Модель аортального клапана человека ex vivo при его патологической кальцификации и ее применение Российский патент 2025 года по МПК G09B23/28 A61K33/08 A61K35/14 A61K38/28 A61K38/40 A61K31/7036 A61P9/10 

Изобретение относится к области медицины, в частности к средствам для тестирования, а именно к средству для тестирования препаратов против кальцификации кровеносных сосудов. Кальцинирующий аортальный стеноз представляет собой результат накопления кальция в створках аортального клапана. На поздних стадиях этот процесс ведет к гемодинамическим нарушениям, обуславливающим такие осложнения, как хроническая сердечная недостаточность, аритмии, внезапная сердечная смерть. [Hutcheson J. D., Aikawa E. The History of Cardiovascular Calcification Contemporary Cardiology / Springer International Publishing, 2020.C. 3–11.]. На данный момент этот процесс рассматривается как многофакторный, иначе говоря, заболевание развивается под воздействием ряда факторов (хроническое воспаление, напряжение сдвига, давление в луковице аорты, генетическая предрасположенность, нарушения метаболизма кальция и фосфора). [Kang H. Zheng, Evangelos Tzolos, Marc R. Dweck. Pathophysiology of Aortic Stenosis and Future Perspectives for Medical Therapy. Cardiology Clinics. 38 (1). 2020. 1-12. https://doi.org/10.1016/j.ccl.2019.09.010].

Многообразие причин, вызывающих аортальный стеноз, ставит перед исследователями непростую задачу по моделированию данного процесса для изучения его патогенеза и разработки медикаментозной терапии. Традиционной моделью являются культуры клеток in vitro, как первичные (интерстициальные клетки аортального клапана (VICs), клетки эндотелия аортального клапана (VECs)), так и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs). Они успешно применяются в связи с гибкостью в отношении молекулярных и омиксных исследований, укороченной средней продолжительностью эксперимента, а также возможности к сокультивированию и прямым фармакологическим и генетическим модификациям. [Rutkovskiy A, Malashicheva A, Sullivan G, Bogdanova М, Kostareva A, Stens1økken KO, Fiane A, Vaage J.. Valve Interstitial Cells: The Key to Understanding the Pathophysiology of Heart Valve Calcification // Journal of the American Heart Association. 2017. №9 (6). C. e006339.].

Недостатком метода является невозможность воспроизвести взаимодействия между клеточными популяциями клапана (в том числе не делящимися) и внеклеточным матриксом. Модель ex vivo, предусматривающая использование створок клапанов пациентов, представляется более приближенным к условиям в макроорганизме, так как сохраняются взаимодействия между популяциями клеток и внеклеточным матриксом. На данный момент существует ряд фундаментальных исследований на ex vivo моделях клапанов свиней. [Zabirnyk A, Perez MDM, Blasco М, Stensl0kken КО, Ferrer MD, Salcedo С, Vaage J. A Novel Ex Vivo Model of Aortic Valve Calcification. A Preliminary Report // Frontiers in Pharmacology. 2020. (11). C. 568764.; Aviles-Reyes A, Freires IA, Rosalen PL, Lemos JA, Abranches J. Ex vivo Model of Human Aortic Valve Bacterial Colonization // Bio-protocol. 2017. №11 (7). C. e2316.; Bogdanova M, Zabirnyk A, Malashicheva A, Semenova D, Kvitting JP, Kaljusto ML, Perez MDM, Kostareva A, Stenstokken КО, Sullivan GJ, Rutkovskiy A, Vaage J. Models and Techniques to Study Aortic Valve Calcification in Vitro, ex Vivo and in Vivo. An Overview // Frontiers in Pharmacology. 2022. (13). C. 835825.; Sadat N, Aherrahour Z, Osterloh A, Erdmann J, Fujita B, Ensminger S. Comparison of Different Calcification Media on Gene Expression Using a Porcine Aortic Valve Ex Vivo Assay Georg Thieme Verlag KG, 2023.C. DGTHG-V128].

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, было создание модели, отражающей особенности патогенеза кальцификации аортального клапана, характерные для человека, с помощью которой возможно тестирование препаратов, препятствующих кальцификации аортального клапана и кровеносных сосудов.

