РЕКТАЛЬНАЯ ДОСТАВКА МАТРИЧНОЙ РНК Российский патент 2025 года по МПК A61K9/00 A61K9/02 A61K9/51 A61K38/00 A61K31/7088 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество и приоритет по заявке на патент США с порядковым номером 62/951844, поданной 20 декабря 2019 года, содержание которой включено в данный документ.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Доставка нуклеиновых кислот, в частности матричной РНК (мРНК), в целевые клетки и ткани остается сложной технической задачей. При доставке мРНК в представляющие интерес клетки возникают различные трудности, включая, например, физические и химические барьеры. Эти трудности возникают при использовании широкого спектра способов доставки, таких как парентеральный и пероральный пути доставки. Ректальная доставка является особенно сложной, по меньшей мере отчасти из-за уникального содержимого прямой и толстой кишки, например, присутствия РНКазы в прямой кишке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] В настоящем изобретении предусмотрены, среди прочего, эффективные способы и композиции для доставки матричной РНК (мРНК) посредством ректальной доставки. Настоящее изобретение отчасти основано на неожиданном обнаружении того, что инкапсулированная в липид мРНК может эффективно доставляться в кровообращение, печень, почку, кишечник, толстую кишку и/или прямую кишку посредством чресслизистой доставки, включая ректальную доставку, несмотря на многочисленные барьеры, такие как РНКаза и слизистые слои.

[0004] В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрен способ доставки матричной РНК (мРНК) субъекту для продуцирования белка или пептида in vivo у субъекта, включающий введение субъекту с помощью ректальной доставки композиции, содержащей мРНК, которая кодирует белок или пептид и инкапсулирована в липидную наночастицу, и где введение композиции приводит к экспрессии белка или пептида, кодируемых мРНК, которые поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения.

[0005] В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения.

[0006] В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в печени субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в печени субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в печени субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в печени субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в печени субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения.

[0007] В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в почке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в почке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в почке субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в почке субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в почке субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения.

[0008] В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в толстой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в толстой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в толстой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в толстой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в толстой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения.

[0009] В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения. I

[0010] В некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в кровообращении субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в печени субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в почке субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в толстой кишке субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в прямой кишке субъекта.

[0011] В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица содержит один или несколько катионных липидов, один или несколько некатионных липидов и один или несколько PEG-модифицированных липидов. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления липидная наночастица содержит один или несколько катионных липидов. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица содержит один или несколько некатионных липидов. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица содержит один или несколько PEG-модифицированных липидов. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица содержит один

[0012] В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица содержит холестерин.

[0013] В некоторых вариантах осуществления ректальную доставку осуществляют с помощью суппозитория, клизмы, катетера или спринцовки. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления ректальную доставку осуществляют с помощью суппозитория. В некоторых вариантах осуществления ректальную доставку осуществляют с помощью клизмы. В некоторых вариантах осуществления ректальную доставку осуществляют с помощью катетера. В некоторых вариантах осуществления ректальную доставку осуществляют с помощью спринцовки.

[0014] В некоторых вариантах осуществления ректальную доставку осуществляют с помощью суппозитория.

[0015] В некоторых вариантах осуществления композиция не содержит компонент суппозитория на липидной основе.

[0016] В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой масло какао, теобромовое масло, синтетические жиры или синтетические основы. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой масло какао. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой теобромовое масло. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой синтетический жир. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой синтетическую основу.

[0017] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит усилитель проницаемости.

[0018] В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости выбран из солей желчных кислот, поверхностно-активных веществ, жирных кислот и производных, глицеридов, хелаторов, салицилатов или полимеров. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой соль желчной кислоты. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой жирную кислоту и производные. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой глицерид. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой хелатор. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой салицилат. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой полимер.

[0019] В некоторых вариантах осуществления жирные кислоты и производные выбраны из лаурата сорбитана, капрата натрия, сахарозы, пальмитата, лауроилхолина, миристата натрия или пальмитоилкарнитина. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные представляют собой лаурат сорбитана. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные включают капрат натрия. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные представляют собой сахарозу. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные представляют собой пальмитат. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные представляют собой лауроилхолин. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные представляют собой миристат натрия. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные представляют собой пальмитоилкарнитин.

[0020] В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой форму капрата.

[0021] В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости на основе капрата представляет собой капрат натрия.

[0022] В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой Labrasol®.

[0023] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит компонент суппозитория на водной основе.

[0024] В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на водной основе выбран из глицерина, желатина или полиэтиленгликоля (PEG) или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на водной основе представляет собой глицерин. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на водной основе представляет собой желатин. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на водной основе представляет собой полиэтиленгликоль (PEG).

[0025] В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит желатин.

[0026] В некоторых вариантах осуществления единственным компонентом суппозитория на водной основе является желатин.

[0027] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 5% желатина в воде или больше, 10% желатина в воде или больше, 20% желатина в воде или больше, 30% желатина в воде или больше, или 50% желатина в воде или больше. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 5% желатина в воде или больше. Например, в некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 5%, 6%, 7%, 8% или 9% желатина или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 10% желатина в воде или больше. Например, в некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18% или 19% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 20% желатина в воде или больше. Например, в некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28% или 29% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 30% желатина в воде или больше. Например, в некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48% или 49% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 50% желатина в воде или больше. Например, в некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% желатина в воде или больше.

[0028] В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит 0,25 мг/мл мРНК или больше, 0,5 мг/мл мРНК или больше, 0,75 мг/мл мРНК или больше или 1 мг/мл мРНК или больше. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит 0,25 мг/мл мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,5 мг/мл мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,75 мг/мл мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 1 мг/мл мРНК или больше.

[0029] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,5 мг мРНК или больше, 0,75 мг мРНК или больше, 1 мг мРНК или больше, 1,25 мг мРНК или больше, 1,5 мг мРНК или больше или 1,75 мг мРНК или больше. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,5 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,75 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 1 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 1,25 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 1,5 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 1,75 мг мРНК или больше.

[0030] В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 3 грамма, приблизительно 2 грамма или приблизительно 1 грамм. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 3 грамма. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 2 грамма. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 1 грамм.

[0031] В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 2,0 мл, приблизительно 3,5 мл, приблизительно 7,5 мл или приблизительно 10,0 мл. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 2,0 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 3,5 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 7,5 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 10,0 мл.

[0032] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий охлаждают перед введением.

[0033] В некоторых вариантах осуществления субъекту сначала вводят усилитель проницаемости перед введением композиции, содержащей мРНК.

[0034] В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 30 минут, приблизительно 1 час, приблизительно 2,5 часа, приблизительно 5 часов или приблизительно 12 часов перед введением композиции, содержащей мРНК. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 30 минут перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 1 час перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 2,5 часа перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 5,0 часов перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 12 часов перед введением композиции, содержащей мРНК.

[0035] В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрен способ доставки матричной РНК (мРНК) субъекту для продуцирования белка или пептида in vivo у субъекта, включающий введение субъекту с помощью чресслизистой доставки композиции, содержащей мРНК, которая кодирует белок или пептид и инкапсулирована в липидную наночастицу, и где введение композиции приводит к экспрессии белка или пептида, кодируемых мРНК, которые поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления введение композиции приводит к экспрессии белка или пептида, кодируемых мРНК, которые поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления введение композиции приводит к экспрессии белка или пептида, кодируемых мРНК, которые поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления введение композиции приводит к экспрессии белка или пептида, кодируемых мРНК, которые поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления введение композиции приводит к экспрессии белка или пептида, кодируемых мРНК, которые поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения.

[0036] В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в кровообращении субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в кровообращении субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в кровообращении субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в кровообращении субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в печени субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в печени субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в печени субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в печени субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в почке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в почке субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в почке субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в почке субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в толстой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в толстой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в толстой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в толстой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения.

[0037] В некоторых вариантах осуществления чресслизистая доставка является ректальной, вагинальной, глазной, пероральной или желудочно-кишечной. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления чресслизистая доставка является ректальной. В некоторых вариантах осуществления чресслизистая доставка является вагинальной. В некоторых вариантах осуществления чресслизистая доставка является глазной. В некоторых вариантах осуществления чресслизистая доставка является пероральной. В некоторых вариантах осуществления чресслизистая доставка является желудочно-кишечной.

[0038] В некоторых вариантах осуществления пероральная доставка является буккальной или сублингвальной. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления пероральная доставка является буккальной. В некоторых вариантах осуществления пероральная доставка является сублингвальной.

[0039] В некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в кровообращении субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в печени субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в почке субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в толстой кишке субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в прямой кишке субъекта.

[0040] В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрен суппозиторий для ректального введения мРНК, при этом суппозиторий содержит мРНК, инкапсулированную в липидную наночастицу, где мРНК кодирует белок или пептид, и желатин.

[0041] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 5% желатина в воде или больше, 10% желатина в воде или больше, 20% желатина в воде или больше, 30% желатина в воде или больше или 50% желатина в воде или больше. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 5% желатина в воде или больше. Например, в некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 5%, 6%, 7%, 8% или 9% желатина или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 10% желатина в воде или больше. Например, в некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18% или 19% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 20% желатина в воде или больше. Например, в некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28% или 29% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 30% желатина в воде или больше. Например, в некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48% или 49% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 50% желатина в воде или больше. Например, в некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% желатина в воде или больше.

[0042] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий не содержит компонент суппозитория на липидной основе.

[0043] В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой масло какао, теобромовое масло, синтетические жиры или синтетические основы. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой масло какао. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой теобромовое масло. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой синтетический жир. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой синтетическую основу. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой масло какао, теобромовое масло, синтетические жиры или синтетические основы или любую их комбинацию.

[0044] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит усилитель проницаемости.

[0045] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит усилитель проницаемости, выбранный из солей желчных кислот, поверхностно-активных веществ, жирных кислот и производных, глицеридов, хелаторов, салицилатов или полимеров. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой соль желчной кислоты. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой жирную кислоту и производные. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой глицерид. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой хелатор. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой салицилат. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой полимер.

[0046] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит жирные кислоты и производные, которые выбраны из лаурата сорбитана, капрата натрия, сахарозы, пальмитата, лауроилхолина, миристата натрия или пальмитоилкарнитина. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные включают капрат натрия. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные представляют собой сахарозу. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные представляют собой пальмитат. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные представляют собой лауроилхолин. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные представляют собой миристат натрия. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота и производные представляют собой пальмитоилкарнитин.

[0047] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит усилитель проницаемости, который представляет собой форму капрата.

[0048] В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости на основе капрата представляет собой капрат натрия.

[0049] В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой Labrasol®.

[0050] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий дополнительно содержит глицерин и/или PEG. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления суппозиторий дополнительно содержит глицерин. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий дополнительно содержит PEG.

[0051] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится при температуре от приблизительно 36 до 37°C. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается при температуре приблизительно 36,0°C, 36,1°C, 36,2°C, 36,3°C, 36,4°C, 36,5°C, 36,6°C, 36,7°C, 36,8°C, 36,9°C или 37,0°C.

[0052] В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в печени субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0053] Следующие фигуры приведены исключительно с целью иллюстрации, а не для ограничения.

[0054] На фиг. 1 изображен иллюстративный суппозиторий, содержащий мРНК, инкапсулированную в липидные наночастицы. Суппозиторий может быть доставлен ректальным путем.

[0055] На фиг. 2A изображена иллюстративная фотография мышей через 24 часа после ректального введения физиологического раствора в качестве отрицательного контроля. На фиг. 2B изображена иллюстративная фотография различных тканей через 24 часа после ректального введения физиологического раствора в качестве отрицательного контроля. Сигнал не выявляли при введении физиологического раствора ректальным путем.

[0056] На фиг. 3A изображена иллюстративная фотография мышей через 24 часа после ректального введения мРНК FFLuc-LNP. На фиг. 3B изображена иллюстративная фотография различных тканей через 24 часа после ректального введения мРНК FFLuc-LNP. У мышей выявляли сигнал люциферазной активности. Сильная люминесценция продемонстрирована в толстой кишке.

[0057] На фиг. 4 изображена иллюстративная фотография мышей через 24 часа после ректального введения мРНК FFLuc-LNP в дозе 0,2 мг (группа 1) или в дозе 0,05 мг (группа 2). Мышам в группе 2 предварительно вводили дозу капрата натрия перед введением мРНК-LNP.

[0058] На фиг. 5 показано иллюстративное графическое представление люминесценции, выявленной у мышей через 24 часа после введения физиологического раствора (отрицательный контроль), дозы 0,2 мг мРНК-LNP (группа 1) или дозы 0,05 мг мРНК-LNP с капратом натрия (группа 2).

[0059] На фиг. 6A изображена иллюстративная фотография мышей через 24 часа после ректального введения суппозитория, содержащего мРНК FFLuc-LNP. На фиг. 6B изображена иллюстративная фотография различных тканей крыс через 24 часа после ректального введения суппозитория.

[0060] На фиг. 7 показано иллюстративное графическое представление содержание белка hEPO в сыворотке крови, выявленного у крыс через x часов после введения композиции.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0061] Для облегчения понимания настоящего изобретения вначале ниже определены некоторые термины. Дополнительные определения следующих терминов и других терминов приводятся на протяжении всего описания.

[0062] Термины "или больше", "по меньшей мере", "более" и т. п., например, "по меньшей мере один", следует понимать, как включающие без ограничения по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 или 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или больше указанного значения. Также включено любое большее число или промежуточное дробное число.

[0063] И наоборот, термин "не более" включает каждое значение, меньше указанного значения. Например, "не более 100 нуклеотидов" включает 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 и 0 нуклеотидов. Также включено любое меньшее число или промежуточное дробное число.

[0064] Животное. Используемый в данном документе термин "животное" относится к любому представителю царства Животные. В некоторых вариантах осуществления "животное" относится к людям на любой стадии развития. В некоторых вариантах осуществления "животное" относится к отличному от человека животному на любой стадии развития. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой млекопитающее (например, грызуна, мышь, крысу, кролика, обезьяну, собаку, кошку, овцу, крупный рогатый скот, примата и/или свинью). В некоторых вариантах осуществления животные включают без ограничения млекопитающих, птиц, рептилий, земноводных, рыб, насекомых и/или червей. В некоторых вариантах осуществления животным может быть трансгенное животное, модифицированным методами генной инженерии животной и/или клон.

[0065] Примерно или приблизительно. Используемый в данном документе термин "примерно" или "приблизительно", применяемый к одному или нескольким представляющим интерес значениям, относится к значению, которое сходно с указанным эталонным значением. В определенных вариантах осуществления термин "примерно" или "приблизительно" относится к диапазону значений, которые находятся в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше в любую сторону (большую или меньшую) от указанного эталонного значения, если иное не указано или иное не очевидно из контекста (кроме случаев, когда такое число превышает 100% от возможного значения).

[0066] Содержащий. Используемый в данном документе термин "содержащий" или такие варианты, как "содержит" или "содержащий", следует понимать, как подразумевающий включение указанного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.

[0067] Доставка. Используемый в данном документе термин "доставка" охватывает как местную, так и системную доставку. Например, доставка мРНК охватывает ситуации, при которых мРНК доставляется в целевую ткань, и кодируемый белок экспрессируется и остается в целевой ткани (также называется "местным распределением" или "местной доставкой"). Другие иллюстративные ситуации включают ситуацию, при которой мРНК доставляется в целевую ткань, и кодируемый белок экспрессируется и секретируется в систему кровообращения пациента (например, в сыворотку крови) и системно распределяется и захватывается другими тканями (также называется "системным распределением" или "системной доставкой"). В других иллюстративных ситуациях мРНК доставляется системно и захватывается самыми различными клетками и тканями in vivo. В некоторых иллюстративных ситуациях доставка является внутривенной, внутримышечной или подкожной.

[0068] Интервалы введения доз. Используемый в данном документе интервал введения доз в контексте способа лечения заболевания представляет собой частоту введения терапевтической композиции субъекту (млекопитающему), нуждающемуся в этом, например, композиции на основе мРНК, при эффективной дозе мРНК, так что снижается выраженность одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием; или снижается уровень одного или нескольких биомаркеров, ассоциированных с заболеванием, по меньшей мере на протяжении периода интервала введения доз. В настоящем изобретении частота введения доз частота и интервал введения доз могут использоваться взаимозаменяемо.

[0069] Эффективность. Используемый в данном документе термин "эффективность" или его грамматические эквиваленты относятся к улучшению в отношении биологически значимой конечной точки, связанному с доставкой мРНК, которая кодирует соответствующий белок или пептид. В некоторых вариантах осуществления биологическая конечная точка представляет собой защиту от нагрузки хлоридом аммония в определенные моменты времени после введения.

[0070] Инкапсулирование. Используемый в данном документе термин "инкапсулирование" или его грамматические эквиваленты относятся к способу заключения молекулы нуклеиновой кислоты в наночастицу.

[0071] Экспрессия. Используемый в данном документе термин "экспрессия" последовательности нуклеиновой кислоты относится к трансляции мРНК в полипептид, сборке нескольких полипептидов (например, тяжелой цепи или легкой цепи антитела) в интактный белок (например, антитело) и/или посттрансляционной модификации полипептида или полностью собранного белка (например, антитела). В настоящей заявке термины "экспрессия" и "продуцирование", а также их грамматические эквиваленты используются взаимозаменяемо.

[0072] Эффективная доза. Используемая в данном документе эффективная доза представляет собой дозу мРНК в фармацевтической композиции, которая при введении субъекту, нуждающемуся в этом, например млекопитающему, в соответствии со способами по настоящему изобретению, является эффективной для достижения ожидаемого результата у субъекта, например, снижения выраженности симптома, ассоциированного с заболеванием.

[0073] Функциональный. Используемая в данном документе "функциональная" биологическая молекула представляет собой биологическую молекулу в форме, в которой она проявляет свойство и/или активность, которыми она характеризуется.

[0074] Улучшать, увеличивать или снижать. Используемые в данном документе термины "улучшать", "увеличивать" или "снижать" или грамматические эквиваленты указывают на значения относительно исходного измерения, такое как измерение у того же индивидуума перед началом лечения, описанного в данном документе, или измерение у контрольного субъекта (или нескольких контрольных субъектов) в отсутствие лечения, описанного в данном документе. "Контрольный субъект" является субъектом, пораженным той же формой заболевания, что и субъект, получающий лечение, и примерно того же возраста, что и субъект, получающий лечение.

[0075] In vitro. Используемый в данном документе термин "in vitro" относится к событиям, которые происходят в искусственной среде, например, в пробирке или реакционном сосуде, в культуре клеток и т. д., а не в многоклеточном организме.

[0076] In vivo. Используемый в данном документе термин "in vivo" относится к событиям, которые происходят в многоклеточном организме, таком как организм человека и отличного от человека животного. В контексте клеточных систем термин может использоваться в отношении событий, которые происходят в живой клетке (в противоположность, например, системам in vitro).

[0077] Липосома. Используемый в данном документе термин "липосома" относится к любой ламеллярной, многослойной или твердой наноразмерной везикуле. Как правило, используемая в данном документе липосома может быть сформирована путем смешивания одного или нескольких липидов или путем смешивания одного или нескольких липидов и полимера(-ов). В некоторых вариантах осуществления липосома, подходящая для настоящего изобретения, содержит катионный(-ые) липид(-ы) и необязательно некатионный(-ые) липид(-ы), необязательно липид(-ы) на основе холестерина и/или необязательно PEG-модифицированный(-ые) липид(-ы).

[0078] Матричная РНК (мРНК). Используемый в данном документе термин "матричная РНК (мРНК)" относится к полинуклеотиду, который кодирует по меньшей мере один полипептид. Используемая в данном документе мРНК охватывает как модифицированную, так и немодифицированную РНК. мРНК может содержать одну или несколько кодирующих и некодирующих областей. мРНК может быть очищена из природных источников, получена с использованием рекомбинантных систем экспрессии и необязательно очищена, синтезирована химическим путем и т. д. При необходимости, например, в случае химически синтезированных молекул, мРНК может содержать аналоги нуклеозидов, такие как аналоги с химически модифицированными основаниями или сахарами, модификациями остова и т. д. Последовательность мРНК представлена в 5'-3'-направлении, если не указано иное.

[0079] Соотношение N/P. Используемый в данном документе термин "соотношение N/P" относится к молярному соотношению положительно заряженных молекулярных звеньев в катионных липидах в липидной наночастице относительно отрицательно заряженных молекулярных звеньев в мРНК, инкапсулированной в этой липидной наночастице. Таким образом, соотношение N/P, как правило, рассчитывается как соотношение числа молей аминогрупп в катионных липидах в липидной наночастице относительно числа молей фосфатных групп в мРНК, инкапсулированной в данной липидной наночастице.

