УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ, ЗАГРУЖЕННЫХ мРНК Российский патент 2024 года по МПК C12N15/88 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[1] Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным № 62/847837, поданной 14 мая 2019 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[2] Терапия с использованием матричной РНК (MRT) становится все более важным подходом для лечения ряда заболеваний. MRT предусматривает введение матричной РНК (мРНК) нуждающемуся в терапии пациенту для обеспечения выработки белка, кодируемого мРНК, в организме пациента. Липидные наночастицы обычно применяют для инкапсулирования мРНК для эффективной доставки мРНК in vivo.

[3] Для улучшения доставки с помощью липидных наночастиц много усилий было сосредоточено на выявлении новых липидов или конкретных липидных композиций, которые могут влиять на внутриклеточную доставку и/или экспрессию мРНК, например, в различных типах тканей, органов и/или клеток млекопитающих (например, клеток печени млекопитающих). Однако такие существующие подходы являются дорогостоящими, времязатратными и не поддаются прогнозированию.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[4] В настоящем изобретении предусмотрены, среди прочего, дополнительно усовершенствованные способы получения липидных наночастиц, загруженных мРНК (мРНК-LNP). Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии того факта, что по завершении процесса инкапсулирования матричной РНК (мРНК) в LNP, включающего смешивание одного или нескольких липидов в растворе липидов с одной или несколькими мРНК в растворе мРНК с образованием мРНК, инкапсулированной в LNP (мРНК-LNP), в растворе для образования LNP (например, способ A, который дополнительно описан ниже), дальнейшие стадии замены раствора для образования LNP на раствор для составления лекарственного продукта и нагревания мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта обеспечивают неожиданное преимущество в виде значительного повышения эффективности инкапсулирования мРНК-LNP, т. е. количества или процента мРНК, инкапсулированной в LNP (т. е. степени или эффективности инкапсулирования). Настоящее изобретение в частности является применимым для обеспечения при изготовлении мРНК-LNP более высокой степени или эффективности инкапсулирования по сравнению с традиционными подходами.

[5] По сравнению с традиционными подходами описанный в данном документе способ по настоящему изобретению обеспечивает более высокую эффективность инкапсулирования и соответственно может обеспечивать более высокую активность и лучшую эффективность мРНК, доставляемой с помощью липидных наночастиц, тем самым смещая терапевтический индекс в положительном направлении и обеспечивая дополнительные преимущества, такие как более низкая стоимость, лучшее соблюдение пациентами режима лечения и более удобные для пациента схемы дозирования. Составы на основе липидных наночастиц, загруженных мРНК, предусмотренные настоящим изобретением, можно успешно доставлять in vivo с обеспечением более активной и эффективной экспрессии белка различными путями введения, такими как внутривенный, внутримышечный, внутрисуставный, интратекальный, ингаляционный (респираторный), подкожный, интравитреальный и внутриглазной.

[6] Данный способ по настоящему изобретению можно осуществить с применением насосной системы, и, следовательно, он является масштабируемым, что делает возможным улучшение в отношении образования/составления частиц в количествах, достаточных, например, для проведения клинических испытаний и/или коммерческой продажи. Для осуществления на практике настоящего изобретения можно применять различные насосные системы, в том числе без ограничения безимпульсные проточные насосы, шестеренчатые насосы, перистальтические насосы и центробежные насосы.

[7] Данный способ по настоящему изобретению в результате обеспечивает превосходную эффективность инкапсулирования и однородный размер частиц.

[8] Таким образом, в одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ инкапсулирования матричной РНК (мРНК) в липидных наночастицах (LNP), включающий стадии (а) смешивания одного или нескольких липидов в растворе липидов с одной или несколькими мРНК в растворе мРНК с образованием мРНК, инкапсулированной в LNP (мРНК-LNP), в растворе для образования LNP; (b) замены раствора для образования LNP на раствор для составления лекарственного продукта с получением мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта; и (c) нагревания мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта, где эффективность инкапсулирования для мРНК-LNP, полученных на стадии (c), превышает эффективность инкапсулирования для мРНК-LNP, полученных на стадии (b).

[9] В некоторых вариантах осуществления на стадии (c) раствор для составления лекарственного продукта нагревают путем применения в отношении раствора тепла от источника тепла.

