Способ количественного определения доксорубицина в биологических образцах Российский патент 2025 года по МПК G01N21/64 G01N1/28 

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для оценки биораспределения и фармакокинетики доксорубицина в крови и биологических тканях.

Онкологические заболевания являются одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. По оценкам некоторых специалистов к 2030 году количество смертей от рака достигнет 13,1 миллиона человек (GLOBOCAN (IARC) Section of Cancer Information. Available from) [1].

Антрациклины, особенно доксорубицин (Dox), много десятилетий являются основой терапии рака. Несмотря на антинеопластическую активность широкого спектра, побочные эффекты препарата [2], в частности кардиотоксичность, в некоторых случаях ограничивали применение свободного доксорубицина в клинической практике [3]. Особенно это касается пациентов с прогрессирующим заболеванием, требующим постоянного повышения дозы препарата [4].

Несмотря на множество побочных эффектов, в настоящее время продолжают применять в комплексной терапии ряда опухолей свободную форму доксорубицина. Ведутся разработки новых лекарственных форм доксорубицина для повышения избирательности действия и уменьшения системной токсичности. Существует препарат, представляющий собой липосомальную форму доксорубицина, например Doxil/Caelyx [5, 6]. Препарат успешно прошел клинические испытания и был одобрен агенством Министерства здравоохранения и специальных служб США (FDA) [7]. На сегодняшний день разработка и исследования новых лекарственных форм доксорубицина не снизилась, появляется много сообщений о новых лекарственных формах на основе полимерных нано- и микрокапсул [8, 9], мицелл [10, 11], неорганических частиц [12, 13], липидных везикул [14, 15].

Изучение особенностей фармакокинетики является одной из первых основных задач при разработке новых фармацевтических препаратов. Наиболее часто в фармакокинетических исследованиях доксорубицина или его других лекарственных форм применяются такие методы количественного анализа, как ВЭЖХ с флуориметрическим [16, 17] или масс-спектрометрическим детектированием [18, 19].

Данные методы обладают высокой чувствительностью количественного определения доксорубицина в крови (~ 1-10 нг/мл) [20] и в органах (~ 0,5-25 мг/кг) [20]. Также с их помощью возможно количественное определение метаболитов (доксорубицинол и доунрубицин) [21].

При всех достоинствах данных методов они не лишены недостатков, основным из которых является их дороговизна (приборная база, расходные материалы и т.д.). При разработке новых лекарственных форм доксорубицина требуется неоднократное повторение скрининговых исследований биораспределения, по результатам которых препарат дорабатывается до оптимальных фармацевтических характеристик. Данные обстоятельства могут существенным образом влиять на стоимость и длительность проводимых испытаний.

Помимо этого, очень важным этапом количественного определения доксорубицина является разработка метода пробоподготовки, которая включает выбор органических растворителей, процесс гомогенизации образцов, время инкубации, температурный режим и многое другое [22].

Особое внимание следует уделить экстрагирующим растворителям, которые могут повысить чувствительность аналитического метода. Как правило, эффективность экстракции веществ в основном определяется их способностью растворяться в определенных органических растворителях. Наибольшей растворяющей способностью для Dox обладает диметилсульфоксид (ДМСО) (100 мг/мл), хорошо растворяется Dox в воде (10 мг/мл), умеренно растворим в метаноле и этаноле [23]. Кроме того, растворы Dox в ДМСО (по сравнению с другими растворителями) обладают более интенсивной флуоресценцией, что в свою очередь повышает нижний предел количественного определения (НПКО) препарата с помощью флуоресцентных методов [24]. Однако в методах ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС/МС практически не применяется ДМСО из-за его высокой элюирующей силы, температуры плавления (18,5°С) и поглощении света в диапазоне 260-270 нм. В данных методах наиболее часто используют органические растворители такие, как метанол, ацетонитрил и этилацетат.

Одним из приемлемых вариантов решения описанных недостатков и специфических особенностей, связанных с дороговизной методов ВЭЖХ и процессом экстракции, является использование флуориметрического метода без использования системы ВЭЖХ. Для повышения чувствительности флуориметрического метода количественного определения Dox предлагается экстрагирующая фаза, позволяющая максимально выделять препарат из биологических сред.