[0080] Нуклеиновая кислота. Используемый в данном документе термин "нуклеиновая кислота" в его самом широком смысле относится к любому соединению и/или веществу, которое включено или может быть включено в состав полинуклеотидной цепи. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой соединение и/или вещество, которое включено или может быть включено в состав полинуклеотидной цепи посредством фосфодиэфирной связи. В некоторых вариантах осуществления "нуклеиновая кислота" относится к отдельным остаткам нуклеиновой кислоты (например, нуклеотидам и/или нуклеозидам). В некоторых вариантах осуществления "нуклеиновая кислота" относится к полинуклеотидной цепи, содержащей отдельные остатки нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления "нуклеиновая кислота" охватывает РНК, а также одно- и/или двухнитевую ДНК и/или кДНК. Более того, термины "нуклеиновая кислота", "ДНК", "РНК" и/или аналогичные термины включают аналоги нуклеиновой кислоты, т. е. аналоги с остовом, отличным от фосфодиэфирного. Например, так называемые "пептидные нуклеиновые кислоты", которые известны в данной области техники и имеют пептидные связи вместо фосфодиэфирных связей в остове, считаются входящими в объем настоящего изобретения. Термин "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и/или кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и/или РНК, могут включать интроны. Нуклеиновые кислоты могут быть очищены из природных источников, получены с использованием рекомбинантных систем экспрессии и необязательно очищены, синтезированы химическим путем и т. д. При необходимости, например, в случае химически синтезированных молекул, нуклеиновые кислоты могут содержать аналоги нуклеозидов, такие как аналоги с химически модифицированными основаниями или сахарами, модификациями остова и т. д. Последовательность нуклеиновой кислоты представлена в 5'-3'-направлении, если не указано иное. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой или содержит природные нуклеозиды (например, аденозин, тимидин, гуанозин, цитидин, уридин, дезоксиаденозин, дезокситимидин, дезоксигуанозин и дезоксицитидин); аналоги нуклеозидов (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, C5-пропинилцитидин, C5-пропинилуридин, 2-аминоаденозин, C5-бромуридин, C5-фторуридин, C5-йодуридин, C5-пропинилуридин, C5-пропинилцитидин, C5-метилцитидин, 2-аминоаденозин, 7-дезазааденозин, 7-дезазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, O(6)-метилгуанин и 2-тиоцитидин), химически модифицированные основания; биологически модифицированные основания (например, метилированные основания); интеркалированные основания; модифицированные сахара (например, 2’-фторрибозу, рибозу, 2’-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу) и/или модифицированные фосфатные группы (например, фосфотиоаты и 5’-N-фосфорамидитные связи). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение, в частности, направлено на "немодифицированные нуклеиновые кислоты", что означает нуклеиновые кислоты (например, полинуклеотиды и остатки, включая нуклеотиды и/или нуклеозиды), которые не были модифицированы химическим путем с целью облегчения или достижения доставки. В некоторых вариантах осуществления нуклеотиды T и U используются взаимозаменяемо в описаниях последовательностей.

[0081] Пациент. Используемые в данном документе термины "пациент" или "субъект" относятся к любому организму, которому может быть введена предусмотренная композиция, например, для экспериментальных, диагностических, профилактических, косметических и/или терапевтических целей. Типичные пациенты включают животных (например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, отличные от человека приматы и/или люди). В конкретных вариантах осуществления пациентом является человек. Человек включает пре- и постнатальные формы.

[0082] Полипептид. Используемый в данном документе термин "полипептид", в общем случае, представляет собой нить из по меньшей мере двух аминокислот, прикрепленных друг к другу пептидной связью. В некоторых вариантах осуществления полипептид может включать по меньшей мере 3-5 аминокислот, каждая из которых прикреплена к другим с помощью по меньшей мере одной пептидной связи. Специалистам средней квалификации в данной области техники будет понятно, что полипептиды иногда необязательно включают "неприродные" аминокислоты или другие структурные единицы, которые все таки способны интегрироваться в полипептидную цепь.

[0083] Белок. Используемый в данном документе термин "белок" или "терапевтический белок" относится к полипептиду (т. e. нити из по меньшей мере двух аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями). Белки могут включать отличные от аминокислот фрагменты (например, они могут быть гликопротеинами, протеогликанами и т. д.) и/или могут быть процессированы или модифицированы иным образом. Специалистам средней квалификации в данной области техники будет понятно, что "белок" может представлять собой полную полипептидную цепь, продуцируемую клеткой (с сигнальной последовательность или без нее), или может представлять собой ее характерную часть. Специалистам средней квалификации в данной области техники будет понятно, что белок иногда может включать более одной полипептидной цепи, например, связанных одной или несколькими дисульфидными связями или ассоциированных другими средствами. Полипептиды могут содержать l-аминокислоты, d-аминокислоты или и те, и другие, а также могут содержать любую из множества аминокислотных модификаций или аналогов, известных в данной области техники. Применимые модификации включают, например, концевое ацетилирование, амидирование, метилирование и т. д. В некоторых вариантах осуществления белки могут содержать природные аминокислоты, неприродные аминокислоты, синтетические аминокислоты и их комбинации. Термин "пептид" обычно используют в отношении полипептида длиной менее приблизительно 100 аминокислот, менее приблизительно 50 аминокислот, менее 20 аминокислот или менее 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления белки являются антителами, фрагментами антител, их биологически активными частями и/или их характерными частями.

[0084] Системное распределение или доставка. Используемые в данном документе термины "системное распределение", "системная доставка" или их грамматический эквивалент относятся к механизму или подходу доставки и распределения, которые влияют на все тело или весь организм. Как правило, системное распределение или доставка осуществляются через систему кровообращения организма, например, кровоток. Этому противопоставляется определение "местное распределение или доставка".

[0085] Субъект. Используемый в данном документе термин "субъект" относится к человеку или любому отличному от человека животному (например, мыши, крысе, кролику, собаке, кошке, крупному рогатому скоту, свинье, овце, лошади или примату). Человек включает пре- и постнатальные формы. Во многих вариантах осуществления субъектом является человек. Субъект может являться пациентом, что относится к человеку, обращающемуся к поставщику медицинских услуг для постановки диагноза или лечения заболевания. Термин "субъект" используется в данном документе взаимозаменяемо с "индивидуумом" или "пациентом". Субъект может быть пораженным заболеванием или нарушением или предрасположенным к заболеванию или нарушению, но у него могут проявляться или не проявляться симптомы заболевания или нарушения.

[0086] Практически. Используемый в данном документе термин "практически" относится к качественному состоянию проявления полной или почти полной меры или степени представляющих интерес характеристики или свойства. Специалисту средней квалификации в области биологии будет понятно, что биологические и химические явления редко, если вообще когда-либо, подходят к завершению и/или продолжаются до завершенности или достигают или избегают абсолютного результата. Следовательно, термин "практически" используется в данном документе для отражения потенциального отсутствия завершенности, присущего многим биологическим и химическим явлениям.

[0087] Целевые ткани. Используемый в данном документе термин "целевые ткани" относится к любой ткани, которая поражена заболеванием, подлежащим лечению. В некоторых вариантах осуществления целевые ткани включают такие ткани, которые демонстрируют ассоциированную с заболеванием патологию, симптом или признак.

[0088] Терапевтически эффективное количество. Используемый в данном документе термин "терапевтически эффективное количество" терапевтического средства означает количество, которое является достаточным при введении субъекту, страдающему заболеванием, нарушением и/или состоянием или восприимчивому к ним, для лечения, постановки диагноза, предупреждения и/или отсрочки проявления симптома(-ов) заболевания, нарушения и/или состояния. Специалистам средней квалификации в данной области техники будет понятно, что терапевтически эффективное количество, как правило, вводят посредством схемы введения доз, содержащей по меньшей мере одну стандартную дозу.

[0089] Осуществление лечения. Используемый в данном документе термин "лечить", "лечение" или "осуществление лечения" относится к любому способу, применяемому для частичного или полного ослабления интенсивности, облегчения, смягчения, подавления, предупреждения, отсрочки проявления, уменьшения тяжести и/или снижения частоты возникновения одного или несколько симптомов или признаков конкретного заболевания, нарушения и/или состояния. Средство лечения можно вводить субъекту, у которого не проявляются признаки заболевания и/или проявляются только ранние признаки заболевания, с целью уменьшения риска развития патологии, ассоциированной с заболеванием.

[0090] Если не приведено иное определение, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое общеизвестно специалисту средней квалификации в области техники, к которой относится настоящая заявка, и которое обычно используют в области техники, к которой принадлежит настоящая заявка; такой уровень техники включен посредством ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет обладать преимущественной силой.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0091] В настоящем изобретении представлены, среди прочего, эффективные способы и композиции для доставки матричной РНК (мРНК) и/или ее белкового или полипептидного продукта субъекту посредством чресслизистого пути, например, с помощью ректальной доставки. Настоящее изобретение, в частности, основано на неожиданном обнаружении того, что мРНК и/или ее белковый или полипептидный продукт может быть эффективно доставлен в кровообращение, печень, почку, толстую кишку и/или прямую кишку субъекта посредством ректальной доставки, несмотря на многочисленные химические и физические барьеры.

[0092] В последующих разделах подробно описаны различные аспекты настоящего изобретения. Использование разделов не подразумевается для ограничения настоящего изобретения. Каждый раздел может применяться в отношении любого аспекта настоящего изобретения. В настоящей заявке применение "или" означает "и/или", если не указано иное.

Чресслизистая доставка инкапсулированной в липид мРНК

[0093] В настоящем изобретении представлены различные способы доставки мРНК в целевую ткань. Способы доставки включают введение инкапсулированной в липид мРНК через любую ткань слизистой оболочки. Например, инкапсулированную в липид мРНК доставляют ректальным, вагинальным, глазным, пероральным и/или желудочно-кишечным путем.

[0094] В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрен, среди прочего, способ доставки матричной РНК (мРНК) субъекту для продуцирования белка или пептида in vivo у субъекта, включающий введение субъекту с помощью чресслизистой доставки композиция, содержащей мРНК, которая кодирует белок или пептид и инкапсулирована в липидную наночастицу, и где введение композиции приводит к экспрессии белка или пептида, кодируемых мРНК, которые поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения.

[0095] В некоторых вариантах осуществления чресслизистая доставка инкапсулированной в липид мРНК осуществляется через прямую кишку.

Ректальная доставка

[0096] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ ректальной доставки инкапсулированной в липид мРНК, которая кодирует представляющий интерес белок или пептид.

[0097] Преимущества ректальной доставки включают простоту введения, что позволяет пациентам оставаться в домашних условиях. В случае ректальной доставки отсутствует необходимость в стационарных условиях и особом составе стерильных лекарственных препаратов, как это требуется при внутривенном введении. Терапевтическая композиция может вводиться ректальным путем посредством суппозитория, клизмы, спринцовки и катетера. Специализированный ректальный катетер для ректального введения может устанавливать врач на дому. Многие пероральные формы лекарственных препаратов можно измельчить и суспендировать в воде для введения посредством ректального катетера. Таким образом, ректальное введение особенно безопасно и удобно для младенцев и пожилых людей, а также применимо для пациентов с неприязнью к иглам или с любой проблемой моторики пищеварительного тракта, такой как дисфагия, непроходимость кишечника или обструкция кишечника, которые могли бы воспрепятствовать продвижению лекарственного препарата через тракт. Кроме того, вводимые ректальным путем лекарственные средства обычно характеризуются более быстрым началом действия и более высокой биодоступностью, а также реже вызывают тошноту по сравнению с пероральным введением лекарственного средства. Лекарственные средства, вводимые ректальным путем, обходят приблизительно две третьих пресистемного метаболизма, что приводит к меньшему изменению и большей концентрации лекарственного средства в кровеносной системе пациента. Однако доставка мРНК посредством ректального пути является чрезвычайно сложной задачей. В ректальной области (т. е. в прямой кишке и толстой кишке) имеются большие количества РНКазы, которая будет мгновенно разрушать мРНК. Кроме того, слой слизи в прямой кишке и/или толстой кишке будет действовать как барьер для всасывания. Более того, ректальной доставке лекарственного средства может препятствовать каловая пробка.

[0098] Несмотря на эти сложности способы, предусмотренные в данном документе, обеспечивают доставку матричной РНК (мРНК) посредством ректального пути. Настоящее изобретение отчасти основано на неожиданном обнаружении того, что инкапсулированная в липид мРНК может эффективно доставляться в кровообращение, печень, почку, толстую кишку и/или прямую кишку субъекта посредством ректальной доставки, несмотря на многочисленные барьеры, такие как присутствие РНКазы, слой слизи и каловая пробка. Такие неинвазивные пути доставки неожиданным образом обеспечивают эффективные средства для удобной доставки инкапсулированных в липид терапевтических композиций.

[0099] В настоящем изобретении предусмотрен, среди прочего, способ доставки матричной РНК (мРНК) субъекту для продуцирования белка или пептида in vivo у субъекта, включающий введение субъекту с помощью ректальной доставки композиции, содержащей мРНК, которая кодирует белок или пептид и инкапсулирована в липидную наночастицу, и где введение композиции приводит к экспрессии белка или пептида, кодируемых мРНК, которые поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения. Данный способ обеспечивает доставку инкапсулированной в липид мРНК посредством ректального пути, что приводит к экспрессии белка или пептида, кодируемых мРНК, в различных тканях у субъекта-реципиента. Например, способ обеспечивает экспрессию белка или пептида, кодируемых мРНК, в печени, почке, кровообращении, толстой кишке или прямой кишке субъекта.

[0100] Способы, описанные в данном документе, подходят для введения инкапсулированной в липид мРНК в домашних условиях. В некоторых вариантах осуществления ректальную доставку осуществляют с помощью суппозитория, клизмы, катетера или спринцовки. В некоторых вариантах осуществления ректальную доставку осуществляют с помощью суппозитория. В некоторых вариантах осуществления ректальную доставку осуществляют с помощью клизмы. В некоторых вариантах осуществления ректальную доставку осуществляют с помощью катетера. В способах, раскрытых в данном документе, могут применяться различные типы специализированных катетеров, например, одним таким специализированным катетером является катетер Мэйси. В некоторых вариантах осуществления ректальную доставку осуществляют с помощью спринцовки.

[0101] В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению доставляют в различные целевые ткани у субъекта. Таким образом, настоящее изобретение может применяться в качестве неинвазивного средства облегчения доставки требуемого белка или пептида и/или за счет этого продуцирования кодируемых белков или пептидов в целевой ткани. Способы и композиция, описанные в данном документе, применимы в контроле и лечении большого числа заболеваний, которые являются результатом дефицитов как секретируемых, так и несекретируемых белков и/или ферментов.

[0102] В некоторых вариантах осуществления ректальная доставка инкапсулированной в липид мРНК приводит к продуцированию требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в кровообращении, печени, почке, толстой кишке, прямой кишке, сердце и/или селезенке. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления инкапсулированная в липид мРНК приводит к продуцированию требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в кровообращении. В некоторых вариантах осуществления инкапсулированная в липид мРНК приводит к продуцированию требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в печени. В некоторых вариантах осуществления инкапсулированная в липид мРНК приводит к продуцированию требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в почке. В некоторых вариантах осуществления инкапсулированная в липид мРНК приводит к продуцированию требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в толстой кишке. В некоторых вариантах осуществления инкапсулированная в липид мРНК приводит к продуцированию требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в прямой кишке. В некоторых вариантах осуществления инкапсулированная в липид мРНК приводит к продуцированию требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в сердце. В некоторых вариантах осуществления инкапсулированная в липид мРНК приводит к продуцированию требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в селезенке.

[0103] В некоторых вариантах осуществления ректальная доставка инкапсулированной в липид мРНК приводит к продуцированию требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в кровообращении, печени, почке, толстой кишке, прямой кишке, сердце и/или селезенке. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируется у субъекта через по меньшей мере приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 36 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 60 часов, приблизительно 72 часа, приблизительно 96 часов, приблизительно 120 часов, приблизительно 144 часа или приблизительно 168 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 6 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 12 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 18 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 36 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 60 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 120 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 144 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 168 часов после введения.

[0104] В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней или 10 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 1 день после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 2 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 3 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 4 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 5 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 6 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 7 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 8 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 9 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, продуцируются у субъекта через по меньшей мере приблизительно 10 дней после введения.

[0105] В некоторых вариантах осуществления ректальная доставка инкапсулированной в липид мРНК приводит к выявлению требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в кровообращении, печени, почке, толстой кишке, прямой кишке, сердце и/или селезенке. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления ректальная доставка инкапсулированной в липид мРНК приводит к выявлению требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в кровообращении. В некоторых вариантах осуществления ректальная доставка инкапсулированной в липид мРНК приводит к выявлению требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в печени. В некоторых вариантах осуществления ректальная доставка инкапсулированной в липид мРНК приводит к выявлению требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в почке. В некоторых вариантах осуществления ректальная доставка инкапсулированной в липид мРНК приводит к выявлению требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в толстой кишке. В некоторых вариантах осуществления ректальная доставка инкапсулированной в липид мРНК приводит к выявлению требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в прямой кишке. В некоторых вариантах осуществления ректальная доставка инкапсулированной в липид мРНК приводит к выявлению требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в сердце. В некоторых вариантах осуществления ректальная доставка инкапсулированной в липид мРНК приводит к выявлению требуемых белка или пептида, кодируемых мРНК, в селезенке.

[0106] В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 36 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 60 часов, приблизительно 72 часа, приблизительно 96 часов, приблизительно 120 часов, приблизительно 144 часа или приблизительно 168 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 6 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 12 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 18 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 36 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 60 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 120 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 144 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 168 часов после введения.

[0107] В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней или 10 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 1 день после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта по меньшей мере приблизительно 2 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта по меньшей мере приблизительно 3 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта по меньшей мере приблизительно 4 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта по меньшей мере приблизительно 5 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта по меньшей мере приблизительно 6 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта по меньшей мере приблизительно 7 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта по меньшей мере приблизительно 8 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта по меньшей мере приблизительно 9 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению у субъекта по меньшей мере приблизительно 10 дней после введения.

[0108] В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 36 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 60 часов, приблизительно 72 часа, приблизительно 96 часов или приблизительно 120 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 6 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 12 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 18 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 36 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 60 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 120 часов после введения.

[0109] В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней или 10 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 1 день после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 2 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 3 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 4 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 5 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 6 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 7 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 8 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 9 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, кодируемые мРНК, поддаются выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 10 дней после введения.

[0110] В некоторых вариантах осуществления инкапсулированная в липид мРНК способна транслоцироваться после ректальной доставки (например, перемещаться в интактном состоянии с помощью активных или пассивных средств) в системный кровоток и впоследствии достигать различных клеток или целевых тканей.

[0111] Таким образом, в некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрен способ доставки матричной РНК (мРНК) субъекту для продуцирования белка или пептида in vivo у субъекта, включающий введение субъекту с помощью чресслизистой доставки композиции, содержащей мРНК, которые кодирует белок или пептид и инкапсулирована в липидную наночастицу, и где мРНК поддается выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или приблизительно 96 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления продуцирование белка или пептида in vivo происходит в кровообращении, печени, почке, толстой кишке и/или прямой кишке субъекта. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления продуцирование in vivo доставляемой ректальным путем инкапсулированной в липид мРНК происходит в кровообращении субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование in vivo доставляемой ректальным путем инкапсулированной в липид мРНК происходит в печени субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование in vivo доставляемой ректальным путем инкапсулированной в липид мРНК происходит в почке субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование in vivo доставляемой ректальным путем инкапсулированной в липид мРНК происходит в толстой кишке субъекта. В некоторых вариантах осуществления продуцирование in vivo доставляемой ректальным путем инкапсулированной в липид мРНК происходит в прямой кишке субъекта.

[0112] В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в кровообращении, печени, почке, толстой кишке, прямой кишке, сердце и/или селезенке субъекта. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в кровообращении субъекта. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в печени субъекта. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в почке субъекта. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в толстой кишке субъекта. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в прямой кишке субъекта. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в сердце субъекта. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению в селезенке субъекта.

[0113] В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 36 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 60 часов, приблизительно 72 часа, приблизительно 96 часов или приблизительно 120 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 6 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 12 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 18 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 24 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 36 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 48 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 60 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 72 часа после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 96 часов после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 120 часов после введения.

[0114] В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней или 10 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 1 день после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 2 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 3 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 4 дня после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 5 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 6 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 7 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 8 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 9 дней после введения. В некоторых вариантах осуществления мРНК поддается выявлению у субъекта через по меньшей мере приблизительно 10 дней после введения.

Композиция состава

[0115] В настоящем изобретении предусмотрены, среди прочего, эффективные композиции для доставки матричной РНК (мРНК) посредством ректальной доставки. Композиция, описанные в данном документе, применимы для доставки мРНК через ткани слизистой оболочки, например, через прямую кишку.

[0116] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит мРНК, которая кодирует белок или пептид, инкапсулированную в липидную наночастицу. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит компонент суппозитория. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит усилитель проницаемости.

Суппозиторий

[0117] Композиции для ректального или вагинального (например, трансвагинального) введения, как правило, представляют суппозитории, которые могут быть получены путем смешивания композиций с подходящими нераздражающими вспомогательными веществами, такими как масло какао, полимеры, гидрогель, глицерин, желатин, полиэтиленгликоль или суппозиторный воск, которые являются твердыми при температуре окружающей среды, но становятся жидкими при температуре тела, и поэтому расплавляются в полости прямой кишки или влагалища и высвобождают активный ингредиент. Типы применяемого материала зависят от типа суппозитория, типа лекарственного средства и условий, при которых суппозиторий будет храниться.

[0118] В настоящем изобретении предусмотрен, среди прочего, суппозиторий для эффективной доставки мРНК, инкапсулированной в липидной наночастице, посредством чресслизистого пути, такого как, например, ректальный, вагинальный, глазной, пероральный и/или желудочно-кишечный путь. В некоторых вариантах осуществления инкапсулированную в липид мРНК доставляют посредством ректального или вагинального пути. Суппозиторий, описанный в данном документе, содержащий липидную наночастицу и мРНК, является твердым при комнатной температуре и плавится после введения ректальным или вагинальным путем. Плавление суппозитория после помещения в прямую кишку или влагалище обеспечивает эффективное высвобождение загруженных мРНК липидных наночастиц.

