БИОЛОГИЧЕСКИЙ АГЕНТ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА УРОВНЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ОПУХОЛЕВОЙ ДНК И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/574 C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике в области онкологии, и может быть использовано для повышения точности и воспроизводимости количественного анализа уровня опухолевой ДНК в образцах биоматериала для жидкостной биопсии при онкологических заболеваниях.

Уровень техники

Онкологические заболевания являются одной из ключевых проблем современного здравоохранения. По данным Международного агентства по изучению рака, в 2020 году по всему миру было зарегистрировано 19,3 млн новых случаев рака, а также 10 млн смертей, ассоциированных с ним [Sung H., Ferlay J., Siegel R.L. et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. // CA: a cancer journal for clinicians. 2021. Vol. 3(71). P. 209-249. DOI:10.3322/caac.21660]. Известно, что выживаемость онкологических больных тем выше, чем раньше был поставлен соответствующий диагноз [Loud J.T., Murphy J. Cancer Screening and Early Detection in the 21(st) Century. // Seminars in oncology nursing. 2017. Vol. 2(33). P. 121-128. DOI:10.1016/j.soncn.2017.02.002]. Раннее выявление опухоли также способствует значительному снижению затрат на терапию пациента [Blumen H., Fitch K., Polkus V. Comparison of Treatment Costs for Breast Cancer, by Tumor Stage and Type of Service. // American health & drug benefits. 2016. Vol. 1(9). P. 23-32. DOI:10.1371/journal.pone.0207993].

В настоящее время золотым стандартом диагностики злокачественных новообразований является биопсия с последующим гистологическим/гистохимическим исследованием. Этот подход незаменим для классификации опухоли по стадии и типу. Однако в ряде случаев проведение биопсии затруднено, например, при глиобластомах и выраженных диссеминированных метастазах. Также использование биопсии для столь необходимой ранней диагностики рака нецелесообразно не только из-за высокой инвазивности метода, но и из-за того, что на этом этапе опухоль может быть еще не сформирована и прицельный забор биоматериала невозможен. Тем не менее для некоторых видов онкологических заболеваний существуют широко используемые подходы к скринингу, например, маммография при раке молочной железы и анализ уровня простатспецифического антигена при раке простаты, однако они характеризуются довольно низкими чувствительностью и специфичностью [Catalona W.J. Prostate Cancer Screening. // The Medical clinics of North America. 2018. Vol. 2(102). P. 199-214. DOI:10.1016/j.mcna.2017.11.001].

Не менее важным с клинической точки зрения является мониторинг активности опухолевого процесса, будь то регрессия новообразования на фоне терапии или рост опухоли с метастазированием. На данный момент для этого преимущественно используются различные методы визуализации, включающие лучевую диагностику, магнитно-резонансную томографию и ультразвуковое исследование. Использование подобных методов сопряжено с низкой воспроизводимостью, ввиду субъективности анализа, а также требует участия высококвалифицированного персонала [Yoon S.H., Kim K.W., Goo J.M., Kim D.-W., Hahn S. Observer variability in RECIST-based tumour burden measurements: a meta-analysis. // European journal of cancer (Oxford, England: 1990). 2016. (53). P. 5-15. DOI:10.1016/j.ejca.2015.10.014.].

Вышеперечисленных недостатков традиционных подходов к диагностике и мониторингу онкологического процесса лишена современная техника выявления дериватов опухоли в биологических жидкостях организма - жидкостная биопсия. Данный подход уже зарекомендовал себя как крайне перспективная альтернатива традиционной биопсии в отношении диагностики онкологических заболеваний [Zhu Y., Zhang H., Chen N., Hao J., Jin H., Ma X. Diagnostic value of various liquid biopsy methods for pancreatic cancer: A systematic review and meta-analysis. // Medicine. 2020. Vol. 3(99). P. e18581. DOI:10.1097/MD.0000000000018581]. Наиболее распространенным направлением жидкостной биопсии является анализ внеклеточной опухолевой ДНК (воДНК), выявляемой по характерным для злокачественного новообразования мутациям или изменениям паттернов метилирования и представляющая собой небольшие фрагменты ДНК размером 50-150 пар оснований. Однако нерешенным вопросом остается выбор способа представления результатов количественного анализа воДНК: абсолютный в виде копий (или единиц массы) на единицу объема или нормализованный по уровню какого-либо иного маркера.