Задача была решена в результате обнаружения того факта, что фрагменты клапанов пациентов с кальцинирующим аортальным стенозом, полученные в результате операции по их протезированю, демонстрируют ответ на индуцирование остеогенных условий и на подавление кальцификации с помощью фармакологических антикальцифицирующих агентов.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание ех vivo модели кальцификации человеческого клапана для оценки действия средств, ингибирующих кальцификацию.

Заявленный технический результат достигается при использовании полученной модели патологической кальцификации аортального клапана включающей фрагмент створки аортального клапана пациента с кальцинирующим аортальным стенозом тяжелой степени, полученный после операции по протезированию клапанов, и культивированный в среде 5% диоксид углерода при температуре 37°С, с добавлением питательной среды, состоящей из DMEM с низким содержанием глюкозы, а также добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки, 1% инсулин-трансферрин-селена и 50 мг/мл гентамицина.

При создании изобретения были проведены исследования с использованием данной модели, при которых оценивалось подавление накопления кальция при культивировании фрагментов клапанов пациентов с кальцинирующим аортальным стенозом с помощью средства для подавления кальцификации. В качестве такого средства использовался ингибитор гамма-секретазы кренигацестат (LY3039478), антикальцифицирующие свойства которого были ранее описаны на культурах интерстициальных клеток аортального клапана пациентов с кальцинирующим аортальным стенозом [Lobov АА. Boyarskaya NV, Kachanova OS, Gromova ES, Shishkova AA, Zainullina BR, Pishchugin AS, Filippov AA, Uspensky VE, Malashicheva AB. Crenigacestat (LY3039478) inhibits osteogenic differentiation of human valve interstitial cells from patients with aortic valve calcification in vitro // Frontiers in Cardiovascular Medicine. 2022. (9). C. 969096.].

В результате исследования было обнаружено, что действие средства для подавления кальцификации при культивировании свежеиссеченных фрагментов аортальных клапанов аналогично тому, что было описано в литературе, а именно: кренигацестат (LY3039478) способен подавлять накопление кальция при культивировании фрагментов клапанов пациентов с кальцинирующим аортальным стенозом. Обнаружено, что для подавления кальцификации фрагментов клапанов требуются более высокие дозы, а именно 300-500 нМ.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами: На Фиг. 1 показаны варианты вырезки клапанов для культивирования.

a) Образец доступных для вырезки участков кальцинированного клапана;

b) Пример вырезки слабо кальцинированного клапана (без видимых кальциевых наложений);

c) Пример вырезки умеренно кальцинированного клапана (менее 1\2 площади створки клапана);

d) Пример вырезки сильно кальцинированной створки клапана (1\2 площади створки клапана).

На Фиг. 2 демонстрируется оценка накопления кальция в условиях ех

vivo

A) Спектрофотометрическая оценка клапанов в контроле, остеогенной среде (ОМ) и остеогенной среде с добавлением 100 пМ, 300 пМ, 500 пМ кренигацестата (LY3039478).

B) Морфологическая оценка накопления кальция в контроле, в остеогенной среде (ОМ), остеогенной среде с добавлением 300 пМ кренигацестата (ОМ+сге). Группы сравнивались с использованием t-критерия, *р=0,0111; **р=0,0022, ****р<0,0001.

На Фиг. 3 показана экспрессионная активность в клапане. Влияние кренигацестата (LY3039478) на RUNX2 (основной регуляторный ген остеогенной дифференцировки), CollAl (ген, кодирующий фибриллярный белок внеклеточного матрикса), АСТА2 (ген, кодирующий белок из семейства актиновых, используемый как маркер образования миофибробластов) и на маркеры эндотелиально-мезенхимного перехода (SNAIL, SLUG). ОМ - остеогенная среда; ОМ+300 пМ - остеогенная среда с добавлением 300 пМ кренигацестата. Группы сравнивались с использованием критерия Манна-Уитни, *р<0,05

Сущность и промышленная применимость настоящего изобретения поясняются следующими примерами:

Пример 1. Способ культивирования фрагментов клапанов.