[0119] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий охлаждают перед введением.

[0120] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится при приблизительно 30-42°C. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится при приблизительно 32-40°C. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится при приблизительно 34-38°C. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится при приблизительно 36-37°C. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится при приблизительно 36°C. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится при приблизительно 37°C.

[0121] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится в течение 30 минут после введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится в течение 20 минут после введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится в течение 15 минут после введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится в течение 10 минут после введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится в течение 5 минут после введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится в течение 3 минут после введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий размягчается или плавится в течение 1 минуты после введения субъекту.

[0122] В качестве неограничивающего примера, составы для ректального и/или вагинального введения могут быть получены путем смешивания лекарственного средства с подходящим нераздражающим вспомогательным веществом, которое является твердым при обычных температурах, но жидкими при температуре в прямой кишке, и поэтому расплавляются в прямой кишке и/или влагалище с высвобождением лекарственного средства. Такие материалы включают масло какао и полиэтиленгликоли.

[0123] Фармацевтическая композиция для ректального или вагинального введения может содержать по меньшей мере один неактивный ингредиент. Любой или никакой из применяемых неактивных ингредиентов может быть одобрен Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA). Неисчерпывающий перечень неактивных ингредиентов для применения в фармацевтических композициях для ректального или вагинального введения включает метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, полоксамеры, поливиниловые спирты, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, полиэтиленоксиды, модифицированные крахмалы, адипиновую кислоту, денатурированный спирт, аллантоин, безводную лактозу, сложные PEG-6 эфиры масла абрикосовых косточек, сульфат бария, пчелиный воск, бентонит, бензойную кислоту, бензиловый спирт, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, лактат кальция, карбомер 934, карбомер 934p, микрокристаллическую целлюлозу, цетет-20, цетостеариловый спирт, цетиловый спирт, воск на основе сложных цетиловых эфиров, цетилпальмитат, холестерин, холет, лимонную кислоту, моногидрат лимонной кислоты, гидрогенизированные глицериды кокосового масла/пальмоядрового масла, кросповидон, динатрия эдетат, этилцеллюлозы, сополимер этилена и винилацетата (28% винилацетата), сополимер этилена и винилацетата (9% винилацетата), жирные спирты, FD&C желтый № 5, желатин, dl-глутаминовую кислоту, глицерин, глицерилизостеарат, глицерилмоностеарат, глицерилстеарат, гуаровую камедь, полиэтилен высокой плотности, гидрогелевый полимер, гидрогенизированное пальмовое масло, гипромеллозу 2208 (15000 мПа с), гипромеллозы, изопропилмиристат, молочную кислоту, dl-молочную кислоту, лактозу, моногидрат лактозы, водную лактозу, ланолин, безводный ланолин, лецитин, соевый лецитин, легкое минеральное масло, алюмосиликат магния, гидрат алюмосиликата магния, стеарат магния, метилстеарат, метилпарабен, микрокристаллический воск, минеральное масло, азотную кислоту, октилдодеканол, арахисовое масло, PEG-6-32-стеарат/гликоль стеарат, PEG-100-стеарат, PEG-120-глицерилстеарат, PEG-2-стеарат, PEG-5-олеат, пегоксол-7-стеарат, белый вазелин, ацетат фенилртути, фосфолипон 90g, фосфорную кислоту, гексагидрат пиперазина, поли(диметилсилоксан/метилвинилсилоксан/метилгидрогенсилоксан) c концевым блоком из диметилвинила, или диметилгидрокси, или триметила, поликарбофил, сложный полиэфир, полиэтиленгликоль 1000, полиэтиленгликоль 3350, полиэтиленгликоль 400, полиэтиленгликоль 4000, полиэтиленгликоль 6000, полиэтиленгликоль 8000, полиглицерил-3-олеат, полиглицерил-4-олеат, полиоксилпальмитат, полисорбат 20, полисорбат 60, полисорбат 80, полиуретан, калиевые квасцы, гидроксид калия, повидон k29/32, повидоны, промульген D, пропиленгликоль, пропиленгликольмонопальмитостеарат, пропилпарабен, цис-форма кватерниума-15, диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния, силикон, бикарбонат натрия, цитрат натрия, гидроксид натрия, лаурилсульфат натрия, метабисульфит натрия, безводный гидрофосфат натрия, безводный дигидрофосфат натрия, сорбиновую кислоту, сорбитанмоностеарат, сорбитол, раствор сорбитола, спермацет, 2-этилгексаноат олова, крахмал, прежелатинизированный крахмал 1500, кукурузный крахмал, стеарамидоэтилдиэтиламин, стеариновую кислоту, стеариловый спирт, dl-винную кислоту, трет-бутилгидрохинон, тетрапропилортосиликат, троламин, мочевину, гидрогенизированное растительное масло, Wecobee FS, белый церезиновый воск и белый воск.

[0124] В некоторых вариантах осуществления в составах применяется желатин-водная система для сохранения липидных наночастиц интактными. Водный раствор желатина является мукоадгезивным и может содействовать контакту суппозитория с мембраной слизистой оболочки. Таким образом, присутствие желатина будет содействовать транслокации нагруженных мРНК липидных наночастиц в системное кровообращение. Кроме того, раствор желатина представляет собой гель при комнатной температуре, что, в свою очередь, предотвращает вытекание нагруженных мРНК наночастиц из прямой кишки. Кроме того, желатин постепенно плавится при физиологической температуре, что позволяет нагруженным мРНК липидным наночастицам вступать в контакт с мембраной слизистой оболочки.

[0125] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 1% желатина в воде или больше, 3% желатина в воде или больше, 5% желатина в воде или больше, 10% желатина в воде или больше, 15% желатина в воде или больше, 20% желатина в воде или больше, 30% желатина в воде или больше, 40% желатина в воде или больше, 50% желатина в воде или больше, 60% желатина в воде или больше, 70% желатина в воде или больше, 80% желатина в воде или больше, 90% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 1% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 3% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 5% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 10% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 15% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 20% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 30% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 40% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 50% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 60% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 70% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 80% желатина в воде или больше. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит приблизительно 90% желатина в воде или больше.

[0126] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий не оказывает негативного влияния на целостность липидных наночастиц.

[0127] В некоторых вариантах осуществления композиция не содержит компонент суппозитория на липидной основе. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит компонент суппозитория на липидной основе. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой масло какао, теобромовое масло, синтетические жиры или синтетические основы. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой масло какао, теобромовое масло, синтетические жиры или синтетические основы. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой масло какао. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой теобромовое масло. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой синтетические жиры. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на липидной основе представляет собой синтетические основы.

[0128] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит компонент суппозитория на водной основе. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на водной основе выбран из глицерина, желатина или полиэтиленгликоля (PEG) или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на водной основе представляет собой глицерин. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на водной основе представляет собой желатин. В некоторых вариантах осуществления компонент суппозитория на водной основе представляет собой полиэтиленгликоль (PEG). В некоторых вариантах осуществления единственным компонентом суппозитория на водной основе является желатин.

[0129] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит глицерин и/или PEG. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит глицерин. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит PEG. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 10% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 8% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 6% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 4% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 2% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 1% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 0,1% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 10% PEG. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 8% PEG. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 6% PEG. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 4% PEG. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 2% PEG. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 1% PEG. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 0,1% PEG.

[0130] В некоторых вариантах осуществления суппозиторий дополнительно содержит глицерин. В некоторых вариантах осуществления количество глицерина, присутствующего в суппозитории, не разрушает липидные наночастицы. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий не содержит глицерин. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 30% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 20% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 15% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 10% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 8% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 6% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 4% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 2% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 1% глицерина. . В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 0,5% глицерина. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит менее приблизительно 0,1% глицерина.

[0131] В настоящем изобретении предусмотрен, среди прочего, суппозиторий для ректального введения мРНК. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий содержит мРНК, инкапсулированную в липидную наночастицу, где мРНК кодирует белок или пептид, и желатин.

[0132] Суппозиторий, описанный в данном документе, составляют для содержания различных концентраций мРНК, при этом его размер обеспечивает удобное и неинвазивное введение посредством ректальной или вагинальной доставки. Такие неинвазивные пути доставки неожиданно обеспечивают эффективные средства для удобной доставки терапевтических композиций.

[0133] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,25 мг/мл мРНК или больше, 0,5 мг/мл мРНК или больше, 0,75 мг/мл мРНК или больше или 1 мг/мл мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,1 мг/мл мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,25 мг/мл мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,5 мг/мл мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,75 мг/мл мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 1 мг/мл мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 2 мг/мл мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 2,5 мг/мл мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 5 мг/мл мРНК или больше.

[0134] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,5 мг мРНК или больше, 0,75 мг мРНК или больше, 1 мг мРНК или больше, 1,25 мг мРНК или больше, 1,5 мг мРНК или больше или 1,75 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,1 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,25 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,5 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,75 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 1 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 1,25 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 1,5 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 1,75 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 2 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 2,5 мг мРНК или больше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 5 мг мРНК или больше.

[0135] В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 3 грамма, приблизительно 2 грамма или приблизительно 1 грамм. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 20 грамма. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 10 грамма. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 5 грамма. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 3 грамма. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 2 грамма. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 1 грамм. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 0,5 грамма.

[0136] В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 2,0 мл, приблизительно 3,5 мл, приблизительно 7,5 мл или приблизительно 10,0 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 1,0 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 2,0 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 2,5 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 3,0 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 3,5 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 4,0 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 5,0 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 7,5 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 10,0 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 12,5 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 15,0 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 17,5 мл. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена для суппозитория, имеющего объем приблизительно 20,0 мл.

Усилители проницаемости

[0137] Для улучшения биодоступности лекарственных средств с неудовлетворительным всасыванием при чресслизистых путях (например, ректальном, вагинальном, глазном, пероральном или желудочно-кишечном) следует применять усилители проникновения или проницаемости. В некоторых вариантах осуществления для ректального или вагинального введения суппозиторий дополнительно содержит усилитель проницаемости. В некоторых вариантах осуществления суппозиторий не содержит усилитель проницаемости. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости не оказывает негативного влияния на целостность липидной наночастицы.

[0138] В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости выбран из солей желчных кислот, поверхностно-активных веществ, жирных кислот и производных, глицеридов, хелаторов, салицилатов или полимеров. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой соль желчной кислоты. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой жирную кислоту и ее производные. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой глицериды. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой хелатор. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой салицилат. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой полимер.

[0139] В некоторых вариантах осуществления жирные кислоты и производные выбраны из лаурата сорбитана, капрата натрия, сахарозы, пальмитата, лауроилхолина, миристата натрия или пальмитоилкарнитина. В некоторых вариантах осуществления жирные кислоты и производные включают лаурат сорбитана. В некоторых вариантах осуществления жирные кислоты и производные включают капрат натрия. В некоторых вариантах осуществления жирные кислоты и производные представляют собой сахарозу. В некоторых вариантах осуществления жирные кислоты и производные включают пальмитат. В некоторых вариантах осуществления жирные кислоты и производные включают лауроилхолин. В некоторых вариантах осуществления жирные кислоты и производные включают миристат натрия. В некоторых вариантах осуществления жирные кислоты и производные включают пальмитоилкарнитин.

[0140] В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой форму капрата. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости на основе капрата представляет собой капрат натрия.

[0141] В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости включает холаты. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой лимонную кислоту. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой олеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой капраты. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой поверхностно-активные вещества. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой додецилсульфат натрия (SDS). В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой Cremophor®. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой Tween® 80. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой Labrasol®. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой самомикроэмульгирующуюся систему доставки лекарственного средства (SMEDDS). В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой природные биоусилители. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой аллицин. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой пиперин. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой куркумин. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости представляет собой кверцетин.

[0142] Было разработано несколько разных составов композиции на основе инкапсулированной в липид мРНК для облегчения доставки субъекту, включая введение усилителя проницаемости перед введением композиции, содержащей мРНК. Введение усилителя проницаемости облегчает перенос нагруженных мРНК липидных наночастиц из толстой кишки в системное кровообращение.

[0143] В некоторых вариантах осуществления субъекту сначала вводят усилитель проницаемости перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 30 минут, приблизительно 1 час, приблизительно 2,5 часа, приблизительно 5 часов или приблизительно 12 часов перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 1 минуту перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 3 минуты перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 5 минут перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 10 минут перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 15 минуты перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 20 минут перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 25 минут перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 30 минут перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 45 минут перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 1 час перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 1,5 часа перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 2 часа перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 2,5 часа перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 5 часов перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 12 часов перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 18 часов перед введением композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту за приблизительно 24 часа перед введением композиции, содержащей мРНК.

[0144] В некоторых вариантах осуществления усилитель проницаемости вводят субъекту одновременно с композицией, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 5 минут после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 10 минут после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 15 минут после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 20 минут после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 30 минут после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 45 минут после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 1 час после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 2 часа после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 2,5 часа после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 5 часов после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 12 часов после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 18 часов после введения композиции, содержащей мРНК. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят усилитель проницаемости через приблизительно 24 часа после введения композиции, содержащей мРНК.

Синтез мРНК

[0145] мРНК в соответствии с настоящим изобретением могут быть синтезированы в соответствии с любым из ряда известных способов. Различные способы описаны в опубликованной заявке на патент США № US 2018/0258423 и могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения на практике, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Например, мРНК в соответствии с настоящим изобретением могут быть синтезированы посредством транскрипции in vitro (IVT). Вкратце, IVT, как правило, осуществляют с использованием линейной или кольцевой ДНК-матрицы, содержащей промотор, пула рибонуклеотидных трифосфатов, буферной системы, которая может содержать DTT и ионы магния, и соответствующей РНК-полимеразы (например, РНК-полимеразы T3, T7 или SP6), ДНКазы I, пирофосфатазы и/или ингибитора РНКазы. Точные условия будут меняться в зависимости от специфического применения.

[0146] В некоторых вариантах осуществления подходящей последовательностью мРНК является последовательность мРНК, кодирующая белок или пептид. В некоторых вариантах осуществления подходящая последовательность мРНК является кодон-оптимизированной для эффективной экспрессии в человеческих клетках. В некоторых вариантах осуществления подходящей последовательностью мРНК является встречающаяся в природе последовательность или последовательность дикого типа. В некоторых вариантах осуществления подходящая последовательность мРНК кодирует белок или пептид, которые содержат одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности.

[0147] Настоящее изобретение можно применять для доставки мРНК различной длины. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение можно применять для доставки синтезированной in vitro мРНК длиной более приблизительно 0,5 т. о., 1 т. о., 1,5 т. о., 2 т. о., 2,5 т. о., 3 т. о., 3,5 т. о., 4 т. о., 4,5 т. о., 5 т. о., 6 т. о., 7 т. о., 8 т. о., 9 т. о., 10 т. о., 11 т. о., 12 т. о., 13 т. о., 14 т. о., 15 т. о., 20 т. о., 30 т. о., 40 т. о. или 50 т. о. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение можно применять для доставки синтезированной in vitro мРНК длиной, находящейся в диапазоне приблизительно 1-20 т. о., приблизительно 1-15 т. о., приблизительно 1-10 т. о., приблизительно 5-20 т. о., приблизительно 5-15 т. о., приблизительно 5-12 т. о., приблизительно 5-10 т. о., приблизительно 8-20 т. о. или приблизительно 8-50 т. о.

[0148] В некоторых вариантах осуществления для получения мРНК в соответствии с настоящим изобретением ДНК-матрицу транскрибируют in vitro. Подходящая ДНК-матрица, как правило, содержит промотор, например, промотор для T3, T7 или SP6, для транскрипции in vitro, за которым следует требуемая нуклеотидная последовательность для требуемой мРНК и сигнал терминации.

Нуклеотиды

[0149] Различные встречающиеся в природе или модифицированные нуклеозиды можно применять для получения мРНК в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления мРНК представляет собой или содержит встречающиеся в природе нуклеозиды (или немодифицированные нуклеотиды; например, аденозин, гуанозин, цитидин, уридин); аналоги нуклеозидов (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, C5-пропинилцитидин, C5-пропинилуридин, 2-аминоаденозин, C5-бромуридин, C5-фторуридин, C5-йодуридин, C5-пропинилуридин, C5-пропинилцитидин, C5-метилцитидин, 2-аминоаденозин, 7-дезазааденозин, 7-дезазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, O(6)-метилгуанин, псевдоуридин (например, N-1-метил-псевдоуридин), 2-тиоуридин и 2-тиоцитидин); химически модифицированные основания; биологически модифицированные основания (например, метилированные основания); интеркалированные основания; модифицированные сахара (например, 2’-фторрибозу, рибозу, 2’-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу) и/или модифицированные фосфатные группы (например, фосфотиоаты и 5′-N-фосфорамидитные связи).

[0150] В некоторых вариантах осуществления подходящая мРНК может содержать модификации остова, модификации сахара и/или модификации основания. Например, модифицированные нуклеотиды могут включать без ограничения модифицированные пурины (аденин (A), гуанин (G)) или пиримидины (тимин (T), цитозин (C), урацил (U)) и в качестве модифицированных нуклеотидов аналоги или производные пуринов и пиримидинов, такие как, например, 1-метиладенин, 2-метиладенин, 2-метилтио-N-6-изопентениладенин, N6-метиладенин, N6-изопентениладенин, 2-тиоцитозин, 3-метилцитозин, 4-ацетилцитозин, 5-метилцитозин, 2,6-диаминопурин, 1-метилгуанин, 2-метилгуанин, 2,2-диметилгуанин, 7-метилгуанин, инозин, 1-метилинозин, псевдоурацил (5-урацил), дигидроурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-(карбоксигидроксиметил)-урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, 5-метил-2-тиоурацил, 5-метилурацил, сложный метиловый эфир N-урацил-5-оксиуксусной кислоты, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, сложный метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота (v), 1-метилпсевдоурацил, квеуозин, бета-D-маннозилквеуозин, вибутоксозин, а также фосфороамидаты, фосфотиоаты, пептидные нуклеотиды, метилфосфонаты, 7-деазагуанозин, 5-метилцитозин и инозин. Получение таких аналогов известно специалисту в данной области техники, например, из патента США № 4373071, патента США № 4401796, патента США № 4415732, патента США № 4458066, патента США № 4500707, патента США № 4668777, патента США № 4973679, патента США № 5047524, патента США № 5132418, патента США № 5153319, патента США №№ 5262530 и 5700642, раскрытия которых включены посредством ссылки во всей своей полноте.

[0151] В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит один или несколько нестандартных нуклеотидных остатков. Нестандартные нуклеотидные остатки могут включать, например, 5-метилцитидин ("5mC"), псевдоуридин ("ψU") и/или 2-тиоуридин ("2sU"). Обсуждение таких остатков и их включения в мРНК см., например, в патенте США № 8278036 или WO 2011/012316. мРНК может представлять собой РНК, которая определяется как РНК, в которой 25% остатков U представляют собой 2-тиоуридин, а 25% остатков C представляют собой 5-метилцитидин. Указания по применению РНК раскрыты в публикации заявки на патент США US 2012/0195936 и публикации международной заявки WO 2011/012316, обе из которых настоящим включены посредством ссылки во всей своей полноте. Наличие нестандартных нуклеотидных остатков может сделать мРНК более стабильной и/или менее иммуногенной, чем контрольная мРНК с той же последовательностью, но содержащая только стандартные остатки. В дополнительных вариантах осуществления мРНК может содержать один или несколько нестандартных нуклеотидных остатков, выбранных из изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-бромурацила, 5-пропинилурацила, 6-аминопурина, 2-аминопурина, инозина, диаминопурина и 2-хлор-6-аминопуринцитозина, а также комбинаций этих модификаций и других модификаций азотистых оснований. Некоторые варианты осуществления могут дополнительно включать дополнительные модификации фуранозного кольца или азотистого основания. Дополнительные модификации могут включать, например, модификации или замены сахаров (например, одно или несколько из 2'-O-алкильной модификации, запертой нуклеиновой кислоты (LNA)). В некоторых вариантах осуществления РНК могут образовывать комплексы или гибридизоваться с дополнительными полинуклеотидами и/или пептидными полинуклеотидами (PNA). В некоторых вариантах осуществления, если модификация сахара представляет собой 2'-O-алкильную модификацию, такая модификация может включать без ограничения 2'-дезокси-2'-фтор-модификацию, 2'-O-метильную модификацию, 2′-O-метоксиэтильную модификацию и 2′-дезокси-модификацию. В некоторых вариантах осуществления любая из этих модификаций может присутствовать в 0-100% нуклеотидов, например в более чем 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% или 100% входящих в состав нуклеотидов по отдельности или в комбинации.

[0152] В некоторых вариантах осуществления мРНК могут содержать модификации остова РНК. Как правило, модификация остова представляет собой модификацию, при которой химически модифицированы фосфаты в остове нуклеотидов, содержащихся в РНК. Иллюстративные модификации остова, как правило, включают без ограничения модификации из группы, состоящей из метилфосфонатов, метилфосфороамидатов, фосфороамидатов, фосфотиоатов (например, цитидин-5'-O-(1-тиофосфат)), боранофосфатов, положительно заряженных групп гуанидиния и т. д., что означает замену фосфодиэфирной связи другими анионными, катионными или нейтральными группами.