Из уровня техники известен способ абсолютного отображения результатов количественного анализа воДНК [Патент US7888008B2; Method for the detection of cancer], по которому уровень воДНК, измеренный с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, представляется в виде нг в 1 мл плазмы пациента. Ключевым недостатком данного способа является низкая воспроизводимость результатов, ограничиваемая воспроизводимостью самого процесса выделения ДНК из плазмы, а также влиянием погрешности пипетирования на стадиях внесения биологического образца, элюирования ДНК и внесения раствора ДНК в реакционную смесь. Не менее значимым является то, что данный способ подразумевает калибровку при помощи серийных разведений стандартных образцов ДНК, что также снижает воспроизводимость результатов, так как анализ серийных разведений стандартных образцов ДНК в равной степени связан с погрешностью пипетирования на разных стадиях их подготовки. Ограниченная воспроизводимость подобного абсолютного подхода к представлению результатов количественного анализа воДНК в образцах биоматериала онкологических больных затрудняет не только сравнение данных между разными лабораториями, но и процесс регулярного мониторинга уровня воДНК в рамках цикла химиотерапии для оценки степени ответа на лечение.

Так, из уровня техники известен способ абсолютного представления результатов количественного анализа воДНК [Seremet T., Jansen Y., Planken S. et al. Undetectable circulating tumor DNA (ctDNA) levels correlate with favorable outcome in metastatic melanoma patients treated with anti-PD1 therapy // Journal of Translational Medicine 2019. Vol. 1(17). P. 1-13. DOI:10.1186/S12967-019-2051-8], в соответствии с которым уровень воДНК представляется в виде копий на 1 мл плазмы пациента. Данный способ подразумевает абсолютный количественный анализ при помощи метода цифровой капельной ПЦР, который не нуждается в серийных разведениях какого-либо стандартного раствора для калибровки. Тем не менее воспроизводимость количественного анализа по данному способу все же подвержена влиянию ряда вышеназванных факторов, таких как ограниченная воспроизводимость процесса выделения ДНК из биоматериала, а также погрешностям пипетирования на разных стадиях. Обозначенные недостатки способа нашли отражение в низкой корреляции уровня воДНК в плазме с размером злокачественного новообразования (коэффициент корреляции составил всего 0,32, что соответствует крайне слабой положительной корреляции).

Из уровня техники также известен способ нормализации уровня опухолевой ДНК по уровню метилированного гена ZDHHC1 [Патент EP3230476B1; ZDHHC1 for normalizaing methylation detection assays]. Данный способ подразумевает, что определенный с помощью количественной ПЦР уровень биомаркера с характерным для желудочно-кишечных злокачественных новообразований паттерном метилирования будет нормализован по уровню метилированного гена ZDHHC1. Недостатком данного способа является тот факт, что метилированный ген ZDHHC1 не присутствует (или крайне малочисленен) в крови и плазме пациентов без метастатического рака. Следовательно, нормализация по его уровню в данном биоматериале невозможна, однако такой способ подходит для образцов фекалий и ткани. Также стоит отметить, что данный способ нормализации воДНК подходит только для анализа по паттернам метилирования и не применим для выявления воДНК по мутациям, характерным для опухолевых клеток.

Из уровня техники известен и способ представления результатов количественного анализа воДНК в виде доли воДНК от уровня общей ДНК в биоматериале [Jain M., Kamalov D., Tivtikyan A. et al. Urine TERT promoter mutations-based tumor DNA detection in patients with bladder cancer: A pilot study // Molecular and Clinical Oncology 2021. Vol. 15 (253). DOI:10.3892/mco.2021.2415]. В соответствии с данным способом уровень воДНК в моче измеряется по мутациям в промоторе гена TERT, а затем делится на сумму уровней воДНК и ДНК дикого типа и представляется в виде фракции (%). Данный способ подразумевает цифровую капельную ПЦР в качестве метода количественного анализа. Относительный характер представления данных избавляет способ от влияния погрешности пипетирования или ограниченной воспроизводимости процесса выделения ДНК из биоматериала. Однако корреляция фракции воДНК с размером злокачественного новообразования была статистически незначимой. Причиной этому может являться влияние так называемого эффекта Варбурга [Meng W., Hao Y., He C. et al. Exosome-orchestrated hypoxic tumor microenvironment // Molecular Cancer. 2019. Vol. 1(18). DOI:10.1186/S12943-019-0982-6], который приводит к закислению окружающей опухоль ткани и к выделению из нее ДНК дикого типа в ходе апоптоза или активной секреции, ассоциированной с репаративными процессами. В результате значение фракции воДНК оказывается заниженным, ведь чем больше опухоль, тем более явным оказывается данный эффект, и вместе с ростом числителя в формуле вычисления фракции воДНК растет и знаменатель.