В ходе проведения исследований и анализа литературных данных не было найдено сообщений о применении экстрагирующей органической фазы (Метанол, 37% НС1 и ДМСО в объемном соотношении 5:5:7) для выделения и дальнейшего количественного определения доксорубицина в биологических образцах флуориметрическим методом без ВЭЖХ системы.

Известен спектрофотометрический метод определения доксорубицина гидрохлорида в крови и плазме, где к образцам крови и плазмы (обогащенные или тестируемые) объемом 5 мл добавляли 5 мл экстрагирующего агента (этилацетат). Экстракцию образцов проводили в течение 30 минут при перемешивании на вортексе, затем для удаления форменных элементов крови и белов центрифугировали (5000 об/мин, 2 мин). В собранный супернатант добавляли сульфат магния для удаления остатков воды, затем прозрачную аликвоту экстракта помещали в кювету и измеряли поглощение при λ=496 нм. Нижний предел обнаружения для крови и плазмы составил 1,6 мкг/мл и 1,2 мкг/мл соответственно [25]. Основным недостатком метода является низкая чувствительность и невозможность определения доксорубицина в биологических тканях.

Известен флуориметрический метод количественного определения доксорубицина в человеческой плазме и моче. Образцы биологических жидкостей смешивали с ацетонитрилом или подкисленным растровом этанола. Затем центрифугировали, полученный супернатант переносили в кювету и измеряли флуоресценцию λ - 590 нм при возбуждении на λ=475 нм. Концентрацию доксорубицина определяли по заранее построенным калибровочным графикам с диапазоном концентраций 0,05-4 мкг/мл. Нижний предел обнаружения для плазмы составил 0,2 мкг/мл [26].

Недостатком изобретения является использование в качестве экстрагирующей фазы подкисленного этанола и ацетонитрила, поскольку в последнем Dox ограничено растворим [27]. А нижний предел обнаружения меньше, чем в предложенном нами изобретении.

В качестве прототипа был выбран метод, описанный в работе Tatsumi Т., et al., 2011. К образцам биологических тканей (сердце, почки, легкие, селезенка и опухоль) добавляли 1,5 мл лизисного буфера (10 мМ HEPES, 1 мМ MgSO4, 1 мМ CaCl₂) и проводили гомогенизацию. Аликвоту гомогената (100 мкл) переносили в 1,5 мл эппендорф и добавляли 50 мкл (10% Тритон Х-100), 100 мкл деионизованной воды и 750 мкл подкисленного 0.75Н HCL изопропанола. Затем смесь центрифугировали 12000g/10 минут, супернатант развивали в 96 луночный планшет и измеряли флуорисценцию λ -590, при возбуждении λ - 485 [28].

Недостатком данного метода является использование многокомпонентной буферной системы и детергентов для экстракции доксорубицина из тканей и плазы. Калибровочные кривые получены на основе относительных значений люминесценции Dox в гомогенатах, а содержание препарата выраженно в процентах (%введенная доза/г) без указаний предела количественного обнаружения.

Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного рутинного способа определения доксорубицина гидрохлорида в биологических образцах.

Техническим результатом изобретения является высокая степень извлечения препарата из плазмы крови и тканей/органов за счет использования разработанной экстрагирующей фазы, высокий (для флуоресцентного метода) нижний предел обнаружения и количественного определения в биологических образцах, наличие необходимой линейности, точности и прецизионности.

Сущность изобретения заключается в том, что способ количественного определения доксорубицина в биологических образцах включает в себя выделение доксорубицина из биологических образцов путем жидкостной экстракции органической фазой, а именно смесью метанола, 37% НС1 и диметилсульфоксида в объемном соотношении 5:5:7, идентификацию доксорубицина путем записи его характерного спектра флуоресценции и получение значений интенсивностей флуоресценции доксорцбицина из биологических образцов на λ - 595 нм при возбуждении светом λ=495 нм для определения концентрации доксорубицина в биологическом образце, представляющем собой плазму крови или гомогенаты органов или тканей.

