Способ оценки эффективности брахитерапии начальных и средних меланом хориоидеи Российский патент 2025 года по МПК G01N33/58 C12Q1/686 C12Q1/6886 A61B3/10 

Иизобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии и молекулярной биологии, и предназначено для оценки эффективности органосохраняющего лечения меланомы хориоидеи.

Меланома хориоидеи (МХ) среди меланом сосудистой оболочки глаза составляет 92-95% (Бровкина А.Ф., 2002; Damato B., 2006), является единственной первичной злокачественной опухолью хориоидеи у взрослых, которая приводит к летальному исходу при отсутствии лечения. Заболеваемость МХ в Москве составляет 8,5-13,3 человек на 1 миллион населения в год (Бровкина А.Ф., 2018; Саакян С.В. и др. Брахитерапия внутриглазных опухолей // Эффективная фармакотерапия. - 2019. - Т. 15. - №17. - С. 8-10), метастазирует только гематогенным путем, таргетными органами признаны печень (93-95%), легкие (28%). С целью персонализированного планирования и оценки эффективности лечения МХ используют метрическую классификацию (Shields J., 1983). Согласно существующим рекомендациям, локальному лечению, и, в первую очередь, брахитерапии, подлежат начальные (толщиной до 3 мм и максимальным диаметром до 10 мм) и средние (толщиной более 3 до 5 мм, максимальным диаметром более 10 до 15 мм) хориоидальные меланомы при условии отсутствия дистантных метастазов.

В качестве источника излучения с 1973 года используют отечественные офтальмоаппликаторы (ОА) с Ru/Rh-106 - бета-излучение с длиной пробега 6 мм (Бровкина А.Ф., Офтальмоонкология. Руководство для врачей. М.: Медицина, 2002). С учетом характера действия бета-излучения на опухолевые клетки эффективность проводимой брахитерапии начинают оценивать спустя 3-4 месяца после окончания лечения. В результате полной регрессии опухоли формируется ретиноопухолесклеральный рубец к 20-26 месяцу. В процессе наблюдения перед лечащим врачом встает вопрос об оценке характера “остаточного” очага - остаточная опухоль, продолженный рост или гиперплазия пигментного эпителия на поверхности сформировавшегося рубца? Именно правильная дифференциальная диагностика таких изменений позволяет верно определить дальнейшую тактику ведения пациента - динамическое наблюдение или необходимость повторного проведения лечения. В настоящий момент для контроля эффективности брахитерапии проводят тщательную визуальную оценку состояния облученного опухолевого узла, где в случае положительного эффекта лучевой терапии визуализируется появление рубцовых изменений вокруг него с формированием плоского хориоретинального рубца на месте опухолевой ткани. Объективная оценка в клинической практике может быть затруднена, в том числе по причине нарушения прозрачности оптических сред глаза вследствие таких заболеваний, как сенильная, постлучевая катаратка, гемофтальм, выраженная деструкция стекловидного тела, локализация опухоли на крайней периферии. Оценку эффективности лучевого лечения также проводят по характеру изменений метрических параметров меланомы хориоидеи с помощью УЗ-биометрии, данных ОКТ-исследования при постэкваториальной локализации опухоли. Недостатками этих методов является отсутствие возможности выявления “активных скрытых” опухолевых клеток.

В связи с этим возрастает значимость поиска иных, в том числе лабораторно-инструментальных методов исследования, позволяющих получить дополнительную информацию о состоянии внутриглазной опухоли.

Известен способ диагностики начальной увеальной меланомы, заключающийся в исследовании уровня иммуннокомпетентных клеток (нормальных киллерных клеток CД16+) в сыворотке периферической крови с помощью метода моноклональных антител и лазерной цитофлуометрии, где при их повышении за пределы нормы констатируют начальную увеальную меланому (патент RU 2147129 С1, oпубл. 27.03.2000).

Недостатками способа являются недостаточная точность диагностики, связанная с возможными ошибками при количественном подсчете клеток CD16+ в мл³.