[0153] В некоторых вариантах осуществления мРНК могут содержать модификации сахара. Типичная модификация сахара представляет собой химическую модификацию сахара в содержащих его нуклеотидах, включая без ограничения модификации сахара, выбранные из группы, состоящей из 2'-дезокси-2'-фтор-олигорибонуклеотида (2'-фтор-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата, 2'-фтор-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата), 2'-дезокси-2'-дезаминолигорибонуклеотида (2'-амино-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата, 2'-амино-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата), 2'-O-алкилолигорибонуклеотида, 2'-дезокси-2'-C-алкилолигорибонуклеотида (2'-O-метилцитидин-5'-трифосфата, 2'-метилуридин-5'-трифосфата), 2'-C-алкилолигорибонуклеотида и его изомеров (2'-арацитидин-5'-трифосфата, 2'-арауридин-5'-трифосфата) или азидотрифосфатов (2'-азидо-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата, 2'-азидо-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата).

Постсинтетический процессинг

[0154] Как правило, после синтеза могут добавляться 5’-кэп и/или 3’-хвост. Присутствие кэпа важно для обеспечения устойчивости к нуклеазам, обнаруживаемым в большинстве эукариотических клеток. Присутствие "хвоста" служит для защиты мРНК от разрушения экзонуклеазой.

[0155] 5’-кэп обычно добавляется следующим образом: вначале терминальная РНК-фосфатаза удаляет из 5’-нуклеотида одну из концевых фосфатных групп, оставляя два концевых фосфата, затем гуанилилтрансфераза добавляет к концевым фосфатам гуанозинтрифосфат (ГТФ), образуя 5'5'5-трифосфатную связь; а затем метилтрансфераза метилирует атом азота в положении 7 гуанина. Примеры кэп-структур включают без ограничения m7G(5’)ppp (5’(A, G(5’)ppp(5’)A и G(5’)ppp(5’)G. Дополнительные кэп-структуры описаны в опубликованной заявке на патент США № US 2016/0032356 и опубликованной заявке на патент США № US 2018/0125989, которые включены в данный документ посредством ссылки.

[0156] Как правило, хвостовая структуры включает поли(A)- и/или поли(C)-хвост. Поли(А)- или поли(С)-хвост на 3’-конце мРНК, как правило, содержит по меньшей мере 50 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 150 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 200 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 250 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 300 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 350 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 400 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 450 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 500 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 550 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 650 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 700 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 750 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 800 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 850 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 900 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, по меньшей мере 950 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, или по меньшей мере 1 т. о. аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов соответственно. В некоторых вариантах осуществления поли(A)- или поли(C)-хвост может составлять приблизительно 10-800 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов (например, приблизительно 10-200 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 10-300 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 10-400 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 10-500 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 10-550 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 10-600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 50-600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 100-600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 150-600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 200-600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 250-600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 300-600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 350-600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 400-600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 450-600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 500-600 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 10-150 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 10-100 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов, приблизительно 20-70 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов или приблизительно 20-60 аденозиновых или цитозиновых нуклеотидов) соответственно. В некоторых вариантах осуществления хвостовая структура включает комбинацию поли(A)- и поли(С)-хвостов различной длины, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления хвостовая структура включает по меньшей мере 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аденозиновых нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления хвостовая структура включает по меньшей мере 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% цитозиновых нуклеотидов.

[0157] Как описано в данном документе, добавление 5’-кэпа и/или 3’-хвоста облегчает выявление абортивных транскриптов, образованных во время синтеза in vitro, поскольку без кэпирования и/или присоединения хвоста размер этих преждевременно прерванных транскриптов мРНК может быть слишком мал, чтобы быть выявленным. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления 5’-кэп и/или 3’-хвост добавляют к синтезированной мРНК перед тестированием мРНК в отношении чистоты (например, определения уровня абортивных транскриптов, присутствующих в мРНК). В некоторых вариантах осуществления 5’-кэп и/или 3’-хвост добавляют к синтезированной мРНК перед очисткой мРНК, как описано в данном документе. В других вариантах осуществления 5’-кэп и/или 3’-хвост добавляют к синтезированной мРНК после очистки мРНК, как описано в данном документе.

[0158] мРНК, синтезированную в соответствии с настоящим изобретением, можно применять без дополнительной очистки. В частности, мРНК, синтезированную в соответствии с настоящим изобретением, можно применять без стадии удаления шортмеров. В некоторых вариантах осуществления мРНК, синтезированную в соответствии с настоящим изобретением, можно дополнительно очищать. Для очистки мРНК, синтезированной в соответствии с настоящим изобретением, можно применять различные способы. Например, очистку мРНК можно проводить с использованием способов на основе центрифугирования, фильтрации и/или хроматографии. В некоторых вариантах осуществления синтезированную мРНК очищают с помощью осаждения этанолом, или фильтрации, или хроматографии, или очистки в геле, или любым другим подходящим способом. В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают с помощью HPLC. В некоторых вариантах осуществления мРНК экстрагируют стандартным раствором фенола:хлороформа:изоамилового спирта, хорошо известным специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают с использованием фильтрации в тангенциальном потоке. Подходящие способы включают описанные в опубликованной заявке на патент США № US 2016/0040154, опубликованной заявке на патент США № US 2015/0376220, опубликованной заявке на патент США № US 2018/0251755, опубликованной заявке на патент США № US 2018/0251754, предварительной заявке на патент США № 62/757612, поданной 8 ноября 2018 г., и предварительной заявке на патент США № 62/891781 поданной 26 августа 2019 г., все из которых включены в данный документ посредством ссылки и могут применяться для осуществления настоящего изобретения на практике.

[0159] В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают до кэпирования и присоединения хвоста. В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают после кэпирования и присоединения хвоста. В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают как до кэпирования и присоединения хвоста, так и после этого.

[0160] В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают либо до кэпирования и присоединения хвоста, либо после этого, либо до и после этого с помощью центрифугирования.

[0161] В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают либо до кэпирования и присоединения хвоста, либо после этого, либо до и после этого с помощью фильтрации.

[0162] В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают либо до кэпирования и присоединения хвоста, либо после этого, либо до и после этого с помощью фильтрации в тангенциальном потоке (TFF).

[0163] В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают либо до кэпирования и присоединения хвоста, либо после этого, либо до и после этого с помощью хроматографии.

Определение характеристик очищенной мРНК

[0164] Композиция на основе мРНК, описанная в данном документе, практически не содержит загрязняющих примесей, содержащих короткие молекулы абортивной РНК, длинные молекулы абортивной РНК, двухнитевую РНК (dsRNA), остаточную плазмидную ДНК, остаточные ферменты для транскрипции in vitro, остаточный растворитель и/или остаточную соль.

[0165] Композиция на основе мРНК, описанная в данном документе, характеризуется чистотой, составляющей от приблизительно 60% до приблизительно 100%. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 60%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 65%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 70%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 75%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 80%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 85%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 90%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 91%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 92%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 93%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 94%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 95%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 96%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 97%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 98%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 99%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 100%.

[0166] В некоторых вариантах осуществления композиция на основе мРНК, описанная в данном документе, имеет менее 10%, менее 9%, менее 8%, менее 7%, менее 6%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1%, менее 0,5% и/или менее 0,1% примесей, отличных от полноразмерной мРНК. Примеси включают загрязняющие примеси IVT, например, белки, ферменты, ДНК-матрицы, свободные нуклеотиды, остаточный растворитель, остаточную соль, двухнитевую РНК (dsRNA), преждевременно прерванные последовательности РНК ("шортмеры" или "короткие молекулы абортивной РНК") и/или длинные молекулы абортивной РНК. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК практически не содержит ферменты, применяемые в способе.

[0167] В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК по настоящему изобретению составляет менее приблизительно 1 пг/мг, менее приблизительно 2 пг/мг, менее приблизительно 3 пг/мг, менее приблизительно 4 пг/мг, менее приблизительно 5 пг/мг, менее приблизительно 6 пг/мг, менее приблизительно 7 пг/мг, менее приблизительно 8 пг/мг, менее приблизительно 9 пг/мг, менее приблизительно 10 пг/мг, менее приблизительно 11 пг/мг или менее приблизительно 12 пг/мг. Соответственно, остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 1 пг/мг. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 2 пг/мг. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 3 пг/мг. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 4 пг/мг. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 5 пг/мг. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 6 пг/мг. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 7 пг/мг. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 8 пг/мг. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 9 пг/мг. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 10 пг/мг. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 11 пг/мг. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в очищенной мРНК составляет менее приблизительно 12 пг/мг.

[0168] В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению обеспечивает удаление более приблизительно 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или практически всех преждевременно прерванных последовательностей РНК (также известных как "шортмеры"). В некоторых вариантах осуществления композиция на основе мРНК практически не содержит преждевременно прерванных последовательностей РНК. В некоторых вариантах осуществления композиция на основе мРНК содержит менее приблизительно 5% (например, менее приблизительно 4%, 3%, 2% или 1%) преждевременно прерванных последовательностей РНК. В некоторых вариантах осуществления композиция на основе мРНК содержит менее приблизительно 1% (например, менее приблизительно 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% или 0,1%) преждевременно прерванных последовательностей РНК. В некоторых вариантах осуществления композиция на основе мРНК содержит не поддающиеся выявлению преждевременно прерванные последовательности РНК, что установлено, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (например, плечи пиков или отдельные пики), бромида этидия, окрашивания Кумасси, капиллярного электрофореза или гель-электрофореза с денатурацией глиоксалем (например, наличие отдельной полосы внизу). Используемые в данном документе термины "шортмеры", "короткие молекулы абортивной РНК", "преждевременно прерванные последовательности РНК" или "длинные молекулы абортивной РНК" относятся к любым транскриптам, длина которых меньше полноразмерных. В некоторых вариантах осуществления длина "шортмеров", "коротких молекул абортивной РНК" или "преждевременно прерванных последовательностей РНК" составляет менее 100 нуклеотидов, менее 90 нуклеотидов, менее 80 нуклеотидов, менее 70 нуклеотидов, менее 60 нуклеотидов, менее 50 нуклеотидов, менее 40 нуклеотидов, менее 30 нуклеотидов, менее 20 нуклеотидов или менее 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления шортмеры выявляют или подвергают количественному определению после добавления 5'-кэпа и/или 3'-поли(A)-хвоста. В некоторых вариантах осуществления преждевременно прерванные транскрипты РНК содержат менее 15 оснований (например, менее 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 оснований). В некоторых вариантах осуществления преждевременно прерванные транскрипты РНК содержат приблизительно 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11 или 8-10 оснований.

[0169] В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК по настоящему изобретению практически не содержит ферментные реагенты, применяемые в синтезе in vitro, включая без ограничения РНК-полимеразу T7, ДНКазу I, пирофосфатазу и/или ингибитор РНКазы. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК в соответствии с настоящим изобретением содержит менее приблизительно 5% (например, менее приблизительно 4%, 3%, 2% или 1%) ферментных реагентов, включая применяемые в синтезе in vitro. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит менее приблизительно 1% (например, менее приблизительно 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% или 0,1%) ферментных реагентов, включая применяемые в синтезе in vitro. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит не поддающиеся выявлению ферментные реагенты, включая применяемые в синтезе in vitro, что установлено, например, с помощью окрашивания серебром, гель-электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) и/или капиллярного электрофореза, бромида этидия и/или окрашивания Кумасси.

[0170] В различных вариантах осуществления очищенная мРНК по настоящему изобретению сохраняет высокую степень целостности. Используемый в данном документе термин "целостность мРНК" обычно относится к качеству мРНК после очистки. Целостность мРНК можно определить с применением способов, хорошо известных из уровня техники, например, посредством электрофореза РНК в агарозном геле. В некоторых вариантах осуществления целостность мРНК можно определить по распределению полос при электрофорезе РНК в агарозном геле. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК по настоящему изобретению демонстрирует слабое образование полос или отсутствие полос по сравнению с эталонной полосой при электрофорезе РНК в агарозном геле. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК по настоящему изобретению характеризуется целостностью более приблизительно 95% (например, более приблизительно 96%, 97%, 98%, 99% или больше). В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК по настоящему изобретению характеризуется целостностью более 98%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК по настоящему изобретению характеризуется целостностью более 99%. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК по настоящему изобретению характеризуется целостностью примерно 100%.

[0171] В некоторых вариантах осуществления очищенную мРНК оценивают в отношении одной или нескольким из следующих характеристик: внешний вид, идентичность, количество, концентрация, наличие примесей, микробиологическая оценка, уровень pH и активность. В некоторых вариантах осуществления приемлемый внешний вид включает прозрачный бесцветный раствор, практически не содержащий видимых частиц. В некоторых вариантах осуществления идентичность мРНК оценивают посредством способов секвенирования. В некоторых вариантах осуществления концентрацию оценивают подходящим способом, таким как УФ-спектрофотометрия. В некоторых вариантах осуществления подходящая концентрация составляет от приблизительно 90% до 110% от номинальной (0,9-1,1 мг/мл).

[0172] В некоторых вариантах осуществления оценка чистоты мРНК включает оценку целостности мРНК, оценку уровня остаточной плазмидной ДНК и оценку уровня остаточного растворителя. В некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни целостности мРНК оценивают посредством электрофореза в агарозном геле. Гели анализируют для определения того, соответствует ли распределение полос и кажущаяся длина нуклеотидов аналитическому эталонному стандарту. Дополнительные способы оценки целостности РНК включают, например, оценку очищенной мРНК с применением капиллярного гель-электрофореза (CGE). В некоторых вариантах осуществления приемлемая чистота очищенной мРНК, определенная посредством CGE, является такой, что композиция на основе очищенной мРНК содержит не более приблизительно 55% длинных абортивных/расщепленных молекул. В некоторых вариантах осуществления уровень остаточной плазмидной ДНК оценивают посредством способов, известных из уровня техники, например, посредством применения qPCR. В некоторых вариантах осуществления приемлемый уровень остаточной плазмидной ДНК составляет менее 10 пг/мг (например, менее 10 пг/мг, менее 9 пг/мг, менее 8 пг/мг, менее 7 пг/мг, менее 6 пг/мг, менее 5 пг/мг, менее 4 пг/мг, менее 3 пг/мг, менее 2 пг/мг или менее 1 пг/мг). В некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни остаточного растворителя составляют не более 10000 ppm, 9000 ppm, 8000 ppm, 7000 ppm, 6000 ppm, 5000 ppm, 4000 ppm, 3000 ppm, 2000 ppm, 1000 ppm. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни остаточного растворителя составляют не более 10000 ppm. В некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни остаточного растворителя составляют не более 9000 ppm. В некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни остаточного растворителя составляют не более 8000 ppm. В некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни остаточного растворителя составляют не более 7000 ppm. В некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни остаточного растворителя составляют не более 6000 ppm. В некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни остаточного растворителя составляют не более 5000 ppm. В некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни остаточного растворителя составляют не более 4000 ppm. В некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни остаточного растворителя составляют не более 3000 ppm. В некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни остаточного растворителя составляют не более 2000 ppm. В некоторых вариантах осуществления приемлемые уровни остаточного растворителя составляют не более 1000 ppm.

[0173] В некоторых вариантах очищенную мРНК подвергают микробиологическим тестам, которые включают, например, оценку бактериальных эндотоксинов. В некоторых вариантах осуществления уровень бактериальных эндотоксинов составляет <0,5 ЕЭ/мл, <0,4 ЕЭ/мл, <0,3 ЕЭ/мл, <0,2 ЕЭ/мл или <0,1 ЕЭ/мл. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления уровень бактериальных эндотоксинов в очищенной мРНК составляет <0,5 ЕЭ/мл. В некоторых вариантах осуществления уровень бактериальных эндотоксинов в очищенной мРНК составляет <0,4 ЕЭ/мл. В некоторых вариантах осуществления уровень бактериальных эндотоксинов в очищенной мРНК составляет <0,3 ЕЭ/мл. В некоторых вариантах осуществления уровень бактериальных эндотоксинов в очищенной мРНК составляет <0,2 ЕЭ/мл. В некоторых вариантах осуществления уровень бактериальных эндотоксинов в очищенной мРНК составляет <0,2 ЕЭ/мл. В некоторых вариантах осуществления уровень бактериальных эндотоксинов в очищенной мРНК составляет <0,1 ЕЭ/мл. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит не более 1 КОЕ/10 мл, 1 КОЕ/25 мл, 1 КОЕ/50 мл, 1 КОЕ/75 мл или не более 1 КОЕ/100 мл. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит не более 1 КОЕ/10 мл. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит не более 1 КОЕ/25 мл. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит не более 1 КОЕ/50 мл. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит не более 1 КОЕ/75 мл. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит 1 КОЕ/100 мл.

[0174] В некоторых вариантах осуществления оценивают pH очищенной мРНК. В некоторых вариантах осуществления приемлемый pH очищенной мРНК составляет от 5 до 8. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется pH, составляющим приблизительно 5. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется pH, составляющим приблизительно 6. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется pH, составляющим приблизительно 7. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется pH, составляющим приблизительно 7. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК характеризуется pH, составляющим приблизительно 8.

[0175] В некоторых вариантах осуществления оценивают точность трансляции очищенной мРНК. Точность трансляции можно оценивать различными способами, включая, например, трансфекцию и вестерн-блоттинг. Приемлемые характеристики очищенной мРНК включают распределение полос при вестерн-блоттинге, которые мигрируют при аналогичной молекулярной массе как эталонный стандарт.

[0176] В некоторых вариантах осуществления оценивают проводимость очищенной мРНК. В некоторых вариантах осуществления приемлемые характеристики очищенной мРНК включают проводимость, составляющую от приблизительно 50% до 150% от эталонного стандарта.

[0177] Очищенную мРНК также оценивают в отношении процентной доли кэпов и длины поли(А)-хвоста. В некоторых вариантах осуществления приемлемое процентное содержание кэпов включает кэп 1, % площади: NLT90. В некоторых вариантах осуществления приемлемая длина поли(А)-хвоста составляет приблизительно 100-1500 нуклеотидов (например, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 и 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 или 1500 нуклеотидов).

[0178] В некоторых вариантах осуществления очищенную мРНК также оценивают в отношении какого-либо остаточного PEG. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит менее чем от 10 нг PEG/мг очищенной мРНК до 1000 нг PEG/мг мРНК. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит менее приблизительно 10 нг PEG/мг очищенной мРНК. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит менее приблизительно 100 нг PEG/мг очищенной мРНК. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит менее приблизительно 250 нг PEG/мг очищенной мРНК. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит менее приблизительно 500 нг PEG/мг очищенной мРНК. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит менее приблизительно 750 нг PEG/мг очищенной мРНК. В некоторых вариантах осуществления очищенная мРНК содержит менее приблизительно 1000 нг PEG/мг очищенной мРНК.

[0179] Различные способы выявления и количественной оценки чистоты мРНК известны из уровня техники. Например, такие способы включают блоттинг, капиллярный электрофорез, хроматографию, флуоресценцию, гель-электрофорез, HPLC, окрашивание серебром, спектроскопию, ультрафиолетовое выявление (УФ) или UPLC или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления мРНК сначала денатурируют с помощью глиоксалевого красителя перед гель-электрофорезом ("гель-электрофорез с глиоксалем"). В некоторых вариантах осуществления характеристики синтезированной мРНК определяют перед кэпированием или присоединением хвоста. В некоторых вариантах осуществления характеристики синтезированной мРНК определяют после кэпирования или присоединения хвоста.

Среды-носители для доставки

[0180] В соответствии с настоящим изобретением мРНК или MCNA, кодирующие белок или пептид (например, полноразмерный белок или пептид, фрагмент или часть белка или пептида), описанные в данном документе, можно доставлять в виде голой (неупакованной) РНК или посредством сред-носителей для доставки. Используемые в данном документе термины "среда-носитель для доставки", "среда-носитель для переноса", "наночастица" или грамматический эквивалент используются взаимозаменяемо.

[0181] Среды-носители для доставки могут быть составлены в комбинации с одной или несколькими дополнительными нуклеиновыми кислотами, носителями, нацеливающими лигандами или стабилизирующими реагентами, или в фармакологические композиции, где их смешивают с подходящими вспомогательными веществами. Методики для составления и введения лекарственных средств можно найти в "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., последнее издание. Конкретную среду-носитель для доставки выбирают на основании ее способности облегчать трансфекцию нуклеиновой кислоты в целевую клетку.

[0182] В некоторых вариантах осуществления мРНК или MCNA, кодирующие по меньшей мере один белок или пептид, могут доставляться с помощью одной среды-носителя для доставки. В некоторых вариантах осуществления мРНК или MCNA, кодирующие по меньшей мере один белок или пептид, могут доставляться с помощью одной или нескольких сред-носителей для доставки, каждая из которых имеет отличающийся состав. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько мРНК и/или MCNA инкапсулируют в одни и те же липидные наночастицы. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько мРНК инкапсулируют в отдельные липидные наночастицы.