Способ количественного определения доксорубицина заключается в том, что сначала готовится экстрагирующая фаза: метанол, 37% НС1 и ДМСО в объемном соотношении 5:5:7. Биологические образцы (бедренная мышца, легкие, сердце, печень, селезенка, почки) содержащие доксорубицин взвешиваются на аналитических весах и расфасовываются в пробирки объемом 15 мл. Добавляется экстрагирующая фаза и 0,15М NaCl согласно соотношениям V_фаза/m_орган=5 мл/г; V_фаза/V_плазма=5, а затем ткани/органы гомогенизируются с помощью гомогенизатора.

Экстракция доксорубицина проводится в течение 6 часов при постоянном перемешивании и комнатной температуре. Забираются аликвоты экстрактов по 0,5 мл из всех образцов и центрифугируются при 16000 RPM в течение 20 минут. Отбирается супернатант по 0,2 мл для флуоресцентного анализа. Производится идентификация доксорубицина путем записи спектра флуоресценции образцов и регистрация значений интенсивностей флуоресценции доксорубицина из них на λ - 595 нм при возбуждении светом с λ=495 нм. Концентрация препарата определяется по калибровочным кривым зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации доксорубицина.

Преимуществом заявляемого изобретения является оптимизированная методика экстракции доксорубицина из биологических образцов за счет использования экстрагирующей фазы (метанол, 37% HCl и ДМСО в объемном соотношении 5:5:7), в частности использование в качестве одного из компонентов ДМСО, который обладает наибольшей растворимостью для доксорубицина и улучшает его спектрально-люминесцентные свойства. Применение флуоресцентного метода анализа без ВЭЖХ системы для количественного определения доксорубицина, в совокупности с использованием меньшего количества реагентов для экстракции препарата (относительно аналогов), уменьшает затраты на исследование.

Далее представлена оптимизация метода экстракции доксорубицина из биологических образцов.

Для разработки метода использовался мультимодальный ридер Thermo Scientific Varioskan LUX, США.

Вспомогательные устройства: весы лабораторные электронные аналитические (ГОСТ 24104-2001) OHAUS Pioneer РА-64С (Китай), с погрешностью взвешивания не более 0,001 мг; 96-луночный планшет с плоским дном Thermo Scientific NuncTM Edge (США); гомогенизатор Scientz JY92-IIN (Китай); лабораторная центрифуга Hettich ЕВА 200 (Германия); шейкер ELMI S-3M (Латвия); система отчистки воды Nova U, 18.25 MΩ/cm@25°C (Китай); холодильник фармацевтический Pozis ХФ-250 (Россия).

Для оптимизации экстракции препарата предварительно были зарегистрированы стандартные молекулярные спектры доксорубицина в фазе метанол и ДМСО (в объем соотношении 50/50). Аналиты показали типичные спектры возбуждения и эмиссии, а максимальные значения поглощения и интенсивности флуоресценции достигнуты при длине волны 495 нм и 595 нм соответственно (фиг. 1).

Для оценки зависимости степени экстракции (извлечения) препарата от соотношения компонентов экстрагирующей фазы был проведен ряд экспериментов экстракции доксорубицина из гомогентов органов и плазмы крови. Количество доксорубицина и экстрагирующей фазы было выбрано с определенным соотношением, чтобы нормировать массу доксорубицина и экстрагирующей фазы на грамм веса органа или на миллилитр плазмы: V_фаза/m_орган=5 мл/г; m_Dox/m_орган=3,33 МКГ/Г; V_фаза/V_плазма=5.