[10] В некоторых вариантах осуществления на стадии (c) раствор для составления лекарственного продукта нагревают путем применения в отношении раствора тепла от источника тепла и раствор выдерживают при температуре, превышающей температуру окружающей среды, в течение 5 секунд или больше, 10 секунд или больше, 20 секунд или больше, 30 секунд или больше, 40 секунд или больше, 50 секунд или больше, 1 минуты или больше, 2 минут или больше, 3 минут или больше, 4 минут или больше, 5 минут или больше, 10 минут или больше, 15 минут или больше, 20 минут или больше, 25 минут или больше, 30 минут или больше, 35 минут или больше, 40 минут или больше, 45 минут или более 50 минут или больше, 60 минут или больше, 70 минут или больше, 80 минут или больше, 90 минут или больше, 100 минут или более или 120 минут или больше. В некоторых вариантах осуществления на стадии (c) раствор для составления лекарственного продукта нагревают путем применения в отношении раствора тепла от источника тепла и раствор выдерживают при температуре, превышающей температуру окружающей среды, в течение 120 минут или меньше, 100 минут или меньше, 90 минут или меньше, 60 минут или меньше, 45 минут или меньше, 30 минут или меньше, 25 минут или меньше, 20 минут или меньше, 15 минут или меньше, 10 минут или меньше, 5 минут или меньше, 4 минут или меньше, 3 минут или меньше, 2 минут или меньше, 1 минуты или меньше, 50 секунд или меньше, 40 секунд или меньше, 30 секунд или меньше, 20 секунд или меньше, 10 секунд или меньше, 5 секунд или меньше. В некоторых вариантах осуществления на стадии (c) раствор для составления лекарственного продукта нагревают путем применения в отношении раствора тепла от источника тепла и раствор выдерживают при температуре, превышающей температуру окружающей среды, в течение от 10-20 минут. В некоторых вариантах осуществления на стадии (c) раствор для составления лекарственного продукта нагревают путем применения в отношении раствора тепла от источника тепла и раствор выдерживают при температуре, превышающей температуру окружающей среды, в течение от 20-90 минут. В некоторых вариантах осуществления на стадии (c) раствор для составления лекарственного продукта нагревают путем применения в отношении раствора тепла от источника тепла и раствор выдерживают при температуре, превышающей температуру окружающей среды, в течение 30-60 минут. В некоторых вариантах осуществления на стадии (c) раствор для составления лекарственного продукта нагревают путем применения в отношении раствора тепла от источника тепла и раствор выдерживают при температуре, превышающей температуру окружающей среды, в течение приблизительно 15 минут. В некоторых вариантах осуществления температура, до которой нагревают раствор для составления лекарственного продукта (или при которой выдерживают раствор для составления лекарственного продукта), составляет приблизительно 30°C, 37°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C или 70°C или больше. В некоторых вариантах осуществления температура, до которой нагревают раствор для составления лекарственного продукта, находится в диапазоне приблизительно 25-70°C, приблизительно 30-70°C, приблизительно 35-70°C, приблизительно 40-70°C, приблизительно 45-70°C, приблизительно 50-70°C или приблизительно 60-70°C. В некоторых вариантах осуществления температура, превышающая температуру окружающей среды, до которой нагревают раствор для составления лекарственного продукта, составляет приблизительно 65°C.

[11] В некоторых вариантах осуществления на стадии (а) образование липидных наночастиц обеспечивают путем смешивания липидов, растворенных в растворе липидов, содержащем этанол, с мРНК, растворенной в водном растворе мРНК. В некоторых вариантах осуществления на стадии (а) один или более липидов включают один или более катионных липидов, один или более вспомогательных липидов и один или более PEG-модифицированных липидов (также называемых PEG-липидами). В некоторых вариантах осуществления липиды также включают один или более липидов на основе холестерина. Образование мРНК-LNP обеспечивают путем смешивания раствора липидов и раствора мРНК. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления LNP содержат один или более катионных липидов, один или более вспомогательных липидов и один или более PEG-липидов. В некоторых вариантах осуществления LNP также содержат один или более липидов на основе холестерина.