В день получения цельной створки клапана производилась вырезка свободных от кальцинированных бляшек участков, целями которой является достичь максимальной однородности между фрагментами и избежать формирования повышенного кальциевого фона. Достигалось это избеганием при вырезке видимых участков кальциноза, а также области свободного края створки клапана. Варианты вырезки фрагментов створок в зависимости от степени кальциноза представлены на Фиг. 1. Все манипуляции проводились в условиях асептики с использованием стерильного оборудования. После фрагменты клапанов были рандомизированы по экспериментальным группам и размещены на 24-луночных планшетах (Corning, США). Для дальнейшего культивирования мы адаптировали антимиофибробластную среду из статьи А. Забирника и др. (Zabirnyk A, Perez MDM, Blasco М, Stenslskken КО, Ferrer MD, Salcedo С, Vaage J. A Novel Ex Vivo Model of Aortic Valve Calcification. A Preliminary Report // Frontiers in Pharmacology. 2020. (11). C. 568764.) Мы использовали среду DMEM с низким содержанием глюкозы (Gibco, США) с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Gibco, США), 1% инсулин-трансферрин-селена (Gibco, США) и 50 мг/мл гентамицина. Питательную среду меняли два раза в неделю. Перед каждым использованием готовилась новая среда. Фрагменты створок содержались условиях с содержанием 5% CO2 при температуре 37°С. Отсутствие контаминации микоплазмами проверяли с помощью количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) в соответствии с Janetzko et al. (Janetzko К, Rink G, Hecker A, Bieback K, Kliiter H, Bugert P. A Single-Tube Real-Time PCR Assay for Mycoplasma Detection as a Routine Quality Control of Cell Therapeutics // Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2014. №1 (41). C. 83-89.) Все эксперименты проводились в биологических трипликатах (клетки, выделенные минимум от трех доноров). Фрагменты створок культивировались на протяжении 8 недель для оценивания степени кальцификации, а также для гистологической и иммуногистохимической оценки. Для изучения экспрессионной активности фрагменты створок культивировались на протяжении 4 недель.

Пример 2. Способ приготовления остеогенной среды.

В экспериментальных группах, в которых создавались условия для повышенной кальцификации, мы добавляли в среду для культивирования 50 мкМ аскорбиновой кислоты, 100 нМ дексаметазона и 10 мМ р-глицерофосфата (Sigma, США). Другие условия культивирования были такими же, как и для стандартного, описанного выше; остеогенную среду также меняли два раза в неделю.

Накопление кальция определяли спектрофотометрическим методом с использованием набора "Кальций Ольвекс" (Olvex Diagnosticum, Россия) на 8-й неделе культивирования в соответствии с протоколом производителя с некоторыми изменениями. Набор Calcium Olvex предназначен для количественного измерения уровня кальция в жидкой среде колориметрическим методом (хромоген Арсеназо III). При взаимодействии ионов кальция с хромогеном Арсеназо III образуется окрашенный комплекс. Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна концентрации кальция в образце и регистрируется спектрофотометрически при длине волны 650 (640-660) нм. Фрагменты створок дважды промывались PBS, после чего были гомогенизированы механически в осцилляторе в растворе дистиллированной воды (500 мл). Использовались размольные шарики из нержавеющей стали для гомогенизации (по 2 шт. на эппендорф) и эппендорфы на 2 мл с толстым дном. Осцилляция продолжалась 30 минут, каждые 15 минут проверялось качество гомогенизации. Далее производилось центрифугирование гомогенизата на скорости 300G в течение 5 минут с целью удаления шариков и разрушенных тканей. Супернатант перемещался в новый эппендорф и был повторно центрифугирован на скорости 1000G в течение 5 минут.60 мл супернатанта помещалось в эппендорфы с 500 мл монореагента из набора «Кальций Ольвекс», после чего, согласно протоколу производителя, смесь инкубировалась 5 минут при комнатной температуре, после чего была измерена оптическая плотность опытных, калибровочной и холостой проб при длине волны 650 (640-660) нм в кювете с длиной оптического пути 1.0 см на многорежимном считывателе плашек CLARIOstar® Plus. Для расчета концентрации кальция мы использовали калибратор со стандартной концентрацией хлорида кальция 2,5 ммоль/л. Согласно протоколу производителя набора Olvex, мы рассчитали концентрацию кальция в ммоль/л по формуле: С(ненормированная)=Е (образцы)/Е (калибратор) * 2,5. Для измерения площади фрагмента (S) клапана мы использовали фотографии каждого фрагмента, которые мы делали для динамического наблюдения за накоплением кальция. Используя программу ImageJ, мы измерили площадь фрагментов на всех фотографиях в динамике и вычислили среднее арифметическое между ними (таким образом, для каждого фрагмента мы получили одно значение площади (S(среднее значение))). Затем, используя формулу С(нормализованную)=С(ненормированную)/S(среднюю), мы получили нормализованную концентрацию кальция, нормированную по площади конкретного фрагмента, то есть концентрацию кальция в ммоль/л/см2. Обработка данных проводилась с использованием Microsoft Excel и GraphPad Prism. Пример 3. Ингибиторы кальцификации