В гомогенаты органов (печень, сердце, легкое, селезенка, почки, мышечная ткань) и плазму крови добавляли определенный объем стандартных растворов доксорубицина с заданными концентрациями и тщательно перемешивали. Конечная концентрация доксорубицина в плазме и органах составила 1 мкг/ мл. Далее добавлялся раствор 0,15М NaCl и экстрагирующая фаза (с различным объемным соотношением компонентов метанол, 37% НС1 и ДМСО) согласно пропорциям. Экстракцию доксорубицина проводили в течение 6 часов при постоянном перемешивании при комнатной температуре и в защищенном от света месте. Забирали аликвоты экстрактов по 0,5 мл из всех образцов и центрифугировали при 16000 RPM в течение 20 минут. Отбирали супернатант по 0,2 мл для флуоресцентного анализа. Идентифицировали доксорубицина путем записи спектра флуоресценции образцов и регистрировали значения относительных интенсивностей флуоресценции на λ - 595 нм при возбуждении светом с λ -495 нм. Процент экстракции определяли по значениям полученных интенсивностей из спектров относительно значений интенсивностей холостых проб.

По результатам исследования определено, что экстрагирующая фаза (метанол, 37% НС1 и ДМСО) обладает наилучшей степенью экстракции при объемном соотношении 5:5:7, а процентные значения составили: плазма - 97%, легкие - 92%, сердце - 90%, почки - 98%, селезенка - 90%, мышцы -94%, печень - 89%. На фиг. 2 представлены спектры флуоресценции доксорубицина, экстрагированного из плазмы и гомогенатов органов/тканей.

Оценка линейности, предела обнаружения и предела количественного определения доксорубицина в плазме крови и гомогенатах органов представлены далее.

Для определения линейности, нижнего предела обнаружения (НПО) и количественного определения (НПКО) готовились матричный раствор, рабочие и калибровочные стандарты.

Матричный раствор доксорубицина гидрохлорида (100 мкг/мл) готовили путем смешивания 1 мл доксорубицина (Doxorubicin hydrochloride suitable for fluorescence, 98,0-102,0% (HPLC), USA) (2 мг/мл) с 0,9% NaCl в мерной колбе вместимостью 20 мл. Матричный раствор использовали для приготовления рабочих стандартов 10 мкг/мл, 100 нг/мл в 0,15М NaCl, полученные растворы хранились при температуре +4°С в течение 72 часов.

Калибровочные стандарты были приготовлены в плазме и органах (гомогенаты бедренной мышцы, легких, сердца, печени, селезенки, почек) интактных мышей. В общем случае для каждой биологической среды приготовлено 9 стандартов, содержащих 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 мкг/мл доксорубицина. Для каждой концентрации готовили по 5 образцов.

Калибровочные образцы были приготовлены так, что количество доксорубицина и фазы в калибровочных растворах было выбрано с определенным соотношением, чтобы нормировать массу доксорубицина и экстрагирующей фазы на грамм веса органа или на миллилитр плазмы. V_фаза/m_орган=5 мл/г; m_Dox/m_орган=3,33 мкг/г; V_фаза/V_плазма=5. В случае плазмы образцы были приготовлены путем добавления соответствующего рабочего стандартного раствора доксорубицина в 0,1 мл интактной плазмы (свободной от доксорубицина). В случае сердца, почек, легкого, селезенки и мышечной ткани, органы взвешивались на аналитических весах. Далее в гомогенаты добавляли определенное количество рабочего стандартного раствора доксорубицина и тщательно перемешивали. Далее добавлялся 0,15М раствор NaCl и экстрагирующая фаза согласно пропорциям. Экстракцию доксорубицина проводили в течение 6 часов при постоянном перемешивании при комнатной температуре и в защищенном от света месте. Забирали аликвоты экстрактов по 0,5 мл из всех образцов и центрифугировали при 16000 RPM в течение 20 минут. Отбирали супернатант по 0,2 мл для флуоресцентного анализа. Полученные растворы хранили в холодильнике при температуре +2°С.

Калибровочные кривые построены, исходя из полученных интенсивностей флуоресценции доксорубицина, содержащегося в различных биологических образцах.