Таким образом, в настоящее время существует необходимость в разработке способа нормализации уровня воДНК в биоматериале для жидкостной биопсии при онкологических заболеваниях, лишенного всех вышеперечисленных недостатков.

Техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в необходимости разработки способа нормализации уровня воДНК в образцах биоматериала для количественного анализа с применением жидкостной биопсии, отличающегося от аналогов возможностью применения в любом жидком биоматериале, устойчивостью к влиянию каких-либо эндогенных факторов в организме пациента, ограниченной воспроизводимости процесса выделения нуклеиновых кислот из биоматериала и погрешностям пипетирования, а также повышающего способность уровня воДНК отражать размер злокачественного новообразования.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение нормализованного значения концентрации воДНК в биоматериале пациента с онкологическим заболеванием, коррелирующего с размером опухоли в большей степени, чем значения концентрации воДНК, представляемые по известным из уровня техники способам (табл. 2), и пригодного для мониторинга ответа на терапию и прогрессирования заболевания.

Техническая проблема решается за счет создания набора реагентов, включающего синтетический фрагмент ДНК - биологический агент (представлен отдельными прямой и обратной цепями ДНК с последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2), используемый в качестве экзогенного контроля эффективности выделения ДНК из биоматериала, последовательность которого не встречается в организме человека и размер которого имитирует средний размер фрагментов воДНК, пару олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченый зонд для детектирования синтетического фрагмента ДНК.

Также техническая проблема решается набором для проведения цифровой полимеразной цепной реакции, включающий заявляемый биологический агент и прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 соответственно, а также олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд с последовательностью SEQ ID NO: 5.

Техническая проблема также решается способом нормализации уровня воДНК в биоматериале для жидкостной биопсии, включающим:

- ренатурацию прямой и обратной цепей синтетического фрагмента ДНК путем их смешивания в соотношении 1:1 и последующих нагревания и медленного охлаждения;

- добавление ренатурировавшего синтетического фрагмента ДНК в жидкий биоматериал в заведомо известной концентрации перед процедурой выделения нуклеиновых кислот;

- выделение нуклеиновых кислот из исследуемого образца любого жидкого биоматериала любым известным из уровня техники способом, например, с использованием сорбционной колонки или магнитных частиц [Pandoh P., Corbett R., McDonald H. et al. A high-throughput protocol for isolating cell-free circulating tumor DNA from peripheral blood // Biotechniques. 2019 Vol. 66(2). P. 85-92. DOI: 10.2144/btn-2018-0148];

- проведение любой известной из уровня техники вариации цифровой ПЦР, например, цифровой капельной ПЦР или цифровой ПЦР на чипах [Quan P., Sauzade M., Brouzes E. dPCR: A Technology Review // Sensors. 2018 Vol. 18(4) P. 1271. DOI: 10.3390/s18041271], с количественным определением уровня синтетического фрагмента ДНК в образце, добавленного в биоматериал в качестве экзогенного контроля, с использованием заявляемых в данном документе олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченого зонда, специфичных к заявляемому синтетическому фрагменту ДНК;

- расчет значения коэффициента экстракции (К_Э) ДНК в соответствии со следующей формулой:

К_Э = (С_К2 × V_Э/Б) / (С_К1 × V_Б/М),

где К_Э - коэффициент экстракции ДНК, С_К2 - концентрация экзогенного контрольного фрагмента ДНК в растворе ДНК (копии на 1 микролитре раствора ДНК), V_Э/Б - объем элюирующего буфера, использованного при выделении ДНК (микролитры), С_К1 - концентрация экзогенного контрольного фрагмента ДНК (копии в 1 миллилитре биоматериала), V_Б/М - объем биоматериала, из которого выделялась ДНК (миллилитры);

- определение уровня воДНК в образце любым известным из уровня техники способом, например, при помощи секвенирования нового поколения или цифровой ПЦР [Cisneros-Villanueva, M., Hidalgo-Pérez, L., Rios-Romero, M. et al. Cell-free DNA analysis in current cancer clinical trials: a review // Br J Cancer. 2022. Vol. 126. P. 391-400. DOI: 10.1038/s41416-021-01696-0];

- нормализация определенного уровня воДНК по уровню экзогенного контрольного фрагмента ДНК путем деления уровня воДНК на рассчитанный коэффициент экстракции ДНК.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими чертежами.