[12] В некоторых вариантах осуществления один или более катионных липидов выбраны из группы, состоящей из cKK-E12, OF-02, C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, ICE (на основе имидазола), HGT5000, HGT5001, HGT4003, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA и DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, 3-(4-(бис(2-гидроксидодецил)амино)бутил)-6-(4-((2-гидроксидодецил)(2-гидроксиундецил)амино)бутил)-1,4-диоксан-2,5-диона («Target 23»), 3-(5-(бис(2-гидроксидодецил)амино)пентан-2-ил)-6-(5-((2-гидроксидодецил)(2-гидроксиундецил)амино)пентан-2-ил)-1,4-диоксан-2,5-диона («Target 24»), N1GL, N2GL, V1GL и их комбинаций.

[13] В некоторых вариантах осуществления один или более катионных липидов представляют собой аминолипиды. Аминолипиды, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают те, которые описаны в WO 2017180917, которая включена в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные аминолипиды в WO 2017180917 включают те, которые описаны в абзаце [0744], такие как DLin-MC3-DMA (MC3), (13Z,16Z)-N, N-диметил-3-нонилдокоза-13,16-диен-1-амин (L608) и соединение 18. Другие аминолипиды включают соединение 2, соединение 23, соединение 27, соединение 10 и соединение 20. Дополнительные аминолипиды, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают те, которые описаны в WO 2017112865, которая включена в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные аминолипиды в WO 2017112865 включают соединение согласно одной из формул (I), (Ia1)-(Ia6), (lb), (II), (Ila), (III), (IIIa), (IV), (17-1), (19-1), (19-11) и (20-1) и соединения из абзацев [00185], [00201], [0276]. В некоторых вариантах осуществления катионные липиды, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают те, которые описаны в WO 2016118725, которая включена в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные катионные липиды из WO 2016118725 включают такие липиды, как KL22 и KL25. В некоторых вариантах осуществления катионные липиды, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают те, которые описаны в WO 2016118724, которая включена в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные катионные липиды из WO 2016118725 включают такие липиды, как KL10, 1,2-дилинолеилокси-N, N-диметиламинопропан (DLin-DMA) и KL25.

[14] В некоторых вариантах осуществления один или более липидов, отличных от катионных, выбраны из DSPC (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин), DPPC (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин), DOPE (1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин), DOPC (1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфотидилхолин) DPPE (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин), DMPE (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин), DOPG (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерин)).

[15] В некоторых вариантах осуществления один или более PEG-модифицированных липидов содержат цепь полиэтиленгликоля диной до 5 кДа, ковалентно присоединенную к липиду с алкильной(алкильными) цепью(цепями) длиной C₆-C₂₀.

[16] В некоторых вариантах осуществления после стадии (а) мРНК-LNP очищают с помощью способа фильтрации в тангенциальном потоке (TFF). В некоторых вариантах осуществления более чем приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% очищенных мРНК-LNP имеют размер менее чем приблизительно 150 нм (например, менее чем приблизительно 145 нм, приблизительно 140 нм, приблизительно 135 нм, приблизительно 130 нм, приблизительно 125 нм, приблизительно 120 нм, приблизительно 115 нм, приблизительно 110 нм, приблизительно 105 нм, приблизительно 100 нм, приблизительно 95 нм, приблизительно 90 нм, приблизительно 85 нм, приблизительно 80 нм, приблизительно 75 нм, приблизительно 70 нм, приблизительно 65 нм, приблизительно 60 нм, приблизительно 55 нм или приблизительно 50 нм). В некоторых вариантах осуществления практически все очищенные мРНК-LNP имеют размер менее чем 150 нм (например, менее чем приблизительно 145 нм, приблизительно 140 нм, приблизительно 135 нм, приблизительно 130 нм, приблизительно 125 нм, приблизительно 120 нм, приблизительно 115 нм, приблизительно 110 нм, приблизительно 105 нм, приблизительно 100 нм, приблизительно 95 нм, приблизительно 90 нм, приблизительно 85 нм, приблизительно 80 нм, приблизительно 75 нм, приблизительно 70 нм, приблизительно 65 нм, приблизительно 60 нм, приблизительно 55 нм или приблизительно 50 нм). В некоторых вариантах осуществления более чем приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% очищенных мРНК-LNP имеют размер в диапазоне от 50 до 150 нм. В некоторых вариантах осуществления практически все очищенные мРНК-LNP имеют размер в диапазоне от 50 до 150 нм. В некоторых вариантах осуществления более чем приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% очищенных мРНК-LNP имеют размер в диапазоне от 80 до 150 нм. В некоторых вариантах осуществления практически все очищенные наночастицы имеют размер в диапазоне от 80 до 150 нм.