Нижний предел обнаружения (НПО) и нижний предел количественного определения (НПКО) доксорубицина в биологических образцах определялись как интенсивности сигнала (λ - 595 нм) доксорубицина в аналите относительно интенсивности собственной флуоресценции биологических образцов при возбуждении светом с λ - 495 нм. Соотношение сигнал/шум (С/Ш) не меньше 3 и 5 для НПО и НПКО соответственно (согласно Решение Совета ЕЭК от 03.11.2016 № 85). Отклонение расчетной концентрации доксорубицина в калибровочных растворах не превышало 15%. Результаты расчета параметров калибровочных кривых в таблице 1, НПО и НПКО, и соотношение сигнал/шум для них представлены в таблице 2 (линейный диапазон, коэффициент корреляции, уравнения калибровочных кривых, значения нижнего предела обнаружения и нижнего предела количественного определения для доксорубицина в биологических образцах).

На фиг. 3, фиг. 4, фиг. 5, фиг. 6 представлены калибровочные графики зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации доксорубицина в биологической среде: бедренная мышца (фиг. 3), печень (фиг. 4), сердце (фиг. 5), плазма (фиг. 6).

На фиг. 7, фиг. 8, фиг. 9 представлены калибровочные графики зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации доксорубицина в биологической среде: селезенка (фиг. 7), легкие (фиг. 8), почки (фиг. 9).

Квадрат коэффициента корреляции градуировочной кривой должен быть не менее 0,99. Как видно из результатов, квадрат коэффициента корреляции для калибровочных кривых плазмы, сердца, почек, легкого, селезенки, печени и мышечной ткани имеет значение ≥0,99. Таким образом подтверждена линейность в диапазоне концентраций 0,05-5 мкг/мл. Для всех биологических образцов найдены значения НПО и НПКО, а соотношение С/Ш для них ≥3 и ≥5 соответственно, что является приемлемым согласно Решение Совета ЕЭК от 03.11.2016 № 85.

Оценка точности и прецизионности количественного определения доксорубицина в плазме крови и гомогенатах органов представлена далее.

Внутрисуточная и межсуточная прецизионность и точность оценивалась путем определения концентрации доксорубицина в трех образцах контроля качества (плазма, сердце, печень) в течение одного и пяти дней соответственно. Определенное количество доксорубицина добавляли в гомогенаты для получения серии концентраций 0,05, 2 и 5 мкг/мл. Точность определялась как процент отклонения (относительная ошибка, RE%) между измеренной и истинной концентрациями. Прецизионность оценивали по относительному стандартному отклонению (RSD%). Внутри-, межсуточная точность и прецизионность для концентраций контрольных образцов, составляющих менее или равные 15%, считались приемлемыми. Значения прецизионности и точности определения доксорубицина в плазме, сердце и печени (n=3) представлены в таблице 3.

Таким образом, значения относительной ошибки (RE%) и стандартного отклонения (RSD%) для внутрисуточной/межсуточной точности и прецизионности соответствуют требованиям - не более 15%. Следовательно, разработанный способ количественного определения доксорубицина обладает необходимой правильностью и повторяемостью.

Оценка применимости способа количественного определения доксорубицина для исследование его фармакокинетики in vivo представлена ниже.

Для оценки достоверности предлагаемого способа количественного определения доксорубицина в биологических образцах проведено фармакокинетическое исследование, которое приведено далее.

Исследование фармакокинетики проводили на белых лабораторных мышах линии BALB/c в возрасте 40-45 дней со средней массой 23 г. Животных подвергали анестезии Zoletil, Virbac (Франция) и Rometar, Bioveta (Чешская Республика).

В эксперименте было сформировано 2 группы. Животным первой группы (контроль) в хвостовую вену вводили 0,2 мл раствора 015М NaCl. Животным второй группы (экспериментальная) вводили 0,2 мл раствора Dox в дозе 3 мг/кг. Внутривенное введение растворов занимало не более 10 секунд. Через 0,5; 1; 2; 5; 10; 30 минут, 1, 2 и 6 часов с момента внутривенного введения раствора 0,15М NaCl и Dox мышей подвергали эвтаназии путем дислокации шейных позвонков, а затем незамедлительно проводили декапитацию для сбора крови. Остальные образцы (бедренная мышца, легкие, сердце, печень, селезенка, почки) расфасовывали в пробирки объемом 15 мл. Добавляли экстрагирующую фазу и 0,15М NaCl согласно соотношениям V_фаза/m_орган=5 мл/г; V_фаза/V_плазма=5, а затем гомогенизировали с помощью гомогенизатора Scientz JY92-IIN (Китай).