С 2012 года с целью диагностики и оценки агрессивности МХ используют исследования уровня экспрессии микроРНК в плазме крови больного. Из аннотированных 2654 микроРНК апробированы в качестве биомаркеров увеальной меланомы 27 микроРНК как по результатам изучения ткани опухоли глаза, так и гематогенных метастазов в печень (Beasley A.B. et al, 2022). Исследован их уровень и в плазме больных меланомой, речь идет в основном об увеальной меланоме метастатического уровня развития (Triozzi P.L., 2012, Kozomara A., 2019). В исследованиях по определению возможности использования микроРНК как биомаркеров прогрессирования хориоидальной меланомы с учетом ее метрических показателей при условии отсутствия отдаленных метастазов показана бóльшая информативность по увеличению уровня экспрессии циркулирующих микроРНК-27b и микроРНК-223 (Бровкина А.Ф., Цыбикова Н.Д., 2021, 2022). Анализ работ, опубликованных в течение последних 12 лет (2012-2024 гг.) как в зарубежной, так и в отечественной литературе позволяет заключить, что четкие сведения о влиянии состояния облученного узла опухоли на уровень экспрессии панели микроРНК в плазме крови отсутствуют. Предлагаемый способ на данный момент не известен, что соответствует критерию “новизна”.

Ближайшим прототипом явился способ диагностики меланомы хориоидеи, заключающийся в исследовании уровня экспрессии микроРНК-27b в плазме крови пациентов посредством проведения ПЦР в режиме реального времени. При увеличении экспрессии микроРНК-27b на 318% диагностируют среднюю меланому хориоидеи толщиной более 3 мм до 5 мм, при увеличении экспрессии микроРНК-27b на 362% диагностируют большую меланому хориоидеи толщиной более 5 мм (Патент №2778267 C1 Российская Федерация, МПК G01N 33/58, C12Q 1/6806, C12Q 1/686. Способ диагностики меланомы хориоидеи: № 2021123797: заявл. 10.08.2021: опубл. 17.08.2022 / А. Ф. Бровкина, Н. Д. Цыбикова).

Недостатком данного способа является неизученность характера изменения его экспрессии у пациентов после проведенного органосохранного лечения.

Сущность предложенного способа оценки эффективности брахитерапии начальных и средних МХ у больных, пролеченных брахитерапией ОА с рутением-106, заключается в следующем: плазму крови, полученную путем центрифугирования в течение 10 минут при ускорении 2000 оборотов в минуту, отделяют от клеточного осадка и переносят в стерильные пробирки объемом 2 мл. Выделение суммарной РНК, включая микроРНК, проводят с использованием реагента Qiazol и набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Хильден, Германия). Концентрацию и чистоту полученной РНК оценивают на спектрофотометре для микрообъемов NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Нью-Йорк, США). Обратную транскрипцию проводят с использованием набора MiScript II RT Kit (Qiagen) в соответствии с рекомендованным протоколом. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени проводится на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Геркулес, США). Экспрессию микроРНК нормализуют относительно экзогенного контроля cel-miR-39-3p и выражают в относительных единицах равных 2-ΔCt, где ΔCt - рабочие значения изменения цикла получения продукта относительно внутреннего контроля экспрессии микроРНК cel-miR-39-3р. В качестве биомаркера с учетом наибольшей информативности, использовали микроРНК-27b (Бровкина А. Ф., Цыбикова Н. Д. МикроРНК-биомаркер агрессивности меланомы хориоидеи // Российский офтальмологический журнал. - 2022. - Т. 15. - №1. - С. 7-12). В качестве контроля были использованы результаты экспрессии микроРНК-27b волонтёров в возрасте 62,9 ± 1,42 года (45-78 лет), не имеющих ни опухолевых, ни аутоиммунных, ни хронических заболеваний в стадии суб- и декомпенсации (28 человек).

Характер экспрессии микроРНК-27b у 6 пациентов МХ (Т1-2М0N0) представлены в Таблице 1 при сроках наблюдения от 32 до 49 месяцев.

Характер экспрессии микроРНК-27b у пациентов до и после брахитерапии в отдаленные сроки

Таблица 1

МикроРНК Кол-во пациентов (n) Сроки повторного исследования (мес) Превышение уровня микроРНК до лучевого лечения (%) Снижение уровня микроРНК относительно контроля (после лучевого лечения) (%) микроРНК-27b 6 39,3±7,03 260% 106%

Представленные различия статистически достоверные (р<0,05).