[17] В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению обеспечивает в результате эффективность инкапсулирования после стадии (c), которая является повышенной на по меньшей мере 5% или больше по сравнению с эффективностью инкапсулирования после стадии (b). В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению обеспечивает в результате эффективность инкапсулирования после стадии (c), которая является повышенной на по меньшей мере 10% или больше по сравнению с эффективностью инкапсулирования после стадии (b). В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению обеспечивает в результате эффективность инкапсулирования после стадии (c), которая является повышенной на по меньшей мере 15% или больше по сравнению с эффективностью инкапсулирования после стадии (b). В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению обеспечивает в результате эффективность инкапсулирования после стадии (c), которая является повышенной на по меньшей мере 20% или больше по сравнению с эффективностью инкапсулирования после стадии (b). В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению обеспечивает в результате эффективность инкапсулирования после стадии (c), которая является повышенной на по меньшей мере 25% или больше по сравнению с эффективностью инкапсулирования после стадии (b).

[18] В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению обеспечивает повышение количественного показателя инкапсулирования на 5% инкапсулирования или больше при сравнении значения инкапсулирования после стадии (b) со значением инкапсулирования после стадии (c). В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению обеспечивает повышение количественного показателя инкапсулирования на 10% инкапсулирования или больше при сравнении значения инкапсулирования после стадии (b) со значением инкапсулирования после стадии (c). В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению обеспечивает повышение количественного показателя инкапсулирования на 15% инкапсулирования или больше при сравнении значения инкапсулирования после стадии (b) со значением инкапсулирования после стадии (c). В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению обеспечивает повышение количественного показателя инкапсулирования на 20% инкапсулирования или больше при сравнении значения инкапсулирования после стадии (b) со значением инкапсулирования после стадии (c). В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению обеспечивает повышение количественного показателя инкапсулирования на 25% инкапсулирования или больше при сравнении значения инкапсулирования после стадии (b) со значением инкапсулирования после стадии (c).

[19] В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению в результате обеспечивает более чем приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% извлечение мРНК после стадии (с).

[20] В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению в результате обеспечивает степень инкапсулирования после стадии (c), составляющую более чем приблизительно 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению в результате обеспечивает более чем приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% извлечение мРНК после стадии (с).

[21] В некоторых вариантах осуществления раствор липидов и раствор мРНК смешивают с помощью насосной системы. В некоторых вариантах осуществления насосная система предусматривает безимпульсный проточный насос. В некоторых вариантах осуществления насосная система представляет собой шестеренчатый насос. В некоторых вариантах осуществления подходящий насос представляет собой перистальтический насос. В некоторых вариантах осуществления подходящий насос представляет собой центробежный насос. В некоторых вариантах осуществления способ с применением насосной системы осуществляют в крупном масштабе. Например, в некоторых вариантах осуществления способ предусматривает применение насосов, описанных в данном документе, для смешивания раствора по меньшей мере приблизительно 1 мг, 5 мг, 10 мг, 50 мг, 100 мг, 500 мг или 1000 мг мРНК с раствором липидов, содержащим один или более катионных липидов, один или более вспомогательных липидов и один или более PEG-модифицированных липидов. В некоторых вариантах осуществления способ смешивания раствора липидов и раствора мРНК обеспечивает получение композиции согласно настоящему изобретению, которая содержит по меньшей мере приблизительно 1 мг, 5 мг, 10 мг, 50 мг, 100 мг, 500 мг или 1000 мг инкапсулированной мРНК после стадии (с).