Экстракцию доксорубицина проводили в течение 6 часов при постоянном перемешивании и комнатной температуре. Забирали аликвоты экстрактов по 0,5 мл из всех образцов и центрифугировали при 16000 RPM в течение 20 минут. Отбирали супернатант по 0,2 мл для флуоресцентного анализа. Полученные супернатанты были прозрачные светло-желтого цвета, для которых измеряли интенсивность флуоресценции. Концентрацию доксорубицина определяли по калибровочным графикам для каждого биологического образца.

На фиг. 10, фиг. 11, фиг. 12, фиг. 13 представлен профиль зависимости общей концентрации доксорубицина от времени в бедренной мышце (фиг. 10), печени (фиг. 11), сердце (фиг. 12), плазме (фиг. 13) после однократного внутривенного введения (n=5).

На фиг. 14, фиг. 15, фиг. 16 представлен профиль зависимости общей концентрации доксорубицина от времени в селезенке (фиг. 14), легких (фиг. 15), почках (фиг. 16) после однократного внутривенного введения (n=5).

Из результатов видно, что кинетика доксорубицина в плазме представляет собой экспоненциальную кривую, согласующуюся с ранее полученными результатами [29]. Через 5 минут после внутривенного введения около 95% Dox выходит из кровотока и распределяется по тканям и органам. В действительности из кинетических кривых видно, что почти во всех органах максимальная концентрация препарата достигается на 5 минуте, а далее концентрация убывает, что можно связать с его метаболизмом и выведением из организма. Полученные результаты по распределению доксорубицина в органах коррелируют с ранее опубликованным данными фармакокинетики препарата (методами ВЭХЖ-УФ и ВЭЖХ-МС/МС) [30, 31, 32]. Также проведена оценка суммарной концентрации DOX в органах в течение времени 0-360 минут.Для этого был вычислен интегральный фармакокинетический показатель AUC (area under curve) и тканевая доступность препарата F_t=AUC (органа) / AUC (плазмы). На фиг. 17 представлен интегральный фармакокинетический показатель AUC и коэффициент тканевой доступности F_t для биологических образцов.

Таким образом, показано, что разработанная методика обладает требуемой линейностью, точностью и прецизионностью для количественного определения препарата доксорубицина в биологических образцах. Оптимизированная методика экстракции позволяет эффективно извлекать препарат доксорубицин из плазмы крови и органов/тканей.

Предлагаемое изобретение позволяет получить точную и достоверную информацию о количестве доксорубицина в плазме крови и органах/тканях в условиях фармакокинетического исследования доксорубицина in vivo. Предел обнаружение для плазмы составил 35 нг/кг; для бедренной мышцы, легкого, сердца, почек, печени - 50 нг/мл, а для селезенки - 100 нг/мл.

Список использованных источников

1. International Agency for Research on Cancer: официальный сайт. - URL: http://www.globocan.iarc.fr/factsheets/populations/factsheet.asp?uno=900) (дата обращения: 21.04.2024). - Текст: электронный.

2. Ajaykumar, С.Overview on the Side Effects of Doxorubicin / C. Ajaykumar // Advances in Precision Medicine Oncology. - 2021.

3. Thigpen, T. Innovations in anthracycline therapy: Overview / T. Thigpen // Communication Oncology. - 2005.

4. Theodoulou, M. Cardiac Profiles of Liposomal Anthracyclines: Greater Cardiac Safety versus Conventional Doxorubicin? Vol. 100 / M. Theodoulou, C. Hudis. - 2004.

5. Pegylated liposomal doxorubicin (Doxil®) for metastatic breast cancer: The Cancer Research Network, Inc., experience / A. T. Perez, G. H. Domenech, C. Frankel, C. L. Vogel // Cancer Investigation. - 2002. - Vol. 20.