На фиг. 1 представлены результаты определения линейности количественного анализа уровня заявляемого синтетического фрагмента ДНК. По оси X отложены ожидаемые значения концентрации синтетического фрагмента ДНК, полученные в ходе разведения исходного раствора синтетического фрагмента ДНК. По оси Y отложены экспериментально полученные значения концентрации синтетического фрагмента ДНК в заданных разведениях, определенные по заявляемому способу. Пунктирной линией проведена кривая линейной апроксимации.

На фиг. 2 представлены результаты цифровой капельной ПЦР с целью количественного анализа уровня синтетического фрагмента ДНК в образце ДНК, выделенной из плазмы пациента, полученной за 2 дня до проведения химиотерапии (пример 1). По оси Х отложены капли эмульсии, сгенерированной в ходе цифровой капельной ПЦР. По оси Y отложена интенсивность флуоресценции по каналу FAM, соответствующему флуоресцентно меченому зонду по заявляемому способу. Точки, находящиеся выше порогового значения 2875 ЕД, соответствуют каплям эмульсии, в которые попали синтетические фрагменты ДНК.

На фиг. 3 представлены результаты цифровой капельной ПЦР с целью количественного анализа уровня синтетического фрагмента ДНК в образце ДНК, выделенной из плазмы пациента, полученной через 2 недели после завершения химиотерапии (пример 1). По оси Х отложены капли эмульсии, сгенерированной в ходе цифровой капельной ПЦР. По оси Y отложена интенсивность флуоресценции по каналу FAM, соответствующему флуоресцентно меченому зонду по заявляемому способу. Точки, находящиеся выше порогового значения 2875 ЕД, соответствуют каплям эмульсии, в которые попали синтетические фрагменты ДНК.

На фиг. 4 представлены результаты цифровой капельной ПЦР с целью количественного анализа уровня синтетического фрагмента ДНК в образце ДНК, выделенной из желчи пациента (пример 2). По оси Х отложены капли эмульсии, сгенерированной в ходе цифровой капельной ПЦР. По оси Y отложена интенсивность флуоресценции по каналу FAM, соответствующему флуоресцентно меченому зонду по заявляемому способу. Точки, находящиеся выше порогового значения 2875 ЕД, соответствуют каплям эмульсии, в которые попали синтетические фрагменты ДНК.

Осуществление изобретения

Для разработки способа нормализации уровня воДНК в биоматериале для жидкостной биопсии при онкологических заболеваниях был создан синтетический фрагмент ДНК длинной 88 пар оснований, представленный в виде двух комплементарных друг другу цепей ДНК:

5’-GTA CGA GGA GAA TTG ACC TCC AAA TCC TGA TCG TGA CTA CAG GTC GTC GTT CGG AGC TGT GGA AGA GTT TTG AAA ATC TTC GAC CAT G-3’ (SEQ ID NO: 1);

5’- CAT GGT CGA AGA TTT TCA AAA CTC TTC CAC AGC TCC GAA CGA CGA CCT GTA GTC ACG ATC AGG ATT TGG AGG TCA ATT CTC CTC GTA C-3’ (SEQ ID NO: 2).

Вышеуказанная последовательность синтетического фрагмента ДНК не встречается ни в геноме человека, ни в геномах прочих организмах, чей генетический материал может тем или иным способом попасть в организм человека (от представителей микрофлоры, от патогеных микроорганизмов и т.п.). Размер данного фрагмента ДНК в 88 пар оснований соответствует таковому у фрагментов воДНК (50-150 пар оснований), поэтому эффективность его экстракции из биоматериала будет отражать и эффективность экстракции воДНК из того же биоматериала. Синтетический фрагмент ДНК может быть получен любым из известных из уровня техники способом, например, прямым синтезом на супер-парамагнитных частицах [Jensen M., Akhras M., Fukushima M., et al. Direct oligonucleotide synthesis onto super-paramagnetic beads // J Biotechnol. 2013 Vol. 167(4). P. 448-53. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2013.08.006].