[22] В некоторых вариантах осуществления раствор липидов смешивают при скорости потока в диапазоне приблизительно 25-75 мл/минута, приблизительно 75-200 мл/минута, приблизительно 200-350 мл/минута, приблизительно 350-500 мл/минута, приблизительно 500-650 мл/минута, приблизительно 650-850 мл/минута или приблизительно 850-1000 мл/минута. В некоторых вариантах осуществления раствор липидов смешивают при скорости потока приблизительно 50 мл/минута, приблизительно 100 мл/минута, приблизительно 150 мл/минута, приблизительно 200 мл/минута, приблизительно 250 мл/минута, приблизительно 300 мл/минута, приблизительно 350 мл/минута, приблизительно 400 мл/минута, приблизительно 450 мл/минута, приблизительно 500 мл/минута, приблизительно 550 мл/минута, приблизительно 600 мл/минута, приблизительно 650 мл/минута, приблизительно 700 мл/минута, приблизительно 750 мл/минута, приблизительно 800 мл/минута, приблизительно 850 мл/минута, приблизительно 900 мл/минута, приблизительно 950 мл/минута или приблизительно 1000 мл/минута.

[23] В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК смешивают при скорости потока в диапазоне приблизительно 25-75 мл/минута, приблизительно 75-200 мл/минута, приблизительно 200-350 мл/минута, приблизительно 350-500 мл/минута, приблизительно 500-650 мл/минута, приблизительно 650-850 мл/минута или приблизительно 850-1000 мл/минута. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК смешивают при скорости потока приблизительно 50 мл/минута, приблизительно 100 мл/минута, приблизительно 150 мл/минута, приблизительно 200 мл/минута, приблизительно 250 мл/минута, приблизительно 300 мл/минута, приблизительно 350 мл/минута, приблизительно 400 мл/минута, приблизительно 450 мл/минута, приблизительно 500 мл/минута, приблизительно 550 мл/минута, приблизительно 600 мл/минута, приблизительно 650 мл/минута, приблизительно 700 мл/минута, приблизительно 750 мл/минута, приблизительно 800 мл/минута, приблизительно 850 мл/минута, приблизительно 900 мл/минута, приблизительно 950 мл/минута или приблизительно 1000 мл/минута.

[24] В некоторых вариантах осуществления раствор липидов содержит неводный растворитель, такой как органический растворитель. В некоторых вариантах осуществления раствор липидов содержит спирт. В некоторых вариантах осуществления раствор липидов содержит этанол. В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению включает стадию первого растворения одного из липидов в растворе липидов. В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению включает стадию первого растворения одного из липидов в растворе липидов, содержащем этанол.

[25] В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК является водным раствором. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК содержит цитрат. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК представляет собой цитратный буфер. В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению включает стадию первого растворения мРНК в водном растворе. В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению включает стадию первого растворения мРНК в водном растворе, содержащем цитрат.

[26] В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению включает стадию смешивания раствора липидов, содержащего липиды в этаноле, с буфером для мРНК, содержащим мРНК, растворенную в цитратном буфере. В некоторых вариантах осуществления раствор для образования LNP содержит этанол и цитрат.

[27] В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению включает стадию первого получения раствора мРНК путем смешивания цитратного буфера с исходным раствором мРНК. В определенных вариантах осуществления подходящий цитратный буфер содержит приблизительно 10 мМ цитрата, приблизительно 150 мМ NaCl, pH приблизительно 4,5. В некоторых вариантах осуществления подходящий исходный раствор мРНК содержит мРНК в концентрации, составляющей приблизительно 1 мг/мл, приблизительно 10 мг/мл, приблизительно 50 мг/мл или приблизительно 100 мг/мл или больше.

[28] В некоторых вариантах осуществления цитратный буфер смешивают при скорости потока в диапазоне приблизительно 100-300 мл/минута, 300-600 мл/минута, 600-1200 мл/минута, 1200-2400 мл/минута, 2400-3600 мл/минута, 3600-4800 мл/минута или 4800-6000 мл/минута. В некоторых вариантах осуществления цитратный буфер смешивают при скорости потока приблизительно 220 мл/минута, приблизительно 600 мл/минута, приблизительно 1200 мл/минута, приблизительно 2400 мл/минута, приблизительно 3600 мл/минута, приблизительно 4800 мл/минута или приблизительно 6000 мл/минута.