6. Light-sensitive lipid-based nanoparticles for drug delivery: Design principles and future considerations for biological applications. Vol. 27 / A. Yavlovich, B. Smith, K. Gupta [et al.]. - 2010.

7. Barenholz, Y. Doxil® - The first FDA-approved nano-drug: Lessons learned. Vol. 160 / Y. Barenholz. - 2012.

8. Polymer shelled microparticles for a targeted doxorubicin delivery in cancer therapy / B. Cerroni, E. Chiessi, S. Margheritelli [et al.] // Biomacromolecules. - 2011. - Vol. 12. - № 3.

9. Multilayer capsules encapsulating nimbin and doxorubicin for cancer chemo-photothermal therapy / V. Sharma, J. Vijay, M. R.. Ganesh, A. Sundaramurthy // International Journal of Pharmaceutics. - 2020. - Vol. 582.

10. Doxorubicin-loaded pH-sensitive micelles: A promising alternative to enhance antitumor activity and reduce toxicity / С.H. Cavalcante, R. S. Fernandes, J. de Oliveira Silva [et al.] // Biomedicine and Pharmacotherapy. - 2021. - Vol. 134.

11. Bioreducible PAA-g-PEG graft micelles with high doxorubicin loading for targeted antitumor effect against mouse breast carcinoma / Y. Sun, W. Zou, S. Bian [et al.] // Biomaterials. - 2013. - Vol. 34. - № 28.

12. Inorganic Porous Nanoparticles for Drug Delivery in Antitumoral Therapy. Vol. 16 / J. Parra-Nieto, M. A. G. del Cid, I. A. de Cárcer, A. Baeza. -2021.

13. Inorganic nanoparticles: A potential cancer therapy for human welfare. Vol. 539 / A. Pugazhendhi, T. N. J. I. Edison, I. Karuppusamy, B. Kathirvel.-2018.

14. Antitumor efficacy following the intracellular and interstitial release of liposomal doxorubicin / A. Bandekar, S. Karve, M. Y. Chang [et al] // Biomaterials. - 2012. - Vol. 33. - № 17.

15. Doxorubicin-loaded bacterial outer-membrane vesicles exert enhanced anti-tumor efficacy in non-small-cell lung cancer / K. Kuerban, X. Gao, H. Zhang [et al.] // Acta Pharmaceutica Sinica B. - 2020. - Vol. 10. - № 8.

16. A simple HPLC method for doxorubicin in plasma and tissues of nude mice / A. M. Al-Abd, N. H. Kim, S. C. Song [et al.] // Archives of Pharmacal Research. - 2009. - Vol. 32. - № 4.

17. HPLC method development for quantification of doxorubicin in cell culture and placental perfusion media / M. Shah, L. Bourner, S. Ali [et al.] // Separations. - 2018. - Vol. 5. -№ 1.

18. LC-MS/MS method development for quantification of doxorubicin and its metabolite 13-hydroxy doxorubicin in mice biological matrices: Application to a pharmaco-delivery study / S. Mazzucchelli, A. Ravelli, F. Gigli [et al.] // Biomedical Chromatography. - 2017. - Vol. 31. - № 4.

19. LC-MS/MS study of in vivo fate of hyaluronan polymeric micelles carrying doxorubicin / M. Šimek, M. Hermannová, D. Šmejkalová [et al.] // Carbohydrate Polymers. - 2019. - Vol. 209.

20. Distinct biodistribution of doxorubicin and the altered dispositions mediated by different liposomal formulations / R. Luo, Y. Li, M. He [et al.] // International Journal of Pharmaceutics. - 2017. - Vol. 519. - № 1-2.

21. Comparative Study of Various Procedures for Extracting Doxorubicin from Animal Tissue Samples / O. Maliszewska, N. Treder, A. Roszkowska [et al.] // Separations. - 2023. - Vol. 10. - № 1.

22. Pashaei, Y. A review on various analytical methods for determination of anthracyclines and their metabolites as anti-cancer chemotherapy drugs in different matrices over the last four decades. Vol. 130 / Y. Pashaei, M. Mehrabi, M. Shekarchi. - 2020.