С целью ренатурации заявляемого синтетического фрагмента ДНК из двух комплементарных цепей необходимо смешать равные объемы растворов одноцепочечных молекул ДНК (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2), представленных в равных концентрациях, нагреть смесь до температуры 98°С и выдерживать в течение 5 минут, затем охладить до комнатной температуры, полученный раствор двуцепочечного фрагмента ДНК может быть заморожен при температуре от -20°С до -80°С.

Количественный анализ уровня заявляемого синтетического двуцепочечного фрагмента ДНК может быть осуществлен при помощи любого известного из уровня техники метода цифровой ПЦР. Для этого были разработаны последовательности олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов, специфичных к заявляемому синтетическому фрагменту ДНК, которые могут быть синтезированы и мечены любым известным из уровня техники способом, например, в ходе прямого синтеза с постсинтетическим конъюгированием флуоресцентной метки [Zearfoss N., Ryder S. End-labeling oligonucleotides with chemical tags after synthesis // Methods Mol Biol. 2012. Vol. 941. P. 181-93.DOI: 10.1007/978-1-62703-113-4_14].

Прямой праймер: 5’-GTA CGA GGA GAA TTG ACC-3’ (SEQ ID NO: 3);

Обратный праймер: 5’-CAT GGT CGA AGA TTT TCA AA-3’ (SEQ ID NO: 4);

Зонд: 5’-6-FAM-TC CGA ACG ACG ACC TGT AG-BHQ-1-3’ (SEQ ID NO: 5).

Рекомендуемая концентрация заявляемых олигонуклеотидных праймеров (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4) в конечном растворе для цифровой ПЦР составляет по 0,8 мкмоль/л. Рекомендуемая концентрация заявляемого флуоресцентно меченого зонда (SEQ ID NO: 5) в конечном растворе для цифровой ПЦР составляет 0,25 мкмоль/л.

С целью определения наиболее оптимальных температурных условий количественного анализа заявляемого синтетического двуцепочечного фрагмента ДНК была проведена серия экспериментов с использованием цифровой капельной ПЦР (Bio-Rad, США). В соответствии с рекомендациями производителя был выбран температурный протокол амплификации: инкубация при 95°С - не менее 5 мин, 40 циклов денатурации при 94°С - 30 с и отжига / элонгации при Т°С - 60 с, инкубация при 98°С - 10 мин, где Т°С соответствует температурному градиенту от лунки к лунке планшета в диапазоне от 50°С до 64°С в шагом в 2°С. Результаты цифровой капельной ПЦР представлены в табл. 1. В качестве наиболее оптимальной температуры отжига / элонгации при цифровой капельной ПЦР с использованием заявляемых олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов, специфичных к заявляемому синтетическому фрагменту ДНК, была избрана температура 52°С.

Таблица 1
Результаты цифровой капельной ПЦР с температурным градиентом для подбора оптимальный условий амплификации заявляемого синтетического фрагмента ДНК № Температура отжига / энлонгации Амплификация I_{FAM-ПОРОГ} 1 64°С - н/д 2 62°С - н/д 3 60°С - н/д 4 58°С - н/д 5 56°С + 2297 ЕД 6 54°С + 2213 ЕД 7 52°С + 2875 ЕД* 8 50°С + 2236 ЕД

Примечание. I_{FAM-ПОРОГ} - пороговое значение интенсивности флуоресценции по каналу FAM от флуоресцентно меченого зонда (SEQ ID NO: 5) при количественном анализе заявляемого синтетического фрагмента ДНК, разделяющее положительный и отрицательный кластеры капель эмульсии; н/д - нет данных; * - наибольшее значение I_{FAM-ПОРОГ}.

При заданных условиях цифровой капельной ПЦР была определена линейность количественного анализа заявляемого синтетического двуцепочечного фрагмента ДНК. Для этого проводилась серия экспериментов с внесением заявляемого синтетического двуцепочечного фрагмента ДНК в разных концентрациях в реакционную смесь для цифровой капельной ПЦР. Результаты определения линейности количественного анализа представлены на фиг. 1. Коэффициент линейности (R²) составил 0,99.