[29] В некоторых вариантах осуществления исходный раствор мРНК смешивают при скорости потока в диапазоне приблизительно 10-30 мл/минута, приблизительно 30-60 мл/минута, приблизительно 60-120 мл/минута, приблизительно 120-240 мл/минута, приблизительно 240-360 мл/минута, приблизительно 360-480 мл/минута или приблизительно 480-600 мл/минута. В некоторых вариантах осуществления исходный раствор мРНК смешивают при скорости потока приблизительно 20 мл/минута, приблизительно 40 мл/минута, приблизительно 60 мл/минута, приблизительно 80 мл/минута, приблизительно 100 мл/минута, приблизительно 200 мл/минута, приблизительно 300 мл/минута, приблизительно 400 мл/минута, приблизительно 500 мл/минута или приблизительно 600 мл/минута.

[30] В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, в том числе без ограничения криопротектор. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, в том числе без ограничения сахар. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, в том числе без ограничения одно или более из трегалозы, сахарозы, маннозы, лактозы и маннита. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта содержит трегалозу. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта содержит сахарозу. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта содержит маннозу. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта содержит лактозу. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта содержит маннит. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем сахара, такого как трегалоза, сахароза, манноза, лактоза и маннит. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем трегалозы. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем сахарозы. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем маннозы. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем лактозы. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем маннита. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем сахара, такого как трегалоза, сахароза, манноза, лактоза и маннит. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем трегалозы. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем сахарозы. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем маннозы. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем лактозы. В некоторых вариантах осуществления на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем маннита.

[31] В некоторых вариантах осуществления в растворе для составления лекарственного продукта отсутствует (т. е. находится ниже поддающихся обнаружению уровней) один или оба из неводного растворителя, такого как этанол, и цитрата. В некоторых вариантах осуществления в растворе для составления лекарственного продукта отсутствует цитрат (т. е. находится ниже поддающихся обнаружению уровней). В некоторых вариантах осуществления в растворе для составления лекарственного продукта отсутствует этанол (т. е. находится ниже поддающихся обнаружению уровней). В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит этанол, но не содержит цитрат (т. е. он находится ниже поддающихся обнаружению уровней). В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит цитрат, но не содержит этанол (т. е. он находится ниже поддающихся обнаружению уровней). В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит только остаточный цитрат. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит только остаточный неводный растворитель, такой как этанол. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит менее чем приблизительно 10 мМ (например, менее чем приблизительно 9 мМ, приблизительно 8 мМ, приблизительно 7 мМ, приблизительно 6 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 4 мМ, приблизительно 3 мМ, приблизительно 2 мМ или приблизительно1 мМ) цитрата. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит менее чем приблизительно 25% (например, менее чем приблизительно 20%, приблизительно 15%, приблизительно 10%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2% или приблизительно 1%) неводного растворителя, такого как этанол. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта не требует какой-либо дополнительной последующей обработки (например, замены буфера и/или дополнительных стадий очистки) перед лиофилизацией. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта не требует какой-либо дополнительной последующей обработки (например, замены буфера и/или дополнительных стадий очистки) перед введением субъекту.

[32] В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH от pH 4,5 до pH 7,5. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH от pH 5,0 до pH 7,0. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH от pH 5,5 до pH 7,0. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH выше pH 4,5. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH выше pH 5,0. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH выше pH 5,5. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH выше pH 6,0. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH выше pH 6,5.

[33] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение применяют для инкапсулирования мРНК, содержащей один или более модифицированных нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления один или более нуклеотидов модифицированы до псевдоуридина. В некоторых вариантах осуществления один или более нуклеотидов модифицированы до 5-метилцитидина. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение применяют для инкапсулирования мРНК, которая является немодифицированной.

[34] В еще одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ доставки мРНК для обеспечения выработки белка in vivo, включающий введение субъекту композиции липидных наночастиц, инкапсулирующих мРНК, полученных с помощью описанного в данном документе способа, где мРНК кодирует один или более представляющих интерес белков или пептидов.

[35] В настоящей заявке применение термина «или» означает «и/или», если не указано иное. Используемый в настоящем изобретении термин «содержать» и варианты такого термина, такие как «содержащий» и «содержит», не предназначены для исключения других добавок, компонентов, целых чисел или стадий. Используемые в настоящей заявке термины «приблизительно» и «примерно» используются в качестве эквивалентов. Оба термина понимают как охватывающие любые нормальные отклонения, о которых известно специалисту в соответствующей области техники.