[0183] В различных вариантах осуществления подходящие среды-носители для доставки включают без ограничения носители на основе полимера, такого как полиэтиленимин (PEI), липидные наночастицы и липосомы, нанолипосомы, церамид-содержащие нанолипосомы, протеолипосомы, экзосомы как природного, так и синтетического происхождения, природные, синтетические и полусинтетические ламеллярные тельца, наночастицы, наночастицы из фосфоросиликата кальция, наночастицы из фосфата кальция, наночастицы из диоксида кремния, нанокристаллические частицы, полупроводниковые наночастицы, поли(D-аргинин), золь-гели, нанодендримеры, системы доставки на основе крахмала, мицеллы, эмульсии, ниосомы, мультидоменные блок-полимеры (виниловые полимеры, полимеры полипропилакриловой кислоты, динамические поликонъюгаты), сухие порошковые составы, плазмиды, вирусы, нуклеотиды, осажденные на фосфате кальция, аптамеры, пептиды и другие векторные метки. Также предполагается применение бионанокапсул и других сборок вирусных капсидных белков в качестве подходящей среды-носителя для переноса (Hum. Gene Ther. 2008 September; 19(9):887-95).

Липосомные среды-носители для доставки

[0184] В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки представляет собой липосомную среду-носитель для доставки, например, липидную наночастицу. Используемые в данном документе липосомные среды-носители для доставки, например, липидные наночастицы, обычно описывают как микроскопические везикулы, имеющие внутреннее водное пространство, отделенное от внешней среды мембраной из одной или несколько двухслойных структур. Двухслойные мембраны липосом, как правило, сформированы амфифильными молекулами, такими как липиды синтетического или природного происхождения, которые содержат пространственно разделенные гидрофильные и гидрофобные домены (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). Двухслойные мембраны липосом также могут быть сформированы амфифильными полимерами и поверхностно-активными веществами (например, полимеросомами, ниосомами и т. д.). В контексте настоящего изобретения липосомная среда-носитель для доставки, как правило, служит для транспортировки требуемой нуклеиновой кислоты (например, мРНК или MCNA) в целевую клетку или ткань. В некоторых вариантах осуществления средой-носителем для доставки наночастиц является липосома. В некоторых вариантах осуществления липосома содержит один или несколько катионных липидов, один или несколько некатионных липидов, один или несколько липидов на основе холестерина и один или несколько PEG-модифицированных липидов. В некоторых вариантах осуществления липосома содержит не более трех отдельных липидных компонентов. В некоторых вариантах осуществления один отдельный липидный компонент представляет собой катионный липид на основе стерина.

Катионные липиды

[0185] Используемая в данном документе фраза "катионные липиды" относится к любому из целого ряда липидных молекул, которые характеризуются суммарным положительным зарядом при выбранном pH, таком как физиологический pH.

[0186] Подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2010/144740, которая включена в данный документ посредством ссылки. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0187] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают ионизируемые катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2013/149140, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид с одной из следующих формул:

,

или его фармацевтически приемлемую соль, где каждый из R₁ и R₂ независимо выбран из группы, состоящей из водорода, необязательно замещенного характеризующегося переменной насыщенностью или ненасыщенного C₁-C₂₀алкила и необязательно замещенного характеризующегося переменной насыщенностью или ненасыщенного C₆-C₂₀ацила; где каждый из L₁ и L₂ независимо выбран из группы, состоящей из водорода, необязательно замещенного C₁-C₃₀алкила, необязательно замещенного характеризующегося переменной насыщенностью C₁-C₃₀алкенила и необязательно замещенного C₁-C₃₀алкинила; где каждый из m и o независимо выбран из группы, состоящей из нуля и любого положительного целого числа (например, где m составляет три); и где n составляет нуль или любое положительное целое число (например, где n составляет единицу). В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, (15Z,18Z)-N,N-диметил-6-(9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-ил)тетракоза-15,18-диен-1-амин ("HGT5000"), имеющий следующую структуру соединения:

(HGT-5000),

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, (15Z,18Z)-N,N-диметил-6-((9Z, 12Z)-октадека-9,12-диен-1-ил)тетракоза-4,15,18-триен-1-амин ("HGT5001"), имеющий следующую структуру соединения:

(HGT-5001),

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид и (15Z,18Z)-N,N-диметил-6-((9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-ил)тетракоза-5,15,18-триен-1-амин ("HGT5002"), имеющий следующую структуру соединения:

(HGT-5002),

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0188] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные как липидоиды на основе аминоспиртов в международной патентной публикации WO 2010/053572, которая включена в данный документ посредством ссылки. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0189] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2016/118725, которая включена в данный документ посредством ссылки. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0190] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2016/118724, которая включена в данный документ посредством ссылки. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0191] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий формулу 14,25-дитридецил-15,18,21,24-тетраазаоктатриаконтан, и его фармацевтически приемлемые соли.

[0192] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международных патентных публикациях WO 2013/063468 и WO 2016/205691, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид следующей формулы:

или его фармацевтически приемлемые соли, где R^L в каждом случае независимо представляет собой необязательно замещенный C₆-C₄₀алкенил. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0193] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2015/184256, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид следующей формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль, где каждый X независимо представляет собой O или S; каждый Y независимо представляет собой О или S; каждый m независимо составляет от 0 до 20; каждый n независимо составляет от 1 до 6; каждый R_A независимо представляет собой водород, необязательно замещенный C1-50алкил, необязательно замещенный C2-50алкенил, необязательно замещенный C2-50алкинил, необязательно замещенный C3-10карбоциклил, необязательно замещенный 3-14-членный гетероциклил, необязательно замещенный C6-14арил, необязательно замещенный 5-14-членный гетероарил или галоген; и каждый R_B независимо представляет собой водород, необязательно замещенный C1-50алкил, необязательно замещенный C2-50алкенил, необязательно замещенный C2-50алкинил, необязательно замещенный C3-10карбоциклил, необязательно замещенный 3-14-членный гетероциклил, необязательно замещенный C6-14арил, необязательно замещенный 5-14-членный гетероарил или галоген. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид "Целевой 23", имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0194] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2016/004202, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

или его фармацевтически приемлемую соль.

[0195] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в предварительной заявке на патент США с порядковым № 62/758179, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид следующей формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль, где каждый R¹ и R² независимо представляет собой H или C₁-C₆алифатическую группу; каждый m независимо представляет собой целое число, имеющее значение от 1 до 4; каждый A независимо представляет собой ковалентную связь или арилен; каждый L¹ независимо представляет собой сложноэфирную, тиоэфирную, дисульфидную или ангидридную группу; каждый L² независимо представляет собой C₂-C₁₀алифатическую группу; каждый X¹ независимо представляет собой H или OH; и каждый R³ независимо представляет собой C₆-C₂₀алифатическую группу. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид следующей формулы:

(Соединение 1),

или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид следующей формулы:

(Соединение 2),

или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид следующей формулы:

(Соединение 3),

или его фармацевтически приемлемую соль.

[0196] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в J. McClellan, MC King, Cell 2010, 141, 210-217 и в Whitehead et al., Nature Communications (2014) 5:4277, которые включены в данный документ посредством ссылки. В определенных вариантах осуществления катионные липиды из композиций и способов по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0197] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2015/199952, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0198] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2017/004143, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0199] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2017/075531, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид следующей формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль, где один из L¹ или L² представляет собой -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)_x, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NR^aC(=O)-, -C(=O)NR^a-, NR^aC(=O)NR^a-, -OC(=O)NR^a- или -NR^aC(=O)O-; а другой из L¹ или L² представляет собой -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)_x, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NR^aC(=O)-, -C(=O)NR^a-, NR^aC(=O)NR^a-, -OC(=O)NR^a-, или -NR^aC(=O)O-, или прямую связь; каждый из G¹ и G² независимо представляет собой незамещенный C₁-C₁₂алкилен или C₁-C₁₂алкенилен; G³ представляет собой C₁-C₂₄алкилен, C₁-C₂₄алкенилен, C₃-C₈циклоалкилен, C₃-C₈циклоалкенилен; R^a представляет собой H или C₁-C₁₂алкил; каждый из R¹ и R² независимо представляет собой C₆-C₂₄алкил или C₆-C₂₄алкенил; R³ представляет собой H, OR⁵, CN, -C(=O)OR⁴, -OC(=O)R⁴ или -NR⁵C(=O)R⁴; R⁴ представляет собой C₁-C₁₂алкил; R⁵ представляет собой H или C₁-C₆алкил; и x составляет 0, 1 или 2.

[0200] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2017/117528, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0201] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2017/049245, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления катионные липиды из композиций и способов по настоящему изобретению включают соединение с одной из следующих формул:

и его фармацевтически приемлемые соли. Для любой из данных четырех формул R₄ независимо выбран из -(CH₂)_nQ и -(CH₂) _nCHQR; Q выбран из группы, состоящей из -OR, -OH, -O(CH₂)_nN(R)₂, -OC(O)R, -CX₃, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)₂R, -N(H)S(O)₂R, -N(R)C(O)N(R)₂, -N(H)C(O)N(R)₂, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)₂, -N(H)C(S)N(R)₂, -N(H)C(S)N(H)(R) и гетероцикла; и n составляет 1, 2 или 3. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0202] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают катионные липиды, описанные в международных патентных публикациях WO 2017/173054 и WO 2015/095340, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, имеющий следующую структуру соединения:

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0203] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают расщепляемые катионные липиды, описанные в международной патентной публикации WO 2012/170889, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид следующей формулы:

где R₁ выбран из группы, состоящей из имидазола, гуанидиния, амино, имина, енамина, необязательно замещенного алкиламино (например, алкиламино, такого как диметиламино) и пиридила; где R₂ выбран из группы, состоящей из одной из следующих двух формул:

и где каждый из R₃ и R₄ независимо выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного, в разной степени насыщенного или ненасыщенного C₆-C₂₀алкила и необязательно замещенного, в разной степени насыщенного или ненасыщенного C₆-C₂₀ацила; и где n составляет нуль или любое положительное целое число (например, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать и больше). В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид "HGT4001", имеющий следующую структуру соединения:

(HGT4001),

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид "HGT4002", имеющий следующую структуру соединения

(HGT4002),

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид "HGT4003", имеющий следующую структуру соединения

(HGT4003),

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид "HGT4004", имеющий следующую структуру соединения

(HGT4004),

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид "HGT4005", имеющий следующую структуру соединения:

(HGT4005),

и его фармацевтически приемлемые соли.

[0204] Другие подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают расщепляемые катионные липиды, описанные в международной заявке № PCT/US2019/032522, которая включена в данный документ посредством ссылки. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, который характеризуется любой из общих формул или любой из структур (1a)-(21a), (1b)-(21b) и (22)-(237), описанных в международной заявке № PCT/US2019/032522. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, который имеет структуру в соответствии с формулой (I’),

(I’),

где:

R^X независимо представляет собой -H, -L¹-R¹ или -L^5A-L^5B-B';

каждый из L¹, L² и L³ независимо представляет собой ковалентную связь, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)S- или -C(O)NR^L-;

каждый из L^4A и L^5A независимо представляет собой -C(O)-, -C(O)O- или -C(O)NR^L-;

каждый из L^4B и L^5B независимо представляет собой C₁-C₂₀алкилен; C₂-C₂₀алкенилен или C₂-C₂₀алкинилен;

каждый из B и B' представляет собой NR⁴R⁵ или 5-10-членный азотсодержащий гетероарил;

каждый из R¹, R² и R³ независимо представляет собой C₆-C₃₀алкил, C₆-C₃₀алкенил или C₆-C₃₀алкинил;

каждый из R⁴ и R⁵ независимо представляет собой водород, C₁-C₁₀алкил; C₂-C₁₀алкенил или C₂-C₁₀алкинил и

каждый R^L независимо представляет собой водород, C₁-C₂₀алкил, C₂-C₂₀алкенил или C₂-C₂₀алкинил.

В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, который представляет собой соединение (139) из международной заявки № PCT/US2019/032522, имеющее следующую структуру соединения:

("содержащий рибозу липид с углеродным хвостом 18:1").

[0205] В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению включают катионный липид, хлорид N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N, N,N-триметиламмония ("DOTMA") (Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); патент США № 4897355, который включен в данный документ посредством ссылки). Другие катионные липиды, подходящие для композиций и способов по настоящему изобретению, включают, например, 5-карбоксиспермилглициндиоктадециламид ("DOGS"); 2,3-диолеилокси-N-[2(спермин-карбоксамидо)этил]-N, N-диметил-1-пропанаминий ("DOSPA") (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989), патент США № 5171678; патент США № 5334761); 1,2-диолеоил-3-диметиламмония-пропан ("DODAP"); 1,2-диолеоил-3-триметиламмония-пропан ("DOTAP").

[0206] Дополнительные иллюстративные катионные липиды, подходящие для композиций и способов по настоящему изобретению, также включают 1,2-дистеарилокси-N, N-диметил-3-аминопропан ("DSDMA"), 1,2-диолеилокси-N, N-диметил-3-аминопропан ("DODMA"), 1,2-дилинолеилокси-N, N-диметил-3-аминопропан ("DLinDMA"), 1,2-дилиноленилокси-N, N-диметил-3-аминопропан ("DLenDMA"), хлорид N-диолеил-N, N-диметиламмония ("DODAC"), бромид N, N-дистеарил-N, N-диметиламмония ("DDAB"), бромид N-(1,2-димиристилоксипроп-3-ил)-N, N-диметил-N-гидроксиэтиламмония ("DMRIE"), 3-диметиламино-2-(холест-5-ен-3-бета-оксибутан-4-окси)-1-(цис, цис-9,12-октадекадиенокси)пропан ("CLinDMA"), 2-[5’-(холест-5-ен-3-бета-окси)-3’-оксапентокси)-3-диметил-1-(цис, цис-9’,12’-октадекадиенокси)пропан ("CpLinDMA"), N, N-диметил-3,4-диолеилоксибензиламин ("DMOBA"), 1,2-N, N’-диолеилкарбамил-3-диметиламинопропан ("DOcarbDAP"), 2,3-дилинолеилокси-Ν,Ν-диметилпропиламин ("DLinDAP"), 1,2-N, N’-дилинолеилкарбамил-3-диметиламинопропан ("DLincarbDAP"), 1,2-дилинолеилкарбамил-3-диметиламинопропан ("DLinCDAP"), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан ("DLin-K-DMA"); 2-((8-[(3P)-холест-5-ен-3-илокси]октил)окси)-N, N-диметил-3-[(9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-илокси]пропан-1-амин ("октил-CLinDMA"); (2R)-2-((8-[(3-бета)-холест-5-ен-3-илокси]октил)окси)-N, N-диметил-3-[(9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-илокси]пропан-1-амин ("октил-CLinDMA (2R)"); (2S)-2-((8-[(3P)-холест-5-ен-3-илокси]октил)окси)-N, N-диметил-3-[(9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-илокси]пропан-1-амин ("октил-CLinDMA (2S)"); 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан ("DLin-K-XTC2-DMA") и 2-(2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-ил)-1,3-диоксолан-4-ил)-N, N-диметилэтанамин ("DLin-KC2-DMA") (см. WO 2010/042877, которая включена в данный документ посредством ссылки; Semple et al., Nature Biotech. 28: 172-176 (2010)). (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); международную патентную публикацию WO 2005/121348). В некоторых вариантах осуществления один или несколько катионных липидов содержат по меньшей мере один из имидазольного, диалкиламинового или гуанидиниевого фрагментов.

[0207] В некоторых вариантах осуществления один или несколько катионных липидов, подходящих для композиций и способов по настоящему изобретению, включают 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан ("XTC"); (3aR,5s,6aS)-N, N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12-диенил)тетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-5-амин ("ALNY-100") и/или 4,7,13-трис(3-оксо-3-(ундециламино)пропил)-N1,N16-диундецил-4,7,10,13-тетраазагексадекан-1,16-диамид ("NC98-5").

[0208] В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат один или несколько катионных липидов, которые составляют по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 70% при измерении по весу от общего содержания липидов в композиции, например, липидной наночастице. В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат один или несколько катионных липидов, которые составляют по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 70% при измерении в мол. % от общего содержания липидов в композиции, например, липидной наночастице. В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат один или несколько катионных липидов, которые составляют приблизительно 30-70% (например, приблизительно 30-65%, приблизительно 30-60%, приблизительно 30-55%, приблизительно 30-50%, приблизительно 30-45%, приблизительно 30-40%, приблизительно 35-50%, приблизительно 35-45% или приблизительно 35-40%) при измерении по весу от общего содержания липидов в композиции, например, липидной наночастице. В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат один или несколько катионных липидов, которые составляют приблизительно 30-70% (например, приблизительно 30-65%, приблизительно 30-60%, приблизительно 30-55%, приблизительно 30-50%, приблизительно 30-45%, приблизительно 30-40%, приблизительно 35-50%, приблизительно 35-45% или приблизительно 35-40%) при измерении в мол. % от общего содержания липидов в композиции, например, липидной наночастице.

Некатионные/вспомогательные липиды

[0209] В некоторых вариантах осуществления липосомы содержат один или несколько некатионных ("вспомогательных") липидов. Используемое в данном документе выражение "некатионный липид" относится к любому нейтральному, цвиттерионному или анионному липиду. Используемая в данном документе фраза "анионный липид" относится к любому из целого ряда липидных соединений, которые несут суммарный отрицательный заряд при выбранном pH, таком как физиологический pH. Липиды, отличные от катионных, включают без ограничения дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерол (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерол (DPPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (POPC), пальмитоилолеоил-фосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), фосфатидилсерин, сфинголипиды, цереброзиды, ганглиозиды, 16-O-монометил-PE, 16-O-диметил-PE, 18-1-транс-PE, 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламин (SOPE) или их смесь.

[0210] В некоторых вариантах осуществления некатионный липид представляет собой нейтральный липид, т. е. липид, который не несет суммарный заряд при условиях, в которых составляется и/или вводится композиция.

[0211] В некоторых вариантах осуществления такие некатионные липиды могут применяться отдельно, но предпочтительно применяются в комбинации с другими липидами, например, катионными липидами.

[0212] В некоторых вариантах осуществления некатионный липид может быть представлен в молярном соотношении (мол. %) от приблизительно 5% до приблизительно 90%, от приблизительно 5% до приблизительно 70%, от приблизительно 5% до приблизительно 50%, от приблизительно 5% до приблизительно 40%, от приблизительно 5% до приблизительно 30%, от приблизительно 10% до приблизительно 70%, от приблизительно 10% до приблизительно 50% или от приблизительно 10% до приблизительно 40% от общего количества липидов, присутствующих в композиции. В некоторых вариантах осуществления общее количество некатионных липидов может быть представлено в молярном соотношении (мол. %) от приблизительно 5% до приблизительно 90%, от приблизительно 5% до приблизительно 70%, от приблизительно 5% до приблизительно 50%, от приблизительно 5% до приблизительно 40%, от приблизительно 5% до приблизительно 30%, от приблизительно 10% до приблизительно 70%, от приблизительно 10% до приблизительно 50% или от приблизительно 10% до приблизительно 40% от общего количества липидов, присутствующих в композиции. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание некатионного липида в липосоме может составлять более приблизительно 5 мол. %, более приблизительно 10 мол. %, более приблизительно 20 мол. %, более приблизительно 30 мол. % или более приблизительно 40 мол. %. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание общего количества некатионных липидов в липосоме может составлять более приблизительно 5 мол. %, более приблизительно 10 мол. %, более приблизительно 20 мол. %, более приблизительно 30 мол. % или более приблизительно 40 мол. %. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание некатионного липида в липосоме составляет не более приблизительно 5 мол. %, не более приблизительно 10 мол. %, не более приблизительно 20 мол. %, не более приблизительно 30 мол. % или не более приблизительно 40 мол. %. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание общего количества некатионных липидов в липосоме может составлять не более приблизительно 5 мол. %, не более приблизительно 10 мол. %, не более приблизительно 20 мол. %, не более приблизительно 30 мол. % или не более приблизительно 40 мол. %.

[0213] В некоторых вариантах осуществления некатионный липид может быть представлен в весовом соотношении (вес. %), составляющим от приблизительно 5% до приблизительно 90%, от приблизительно 5% до приблизительно 70%, от приблизительно 5% до приблизительно 50%, от приблизительно 5% до приблизительно 40%, от приблизительно 5% до приблизительно 30%, от приблизительно 10% до приблизительно 70%, от приблизительно 10% до приблизительно 50% или от приблизительно 10% до приблизительно 40% от общего количества липидов, присутствующих в композиции. В некоторых вариантах осуществления общее количество некатионных липидов может быть представлено в весовом соотношении (вес. %), составляющим от приблизительно 5% до приблизительно 90%, от приблизительно 5% до приблизительно 70%, от приблизительно 5% до приблизительно 50%, от приблизительно 5% до приблизительно 40%, от приблизительно 5% до приблизительно 30%, от приблизительно 10% до приблизительно 70%, от приблизительно 10% до приблизительно 50% или от приблизительно 10% до приблизительно 40% от общего количества липидов, присутствующих в композиции. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание некатионного липида в липосоме может составлять более приблизительно 5 вес. %, более приблизительно 10 вес. %, более приблизительно 20 вес. %, более приблизительно 30 вес. % или более приблизительно 40 вес. %. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание общего количества некатионных липидов в липосоме может составлять более приблизительно 5 вес. %, более приблизительно 10 вес. %, более приблизительно 20 вес. %, более приблизительно 30 вес. % или более приблизительно 40 вес. %. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание некатионного липида в липосоме составляет не более приблизительно 5 вес. %, не более приблизительно 10 вес. %, не более приблизительно 20 вес. %, не более приблизительно 30 вес. % или не более приблизительно 40 вес. %. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание общего количества некатионных липидов в липосоме может составлять не более приблизительно 5 вес. %, не более приблизительно 10 вес. %, не более приблизительно 20 вес. %, не более приблизительно 30 вес. % или не более приблизительно 40 вес. %.