Для валидации заявляемого способа нормализации уровня воДНК в образцах биоматериала для жидкостной биопсии он был применен в 35 образцах плазмы от пациентов с протоковой аденокарциномой поджелудочной железы. воДНК выявлялась в ходе цифровой капельной ПЦР по мутациям в гене KRAS в кодонах 12, 13 и 61. Затем проводилось определение корреляции уровня воДНК, представленного в виде абсолютного значения (копии на мл плазмы), фракции (%) и нормализованного значения по уровню экзогенного синтетического фрагмента ДНК по заявляемому способу, с размером опухоли по данным КТ и уровнем биомаркера СА 19-9, определенного методом иммуноферментного анализа. В табл. 2 представлены результаты корреляционного анализа методом Спирмена.

Таблица 2
Корреляция результатов жидкостной биопсии плазмы с параметрами опухоли Абс. уровень воДНК (копии/мл) Фракция воДНК (%) Нормализ. уровень воДНК (копии/мл) ρ P ρ P ρ P CA 19-9 (ЕД/мл) 0,402 <0,05 0,286 >0,05 0,425 <0,05 Размер опухоли (см³) 0,399 <0,05 0,198 >0,05 0,484 <0,05

Примечание. Абс. - абсолютный, воДНК - внеклеточная опухолевая ДНК, нормализ. - нормализованный (по заявляемому способу).

Ниже представлено более детальное описание заявляемого способа, которое не ограничивает объем притязаний заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.

1) Для ренатурации заявляемого синтетического фрагмента ДНК из двух комплементарных цепей необходимо смешать равные объемы растворов одноцепочечных молекул ДНК (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2), представленных в равных концентрациях, нагреть смесь до температуры 98°С и выдерживать в течение 5 минут, затем охладить до комнатной температуры, полученный раствор двуцепочечного фрагмента ДНК может быть использован сразу или заморожен при температуре от -20°С до -80°С.

2) Предпочтительно вносить ренатурировавший синтетический фрагмент ДНК в жидкий биоматериал для последующего выделения нуклеиновых кислот в отношении 1000 копий на 10 мкл элюирующего буфера.

3) Для предотвращения чрезмерного разбавления биоматериала предпочтительно вносить ренатурировавший синтетический фрагмент ДНК в виде раствора с концентрацией не менее 1000 копий/мкл.

4) Нормализацию воДНК по заявляемому способу допустимо проводить в любой биологической жидкости - субстрате для жидкостной биопсии, а также в различных смывах с поверхности слизистой оболочки органов или игл для биопсии.

5) Нормализацию воДНК по заявляемому способу допустимо проводить при выделении нуклеиновых кислот из биоматериала для жидкостной биопсии с использованием любого известного из уровня техники набора реагентов и расходуемых материалов при соблюдении всех рекомендаций производителя.

6) Определение уровня заявляемого синтетического фрагмента ДНК допустимо проводить с использованием любого известного из уровня техники метода цифровой ПЦР.

7) Предпочтительно в реакционную смесь для цифровой ПЦР вносить заявляемые олигонуклеотидные праймеры (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4) в конечной концентрации 0,8 мкмоль/л, а заявляемый флуоресцентно меченый зонд (SEQ ID NO: 5) в конечной концентрации 0,25 мкмоль/л.

8) Предпочтительно для цифровой ПЦР использовать двуступенчатый протокол амплификации, рекомендуемый производителем, с этапом отжига / элонгации при температуре 52°С в течение 60 с.

9) Расчет значения коэффициента экстракции (К_Э) ДНК необходимо проводить в соответствии со следующей формулой:

К_Э = (С_К2 × V_Э/Б) / (С_К1 × V_Б/М),

где К_Э - коэффициент экстракции ДНК, С_К2 - концентрация экзогенного контрольного фрагмента ДНК в растворе ДНК (копии на 1 микролитре раствора ДНК), V_Э/Б - объем элюирующего буфера, использованного при выделении ДНК (микролитры), С_К1 - концентрация экзогенного контрольного фрагмента ДНК (копии в 1 миллилитре биоматериала), V_Б/М - объем биоматериала, из которого выделялась ДНК (миллилитры);

10) Определение уровня воДНК для последующей нормализации по заявляемому способу допустимо проводить любым известным из уровня техники способом.

11) Нормализацию уровня воДНК необходимо проводить путем деления уровня воДНК на рассчитанный коэффициент экстракции ДНК.

