Способ оценки риска метастазирования после энуклеации глаза с большими меланомами хориоидеи Российский патент 2024 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6886 

Изобретение относится к области офтальмоонкологии и молекулярной биологии.

Меланома хориоидеи (МХ) – единственная первичная злокачественная опухоль хориоидеи, среди меланом сосудистой оболочки глаза составляет 92-95% [Бровкина А. Ф. (ред.). Офтальмоонкология: Руководство для врачей. – Медицина, 2002; Damato B. Treatment of primary intraocular melanoma //Expert review of anticancer therapy. – 2006. – Т. 6. – №. 4. – С. 493-506], характеризуется гематогенным метастазированием. Таргетный орган - печень. МХ по метрическим характеристикам делят на начальную (толщина до 3 мм, максимальный диаметр до 10 мм), среднюю (толщина более 3 до 5 мм, максимальный диаметр более 10 до 15 мм) и большую (толщина более 5 мм, максимальный диаметр более 15 мм) (Shields J., 1983). Опухоли начальные и средние при условии отсутствия метастазов (N₀M₀) подлежат локальному органосохранному лечению. Глаза с большими МХ удаляют (энукелируют). Причина плохого витального прогноза – метастазы в печень, легкие, в связи с чем, все больные после энуклеации остаются на пожизненном диспансерном наблюдении с обязательным КТ, МРТ-исследованием печени (каждые 6 месяцев), рентгенографией, КТ или МРТ-исследованием легких (1 раз в год). Данные литературы свидетельствуют, что минимальный очаг в печени, который удается выявить с помощью МРТ или КТ с контрастным усилением, имеет размеры в максимальном диаметре от 5 мм и более [Mariani P. et al. Development of a prognostic nomogram for liver metastasis of uveal melanoma patients selected by liver MRI //Cancers. – 2019. – Т. 11. – №. 6. – С. 863]. Но это уже метастатическая болезнь, возможности лечения которой сегодня ограничены [Rodriguez-Vidal C. et al. Treatment of metastatic uveal melanoma: systematic review //Cancers. – 2020. – Т. 12. – №. 9. – С. 2557]. По данным литературы метастазирование в первые 5 лет составляет почти 50%, в последующие 10 лет – до 30%. В литературе описаны случаи гематогенного метастазирования через 40 и более лет [Shields JA, Augsburger JJ, Donoso LA, Bernardino VB Jr, Portenar M. Hepatic metastasis and orbital recurrence of uveal melanoma after 42 years. Am J Ophthalmol. 1985 Nov;100(5):666–8; Coupland SE, Sidiki S, Clark BJ, McClaren K, Kyle P, Lee WR. Metastatic choroidal melanoma to the contralateral orbit 40 years after enucleation. Arch Ophthalmol. 1996 Jun;114(6):751–6].

К настоящему времени эффективного метода лечения метастатической болезни МХ не существует. Что касается раннего выявления небольших одиночных метастазов в печень, то существуют методы хирургического лечения одиночного метастаза, выявленного с помощью МРТ [Mariani P. et al. Surgical management of liver metastases from uveal melanoma: 16 years' experience at the Institut Curie //European Journal of Surgical Oncology (EJSO). – 2009. – Т. 35. – №. 11. – С. 1192-1197; Rivoire M. et al. Treatment of liver metastases from uveal melanoma //Annals of surgical oncology. – 2005. – Т. 12. – С. 422-428; Trivedi D. B. et al. Liver resection for metastatic uveal melanoma: Experience from a supra-regional centre and review of literature //Melanoma Research. – 2023. – Т. 33. – №. 1. – С. 71-79].

Недостатком МРТ-визуализации можно считать невозможность выявления опухолевых очагов менее 5 мм в диаметре.

Кроме того, выявление скрытого метастазирования может явиться базой для разработки методов раннего таргетного лечения МХ [Yang C., Wang R., Hardy P. Potential of miRNA-Based Nanotherapeutics for Uveal Melanoma //Cancers. – 2021. – Т. 13. – №. 20. – С. 5192]. При наличии больших МХ в глазу и признаках гематогенного метастазирования бесполезно подвергать их ликвидационной операции, приносящей, как правило, психологически тяжелые переживания больному. Но энуклеация в таких случаях остается единственным паллиативным лечением при наличии симптомов вторичной болящей глаукомы.