Липиды на основе холестерина

[0214] В некоторых вариантах осуществления липосомы содержат один или несколько липидов на основе холестерина. Например, подходящие катионные липиды на основе холестерина включают, например, DC-Chol (N,N-диметил-N-этилкарбоксамидохолестерин), 1,4-бис(3-N-олеиламино-пропил)пиперазин (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); патент США № 5744335), или сложный имидазольный эфир холестерина (ICE), который имеет следующую структуру

("ICE").

[0215] В вариантах осуществления липид на основе холестерина представляет собой холестерин.

[0216] В некоторых вариантах осуществления липид на основе холестерина может содержать молярное соотношение (мол. %) от приблизительно 1% до приблизительно 30% или от приблизительно 5% до приблизительно 20% от общего количества липидов, присутствующих в липосоме. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание липида на основе холестерина в липидной наночастице может составлять более приблизительно 5 мол. %, более приблизительно 10 мол. %, более приблизительно 20 мол. %, более приблизительно 30 мол. % или более приблизительно 40 мол. %. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание липида на основе холестерина в липидной наночастице может составлять не более приблизительно 5 мол. %, не более приблизительно 10 мол. %, не более приблизительно 20 мол. %, не более приблизительно 30 мол. % или не более приблизительно 40 мол. %.

[0217] В некоторых вариантах осуществления липид на основе холестерина может быть представлен в весовом соотношении (вес. %), составляющим от приблизительно 1% до приблизительно 30% или от приблизительно 5% до приблизительно 20% от общего количества липидов, присутствующих в липосоме. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание липида на основе холестерина в липидной наночастице может составлять более приблизительно 5 вес. %, более приблизительно 10 вес. %, более приблизительно 20 вес. %, более приблизительно 30 вес. % или более приблизительно 40 вес. %. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание липида на основе холестерина в липидной наночастице может составлять не более приблизительно 5 вес. %, не более приблизительно 10 вес. %, не более приблизительно 20 вес. %, не более приблизительно 30 вес. % или не более приблизительно 40 вес. %.

PEG-модифицированные липиды

[0218] В некоторых вариантах осуществления липосома содержит один или несколько пегилированных липидов.

[0219] Например, применение полиэтиленгликоль (PEG)-модифицированных фосфолипидов и дериватизированных липидов, таких как дериватизированные церамиды (PEG-CER), включая N-октаноил-сфингозин-1-[сукцинил(метоксиполиэтиленгликоль)-2000] (церамид C8 PEG-2000), также предусмотрено в настоящем изобретении либо отдельно, либо предпочтительно в комбинации с другими липидными составами, вместе с которыми они составляют среду-носитель для переноса (например, липидную наночастицу).

[0220] Рассматриваемые PEG-модифицированные липиды включают без ограничения цепь полиэтиленгликоля длиной до 5 кДа, ковалентно присоединенную к липиду с алкильной(-ыми) цепью(-ями) длиной C₆-C₂₀. В некоторых вариантах осуществления PEG-модифицированный или пегилированный липид представляет собой пегилированный холестерин или PEG-2K. Добавление таких компонентов может предотвращать агрегацию комплекса, и также может обеспечивать средство повышения продолжительности пребывания в системе кровообращения и увеличения доставки композиции на основе липида и нуклеиновой кислоты в целевые ткани (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237), или они могут быть выбраны для быстрого обмена состава in vivo (см. патент США № 5885613). Особенно применимыми способными к обмену липидами являются PEG-церамиды, имеющие более короткие ацильные цепи (например, C₁₄ или C₁₈).

[0221] PEG-модифицированный фосфолипид и дериватизированные липиды по настоящему изобретению могут характеризоваться молярным соотношением от приблизительно 0% до приблизительно 20%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 20%, от приблизительно 1% до приблизительно 15%, от приблизительно 4% до приблизительно 10% или от приблизительно 2% от общего количества липида, присутствующего в липосомной среде-носителе для переноса. В некоторых вариантах осуществления один или несколько PEG-модифицированных липидов составляют приблизительно 4% от общего количества липидов по молярному соотношению. В некоторых вариантах осуществления один или несколько PEG-модифицированных липидов составляют приблизительно 5% от общего количества липидов по молярному соотношению. В некоторых вариантах осуществления один или несколько PEG-модифицированных липидов составляют приблизительно 6% от общего количества липидов по молярному соотношению.

Амфифильные блок-сополимеры

[0222] В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки содержит амфифильные блок-сополимеры (например, полоксамеры).

[0223] Для осуществления настоящего изобретения на практике можно применять различные амфифильные блок-сополимеры. В некоторых вариантах осуществления амфифильный блок-сополимер также называется поверхностно-активным веществом или неионогенным поверхностно-активным веществом.

[0224] В некоторых вариантах осуществления амфифильный полимер, подходящий для настоящего изобретения, выбран из полоксамеров (Pluronic®), полоксаминов (Tetronic®), сложных алкиловых эфиров полиоксиэтиленгликоля и сорбитана (полисорбатов) и поливинилпирролидонов (PVP).

Полоксамеры

[0225] В некоторых вариантах осуществления подходящий амфифильный полимер представляет собой полоксамер. Например, подходящий полоксамер имеет следующую структуру:

где a представляет собой целое число от 10 до 150, и b представляет собой целое число от 20 до 60. Например, а составляет приблизительно 12, и b составляет приблизительно 20, или а составляет приблизительно 80, и b составляет приблизительно 27, или а составляет приблизительно 64, и b составляет приблизительно 37, или а составляет приблизительно 141, и b составляет приблизительно 44, или а составляет приблизительно 101, и b составляет приблизительно 56.

[0226] В некоторых вариантах осуществления полоксамер, подходящий для настоящего изобретения, содержит этиленоксидные звенья в количестве от приблизительно 10 до приблизительно 150. В некоторых вариантах осуществления полоксамер содержит этиленоксидные звенья в количестве от приблизительно 10 до приблизительно 100.

[0227] В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 84. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 101. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 105. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 108. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 122. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 123. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 124. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 181. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 182. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 183. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 184. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 185. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 188. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 212. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 215. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 217. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 231. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 234. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 235. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 237. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 238. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 282. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 284. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 288. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 304. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 331. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 333. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 334. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 335. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 338. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 401. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 402. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 403. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой полоксамер 407. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер представляет собой их комбинацию.

[0228] В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей от приблизительно 4000 г/моль до приблизительно 20000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей от приблизительно 1000 г/моль до приблизительно 50000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 1000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 2000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 3000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 4000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 5000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 6000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 7000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 8000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 9000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 10000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 20000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 25000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 30000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 40000 г/моль. В некоторых вариантах осуществления подходящий полоксамер характеризуется средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 50000 г/моль.

Другие амфифильные полимеры

[0229] В некоторых вариантах осуществления амфифильный полимер представляет собой полоксамин, например, Tetronic 304 или Tetronic 904.

[0230] В некоторых вариантах осуществления амфифильный полимер представляет собой поливинилпирролидон (PVP), такой как PVP с молекулярной массой, составляющей 3 кДа, 10 кДа или 29 кДа.

[0231] В некоторых вариантах осуществления амфифильный полимер представляет собой простой эфир полиэтиленгликоля (Brij), полисорбат, сорбитан и их производные. В некоторых вариантах осуществления амфифильный полимер представляет собой полисорбат, такой как PS 20.

[0232] В некоторых вариантах осуществления амфифильный полимер представляет собой простой эфир полиэтиленгликоля (Brij), полоксамер, полисорбат, сорбитан и их производные.

[0233] В некоторых вариантах осуществления амфифильный полимер представляет собой простой эфир полиэтиленгликоля. В некоторых вариантах осуществления подходящий простой эфир полиэтиленгликоля представляет собой соединение формулы (S-l):

или его соль или изомер, где:

t представляет собой целое число от 1 до 100;

R^1BRIJ независимо представляет собой C_10-40алкил, C_10-40алкенил или C_10-40алкинил; и необязательно одна или несколько метиленовых групп в R^5PEG независимо заменены на C_3-10карбоциклен, 4-10-членный гетероциклен, C_6-10арилен, 4-10-членный гетероарилен, -N(R^N)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)-, -NRC(O)N(R)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR^N)-, -C(=NR)N(R)-, -NRNC(=NR^N)-, -NR^NC(=NR^N)N(R^N)-, -C(S)-, -C(S)N(R^N)-, -NR^NC(S)-, -NR^NC(S)N(R^N)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)₂-, -S(O)₂O-, -OS(O)₂O-, -N(R^N)S(O)-, -S(O)N(R^N)-, -N(R^N)S(O)N(R^N)-, -OS(O)N(R^N)-, -N(R^N)S(O)О-, -S(O)₂-, -N(R^N)S(O)₂-, - S(O)₂N(R^N)-, -N(R^N)S(O)₂N(R^N)-, -OS(O)₂N(R^N)- или -N(R^N)S(O)₂O-; и

в каждом случае R^N независимо представляет собой водород, C_1-6алкил или защитную группу азота.

[0234] В некотором варианте осуществления R^1BRIJ представляет собой C представляет собой алкил. Например, простой эфир полиэтиленгликоля представляет собой соединение формулы (S-1a):

или его соль или изомер, где s представляет собой целое число от 1 до 100.

[0235] В некоторых вариантах осуществления R^1BRIJ представляет собой C представляет собой алкенил. Например, подходящий простой эфир полиэтиленгликоля представляет собой соединение формулы (S-1b):

или его соль или изомер, где s представляет собой целое число от 1 до 100.

[0236] Как правило, амфифильный полимер (например, полоксамер) присутствует в составе в количестве, которое ниже его критической концентрации мицеллообразования (CMC). В некоторых вариантах осуществления амфифильный полимер (например, полоксамер) присутствует в смеси в количестве, которое на приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 3%, приблизительно 4%, приблизительно 5%, приблизительно 6%, приблизительно 7%, приблизительно 8%, приблизительно 9%, приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45% или приблизительно 50% ниже, чем его CMC. В некоторых вариантах осуществления амфифильный полимер (например, полоксамер) присутствует в смеси в количестве, которое на приблизительно 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1% ниже, чем его CMC. В некоторых вариантах осуществления амфифильный полимер (например, полоксамер) присутствует в смеси в количестве, которое на приблизительно 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% или 95% ниже, чем его CMC.

[0237] В некоторых вариантах осуществления менее приблизительно 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02% или 0,01% от исходного количества амфифильного полимера (например, полоксамера) присутствует в составе после удаления. В некоторых вариантах осуществления остаточное количество амфифильного полимера (например, полоксамера) остается в составе после удаления. Используемое в данном документе остаточное количество означает количество, остающееся после удаления из композиции практически всего вещества (амфифильного полимера, описанного в данном документе, такого как полоксамер). Остаточное количество может поддаваться качественному или количественному выявлению с использованием известной методики. Остаточное количество может не поддаваться выявлению с использованием известной методики.

[0238] В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки содержит менее 5% амфифильных блок-сополимеров (например, полоксамеров). В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки содержит менее 3% амфифильных блок-сополимеров (например, полоксамеров). В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки содержит менее 2,5% амфифильных блок-сополимеров (например, полоксамеров). В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки содержит менее 2% амфифильных блок-сополимеров (например, полоксамеров). В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки содержит менее 1,5% амфифильных блок-сополимеров (например, полоксамеров). В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки содержит менее 1% амфифильных блок-сополимеров (например, полоксамеров). В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки содержит менее 0,5% (например, менее 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%) амфифильных блок-сополимеров (например, полоксамеров). В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки содержит менее 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02% или 0,01% амфифильных блок-сополимеров (например, полоксамеров). В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки содержит менее 0,01% амфифильных блок-сополимеров (например, полоксамеров). В некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки содержит остаточное количество амфифильных полимеров (например, полоксамеров). Используемое в данном документе остаточное количество означает количество, остающееся после удаления из композиции практически всего вещества (амфифильного полимера, описанного в данном документе, такого как полоксамер). Остаточное количество может поддаваться качественному или количественному выявлению с использованием известной методики. Остаточное количество может не поддаваться выявлению с использованием известной методики.

Полимеры

[0239] В некоторых вариантах осуществления подходящую среду-носитель для доставки составляют с использованием полимера в качестве носителя, отдельно или в комбинации с другими носителями, включая различные липиды, описанные в данном документе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления используемые в данном документе липосомные среды-носители для доставки также охватывают наночастицы, содержащие полимеры. Подходящие полимеры могут включать, например, полиакрилаты, полиалкилцианоакрилаты, полилактид, сополимеры полилактида и полигликолида, поликапролактоны, декстран, альбумин, желатин, альгинат, коллаген, хитозан, циклодекстрины, протамин, пегилированный протамин, PLL, пегилированный PLL и полиэтиленимин (PEI). Если присутствует PEI, это может быть разветвленный PEI с молекулярной массой, находящейся в диапазоне от 10 до 40 кДа, например, разветвленный PEI 25 кДа (Sigma, № 408727).

[0240] В различных вариантах осуществления выбор катионных липидов, некатионных липидов, PEG-модифицированных липидов, липидов на основе холестерина и/или амфифильных блок-сополимеров, которые содержат липидную наночастицу, а также относительное молярное соотношение таких компонентов (липидов) между собой, основаны на характеристиках выбранного(-ых) липида(-ов), природе предполагаемых целевых клеток, характеристиках нуклеиновой кислоты, подлежащей доставке. К дополнительным факторам, которые необходимо учитывать, относится, например, насыщенность алкильной цепи, а также размер, заряд, pH, pKa, фузогенность и токсичность выбранного(-ых) липида(-ов). Таким образом, можно соответствующим образом корректировать молярные соотношения.

Соотношение отдельных липидных компонентов

[0241] Липосома, подходящая для настоящего изобретения, может содержать один или несколько из любых катионных липидов, некатионных липидов, липидов на основе холестерина, PEG-модифицированных липидов, амфифильных блок-сополимеров и/или полимеров, описанных в данном документе, при различных соотношениях. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица содержит пять и не более пяти отдельных компонентов наночастицы. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица содержит четыре и не более четырех отдельных компонентов наночастицы. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица содержит три и не более трех отдельных компонентов наночастицы. В качестве неограничивающих примеров подходящий липосомный состав может включать комбинацию, выбранную из cKK-E12, DOPE, холестерина и DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, холестерина и DMG-PEG2K; HGT4003, DOPE, холестерина и DMG-PEG2K; ICE, DOPE, холестерина и DMG-PEG2K или ICE, DOPE и DMG-PEG2K.

[0242] В различных вариантах осуществления катионные липиды (например, cKK-E12, C12-200, ICE и/или HGT4003) составляют приблизительно 30-60% (например, приблизительно 30-55%, приблизительно 30-50%, приблизительно 30-45%, приблизительно 30-40%, приблизительно 35-50%, приблизительно 35-45% или приблизительно 35-40%) липосомы по молярному соотношению. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание катионных липидов (например, cKK-E12, C12-200, ICE и/или HGT4003) составляет или превышает приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 55% или приблизительно 60% липосомы по молярному соотношению.

[0243] В некоторых вариантах осуществления соотношение катионного(-ых) липида(-ов), некатионного(-ых) липида(-ов), липида(-ов) на основе холестерина и PEG-модифицированного(-ых) липида(-ов) может составлять приблизительно 30-60:25-35:20-30:1-15 соответственно. В некоторых вариантах осуществления соотношение катионного(-ых) липида(-ов), и некатионного(-ых) липида(-ов), и липида(-ов) на основе холестерина, и PEG-модифицированного(-ых) липида(-ов) составляет приблизительно 40:30:20:10 соответственно. В некоторых вариантах осуществления соотношение катионного(-ых) липида(-ов), и некатионного(-ых) липида(-ов), и липида(-ов) на основе холестерина, и PEG-модифицированного(-ых) липида(-ов) составляет приблизительно 40:30:25:5 соответственно. В некоторых вариантах осуществления соотношение катионного(-ых) липида(-ов), и некатионного(-ых) липида(-ов), и липида(-ов) на основе холестерина, и PEG-модифицированного(-ых) липида(-ов) составляет приблизительно 40:32:25:3 соответственно. В некоторых вариантах осуществления соотношение катионного(-ых) липида(-ов), и некатионного(-ых) липида(-ов), и липида(-ов) на основе холестерина, и PEG-модифицированного(-ых) липида(-ов) составляет приблизительно 50:25:20:5.

[0244] В вариантах осуществления, где липидная наночастица содержит три и не более трех отдельных компонентов, представляющих собой липиды, соотношение общего содержания липидов (т. е. соотношение липидный компонент (1): липидный компонент (2): липидный компонент (3)) может быть представлено в виде x:y:z, где

(y+z)=100 - x.

[0245] В некоторых вариантах осуществления каждый из "x", "y" и "z" представляет молярное процентное содержание трех отдельных компонентов, представляющих собой липиды, и соотношение представляет собой молярное соотношение.

[0246] В некоторых вариантах осуществления каждый из "x", "y" и "z" представляет весовое процентное содержание трех отдельных компонентов, представляющих собой липиды, и соотношение представляет собой весовое соотношение.

[0247] В некоторых вариантах осуществления липидный компонент (1), представленный переменной "x", представляет собой катионный липид на основе стерина.

[0248] В некоторых вариантах осуществления липидный компонент (2), представленный переменной "y", представляет собой вспомогательный липид.

[0249] В некоторых вариантах осуществления липидный компонент (3), представленный переменной "z", представляет собой липид с PEG.

[0250] В некоторых вариантах осуществления переменная "x", представляющая молярное процентное содержание липидного компонента (1) (например, катионного липида на основе стерина), составляет по меньшей мере приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90% или приблизительно 95%.

[0251] В некоторых вариантах осуществления переменная "x", представляющая молярное процентное содержание липидного компонента (1) (например, катионного липида на основе стерина), составляет не более приблизительно 95%, приблизительно 90%, приблизительно 85%, приблизительно 80%, приблизительно 75%, приблизительно 70%, приблизительно 65%, приблизительно 60%, приблизительно 55%, приблизительно 50%, приблизительно 40%, приблизительно 30%, приблизительно 20% или приблизительно 10%. В вариантах осуществления переменная "x" составляет не более приблизительно 65%, приблизительно 60%, приблизительно 55%, приблизительно 50%, приблизительно 40%.

[0252] В некоторых вариантах осуществления переменная "x", представляющая молярное процентное содержание липидного компонента (1) (например, катионного липида на основе стерина), составляет по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 95%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 90%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 85%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 80%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 75%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 70%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 65%, или по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 60%. В вариантах осуществления переменная "x" составляет по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 70%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 65%; или по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 60%.

[0253] В некоторых вариантах осуществления переменная "x", представляющая весовое процентное содержание липидного компонента (1) (например, катионного липида на основе стерина), составляет по меньшей мере приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90% или приблизительно 95%.

[0254] В некоторых вариантах осуществления переменная "x", представляющая весовое процентное содержание липидного компонента (1) (например, катионного липида на основе стерина), составляет не более приблизительно 95%, приблизительно 90%, приблизительно 85%, приблизительно 80%, приблизительно 75%, приблизительно 70%, приблизительно 65%, приблизительно 60%, приблизительно 55%, приблизительно 50%, приблизительно 40%, приблизительно 30%, приблизительно 20% или приблизительно 10%. В вариантах осуществления переменная "x" составляет не более приблизительно 65%, приблизительно 60%, приблизительно 55%, приблизительно 50%, приблизительно 40%.

[0255] В некоторых вариантах осуществления переменная "x", представляющая весовое процентное содержание липидного компонента (1) (например, катионного липида на основе стерина), составляет по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 95%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 90%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 85%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 80%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 75%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 70%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 65%, или по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 60%. В вариантах осуществления переменная "x" составляет по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 70%; по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 65%; или по меньшей мере приблизительно 50%, но менее приблизительно 60%.

[0256] В некоторых вариантах осуществления переменная "z", представляющая молярное процентное содержание липидного компонента (3) (например, липида с PEG), составляет не более приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% или 25%. В вариантах осуществления переменная "z", представляющая молярное процентное содержание липидного компонента (3) (например, липида с PEG), составляет приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%. В вариантах осуществления переменная "z", представляющая молярное процентное содержание липидного компонента (3) (например, липида с PEG), составляет от приблизительно 1% до приблизительно 10%, от приблизительно 2% до приблизительно 10%, от приблизительно 3% до приблизительно 10%, от приблизительно 4% до приблизительно 10%, от приблизительно 1% до приблизительно 7,5%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 10%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 7,5%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 5%, от приблизительно 5% до приблизительно 7,5% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%.

[0257] В некоторых вариантах осуществления переменная "z", представляющая весовое процентное содержание липидного компонента (3) (например, липида с PEG), составляет не более приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% или 25%. В вариантах осуществления переменная "z", представляющая весовое процентное содержание липидного компонента (3) (например, липида с PEG), составляет приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%. В вариантах осуществления переменная "z", представляющая весовое процентное содержание липидного компонента (3) (например, липида с PEG), составляет от приблизительно 1% до приблизительно 10%, от приблизительно 2% до приблизительно 10%, от приблизительно 3% до приблизительно 10%, от приблизительно 4% до приблизительно 10%, от приблизительно 1% до приблизительно 7,5%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 10%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 7,5%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 5%, от приблизительно 5% до приблизительно 7,5% или от приблизительно 5% до приблизительно 10%.

[0258] Для композиций, содержащих три и только три отдельных липидных компонента, переменные "x", "y" и "z" могут быть в любой комбинации при условии, что сумма трех переменных составляет 100% от общего содержания липидов.