Ингибитор γ-секретазы Кренигацестат (LY3039478; Medchemexpress, США) растворяли в ДМСО (диметилсульфоксиде) до концентрации 10 мМ. Были использованы в исследованиях дозировки, показавшие минимальное число побочных эффектов у пациентов в клинических испытаниях: 100 нМ (Стах=46.444 нг\мл), 300 нМ (Стах=139,332 нг\мл), 500 нМ (Стах=232,22 нг\мл). [Azaro, A., Baldini, С, Rodon, J. et al. Phase 1 study of 2 high dose intensity schedules of the pan-Notch inhibitor crenigacestat (LY3039478) in combination with prednisone in patients with advanced or metastatic cancer. Invest New Drags 39, 193-201 (2021). https://doi.org/10.1007/sl0637-020-00944-z, Yuen, E., Posada, M., Smith, C. et al. Evaluation of the effects of an oral notch inhibitor, crenigacestat (LY3039478), on QT interval, and bioavailability studies conducted in healthy subjects. Cancer Chemother Pharmacol 83, 483-492 (2019). https://doi.org/10.1007/s00280-018-3750-1].

Пример 4. Морфологическая оценка.

На 1 день, 2, 4, 8 недели проводилось фотографирование клапанов при увеличении ЗОх. Оценивалась морфология фрагментов створок и качественная оценка кальцификации в динамике.

Пример 5. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени

Для выделения РНК мы использовали реагент extraRNA (Eurogen, Россия) в соответствии с инструкциями производителя с некоторыми изменениями. После помещения фрагментов створок в реагент extraRNA проводилась его механическая гомогенизация в эппендорфах по 2 мл с толстым дном с использованием размольных шариков из нержавеющей стали для гомогенизации (по 2 шт. на эппендорф. Осцилляция продолжалась не дольше 10 минут, каждые 5 минут проверялось качество гомогенизации. Далее производилось центрифугирование гомогенизата на скорости 1000G в течение 5 минут, после чего супернатант помещался в новые эппендорфы. Далее мы следовали протоколу производителя. После выделения мы использовали 1 мкг общей РНК для обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы MMLV (Eurogen, Россия).

ПЦР в реальном времени проводили с помощью SybrGreen qPCR mastermix "qPCRmix-HS SYBR" (Eurogene, Россия) в системе LightCycler 96 (Roshe, Швейцария) по следующей схеме:

1. денатурация перед амплификацией в течение 300 с при 95°С;

2. 45 циклов трех-ступенчатой амплификации (15 с при 95°С; 30 с при 60°С; 30 при 70°С);

3. плавление с высоким разрешением. Экспрессию генов GAPDH, RUNX2, COL1A1, SNAIL, SLUG, АСТА2 оценивали через 4 недели после индукции остеогенных условий. Уровни мРНК были нормализованы к мРНК GAPDH. Все последовательности праймеров доступны по запросу.