В 2008 году появились первые публикации о роли молекул микроРНК в онкогенезе меланомы сосудистой оболочки глаза [Worley L. A. et al. Micro-RNAs associated with metastasis in uveal melanoma identified by multiplexed microarray profiling //Melanoma research. – 2008. – Т. 18. – №. 3. – С. 184-190; Yan D. et al. MicroRNA-34a inhibits uveal melanoma cell proliferation and migration through downregulation of c-Met //Investigative ophthalmology & visual science. – 2009. – Т. 50. – №. 4. – С. 1559-1565; Yang C. H., Wei W. B. The miRNA expression profile of the uveal melanoma //Science China Life sciences. – 2011. – Т. 54. – С. 351-358]. И только в 2012 году – первые публикации о возможности изучения характера экспрессии микроРНК в плазме крови больного МХ [Triozzi P. L. et al. The association of blood angioregulatory microRNA levels with circulating endothelial cells and angiogenic proteins in patients receiving dacarbazine and interferon //Journal of translational medicine. – 2012. – Т. 10. – №. 1. – С. 1-7; Triozzi P. L., Singh A. D. Blood biomarkers for uveal melanoma //Future Oncology. – 2012. – Т. 8. – №. 2. – С. 205-215]. В этих публикациях речь идет только о больных с установленной метастатической болезнью МХ. В качестве биомаркеров увеальной меланомы из аннотированных к 2023 году 2654 микроРНК апробированы 27 микроРНК по результатам изучения их активности в ткани опухоли глаза, в ткани метастазов в печень [Barbagallo C. et al. Genetics and RNA regulation of uveal melanoma //Cancers. – 2023. – Т. 15. – №. 3. – С. 775].

В нашей стране проведены исследования характера экспрессии панели микроРНК: микроРНК-223, микроРНК-27b, микроРНК-146 и микроРНК -155 в плазме крови больных МХ любого размера в условиях доказанного отсутствия дистантных метастазов (МРТ и КТ исследования печени и органов грудной клетки). Авторы указывают, что микроРНК-223 и микроРНК-27b могут быть биомаркерами активности опухолевого процесса именно МХ. Показано, что экспрессия микроРНК-27b в группе больших МХ увеличивается в 4,3 раза [Бровкина А. Ф., Цыбикова Н. Д. МикроРНК в уточнённой диагностике меланомы хориоидеи //Acta Biomedica Scientifica. – 2021. – Т. 6. – №. 6-1. – С. 65-73; Бровкина А. Ф., Цыбикова Н. Д. МикроРНК—биомаркер агрессивности меланомы хориоидеи //Российский офтальмологический журнал. – 2022. – Т. 15. – №. 1. – С. 7-12].

В литературе, посвященной вопросам диагностики и лечения злокачественных опухолей, появились первые сведения об изменении профиля экспрессии ряда микроРНК в плазме крови больных раком молочной железы, легких, колоректального рака, рака слизистых оболочек рта как до, так и после хирургического лечения или химиотерапии [Jung, E. J., Santarpia, L., Kim, J., Esteva, F. J., Moretti, E., Buzdar, A. U., Leo, A.D., Le, X., Bast, R. C., Park, S., Pusztai, L., & Calin, G. A. 2012. Plasma microRNA 210 levels correlate with sensitivity to trastuzumab and tumor presence in breast cancer patients. Cancer, 118(10), 2603-2614; Leidinger P, Keller A, Backes C, Huwer H, Meese E. MicroRNA expression changes after lung cancer resection: a follow-up study. RNA Biol. 2012 Jun;9(6):900-10. doi: 10.4161/rna.20107. Epub 2012 Jun 1. PMID: 22664918; Fang, Z., Tang, J., Bai, Y., Lin, H., You, H., Jin, H., Zhang, Z. Y. 2015. Plasma levels of microRNA-24, microRNA-320a, and microRNA-423-5p are potential biomarkers for colorectal carcinoma. Journal of experimental & clinical cancer research, 34(1), 1-10; Piao Y., Jung, S. N., Lim, M. A., Oh, C., Jin, Y. L., Kim, H. J., Koo, B. S. A circulating microRNA panel as a novel dynamic monitor for oral squamous cell carcinoma //Scientific Reports. – 2023. – Т. 13. – №. 1. – С. 2000].

Что касается МХ, то публикации по этому вопросу в литературе отсутствуют (проанализирована литература за последние 11 лет по базам PubMed, Medline, Elibrary).