Пример 1

Пациент А., женщина, 68 лет, диагноз: протоковая аденокарцинома поджелудочной железы с метастазами. Были собраны образцы периферической крови в объеме 10 мл за 2 дня до начала химиотерапевтического вмешательства и через 2 недели после его завершения. ДНК выделялось из 2 образцов по 5 мл плазмы, в которую предварительно было добавлено по 5 мкл раствора заявляемого синтетического фрагмента ДНК в концентрации 1000 копий/мкл, объем элюирования ДНК составил по 50 мкл. В полученных растворах был проведен количественный анализ уровня заявляемого синтетического фрагмента ДНК методом цифровой капельной ПЦР в соответствии с заявляемым способом.

Концентрация синтетического фрагмента ДНК в образце, полученном до начала химиотерапии, составила 11,52 копий/мкл (фиг. 2), а в образце, полученном после химиотерапии - 6,65 копий/мкл (фиг. 3). Уровень воДНК в обоих образцах оценивался при помощи цифровой капельной ПЦР по мутации гена KRAS в кодонах 12 и 13. Уровень воДНК на единицу объема плазмы составил 51,36 копий/мл в образце, полученном до начала химиотерапии, и 40,21 копий/мл в образце, полученном после химиотерапии. Данные значения для каждого из образцов были подставлены в формулу расчета коэффициента экстракции ДНК по заявляемому способу. Для образца до начала химиотерапии:

К_Э = (11,52 × 50) / (1000 × 5) = 0,115.

Для образца, полученного после химиотерапии:

К_Э = (6,65 × 50) / (1000 × 5) = 0,067.

Уровни воДНК в образцах до и после химиотерапии, измеренные при помощи цифровой капельной ПЦР, в соответствии с заявляемым способом были разделены на соответствующие значения коэффициентов экстракции ДНК. Нормализованные по заявляемому способу уровни воДНК в образцах до и после химиотерапии оказались равными 446,61 копий/мл и 600,15 копий/мл соответственно. Таким образом, после завершения курса химиотерапии произошло увеличение нормализованного по заявляемому способу уровня воДНК, что свидетельствует об отсутствии ответа на химиотерапию и о возможном прогрессировании заболевания. Рутинно применяемые методики мониторинга ответа на химиотерапию, включающие компьютерную томографию и анализ уровня биомаркера СА 19-9 в сыворотке также не выявили успешный ответ на лечение. В то же время использование ненормализованных абсолютных значений уровня воДНК свидетельствовало бы о снижении уровня воДНК после химиотерапии, что бы не согласовалось с результатами рутинно применяемых методик мониторинга ответа на химиотерапию.

Пример 2

Пациент М., женщина, 72 года, диагноз: механическая желтуха, протоковая аденокарцинома поджелудочной желез. Был собран образец желчи в ходе дренирования по медицинским показаниям в объеме 14 мл. ДНК выделялось образца супернатанта желчи объемом 4 мл, в которую предварительно было добавлено 4 мкл раствора заявляемого синтетического фрагмента ДНК в концентрации 1000 копий/мкл, объем элюирования ДНК составил 50 мкл. В полученных растворах был проведен количественный анализ уровня заявляемого синтетического фрагмента ДНК методом цифровой капельной ПЦР в соответствии с заявляемым способом.

Концентрация синтетического фрагмента ДНК в образце составила 8,30 копий/мкл (фиг. 4). Уровень воДНК оценивался при помощи цифровой капельной ПЦР по мутации гена KRAS в кодонах 12 и 13. Уровень воДНК на единицу объема желчи составил 4641 копий/мл. Данные были подставлены в формулу расчета коэффициента экстракции ДНК по заявляемому способу:

К_Э = (3,02 × 50) / (1000 × 4) = 0,037.