На Фиг. 1 графически представлены показатели снижения уровня экспрессии микроРНК-27b в плазме крови 6 пациентов МХ при средних исходных показателях толщины опухоли 2,82±1,4мм и 0,74±0,44мм после брахитерапии ОА. Контроль после лечения проведен в среднем через 39,3±7,03 месяцев.

В качестве примера приводим одно из наших наблюдений.

Больной О. 44 лет, до лечения имел МХ размерами 2,93×8,76 мм, (Т1M0N0) (Фиг. 2 а). 18.02.2020 начата брахитерапия рутениевым ОА. Аппликатор снят 20.02.2020 года. На вершине опухоли доза облучения составила 140 Гр.

К моменту повторного исследования пациента через 36 месяцев после брахитерапии биомикроофтальмоскопически фиксировали резорбцию опухоли и четкое отграничение облученной зоны от нормальной ткани сетчатки (Фиг. 2 б).

Эхобиометрически в эти же сроки зафиксирована толщина ткани в зоне облучения равная 0,66 мм (Фиг. 3 б).

Приведенное клиническое наблюдение и эхобиометрия зоны интереса спустя 36 месяцев после БТ свидетельствуют о положительной динамике (Фиг. 4).

Таким образом, полученные результаты исследования глазного дна, УЗ-сканирование, свидетельствующие о положительной динамике проведенной терапии, и показатели снижения экспрессии микроРНК-27b в отдаленном периоде наблюдения позволяют высказать суждение о положительном эффекте БТ МХ.

Описание изображений:

Фиг. 1 - Графическое изображение уровня экспрессии микроРНК-27b до и после брахитерапии;

Фиг. 2:

а - меланома хориоидеи проминенция до 3 мм, максимальный диаметр до 9 мм, состояние до лечения;

б - глазное дно того же больного через 36 мес после облучения: опухоль резорбировала практически полностью, контурируется четкий отграничительный ретиносклеральный рубец;

Фиг. 3:

а - УЗИ-сканограмма больного О. 44 лет до брахитерапии. Размеры тени опухоли 2,93×8,76 мм;

б - УЗИ-сканограмма того же больного спустя 36 мес после лечения в зоне интереса видна достаточно интенсивная тень проминенцией 0,66 мм, что можно расценить как постлучевой рубец;

Фиг. 4 - Характер экспрессии микроРНК-27b у больного О. 44 лет до и через 36 месяцев после брахитерапии.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для оценки эффективности брахитерапии начальных и средних меланом хориоидеи. Осуществляют проведение забора крови, исследование уровня экспрессии микроРНК-27b в плазме крови пациентов посредством проведения ПЦР в режиме реального времени и биомикроофтальмоскопическое исследование пациентов. Проводят исследование уровня экспрессии микроРНК-27b у здоровых лиц и у пациентов до и после проведенной брахитерапии меланомы хориоидеи через 36 месяцев. Сравнивают полученный результат после брахитерапии с результатом до лечения и с контрольным значением, полученным у здоровых лиц. При снижении уровня экспрессии микроРНК-27b до показателя контроля, а также при формировании рубца облученной опухоли по биомикроофтальмоскопическому исследованию оценивают лечение брахитерапией как эффективное. Способ обеспечивает возможность оценки эффективности органосохраняющего лечения меланомы хориоидеи - брахитерапии, за счет биомикроофтальмоскопического исследования пациентов и исследования уровня экспрессии микроРНК-27b в крови, снижение которого ниже показателей контроля через 36 месяцев после брахитерапии позволяет не только констатировать полное формирование рубца облученной опухоли, но и исключить наличие скрытого метастазирования. 4 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ оценки эффективности брахитерапии начальных и средних меланом хориоидеи, включающий проведение забора крови, исследование уровня экспрессии микроРНК-27b в плазме крови пациентов посредством проведения ПЦР в режиме реального времени и биомикроофтальмоскопическое исследование пациентов, характеризующийся тем, что проводят исследование уровня экспрессии микроРНК-27b у здоровых лиц и у пациентов до и после проведенной брахитерапии меланомы хориоидеи через 36 месяцев, сравнивают полученный результат после брахитерапии с результатом до лечения и с контрольным значением, полученным у здоровых лиц; и при снижении уровня экспрессии микроРНК-27b до показателя контроля, а также при формировании рубца облученной опухоли по биомикроофтальмоскопическому исследованию оценивают лечение брахитерапией как эффективное.