Формирование липосом, инкапсулирующих мРНК

[0259] Липосомные среды-носители для переноса для применения в композициях по настоящему изобретению могут быть получены посредством различных методик, которые в настоящее время известны в данной области техники. Например, многослойные везикулы (MLV) могут быть получены в соответствии с традиционными методиками, например, путем осаждения выбранного липида на внутренней стенке подходящего контейнера или сосуда путем растворения липида в соответствующем растворителе, а затем выпаривания растворителя с получением тонкой пленки на внутренней стороне сосуда, или с помощью распылительной сушки. Затем в сосуд можно добавить водную фазу с вихревым перемешиванием, которое приводит к образованию MLV. Затем с помощью гомогенизации, обработки ультразвуком или экструзии многослойных везикул могут формироваться однослойные везикулы (ULV). Кроме того, однослойные везикулы могут формироваться с помощью методик удаления детергента.

[0260] Различные способы описаны в опубликованной заявке на патент США № US 2011/0244026, опубликованной заявке на патент США № US 2016/0038432, опубликованной заявке на патент США № US 2018/0153822, опубликованной заявке на патент США № US 2018/0125989 и предварительной заявке на патент США № 62/877597, поданной 23 июля 2019 г., и они могут применяться в осуществлении настоящего изобретения на практике, при этом все из этих заявок включены в данный документ посредством ссылки. Используемый в данном документе термин "способ A" относится к традиционному способу инкапсулирования мРНК путем смешивания мРНК со смесью липидов без предварительного формирования липидов в липидные наночастицы, как описано в US 2016/0038432. Используемый в данном документе термин "способ В" относится к способу инкапсулирования матричной РНК (мРНК) путем смешивания предварительно сформированных липидных наночастиц с мРНК, как описано в US 2018/0153822.

[0261] Вкратце, способ получения липидных липосом, загруженных мРНК или MCNA, включает стадию нагревания одного или несколько растворов (т. е. подачи тепла от источника тепла к раствору) до температуры (или поддержания температуры) выше температуры окружающей среды, при этом один или несколько растворов представляют собой раствор, содержащий предварительно сформированные липидные наночастицы, раствор, содержащий мРНК, и смешанный раствор, содержащий инкапсулированную в липидные наночастицым РНК. В некоторых вариантах осуществления способ включает стадию нагревания одного или обоих из раствора мРНК и раствора предварительно сформированных липидных наночастиц перед стадией смешивания. В некоторых вариантах осуществления способ включает нагревание одного или нескольких из раствора, содержащего предварительно сформированные липидные наночастицы, раствора, содержащего мРНК, и раствора, содержащего инкапсулированную в липидные наночастицы мРНК, во время стадии смешивания. В некоторых вариантах осуществления способ включает стадию нагревания инкапсулированной в липидные наночастицы мРНК после стадии смешивания. В некоторых вариантах осуществления температура, до которой нагревают один или несколько растворов (или при которой поддерживают один или несколько растворов) составляет приблизительно 30°C, 37°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C или 70°C или выше. В некоторых вариантах осуществления температура, до которой нагревают один или несколько растворов находится в диапазоне приблизительно 25-70°C, приблизительно 30-70°C, приблизительно 35-70°C, приблизительно 40-70°C, приблизительно 45-70°C, приблизительно 50-70°C или приблизительно 60-70°C. В некоторых вариантах осуществления температура, превышающая температуру окружающей среды, до которой нагревают один или несколько из растворов, составляет приблизительно 65°C.

[0262] Для получения раствора мРНК, подходящего для настоящего изобретения, можно применять различные способы. В некоторых вариантах осуществления мРНК может быть непосредственно растворена в буферном растворе, описанном в данном документе. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК может быть получен путем смешивания исходного раствора мРНК с буферным раствором перед смешиванием с раствором липидов для инкапсулирования. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК может быть получен путем смешивания исходного раствора мРНК с буферным раствором непосредственно перед смешиванием с раствором липидов для инкапсулирования. В некоторых вариантах осуществления подходящий исходный раствор мРНК может содержать мРНК в воде в концентрации, составляющей приблизительно 0,2 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,8 мг/мл, 1,0 мг/мл, 1,2 мг/мл, 1,4 мг/мл, 1,5 мг/мл или 1,6 мг/мл, 2,0 мг/мл, 2,5 мг/мл, 3,0 мг/мл, 3,5 мг/мл, 4,0 мг/мл, 4,5 мг/мл или 5,0 мг/мл или больше.

[0263] В некоторых вариантах осуществления исходный раствор мРНК смешивают с буферным раствором с применением насоса. Иллюстративные насосы включают без ограничения шестеренчатые насосы, перистальтические насосы и центробежные насосы.

[0264] Как правило, буферный раствор смешивают при скорости, превышающем скорость у исходного раствора мРНК. Например, буферный раствор можно смешивать при скорости, которая в по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 раза превышает скорость у исходного раствора мРНК. В некоторых вариантах осуществления буферный раствор смешивают при скорости потока, находящейся в диапазоне приблизительно 100-6000 мл/минута (например, приблизительно 100-300 мл/минута, 300-600 мл/минута, 600-1200 мл/минута, 1200-2400 мл/минута, 2400-3600 мл/минута, 3600-4800 мл/минута, 4800-6000 мл/минута или 60-420 мл/минута). В некоторых вариантах осуществления буферный раствор смешивают при скорости потока, составляющей приблизительно 60 мл/минута, 100 мл/минута, 140 мл/минута, 180 мл/минута, 220 мл/минута, 260 мл/минута, 300 мл/минута, 340 мл/минута, 380 мл/минута, 420 мл/минута, 480 мл/минута, 540 мл/минута, 600 мл/минута, 1200 мл/минута, 2400 мл/минута, 3600 мл/минута, 4800 мл/минута или 6000 мл/минута или больше.

[0265] В некоторых вариантах осуществления исходный раствор мРНК смешивают при скорости потока, находящейся в диапазоне приблизительно 10-600 мл/минута (например, приблизительно 5-50 мл/минута, приблизительно 10-30 мл/минута, приблизительно 30-60 мл/минута, приблизительно 60-120 мл/минута, приблизительно 120-240 мл/минута, приблизительно 240-360 мл/минута, приблизительно 360-480 мл/минута или приблизительно 480-600 мл/минута). В некоторых вариантах осуществления исходный раствор мРНК смешивают при скорости потока, составляющей приблизительно 5 мл/минута, 10 мл/минута, 15 мл/минута, 20 мл/минута, 25 мл/минута, 30 мл/минута, 35 мл/минута, 40 мл/минута, 45 мл/минута, 50 мл/минута, 60 мл/минута, 80 мл/минута, 100 мл/минута, 200 мл/минута, 300 мл/минута, 400 мл/минута, 500 мл/минута или 600 мл/минута или больше.

[0266] В соответствии с настоящим изобретением раствор липидов содержит смесь липидов, подходящую для формирования липидных наночастиц для инкапсулирования мРНК. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов получен на основе этанола. Например, подходящий раствор липидов может содержать смесь требуемых липидов, растворенных в чистом этаноле (т. е. 100% этаноле). В другом варианте осуществления подходящий раствор липидов получен на основе изопропилового спирта. В другом варианте осуществления подходящий раствор липидов получен на основе диметилсульфоксида. В другом варианте осуществления подходящий раствор липидов представляет собой смесь подходящих растворителей, включая без ограничения этанол, изопропиловый спирт и диметилсульфоксид.

[0267] Подходящий раствор липидов может содержать смесь требуемых липидов в различных концентрациях. Например, подходящий раствор липидов может содержать смесь требуемых липидов при общей концентрации, составляющей приблизительно 0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 1,0 мг/мл, 2,0 мг/мл, 3,0 мг/мл, 4,0 мг/мл, 5,0 мг/мл, 6,0 мг/мл, 7,0 мг/мл, 8,0 мг/мл, 9,0 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл или 100 мг/мл или больше. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов может содержать смесь требуемых липидов при общей концентрации, находящейся в диапазоне приблизительно 0,1-100 мг/мл, 0,5-90 мг/мл, 1,0-80 мг/мл, 1,0-70 мг/мл, 1,0-60 мг/мл, 1,0-50 мг/мл, 1,0-40 мг/мл, 1,0-30 мг/мл, 1,0-20 мг/мл, 1,0-15 мг/мл, 1,0-10 мг/мл, 1,0-9 мг/мл, 1,0-8 мг/мл, 1,0-7 мг/мл, 1,0-6 мг/мл или 1,0-5 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов может содержать смесь требуемых липидов при общей концентрации, составляющей не более приблизительно 100 мг/мл, 90 мг/мл, 80 мг/мл, 70 мг/мл, 60 мг/мл, 50 мг/мл, 40 мг/мл, 30 мг/мл, 20 мг/мл или 10 мг/мл.

[0268] Любые требуемые липиды можно смешивать при любых соотношениях, подходящих для инкапсулирования мРНК. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов содержит смесь требуемых липидов, включая катионные липиды, вспомогательные липиды (например, некатионные липиды и/или липиды на основе холестерина), амфифильные блок-сополимеры (например, полоксамеры) и/или пегилированные липиды. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов содержит смесь требуемых липидов, включая один или несколько катионных липидов, один или несколько вспомогательных липидов (например, липиды, отличные от катионных, и/или липиды на основе холестерина) и один или несколько пегилированных липидов.

[0269] В некоторых вариантах осуществления предусмотренные композиции содержат липосому, в которой мРНК ассоциирована как с поверхностью липосомы, так и инкапсулирована в той же липосоме. Например, во время получения композиций по настоящему изобретению катионные липосомы могут ассоциироваться с мРНК или MCNA за счет электростатических взаимодействий.

[0270] В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению содержат мРНК, инкапсулированную в липосому. В некоторых вариантах осуществления один или несколько видов мРНК могут быть инкапсулированы в одну и ту же липосому. В некоторых вариантах осуществления один или несколько видов мРНК могут быть инкапсулированы в разные липосомы. В некоторых вариантах осуществления мРНК инкапсулирована в одну или несколько липосом, отличающихся своим липидным составом, молярным соотношением липидных компонентов, размером, зарядом (дзета-потенциалом), нацеливающими лигандами и/или их комбинациями. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько липосом могут иметь отличающийся состав катионных липидов на основе стеринов, нейтральных липидов, PEG-модифицированных липидов и/или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько липосом могут характеризоваться отличающимся молярным соотношением катионного липида на основе холестерина, нейтрального липида и PEG-модифицированного липида, используемых для создания липосомы.

[0271] Процесс включения требуемой нуклеиновой кислоты (например, мРНК или MCNA) в липосому часто называют "загрузкой". Иллюстративные способы описаны в Lasic, et al. FEBS Lett., 312: 255-258, 1992, которая включена в данный документ посредством ссылки. Встроенные в липосомы нуклеиновые кислоты могут быть полностью или частично расположены во внутреннем пространстве липосомы, внутри двухслойной мембраны липосомы, или ассоциированы с внешней поверхностью липосомной мембраны. Включение нуклеиновой кислоты в липосомы также обозначается в данном документе как "инкапсуляция", при которой нуклеиновая кислота полностью заключается во внутреннее пространство липосомы. Целью включения мРНК в среду-носитель для переноса, такую как липосома, часто является защита нуклеиновой кислоты от окружающей среды, которая может содержать ферменты или химические вещества, разрушающие нуклеиновые кислоты, и/или системы или рецепторы, обуславливающие быстрое выведение нуклеиновых кислот. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления подходящая среда-носитель для доставки способна повышать стабильность содержащейся в ней мРНК и/или облегчать доставку терапевтического средства (например, мРНК или MCNA) в целевую клетку или ткань.

[0272] Подходящие липосомы в соответствии с настоящим изобретением можно изготавливать с различными размерами. В некоторых вариантах осуществления предусмотренные липосомы можно изготавливать с меньшими размерами, чем у ранее известных липосом. В некоторых вариантах осуществления уменьшение размера липосом ассоциировано с более эффективной доставкой терапевтического средства (например, мРНК или MCNA). При выборе соответствующего размера липосомы может учитываться местонахождение целевой клетки или ткани и, в некоторой степени, вариант применения, для которого изготавливается липосома.

[0273] В некоторых вариантах осуществления соответствующий размер липосомы выбирается для облегчения системного распределения антитела, кодируемого мРНК. В некоторых вариантах осуществления может потребоваться ограничить трансфекцию мРНК определенными клетками или тканями. Например, для нацеливания на гепатоциты можно обеспечивать размер липосомы, чтобы ее габариты были меньше, чем поры эндотелиального слоя, выстилающего печеночные синусоиды в печени; в таких случаях липосома может легко проникать через такие эндотелиальные поры, чтобы достичь целевых гепатоцитов.

[0274] В качестве альтернативы или дополнения можно обеспечивать размер липосомы, чтобы габариты липосомы имели достаточный диаметр для ограничения или явного предотвращения распределения в определенные клетки или ткани.

[0275] Для обеспечения размера популяции липосом доступно множество альтернативных способов, известных из уровня техники. Один из таких способов обеспечения размера описан в патенте США № 4737323, включенном в данный документ посредством ссылки. Обработка липосомной суспензии ультразвуком либо в ванне, либо зондом, приводит к постепенному уменьшению размера вплоть до получения небольшой ULV диаметром менее чем приблизительно 0,05 микрона. Гомогенизация является еще одним способом, основанным на энергии сдвига для фрагментации крупных липосом на более мелкие. В типичной процедуре гомогенизации MLV рециркулируются через стандартный гомогенизатор эмульсий до тех пор, пока не будут наблюдаться липосомы выбранных размеров, как правило, от приблизительно 0,1 микрона до 0,5 микрона. Размер липосом можно определить с помощью квазиэлектрического светорассеяния (QELS), описанного в Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-450 (1981), включенной в данный документ посредством ссылки. Средний диаметр липосомы может быть уменьшен путем обработки сформированных липосом ультразвуком. Для осуществления эффективного синтеза липосом периодические циклы обработки ультразвуком можно чередовать с оценкой на основе QELS.

Предусмотренные наночастицы, инкапсулирующие мРНК

[0276] В некоторых вариантах осуществления большая часть очищенных наночастиц в композиции, т. e. более приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% наночастиц, имеют размер приблизительно 150 нм (например, приблизительно 145 нм, приблизительно 140 нм, приблизительно 135 нм, приблизительно 130 нм, приблизительно 125 нм, приблизительно 120 нм, приблизительно 115 нм, приблизительно 110 нм, приблизительно 105 нм, приблизительно 100 нм, приблизительно 95 нм, приблизительно 90 нм, приблизительно 85 нм или приблизительно 80 нм). В некоторых вариантах осуществления практически все очищенные наночастицы имеют размер приблизительно 150 нм (например, приблизительно 145 нм, приблизительно 140 нм, приблизительно 135 нм, приблизительно 130 нм, приблизительно 125 нм, приблизительно 120 нм, приблизительно 115 нм, приблизительно 110 нм, приблизительно 105 нм, приблизительно 100 нм, приблизительно 95 нм, приблизительно 90 нм, приблизительно 85 нм или приблизительно 80 нм).

[0277] В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет средний размер менее 150 нм. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет средний размер менее 120 нм. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет средний размер менее 100 нм. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет средний размер менее 90 нм. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет средний размер менее 80 нм. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет средний размер менее 70 нм. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет средний размер менее 60 нм. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет средний размер менее 50 нм. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет средний размер менее 30 нм. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет средний размер менее 20 нм.

[0278] В некоторых вариантах осуществления дисперсность или мера неоднородности по размеру молекул (PDI) наночастиц в композиции, предусмотренной в настоящем изобретении, составляет менее приблизительно 0,5. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,5. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,4. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,3. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,28. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,25. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,23. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,20. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,18. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,16. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,14. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,12. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,10. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется PDI, составляющим менее приблизительно 0,08.

[0279] В некоторых вариантах осуществления более приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% очищенных липидных наночастиц в композиции, предусмотренной в настоящем изобретении, инкапсулируют мРНК в каждой отдельной частице. В некоторых вариантах осуществления практически все очищенные липидные наночастицы в композиции инкапсулируют мРНК в каждой отдельной частице. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования от 50% до 99%. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования более приблизительно 60%. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования более приблизительно 65%. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования более приблизительно 70%. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования более приблизительно 75%. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования более приблизительно 80%. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования более приблизительно 85%. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования более приблизительно 90%. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования более приблизительно 92%. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования более приблизительно 95%. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования более приблизительно 98%. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется эффективностью инкапсулирования более приблизительно 99%.

[0280] В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется соотношением N/P от 1 до 10. Используемый в данном документе термин "соотношение N/P" относится к молярному соотношению положительно заряженных молекулярных звеньев в катионных липидах в липидной наночастице относительно отрицательно заряженных молекулярных звеньев в мРНК, инкапсулированной в этой липидной наночастице. Таким образом, соотношение N/P, как правило, рассчитывается как соотношение числа молей аминогрупп в катионных липидах в липидной наночастице относительно числа молей фосфатных групп в мРНК, инкапсулированной в данной липидной наночастице. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется соотношением N/P выше 1. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется соотношением N/P, составляющим приблизительно 1. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется соотношением N/P, составляющим приблизительно 2. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется соотношением N/P, составляющим приблизительно 3. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется соотношением N/P, составляющим приблизительно 4. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется соотношением N/P, составляющим приблизительно 5. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется соотношением N/P, составляющим приблизительно 6. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется соотношением N/P, составляющим приблизительно 7. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица характеризуется соотношением N/P, составляющим приблизительно 8.

[0281] В некоторых вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит по меньшей мере приблизительно 0,5 мг, 1 мг, 5 мг, 10 мг, 100 мг, 500 мг или 1000 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от приблизительно 0,1 мг до 1000 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 0,5 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 0,8 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 1 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 5 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 8 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 10 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 50 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 100 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 500 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 1000 мг инкапсулированной мРНК.

Терапевтическое применение композиций

[0282] Для облечения экспрессии мРНК in vivo среды-носители для доставки, такие как липосомы, могут быть составлены в комбинации с одной или несколькими дополнительными нуклеиновыми кислотами, носителями, нацеливающими лигандами или стабилизирующими реагентами, или в фармакологические композиции, где их смешивают с подходящими вспомогательными веществами. Методики для составления и введения лекарственных средств можно найти в "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., последнее издание.

[0283] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит мРНК, инкапсулированные в среде-носителе для доставки или в комплексе с ней. В некоторых вариантах осуществления среда-носитель для доставки выбрана из группы, состоящей из липосом, липидных наночастиц, твердых липидных наночастиц, полимеров, вирусов, золь-гелей и наногелей.

[0284] Предусмотренные загруженные мРНК наночастицы и содержащие их композиции можно вводить и дозировать в соответствии с текущей медицинской практикой, принимая во внимание клиническое состояние субъекта, место и способ введения, график введения, возраст субъекта, пол, вес тела и другие факторы, имеющие значение для лечащих врачей средней квалификации в данной области. "Эффективное количество" для целей, представленных в данном документе, может быть определено с помощью соответствующих критериев, известных специалистам средней квалификации в области экспериментального клинического исследования, фармакологии, клинической и медицинской области. В некоторых вариантах осуществления вводимое количество является эффективным для достижения по меньшей мере некоторой стабилизации, улучшения или устранения симптомов и других показателей, выбранных специалистами в данной области техники в качестве соответствующих мер прогрессирования, регрессии или улучшения при заболевании. Например, подходящим количеством и схемой введения доз являются те, которые обуславливают по меньшей мере временное продуцирование белка (например, фермента).

[0285] В настоящем изобретении предусмотрены способы доставки мРНК для продуцирования белка in vivo, включающие введение мРНК субъекту, нуждающемуся в доставке. В некоторых вариантах осуществления мРНК вводят путем доставки, выбранным из группы, состоящей из внутривенной доставки, подкожной доставки, пероральной доставки, подкожной доставки, глазной доставки, легочной доставки посредством внутритрахеальной инъекции (например, распыления), внутримышечной доставки, внутриоболочечной доставки или внутрисуставной доставки.

[0286] Подходящие пути введения включают, например, пероральное, ректальное, вагинальное, чресслизистое, легочное, включая внутритрахеальное или ингаляционное, или кишечное введение; парентеральную доставку, включая интрадермальную, трансдермальную (местную), внутримышечную, подкожную, интрамедуллярную инъекции, а также интратекальное, прямое внутрижелудочковое, внутривенное, внутрибрюшинное и/или интраназальное. В некоторых вариантах осуществления внутримышечное введение осуществляют в мышцу, выбранную из группы, состоящей из скелетной мышцы, гладкой мышцы и сердечной мышцы. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к доставке мРНК в мышечную клетку. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к доставке мРНК в гепатоцит (т. e. клетку печени). В конкретном варианте осуществления внутримышечное введение приводит к доставке мРНК в мышечную клетку.

[0287] Дополнительное описание легочной доставки и распыления представлено в опубликованной заявке на патент США № US 2018/0125989 и опубликованной заявке на патент США № US 2018/0333457, каждая из которых включена посредством ссылки во всей своей полноте.