Пример 6. Статистика

Обработка данных, полученных с помощью спектрофотометрической оценки кальцификации и qПЦР проводилась с использованием Microsoft Excel (расчеты) и GraphPad Prism (графики, статистический анализ). Уровни оптической плотности рассчитывались с вычетом холостой пробы. Данные были проанализированы с помощью ANOVA в GraphPad Prism. При проверке нормальности использовался тест Шапиро-Уилка. Так как не все пробы прошли проверку на нормальность, статистическая значимость различий между пробами оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни. Те пробы, что прошли проверку на нормальность, также были проверены с помощью t-критерия Стьюдента. Указаны стандартные ошибки среднего значения (SEM).

Изменения в уровнях экспрессии генов-мишеней рассчитывали с использованием сравнительного метода ДАСТ. В качестве гена домашнего хозяйства использовался GAPDH. Результаты представлены в виде среднего значения технических повторений. Указаны стандартные ошибки среднего значения (SEM). Относительные уровни экспрессии сравнивали с помощью критерия Манна-Уитни в GraphPad Prism.

Мы обнаружили значимое подавление накопления кальция в пробах с 300 пМ и 500 пМ кренигацестата (Фиг. 2А). При морфологической оценке клапанов (Фиг. 2В) мы обнаружили различимое формирование кальциевых бляшек в пробах в остеогенных условиях без добавления кренигацестата. Дозировка в 100 пМ не имела значимого влияния на кальцификанию.

Для оценки влияния кренигацестата на передачу сигналов Notch в условиях ex vivo мы измерили экспрессию RUNX2 - транскрипционного фактора, регулирующего остеогенную дифференцировку. Уровень экспрессии RUNX2 был ниже в остеогенных условиях с добавлением 300 пМ кренигацестата с сравнении с контролем в дифференцировке (Фиг. 3). Эндотелиально-мезенхимный переход является потенциальным механизмом, участвующим в прогрессировании дегенеративных изменений в клапанах.

SNAIL относится к белкам эндотелиально-мезенхимного перехода, и при оценке экспрессии было выявлено его подавление в пробах с добавлением кренигацестата в сравнении с контролем в дифференцировке (Фиг. 3). Также было выявлено значимое снижение экспрессии гена АСТА2, что позволяет рассуждать об антимиофибробластной активности препарата (Фиг. 3).

Представленные результаты свидетельствуют от том, что модель патологической кальцификации аортального клапана с использоваием клапанов человека ex vivo воспроизводит процессы кальцификации на тканевом уровне и может быть использована в качестве средства для тестирования антикальцифицирующих препаратов.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине. Создают модель патологической кальцификации аортального клапана из фрагмента створки аортального клапана пациента с кальцинирующим аортальным стенозом тяжелой степени, который получают после операции по протезированию клапанов. Полученный клапан культивируют в среде 5% диоксида углерода при температуре 37 °С, с добавлением питательной среды, состоящей из DMEM с низким содержанием глюкозы, а также добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки, 1% инсулин-трансферрин-селена и 50 мг/мл гентамицина. Полученную модель применяют в качестве средства для тестирования антикальцифицирующих препаратов. Группа изобретений позволяет воспроизвести процессы кальцификации на тканевом уровне и может быть использована в качестве средства для тестирования антикальцифицирующих препаратов. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 5 пр.

1. Модель аортального клапана человека ex vivo при его патологической кальцификации, включающая фрагмент створки аортального клапана пациента с кальцинирующим аортальным стенозом тяжелой степени, полученный после операции по протезированию клапанов, и культивированный в среде 5% диоксида углерода при температуре 370 °С с добавлением питательной среды, состоящей из DMEM с низким содержанием глюкозы, а также добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки, 1% инсулин-трансферрин-селена и 50 мг/мл гентамицина.

2. Применение модели аортального клапана по п. 1, полученной после операции по протезированию клапана и культивированной в среде диоксида углерода, с добавлением питательной среды: DMEM с низким содержанием глюкозы, фетальной бычьей сыворотки, инсулин-трансферрин-селена и гентамицина, в качестве средства для тестирования антикальцифицирующих препаратов.