Сущность предложенного способа оценки риска метастазирования после энуклеации глаза с большими меланомами хориоидеи заключается в следующем: плазму крови, полученную путем центрифугирования в течение 10 минут при ускорении 2000 оборотов в минуту, отделяют от клеточного осадка и переносят в стерильные пробирки объемом 2 мл. Выделение суммарной РНК, включая микроРНК, проводят с использованием реагента Qiazol и набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Хильден, Германия). Концентрацию и чистоту полученной РНК оценивают на спектрофотометре для микрообъемов NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Нью-Йорк, США). Обратную транскрипцию проводят с использованием набора MiScript II RT Kit (Qiagen) в соответствии с рекомендованным протоколом. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени проводится на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Геркулес, США). Экспрессию микроРНК нормализуют относительно экзогенного контроля cel-miR-39-3p и выражают в относительных единицах равных 2–ΔCt, где ΔCt – рабочие значения изменения цикла получения продукта относительно внутреннего контроля экспрессии микроРНК cel-miR-39-3р. Статистический анализ полученных данных проводят с помощью стандартных методов статистической обработки. Критический уровень значимости принимают равным 5%, нулевую гипотезу отвергают при p<0,05. Уровень экспрессии микроРНК рассчитывают в процентах по отношению к контролю, который принимают за 100%.

В качестве биомаркера с учетом наибольшей информативности [Бровкина А. Ф., Цыбикова Н. Д. МикроРНК—биомаркер агрессивности меланомы хориоидеи //Российский офтальмологический журнал. – 2022. – Т. 15. – №. 1. – С. 7-12] использовали микроРНК-27b. В качестве контроля были использованы результаты экспрессии микроРНК-27b 28 волонтёров в возрасте 62,9±1,42 года (45-78 лет). Результаты исследования представлены в таблице 1.

Характер экспрессии микроРНК-27b с учетом возможного появления метастазов при меланоме хориоидеи

Таблица 1

Стадия заболевания Кол-во пациентов (n) Сроки повторного исследования (мес) Уровень микроРНК-27b (%) до энукелации (средние показатели) Уровень микроРНК-27b (%) в послеоперационном периоде Т_3-4N₀M₀ 77 29,7±19,7 453,5±212,6 74±193 Т_3-4N₀M_{1
(метастазы в печень)} 6 30,4±14,2 М 936 (Q1-Q3: 626-1324)

Представленные различия статистически достоверные (р<0,05)

Представленные таблица и график (Фиг.1) иллюстрируют снижение экспрессии микроРНК-27b по сравнению с дооперационным периодом. В группе больных МХ N₀M₀. Разница уровня экспрессии микроРНК-27b в плазме крови больных после операции без метастазов и при наличии метастазов достоверна. В группе больных (6 человек) в процессе наблюдения с выявленными через 6-45 месяцев после операции метастазами в печень наблюдалось увеличение экспрессии микроРНК-27b в плазме крови в 1,7 – 3,9 раза по сравнению с предоперационными показателями, а также в 2 – 17 раз выше уровня экспрессии группы контроля. В результате ROC-анализа диагностической значимости чувствительность микроРНК-27b составляет 83%, специфичность – 87% (AUC=0,905). Таким образом, контроль уровня экспрессии в плазме крови больных МХ до и в послеоперационном периоде можно расценивать как биокритерий стабильности или активности опухолевого роста МХ после энуклеации.

Примеры осуществления изобретения:

Пример 1

Больной 63 лет, диагноз - меланома хориоидеи преэкваториальной локализации размерами 8,66х13,91 мм. С учетом размеров опухоли, отсутствии признаков гематогенного метастазирования (заключение МРТ-исследования печени, органов грудной клетки) и повышенного уровня экспрессии микроРНК-27b в плазме крови по отношению к контролю (принятому условно за 100%) на 152% (в 2,5 раза), пациенту проведена энуклеация. Патоморфологический диагноз - веретеноклеточная меланома хориоидеи, расположена в пределах тканей глаза. Операция и послеоперационный период прошли без осложнений. Контрольное исследование уровня экспрессии в плазме крови пациента через 3 месяца показало снижение уровня экспрессии микроРНК-27b в 3,7 раза по сравнению с дооперационными показателями, и на 38% (в 1,6 раза) ниже уровня контроля.