Уровень воДНК, измеренный при помощи цифровой капельной ПЦР, в соответствии с заявляемым способом был разделен на соответствующее значение коэффициента экстракции ДНК. Нормализованный по заявляемому способу уровень воДНК в образце оказался равным 125 432 копий/мл. Настолько большая концентрация воДНК в желчи может свидетельствовать о прорастании злокачественного новообразования в желчный проток, а не сдавлению его извне, что было подтверждено данными инструментальных методов визуализации (показана инвазия опухоли в желчный проток по данным компьютерной томографии). В то же время использование ненормализованных абсолютных значений уровня воДНК могло бы замаскировать столь значительное высвобождение воДНК в желчь.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="2022128771_Анализ

опухолевой ДНК.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-03-15">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022128771</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-07</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>57-2022</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022128771</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-07</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Московский государственный университет имени

М.В.Ломоносова&quot; (МГУ)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal state budgetary education institution of

higher education &quot;Lomonosov Moscow State University&quot;

(MSU)</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">БИОЛОГИЧЕСКИЙ АГЕНТ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ

АНАЛИЗА УРОВНЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ОПУХОЛЕВОЙ ДНК И СПОСОБ ЕГО

ПРИМЕНЕНИЯ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>88</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..88</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtacgaggagaattgacctccaaatcctgatcgtgactacaggtcgtcg

ttcggagctgtggaagagttttgaaaatcttcgaccatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>88</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..88</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catggtcgaagattttcaaaactcttccacagctccgaacgacgacctg

tagtcacgatcaggatttggaggtcaattctcctcgtac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtacgaggagaattgacc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catggtcgaagattttcaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tccgaacgacgacctgtag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описан биологический агент для проведения анализа уровня внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала. Агент представляет собой синтетический фрагмент ДНК длинной 88 пар оснований, представленный в виде двух комплементарных друг другу цепей ДНК с последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Агент используется в качестве экзогенного контроля при определении внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала. Также описан набор для проведения цифровой полимеразной цепной реакции. Набор включает описанный биологический агент и прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 соответственно, а также олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд с последовательностью SEQ ID NO: 5. Раскрыт способ анализа уровня внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала для жидкостной биопсии. Добавляют в образец реагенты из описанного набора. Выделяют ДНК из биоматериала. Проводят количественное определение внеклеточной опухолевой ДНК и количественное определение описанного агента. Проводят расчет коэффициента экстракции ДНК, используемого для нормализации уровня внеклеточной опухолевой ДНК. Изобретение может быть использовано для повышения точности и воспроизводимости количественного анализа уровня опухолевой ДНК в образцах биоматериала для жидкостной биопсии при онкологических заболеваниях. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Биологический агент для проведения анализа уровня внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала, представляющий собой синтетический фрагмент ДНК длиной 88 пар оснований, представленный в виде двух комплементарных друг другу цепей ДНК с последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 для использования в качестве экзогенного контроля при определении внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала.

2. Набор для проведения цифровой полимеразной цепной реакции, включающий биологический агент по п. 1 и прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 соответственно, а также олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд с последовательностью SEQ ID NO: 5.

3. Способ анализа уровня внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала для жидкостной биопсии, характеризующийся тем, что добавляют в образец реагенты из набора по п. 2, выделяют ДНК из биоматериала, проводят количественное определение внеклеточной опухолевой ДНК и количественное определение агента по п. 1, проводят расчет коэффициента экстракции ДНК, используемого для нормализации уровня внеклеточной опухолевой ДНК.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что перед добавлением в образец биологического материала одноцепочечные последовательности ДНК с последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 смешивают в равных концентрациях для получения биологического агента по п. 1.

5. Способ по п.3, характеризующийся тем, что для количественного анализа биологического агента по п. 1 в образце ДНК, выделенной из биоматериала, выполняют цифровую полимеразную цепную реакцию с применением прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, а также олигонуклеотидного флуоресцентно меченого зонда с последовательностью SEQ ID NO: 5, специфичных к последовательности синтетического фрагмента ДНК.

6. Способ по п.3, характеризующийся тем, что для расчета коэффициента экстракции ДНК используют формулу:

К_Э = (С_К2 × V_Э/Б) / (С_К1 × V_Б/М),

где К_Э – коэффициент экстракции ДНК, С_К2 – концентрация биологического агента в растворе ДНК (копии на 1 микролитр раствора ДНК), измеренные способом по п.3, V_Э/Б – объем элюирующего буфера, использованного при выделении ДНК (микролитры), С_К1 – концентрация экзогенного контрольного фрагмента ДНК (копии в 1 миллилитре биоматериала), V_Б/М – объем биоматериала, из которого выделялась ДНК (миллилитры).

7. Способ по п.3, характеризующийся тем, что нормализованный уровень внеклеточной опухолевой ДНК в образце биоматериала получают путем деления уровня внеклеточной опухолевой ДНК на значение коэффициента экстракции, полученного способом по п.6.