промывают EtOH (5 мл x 2) и фильтрат концентрируют с получением 6-метил-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин-3-амина в виде желтого твердого вещества (1,1 г, 100% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 164 [M+H]⁺.

Стадия 3: К раствору 6-метил-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин-3-амина (1,2 г, 7,35 ммоль) и AcONa (1,21 г, 14,70 ммоль) в уксусной кислоте (25 мл) добавляют бром (1,17 г, 7,35 ммоль) при комнатной температуре, и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь разбавляют ДХМ (100 мл) и водой (30 мл) и медленно доводят до pH ~9 с NaHCO₃. Органический слой сушат над безводным Na₂SO₄, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ/MeOH=20/1, об/об) с получением 2-бром-6-метил-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин-3-амина в виде желтого твердого вещества (570 мг, 32%). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 242 [M+H].

Стадия 4: К смеси 2-бром-6-метил-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин-3-амина (250 мг, 1,03 ммоль), карбоната цезия (672,86 мг, 2,07 ммоль) и MeONa (83,67 мг, 1,55 ммоль) в MeOH (2 мл) добавляют CuI (19,67 мг, 103,26 мкмоль) и 1,10-фенантролина моногидрат (40,94 мг, 206,51 мкмоль). Смесь перемешивают в условиях микроволн, защищенных N₂ при 120°С в течение 2 часов. После охлаждения до комнатной температуры, остаток очищают преп-ТСХ (ДХМ/MeOH=15/1, об/об) с получением 2-метокси-6-метил-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин-3-амина в виде желтого твердого вещества (74 мг, 37% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 194 [M+H]⁺.

Пр. W5

2-Изопропил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин

Стадия 1: К смеси 6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (340 мг, 2,08 ммоль) в MeOH (10 мл) добавляют по каплям ацетон (725,93 мг, 12,50 ммоль, 917,74 мкл) при комнатной температуре и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем NaBH(AcO)₃ (6,25 ммоль) добавляют порциями к вышеуказанной смеси при 0°C и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов, гасят насыщенный водный раствор NaHCO₃ (10 мл) при 0°C и концентрируют. Остаток экстрагируют ДХМ (50 мл x 2) и объединенные органические слои промывают насыщенным раствором соли (20 мл x 2), сушат над безводным Na₂SO₄, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ/MeOH=20/1, об/об) с получением 2-изопропил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина в виде белого твердого вещества (150 мг, 35% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 206 [M+H]⁺.

Стадия 2: Процедуры те же, что и для Стадии 4 Пр. W1, с применением 2-изопропил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина вместо 6-метокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина. ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 251 [M+H]⁺.

Стадия 3: Смесь 2-изопропил-6-метокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (200 мг, 799,06 мкмоль) и 10% палладия на угле (30 мг, 799,06 мкмоль) в ЭА (6 мл) перемешивают под H₂ (1 атм) при комнатной температуре в течение 16 часов и фильтруют. Фильтрат концентрируют и остаток очищают преп-ТСХ (ДХМ/MeOH=10/1, об/об) с получением 2-изопропил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амина в виде белого твердого вещества (50 мг, 28% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 221 [M+H]⁺.

Пр. W6

трет-Бутил 7-амино-6-метокси-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-карбоксилат

Стадия 1: к холодному раствору концентрированной H₂SO₄ (5 мл) добавляют 6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин (1,0 г, 1,84 ммоль) при -10°С. Нитрат гуанидина (758 мг, 6,13 ммоль) добавляют к вышеуказанной смеси порциями при -10°С. Смесь перемешивают при -10°С в течение 30 минут, выливают в холодную воду (20 мл), доводят до pH ~8 водным раствором NaOH (4 N) и экстрагируют ЭА (40 мл x 4). Объединенные органические слои сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ 100% об/об и затем ДХМ/MeOH=10/1, об/об) с получением 6-метокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина в виде желтого твердого вещества (200 мг, 16% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 209 [M+H]⁺.