Пример 2

У пациентки 65 лет, в анамнезе энуклеация по поводу меланомы хориоидеи 6,79х16,5мм при условии T₃N₀M₀. Уровень экспрессии микроРНК-27b превышал контроль на 545% (в 6,5 раз) до операции. Патологоанатомический диагноз - веретеноклеточная меланома хориоидеи, ограничена внутренними оболочками глаза. Контрольное исследование через 41 месяц на фоне исследований печени и органов грудной клетки без признаков опухолевого поражения. свидетельствовало о снижении уровня экспрессии микроРНК-27b в плазме крови в 161,3 раза по сравнению с дооперационными показателями, что оказалось даже ниже уровня контроля на 97%.

Последующие 2 примера демонстрируют повышение экспрессии микроРНК-27b в плазме крови после энуклеации, как на фоне метастазирования, так и за 8 месяцев до выявления визуализирующими методами исследования гематогенных метастазов в органы-мишени.

Пример 3

Больному 56 лет после обследования установлено наличие меланомы хориоидеи 8,52х15,43 мм, по заключению КТ/МРТ-исследований признаков опухолевого поражения печени и легких не выявлено. Повышенный уровень микроРНК-27b в плазме крови на 343% (в 4,4 раза) выше группы контроля свидетельствовал в пользу меланомы хориоидеи. Диагноз опухоли подтвержден патоморфологически после энуклеации. Контрольное МРТ-печени через 32 месяца после операции - патологии не выявлено. Повторно (через 36 месяцев после энуклеации) исследован уровень микроРНК-27b в плазме крови: он оказался выше уровня контроля на 681% (в 7,8 раз). А через 8 месяцев (через 44 месяца после энуклеации) при контрольном МРТ – печени выявлены множественные метастазы. Таким образом, выявленная до МРТ-исследования сверхэкспрессия микроРНК-27b свидетельствовала о метастазировании УМ.

Пример 4

Приводим одно из собственных наблюдений, иллюстрирующих характер изменения уровня микроРНК-27b в плазме крови у пациента на фоне проводимой химиотерапии по поводу метастатической болезни МХ. Пациенту 67 лет была проведена энуклеация по поводу преэкваториальной меланомы хориоидеи размерами 13,71х10,77 мм (T3N0M0). В предоперационном периоде уровень экспрессии микроРНК-27b в плазме крови был выше контроля на 372% (в 4,7 раза). Через 29 месяцев после энуклеации выявлены множественные гематогенные метастазы, назначена химиотерапия. Контрольное исследование уровня экспрессии микроРНК-27b в плазме крови проведено через 7 месяцев химиотерапии (36 месяцев после энуклеации). Уровень экспрессии микроРНК-27b в плазме крови оказался выше контроля на 1224% (в 13,2 раза), в 2,8 раза выше дооперационного уровня. Таким образом, полученные в процессе наблюдения за больным результаты исследования уровня экспрессии микроРНК-27b в плазме крови позволили прийти к выводу о неэффективности избранной химиотерапии, проводимой пациенту на протяжении 7 месяцев.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмоонкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для оценки риска метастазирования после энуклеации глаза с большими меланомами хориоидеи. Осуществляют взятие крови у пациентов с большими меланомами хориоидеи в стадии N₀M₀ после энуклеации. Из плазмы крови выделяют микроРНК. С помощью ПЦР в режиме реального времени определяют экспрессию микроРНК-27b. Полученные результаты соотносят с уровнем контроля, полученным у здоровых лиц. При 6-кратном увеличении уровня экспрессии микроРНК-27b у пациентов в послеоперационном периоде по отношению к контролю оценивают высокий риск метастазирования. Способ обеспечивает возможность оценки риска метастазирования после энуклеации глаза с большими меланомами хориоидеи за счет определения экспрессии микроРНК-27b в крови. 1 ил., 1 табл., 4 пр.

Способ оценки риска метастазирования после энуклеации глаза с большими меланомами хориоидеи, включающий взятие крови у пациентов с большими меланомами хориоидеи в стадии N₀M₀ после энуклеации, выделение микроРНК из плазмы крови, определение экспрессии микроРНК-27b с помощью ПЦР в режиме реального времени, соотнесение полученных результатов с уровнем контроля, полученным у здоровых лиц, и при 6-кратном увеличении уровня экспрессии микроРНК-27b у пациентов в послеоперационном периоде по отношению к контролю оценивают высокий риск метастазирования.