23. Cell Signaling Technology. - обнавляется в течение суток. - URL: https://www.cellsignal.com/products/activators inhibitors/doxorubicin/5927 (дата обращения: 1.07.2024). - Текс: электронный.

24. Application of Optical Methods for Determination of Concentration of Doxorubicin in Blood and Plasma / T. Sikora, K. Morawska, W. Lisowski [et al.] // Pharmaceuticals. - 2022. - Vol. 15. - № 2.

25. Doxorubicin Encapsulation Investigated by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection / R. Konecna, H. V. Nguyen, M. Stanisavljevic [et al.] // Chromatographia. - 2014. - Vol. 77. - № 21-22.

26. Derayea, S. M. Facile one-pot green solvent synergized fluorescence reaction for determination of doxorubicin in presence of paclitaxel; coadministered drug, application to stability study and analysis in bulk, vial and biological fluids / S. M. Derayea, R. Ali, A. A. Hamad // Arabian Journal of Chemistry. - 2020. - Vol. 13. - № 11.

27. Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации (МУК 4.1.0.513-96). - 2003. - URL: https://files.stroyinf.ru/Data2/l/4294814/4294814967.htm (дата обращения: 12.05.2024). - Текст: электронный.

28. Tagami, Т. Efficient tumor regression by a single and low dose treatment with a novel and enhanced formulation of thermosensitive liposomal doxorubicin / Т. Tagami, M. J. Ernsting, S. D. Li // Journal of Controlled Release. -2011.-Vol. 152.-№ 2.

29. Pharmacokinetics of doxorubicin incorporated in solid lipid nanospheres (SLN) / G. P. Zara, R. Cavalli, A. Fundarò [et al.] // Pharmacological Research. - 1999. - Vol. 40. - № 3.

30. Daeihamed, M. A Simple and Sensitive HPLC Method for Fluorescence Quantitation of Doxorubicin in Micro-volume Plasma: Applications to Pharmacokinetic Studies in Rats / A. Haeri, S. Dadashzadeh // Iran Journal Pharm Research. - 2015.

31. Choi, S. J. Effects of myricetin on the bioavailability of doxorubicin for oral drug delivery in Rats: Possible role of CYP3A4 and P-glycoprotein inhibition by myricetin / S. J. Choi, S. C. Shin, J. S. Choi // Archives of Pharmacal Research. - 2011. - Vol. 34. - № 2.

32. Pharmacokinetics and biodistribution of RGD-targeted doxorubicin-loaded nanoparticles in tumor-bearing mice / D. C. Bibby, J. E. Talmadge, M. K. Dalai [et al.] // International Journal of Pharmaceutics. - 2005. - Vol. 293. - № 1-2.

Изобретение относится к области аналитической химии. Раскрыт способ количественного определения доксорубицина в биологических образцах, включающий выделение доксорубицина из биологических образцов путем жидкостной экстракции органической фазой, а именно смесью метанола, 37% НСl и диметилсульфоксида в объемном соотношении 5:5:7, идентификацию доксорубицина путем записи его характерного спектра флуоресценции и получение значений интенсивностей флуоресценции доксорубицина из биологических образцов на λ=595 нм при возбуждении светом с λ=495 нм для определения концентрации доксорубицина в биологическом образце, представляющем собой плазму крови или гомогенаты органов или тканей. Изобретение обеспечивает высокую степень извлечения препарата, высокий нижний предел обнаружения и количественного определения, наличие необходимой линейности, точности и прецизионности. 17 ил., 3 табл.

Способ количественного определения доксорубицина в биологических образцах, включающий выделение доксорубицина из биологических образцов путем жидкостной экстракции органической фазой, а именно смесью метанола, 37% НСl и диметилсульфоксида в объемном соотношении 5:5:7, идентификацию доксорубицина путем записи его характерного спектра флуоресценции и получение значений интенсивностей флуоресценции доксорубицина из биологических образцов на λ=595 нм при возбуждении светом с λ=495 нм для определения концентрации доксорубицина в биологическом образце, представляющем собой плазму крови или гомогенаты органов или тканей.