Стадия 2: Смесь 6-метокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (100 мг, 0,48 ммоль), Boc₂O (157 мг, 0,72 ммоль) и Et₃N (97 мг, 0,96 ммоль) в ДХМ (5 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов и концентрируют. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ 100% об/об и затем ДХМ/MeOH=10/1, об/об) с получением трет-бутил 6-метокси-7-нитро-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-карбоксилата в виде желтого масла (150 мг, 100% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 209 [M-100+1]⁺.

Стадия 3: Смесь трет-бутил 6-метокси-7-нитро-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-карбоксилата (150 мг, 0,48 ммоль) и 10% Pd/C (50 мг) в EtOH (5 мл) перемешивают под H₂ (1 атм) при комнатной температуре в течение 16 часов и фильтруют. Фильтрат концентрируют с получением трет-бутил 7-амино-6-метокси-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-карбоксилата в виде желтого твердого вещества (110 мг, 81% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 223 [M-55]⁺.

Пр. W7

6-Фтор-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин

Стадия 1: К раствору 6-фтор-3,4-дигидро-2H-изохинолин-1-она (900 мг, 5,45 ммоль) в H₂SO₄ (9 мл) добавляют нитрат калия (578,47 мг, 5,72 ммоль) порциями при 0°C. Полученную смесь перемешивают при 0°С в течение 2 часов и выливают в лед-воду. белое твердое вещество осаждают, собирают фильтрацией и сушат в вакууме с получением 6-фтор-7-нитро-3,4-дигидро-2H-изохинолин-1-она (1,04 г, 86% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 211 [M+H]⁺.

Стадия 2&3&4: Процедуры те же, что и для Стадий 4&5&6 альтернативного способа синтеза из Пр. W1, с применением 6-фтор-7-нитро-3,4-дигидро-2H-изохинолин-1-она вместо 6-метокси-7-нитро-3,4-дигидро-2H-изохинолин-1-она. ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 181 [M+H]⁺.

Пр. W8

2-Этил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин

Стадия 1: К раствору 6-метокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (300 мг, 1,44 ммоль) в CH₃CN (10 мл) добавляют йодэтан (224,72 мг, 1,44 ммоль, 115,83 мкл) и K₂CO₃ (796,52 мг, 5,76 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 20°C в течение 16 часов и разделяют между этилацетатом (100 мл) и водой (100 мл). Органический слой отделяют, сушат над безводным сульфатом магния и фильтруют. Фильтрат концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (0-20% метанол в дихлорметане с водным гидроксидом аммония) с получением 2-этил-6-метокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (136 мг, 40% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 237 [M+H]⁺.

Стадия 2: Процедуры те же, что и для Стадии 6 альтернативного способа синтеза из Пр. W1, с применением 2-этил-6-метокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина вместо 2-метил-6-метокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина. ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 207 [M+H]⁺.

Пр. W9

6-Метокси-2-метилизоиндолин-5-амин

Стадия 1: Процедуры те же, что и для Стадии 1 Пр. W7, с применением 5-метоксиизоиндолин-1-она вместо 6-фтор-3,4-дигидроизохинолин-1(2H)-она. ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 209 [M+H]⁺.

Стадия 2&3&4: Процедуры те же, что и для Стадий 4&5&6 альтернативного способа синтеза из Пр. W1, с применением 5-метокси-6-нитроизоиндолин-1-она вместо 6-метокси-7-нитро-3,4-дигидро-2H-изохинолин-1-она. ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 179 [M+H]⁺.

Пр. W10

6-Изопропокси-2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-амин

Стадия 1: К раствору 6-метокси-2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (50 мг, 224,98 мкмоль) в воде (5 мл) добавляют 1M гидробромид (1 мл). Смесь перемешивают при кипении с обратным холодильником в течение 16 часов, подщелачивают до pH 8 насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и экстрагируют дихлорметаном/метанолом (об/об, 10/1, 20 мл x 3). Органические фазы сушат над безводным сульфатом натрия и фильтруют. Фильтрат концентрируют в вакууме с получением неочищенного 2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-6-ола (46,84 мг, 90% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 209 [M+H]⁺.