[0288] В качестве альтернативы или дополнения загруженные мРНК наночастицы и композиции по настоящему изобретению можно вводить местно, а не системно, например, путем инъекции фармацевтической композиции непосредственно в целевую ткань, предпочтительно в составе с длительным высвобождением. Местная доставка может осуществляться различными путями, в зависимости от ткани, на которую нацеливаются. Например, аэрозоли, содержащие композиции по настоящему изобретению, можно вводить ингаляцией (для назальной, трахеальной или бронхиальной доставки); композиции по настоящему изобретению можно вводить инъекцией, например, в место поражения, проявления заболевания или боли; композиции могут быть представлены в пастилках для перорального, трахеального или пищеводного применения; могут быть обеспечены в форме жидкости, таблетки или капсулы для введения в желудок или кишечник, могут быть обеспечены в форме суппозитория для ректального или вагинального применения или даже могут быть доставлены в глаз с применением кремов, капель или даже инъекции. Составы, содержащие предусмотренные композиции в комплексе с терапевтическими молекулами или лигандами, можно даже вводить хирургическим путем, например, в ассоциации с полимером или другой структурой или веществом, что может обеспечивать диффузию композиций из места имплантации в окружающие клетки. В качестве альтернативы их можно применять хирургическим путем без применения полимеров или подложек.

[0289] Предусмотренные способы по настоящему изобретению предусматривают однократные, а также многократные введения терапевтически эффективного количества терапевтических средств (например, мРНК), описанных в данном документе. Терапевтические средства можно вводить с регулярными интервалами, в зависимости от характера, тяжести и степени состояния субъекта. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество терапевтических средств (например, мРНК) по настоящему изобретению можно вводить интратекально периодически с регулярными интервалами (например, раз в год, раз в шесть месяцев, раз в пять месяцев, раз в три месяца, раз в два месяца (один раз каждые два месяца), ежемесячно (раз в месяц), раз в две недели (один раз каждые две недели), два раза в месяц, раз в 30 дней, раз в 28 дней, раз в 14 дней, раз в 10 дней, раз в 7 дней, еженедельно, два раза в неделю, ежедневно или постоянно).

[0290] В некоторых вариантах осуществления предусмотренные липосомы и/или композиции составляют так, что они подходят для замедленного высвобождения содержащейся в них мРНК. Такие композиции с замедленным высвобождением можно удобно вводить субъекту с увеличенными интервалами введения доз. Например, в одном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению вводят субъекту два раза в день, ежедневно или через день. В предпочтительном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению вводят субъекту два раза в неделю, раз в неделю, раз в 7 дней, раз в 10 дней, раз в 14 дней, раз в 28 дней, раз в 30 дней, раз в две недели, раз в три недели или, более предпочтительно, раз в четыре недели, раз в месяц, два раза в месяц, раз в шесть недель, раз в восемь недель, раз в два месяца, раз в три месяца, раз в четыре месяца, раз в шесть месяцев, раз в восемь месяцев, раз в девять месяцев или раз в год. Также предусмотрены композиции и липосомы, которые составлены для введения в виде депо-препарата (например, внутримышечно, подкожно, интравитреально) для доставки или высвобождения терапевтического средства (например, мРНК) в течение длительных периодов времени. Предпочтительно, используемые средства замедленного высвобождения комбинируют с модификациями, выполненными в мРНК для повышения стабильности.

[0291] Используемый в данном документе термин "терапевтически эффективное количество" в значительной степени определяется на основании общего количества терапевтического средства, содержащегося в фармацевтических композициях по настоящему изобретению. Обычно терапевтически эффективного количества достаточно для достижения значимой пользы для субъекта (например, лечения, модулирования, излечения, предупреждения и/или облегчения заболевания или нарушения). Например, терапевтически эффективное количество может быть количеством, достаточным для достижения требуемого терапевтического и/или профилактического эффекта. Обычно количество терапевтического средства (например, мРНК), вводимого субъекту, нуждающемуся в этом, будет зависеть от характеристик субъекта. Такие характеристики включают состояние, тяжесть заболевания, общее состояние здоровья, возраст, пол и массу тела субъекта. Специалист средней квалификации в данной области техники сможет легко определить соответствующие дозировки, зависящие от этих и других сопутствующих факторов. Кроме того, для идентификации оптимальных диапазонов дозировок необязательно могут быть использованы как объективные, так и субъективные анализы.

[0292] Терапевтически эффективное количество обычно вводят по схеме введения доз, которая может включать несколько стандартных доз. Для любого конкретного терапевтического белка терапевтически эффективное количество (и/или соответствующая стандартная доза в рамках эффективной схемы введения доз) может меняться, например, в зависимости от пути введения, от комбинации с другими фармацевтическими средствами. Кроме того, специфическое терапевтически эффективное количество (и/или стандартная доза) для любого конкретного пациента может зависеть от множества факторов, включая нарушение, подлежащее лечению, и тяжесть нарушения; активность специфического используемого фармацевтического средства; специфическую используемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион пациента; время введения, путь введения и/или скорость выведения или метаболизма специфического используемого белка; продолжительность лечения, и подобных факторов, также известных в области медицины.

[0293] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза находится в диапазоне от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 500 мг/кг массы тела, например, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 400 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 300 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 200 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 100 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 90 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 80 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 70 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 60 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 50 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 40 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 30 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 25 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 20 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 15 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела до 10 мг/кг массы тела.

[0294] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза составляет более приблизительно 0,1 мг/кг массы тела, более приблизительно 0,5 мг/кг массы тела, более приблизительно 1,0 мг/кг массы тела, более приблизительно 3 мг/кг массы тела, более приблизительно 5 мг/кг массы тела, более приблизительно 10 мг/кг массы тела, более приблизительно 15 мг/кг массы тела, более приблизительно 20 мг/кг массы тела, более приблизительно 30 мг/кг массы тела, более приблизительно 40 мг/кг массы тела, более приблизительно 50 мг/кг массы тела, более приблизительно 60 мг/кг массы тела, более приблизительно 70 мг/кг массы тела, более приблизительно 80 мг/кг массы тела, более приблизительно 90 мг/кг массы тела, более приблизительно 100 мг/кг массы тела, более приблизительно 150 мг/кг массы тела, более приблизительно 200 мг/кг массы тела, более приблизительно 250 мг/кг массы тела, более приблизительно 300 мг/кг массы тела, более приблизительно 350 мг/кг массы тела, более приблизительно 400 мг/кг массы тела, более приблизительно 450 мг/кг массы тела, более приблизительно 500 мг/кг массы тела. В конкретном варианте осуществления терапевтически эффективная доза составляет 1,0 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективную дозу 1,0 мг/кг вводят внутримышечно или внутривенно.

[0295] Также в данном документе рассматриваются лиофилизированные фармацевтические композиции, содержащие одну или несколько липосом, раскрытых в данном документе, и связанные способы применения таких композиций, раскрытые, например, в предварительной заявке на патент США № 61/494882, поданной 8 июня 2011 г., описание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Например, лиофилизированные фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть восстановлены перед введением или могут быть восстановлены in vivo. Например, лиофилизированная фармацевтическая композиция может быть составлена в соответствующей лекарственной форме (например, внутрикожной лекарственной форме, такой как диск, стержень или мембрана) и введена таким образом, чтобы лекарственная форма регидратировалась со временем in vivo с помощью биологических жидкостей индивидуума.

[0296] Предусмотренные липосомы и композиции могут вводиться в любую требуемую ткань. В некоторых вариантах осуществления мРНК, доставленная предусмотренными липосомами или композициями, экспрессируется в ткани, в которую были введены липосомы и/или композиции. В некоторых вариантах осуществления доставленная мРНК экспрессируется в ткани, отличной от ткани, в которую были введены липосомы и/или композиции. Иллюстративные ткани, в которые может быть доставлена и/или экспрессирована доставленная мРНК, включают без ограничения печень, почку, сердце, селезенку, сыворотку крови, головной мозг, скелетную мышцу, лимфатические узлы, кожу и/или спинномозговую жидкость.

[0297] В некоторых вариантах осуществления введение предусмотренной композиции приводит к повышению уровня экспрессии мРНК в биологическом образце субъекта по сравнению с исходным уровнем экспрессии до лечения. Как правило, исходный уровень измеряют непосредственно перед лечением. Биологические образцы включают, например, образцы цельной крови, сыворотки крови, плазмы, мочи и тканей (например, мышцы, печени, фибробластов кожи). В некоторых вариантах осуществления введение предусмотренной композиции приводит к повышению уровня экспрессии мРНК на по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% по сравнению с исходным уровнем непосредственно до лечения. В некоторых вариантах осуществления введение предусмотренной композиции приводит к повышению уровня экспрессии мРНК по сравнению с уровнем экспрессии мРНК у субъектов, не получавших лечение

[0298] В соответствии с различными вариантами осуществления определение сроков экспрессии доставленной мРНК может быть адаптировано для соответствия конкретной медицинской потребности. В некоторых вариантах осуществления экспрессия белка, кодируемого доставленной мРНК, поддается выявлению через 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48, 72 и/или 96 часов после введения предусмотренных липосом и/или композиций. В некоторых вариантах осуществления экспрессия белка, кодируемого доставленной мРНК, поддается выявлению через одну неделю, две недели и/или один месяц после введения.

В настоящем изобретении также предусмотрена доставка композиции, содержащей молекулы мРНК, кодирующие представляющий интерес пептид или полипептид, для применения в лечении субъекта, например, субъекта-человека, или клетки субъекта-человека, или клетки, которую обрабатывают и доставляют субъекту-человеку.

ПРИМЕРЫ

[0299] Хотя определенные соединения, композиции и способы по настоящему изобретению были конкретно описаны в соответствии с определенными вариантами осуществления, следующие примеры служат исключительно для иллюстрации соединений по настоящему изобретению и не предназначены для его ограничения.

Пример 1. Составление композиции на основе мРНК-LNP для ректальной доставки

[0300] В данном примере показан иллюстративный способ получения композиции, содержащей мРНК, инкапсулированную в липидные наночастицы (LNP), подходящую для ректальной доставки.

[0301] Матричные РНК инкапсулировали в липидные наночастицы, содержащие ML-2: DOPE: холестерин: DMG-PEG (40:30:25:5), с использованием способа B. Используемый в данном документе "способ В" относится к способу инкапсулирования мРНК путем смешивания предварительно сформированных липидных наночастиц с мРНК, как описано в US 2018/0153822, которая включена в данный документ во всей своей полноте. Суппозитории получали при концентрации 10% вес/об. желатина в LNP. Вкратце, желатин непосредственно растворяли в LNP при 65°C в течение 5 минут и заливали в одноразовые формы. Затем формы замораживали при -80°C. Суппозитории, содержащие LNP с инкапсулированной мРНК, оставались неповрежденными. Иллюстративный суппозиторий, содержащий мРНК-LNP, показан на фиг. 1.

[0302] Раствор Labrasol (усилителя проницаемости) получали путем растворения 153 мг Labrasol в 1 мл воды.

[0303] Для контроля скорости плавления суппозиториев можно применять различные количества желатина, тем самым контролируя время высвобождения мРНК, инкапсулированной в LNP, после введения субъекту. Кроме того, для контроля времени высвобождения можно добавлять вспомогательные вещества, модифицирующие вязкость.

Пример 2. Ректальная доставка мРНК FFLuc-LNP мышам

[0304] В данном примере показана успешная ректальная доставка мРНК в липидных наночастицах.

[0305] Мышам ректальным путем вводили дозу инкапсулированной в липидные наночастицы мРНК люциферазы светлячка (FFLuc) (0,2 мг на животное) или физиологического раствора. Получали фотографии всего тела и отдельных тканей через 24 часа после ректального введения, которые показаны на фиг. 2 и фиг. 3.

[0306] Как показано на фиг. 2A и фиг. 2B, у мышей, которым ректальным путем вводили дозу физиологического раствора, как и ожидалось, не наблюдали никакой люминесценции. У мышей, которым ректальным путем вводили мРНК FFLuc-LNP, проявлялась люминесценция, особенно сильная люминесценцию в области прямой кишки (фиг. 3A). Среди тканей клоны демонстрировали сильную люминесценцию, как показано на фиг. 3B.

[0307] Этот пример показывает, что мРНК-LNP могут успешно доставляться ректальным путем для экспрессии белка in vivo. Экспрессию выявляли в прямой кишке и толстой кишке.

Пример 3. Ректальная доставка мРНК FFLuc-LNP с усилителем проницаемости

[0308] В данном примере показана успешная доставка мРНК в липидных наночастицах с капратом натрия, усилителем проницаемости. Ректальное введение мРНК-LNP с капратом натрия значительно усиливает экспрессию белка in vivo.

[0309] Одной группе мышей вводили 0,2 мг мРНК FFLuc-LNP (группа 1), как описано в примере 2. Второй группе мышей предварительно вводили дозу с капратом натрия (раствор 200 мг/мл - инъекция 50 ults) перед ректальным введением 0,05 мг мРНК FFLuc-LNP (группа 2). Получали фотографии всего тела и отдельных тканей через 24 часа после ректального введения.

[0310] Как показано на фиг. 4, мыши, которым ректальным путем вводили дозу 0,05 мг мРНК FFLuc-LNP с капратом натрия, демонстрировали значительно более высокий сигнал по сравнению с мышами, которым вводили 0,2 мг мРНК FFLuc-LNP. На фиг. 5 показано, что в группе 2 наблюдали почти 2-кратное увеличение люминесценции, несмотря на то, что доза мРНК-LNP составляла 25% от дозы в группе 1.

[0311] В данном примере показано, что усилители проницаемости могут повышать экспрессию белков, доставляемых с помощью мРНК-LNP.

Пример 4. Ректальная доставка мРНК FFLuc-LNP в суппозиториях мышам и крысам

[0312] В данном примере показана успешная ректальная доставка мРНК-LNP в составе суппозитория. Ректальное введение мРНК-LNP в суппозиториях значительно повышало экспрессию белка in vivo, и экспрессию белка выявляли в различных тканях.

[0313] Мышам или крысам ректальным путем вводили дозу 30 мкл раствора Labrasol (153 мг/мл). Через 30 минут ректальным путем вводили составы суппозитория с мРНК FFLuc-LNP. Получали фотографии всего тела и отдельных тканей через 24 часа после ректального введения.

[0314] На фиг. 6A показано, что у мышей, которым ректальным путем вводили мРНК FFLuc-LNP в суппозиториях, наблюдали значительно более высокую люминесценцию по сравнению с мышами, которым ректальным путем вводили мРНК-LNP без суппозиториев. Более того, наблюдали сильный сигнал люминесценции в разных тканях (например, прямой кишки, толстой кишки, печени, почки и т. д.). Две из четырех крыс демонстрировали люминесценцию в печени, толстой кишке и прямой кишке, как показано на фиг. 6B. У мышей наблюдали меньшую вариабельность по сравнению с крысами.

[0315] В данном примере показано, что при доставке мРНК-LNP в форме суппозитория наблюдается значительное повышение экспрессии белка. Пример также подтверждает, что суппозитории могут помочь мРНК-LNP преодолеть действие РНКазы и барьер слизи, а также контролировать высвобождение мРНК-LNP внутри организма субъектов после доставки. Более того, экспрессию белка in vivo выявляли в различных тканях, включая почку. Это важно, поскольку целевая доставка средств в почку мыши, как известно, является сложной и может потребовать лапаротомии. Кроме того, экспрессия FFL в печени свидетельствует о поглощении LNP в системном кровообращении.

Пример 5. Ректальная доставка EPO мРНК-LNP в суппозиториях крысам

[0316] В данном примере показана успешная ректальная доставка мРНК-LNP в суппозиториях для секретируемых белков.

[0317] Крысам ректальным путем вводили дозу 30 мкл раствора Labrasol (153 мг/мл). Через 30 минут ректальным путем вводили составы суппозитория с мРНК hEPO-LNP. Через 24 часа после введения измеряли уровни hEPO в сыворотке крови. Как показано на фиг. 7, крысы, которым ректальным путем вводили дозу мРНК hEPO-LNP в суппозиториях, демонстрировали выявляемые уровни hEPO в сыворотке крови. Эти уровни намного превышали нормальные физиологические уровни EPO.

[0318] В данном примере показано, что ректальная доставка мРНК-LNP в форме суппозитория может успешно обеспечивать экспрессированный белок в системном кровообращении.

ЭКВИВАЛЕНТЫ И ОБЪЕМ

[0319] Специалистам в данной области техники будут известны многочисленные эквиваленты конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанного в данном документе, или они смогут установить их, используя не более чем рутинный эксперимент. Объем настоящего изобретения не предназначен для ограничения приведенным выше описанием, а определяется следующей формулой изобретения.

В настоящем изобретении предусмотрены эффективные способы и композиции для доставки матричной РНК (мРНК) посредством ректальной доставки. Настоящее изобретение отчасти основано на неожиданном наблюдении того, что мРНК может эффективно доставляться в кровообращение, печень, почку, толстую кишку и/или прямую кишку посредством ректальной доставки несмотря на барьеры, такие как РНКаза и слой слизи. 2 н. и 24 з.п. ф-лы, 10 ил., 5 пр.

1. Комбинация для доставки матричной РНК (мРНК), включающая усилитель проницаемости и композицию, составленную для ректальной доставки мРНК субъекту неодновременно или одновременно с введением усилителя проницаемости, где:

усилитель проницаемости содержит Labrasol®, форму капрата или жирной кислоты или ее производного, выбранного из сорбитана лаурата, капрата натрия, сахарозы, пальмитата, лауроилхолина, миристата натрия или пальмитоил карнитина; и

композиция, составленная для ректальной доставки мРНК, содержит:

липидную наночастицу, содержащую один или несколько катионных липидов и любой из одного или нескольких некатионных липидов, одного или нескольких липидов на основе холестерина или одного или нескольких PEG-модифицированных липидов; и

мРНК, инкапсулированную внутри липидной наночастицы.

2. Комбинация по п.1, где ректальная доставка осуществляется с помощью суппозитория.

3. Комбинация по п.1, где ректальная доставка осуществляется с помощью клизмы.

4. Комбинация по п.1, где ректальная доставка осуществляется с помощью катетера.

5. Комбинация по п.1, где ректальная доставка осуществляется с помощью спринцовки.

6. Комбинация по п.2, где композиция не содержит компонент суппозитория на липидной основе.

7. Комбинация по п.6, где компонент суппозитория на липидной основе представляет собой масло какао, теобромовое масло, синтетические жиры или синтетические основы.

8. Комбинация по п.2, где композиция дополнительно содержит компонент суппозитория на водной основе, выбранный из глицерина, желатина или полиэтиленгликоля (PEG) или их комбинаций.

9. Комбинация по п.8, где суппозиторий на водной основе содержит желатин.

10. Комбинация по любому из пп.1-9, где усилитель проницаемости содержит капрат натрия.

11. Комбинация по любому из пп.1-9, где усилитель проницаемости содержит Labrasol®.

12. Комбинация по п.9, где единственным компонентом суппозитория на водной основе является желатин.

13. Комбинация по п.12, где композиция содержит приблизительно 5% или более желатина в воде, 10% или более желатина в воде, 20% или более желатина в воде, 30% или более желатина в воде или 50% или более желатина в воде.

14. Комбинация по любому из пп.1-13, где композиция содержит 0,25 мг/мл или более мРНК, 0,5 мг/мл или более мРНК, 0,75 мг/мл или более мРНК или 1 мг/мл или более мРНК, 1,25 мг или более мРНК, 1,5 мг или более мРНК или 1,75 мг или более мРНК.

15. Комбинация по п.14, где композиция составлена для суппозитория массой приблизительно 3 грамма, приблизительно 2 грамма или приблизительно 1 грамм и/или имеющего объем приблизительно 2,0 мл, приблизительно 3,5 мл, приблизительно 7,5 мл или приблизительно 10,0 мл.

16. Комбинация по п.15, где суппозиторий охлаждают перед введением.

17. Комбинация по п.1, где субъекту сначала вводят усилитель проницаемости перед введением композиции, составленной для ректальной доставки мРНК.

18. Комбинация по п.17, где усилитель проницаемости вводят субъекту приблизительно за 30 минут, приблизительно 1 час, приблизительно 2,5 часа, приблизительно 5 часов или приблизительно 12 часов до введения композиции, содержащей мРНК.

19. Комбинация для доставки матричной РНК (мРНК), включающая усилитель проницаемости и суппозиторий для ректального введения мРНК субъекту неодновременно или одновременно с введением усилителя проницаемости, где:

усилитель проницаемости содержит капрат натрия или Labrasol®; и

суппозиторий содержит:

a) липидную наночастицу, содержащую один или несколько катионных липидов и один или несколько некатионных липидов, один или несколько липидов на основе холестерина или один или несколько PEG-модифицированных липидов;

b) мРНК, инкапсулированную в липидную наночастицу; и

c) желатин.

20. Комбинация по п.19, где

i) суппозиторий содержит приблизительно 5% или более желатина в воде, 10% или более желатина в воде, 20% или более желатина в воде, 30% или более желатина в воде или 50% или более желатина в воде; и/или

ii) суппозиторий не содержит компонент суппозитория на липидной основе.

21. Комбинация по п.20, где компонент суппозитория на липидной основе представляет собой масло какао, теобромовое масло, синтетические жиры или синтетические основы.

22. Комбинация по п.19, где липидная наночастица содержит диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), холестерин и 1,2-димиристоил-rac-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль (DMG-PEG).

23. Комбинация по п.19, где один или несколько катионных липидов составляют по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 70% по весу от общего содержания липидов в липидной наночастице.

24. Комбинация по п.19, где липидная наночастица предварительно формируется перед смешиванием с мРНК.

25. Комбинация по п.19, дополнительно содержащая глицерин и/или PEG.

26. Комбинация по любому из пп.19-25, где суппозиторий размягчается или плавится приблизительно при температуре от 36 до 37°С.