Стадия 2: К раствору 2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-6-ола (230 мг, 1,10 ммоль) и 2-йодпропана (187,78 мг, 1,10 ммоль, 110,46 мкл) в ДМФ (2 мл) добавляют карбонат калия (229,00 мг, 1,66 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов и разбавляют насыщенным раствором соли (10 мл). водную фазу отделяют и экстрагируют этилацетатом (20 мл x 3). Органические фазы сушат над безводным сульфатом натрия и фильтруют. Фильтрат концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (ЭА/ПЭ: 10~50%) с получением 6-изопропокси-2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (240 мг, 87% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 251 [M+H]⁺.

Стадия 3: Процедуры те же, что и для Стадии 6 альтернативного способа синтеза из Пр. W1, с применением 6-изопропокси-2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина вместо 6-метокси-2-метил-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина 5-метокси-6-нитроизоиндолин-1-она. ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 221 [M+H]⁺.

Пр. W11

1-(7-Амино-6-метокси-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-2,2,2-трифторэтан-1-он

Стадия 1: К раствору 6-метокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (908 мг, 4,14 ммоль) в дихлорметане (15 мл) добавляют триэтиламин (838,43 мг, 8,29 ммоль, 1,15 мл) при 0°C, затем добавляют трифторуксусный ангидрид (1,04 г, 4,97 ммоль, 700,78 мкл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов, подщелачивают до pH 8 насыщенным водным раствором NaHCO₃ и экстрагируют дихлорметаном (10 мл x 3). Объединенную органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия и фильтруют. Фильтрат концентрируют в вакууме с получением неочищенного 2,2,2-трифтор-1-(6-метокси-7-нитро-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)этан-1-она в виде желтого твердого вещества (1,26 г, 95% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 305 [M+H]⁺.

Стадия 2: Смесь 2,2,2-трифтор-1-(6-метокси-7-нитро-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)этан-1-она (1,33 г, 4,14 ммоль) и 10% палладия на угле (400 мг, 3,76 ммоль) в метаноле (30 мл) перемешивают при 25°C в течение 16 часов под атмосферой H₂ и фильтруют через целит. Лепешку промывают метанолом (30 мл x 3) и фильтрат концентрируют в вакууме с получением 1-(7-амино-6-метокси-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-2,2,2-трифторэтан-1-она в виде светло-желтого твердого вещества (1,14 г, 95% выход). ЖХ-МС (ИЭР) m/z: 275 [M+H]⁺.

Пр. E1

(1H-индол-3-ил)диметилфосфин оксид

Стадия 1: К смеси 1H-индол (2,34 г, 19,97 ммоль) и KOH (1,34 г, 23,97 ммоль) в ДМФ (40 мл) добавляют по каплям раствор I₂ (5,08 г, 19,97 ммоль) в ДМФ (10 мл) при 0°С. Полученную смесь перемешивают при 0°С в течение 30 минут, разбавляют холодной водой (200 мл) и перемешивают в течение еще 30 минут. Твердое вещество собирают фильтрацией, промывают H₂O (30 мл x 3) и сушат в вакууме с получением 3-йод-1H-индола в виде желтого твердого вещества (2,58 г, 53% выход).

Стадия 2: К раствору 3-йод-1H-индола (2,4 г, 9,87 ммоль) в ДХМ (15 мл) добавляют триэтиламин (3,00 г, 4,13 мл, 29,62 ммоль), Boc₂O (4,31 г, 19,75 ммоль) и ДМАП (120,64 мг, 0,99 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа и концентрируют в вакууме. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (ЭА/ПЭ=20/1, об/об) с получением трет-бутил 3-йод-1H-индол-1-карбоксилат в виде коричневого масла (4,6 г, 100% выход).