[36] Другие признаки, объекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из подробного описания, графических материалов и формулы изобретения. Однако следует учитывать, что подробное описание, графические материалы и формула изобретения, хотя и указывают на варианты осуществления настоящего изобретения, приведены исключительно в качестве иллюстрации, а не ограничения. Различные изменения и модификации в пределах объема настоящего изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[37] Графические материалы приведены исключительно с целью иллюстрации, а не ограничения.

[38] На ФИГ. 1 показана схема традиционного способа инкапсулирования LNP-мРНК (способа A), который включает смешивание мРНК, растворенной в водном растворе мРНК, с липидами, растворенными в растворе липидов, с помощью насосной системы с получением мРНК-LNP в растворе для образования LNP, а затем замену раствора для образования LNP на раствор для составления лекарственного продукта.

[39] На ФИГ. 2 показана схема иллюстративного способа инкапсулирования LNP-мРНК по настоящему изобретению, который включает смешивание мРНК, растворенной в водном растворе мРНК, с липидами, растворенными в растворе липидов, с помощью насосной системы с получением мРНК-LNP в растворе для образования LNP, затем замену раствора для образования LNP на раствор для составления лекарственного продукта, а затем нагревание раствора для составления лекарственного продукта для обеспечения увеличения уровня инкапсулирования мРНК в LNP.

[40] На ФИГ. 3 показана разница в уровне инкапсулирования до и после заключительной стадии нагревания мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта для двенадцати различных протестированных мРНК-LNP.

[41] На ФИГ. 4 показана разница в инкапсулировании до и после заключительной стадии нагревания мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта для тринадцати различных протестированных мРНК-LNP.

[42] На ФИГ. 5 показан иллюстративный график экспрессии белка после легочного введения мРНК, инкапсулированной в липидные наночастицы, полученные с помощью способа A, после стадии нагревания.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[43] Для облегчения понимания настоящего изобретения сначала ниже определены некоторые термины. Дополнительные определения следующих терминов и других терминов приводятся по всему описанию.

[44] Алкил. Используемый в данном документе термин «алкил» относится к радикалу линейной или разветвленной насыщенной углеводородной группы, содержащей от 1 до 20 атомов углерода («C_1-20алкил»). В некоторых вариантах осуществления алкильная группа содержит от 1 до 3 атомов углерода («C_1-3алкил»). Примеры C_1-3-алкильных групп включают метил (C₁), этил (C₂), н-пропил (C₃) и изопропил (C₃). В некоторых вариантах осуществления алкильная группа содержит от 8 до 12 атомов углерода («C_8-12алкил»). Примеры C_8-12алкильных групп включают без ограничения н-октил (C₈), н-нонил (C₉), н-децил (C₁₀), н-ундецил (C₁₁), н-додецил (C₁₂) и т. п. Приставка «н-» (нормальный) относится к неразветвленным алкильным группам. Например, н-C₈алкил относится к -(CH₂)₇CH₃, н-C₁₀алкил относится к -(CH₂)₉CH₃ и т. д.

[45] Аминокислота. Используемый в данном документе термин «аминокислота» в его самом широком смысле относится к любому соединению и/или веществу, которое может быть включено в полипептидную цепь. В некоторых вариантах осуществления аминокислота имеет общую структуру H₂N-C(H)(R)-COOH. В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой синтетическую аминокислоту; в некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой D-аминокислоту; в некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой L-аминокислоту. «Стандартная аминокислота» относится к любой из стандартных L-аминокислот, которые обычно присутствуют во встречающихся в природе пептидах. «Нестандартная аминокислота» относится к любой аминокислоте, отличной от стандартных аминокислот, независимо от того, получена ли синтетическим путем или из природного источника. Используемый в данном документе термин «синтетическая аминокислота» охватывает химически модифицированные аминокислоты, в том числе без ограничения соли, производные аминокислот (такие как амиды) и/или заместители. Аминокислоты, в том числе карбокси- и/или аминоконцевые аминокислоты в пептидах, можно модифицировать метилированием, амидированием, ацетилированием, защитными группами и/или замещением другими химическими группами, которые могут изменять период полужизни пептида в кровотоке без отрицательного воздействия на их активность. Аминокислоты могут принимать участие в образовании дисульфидной связи. Аминокислоты могут содержать одну или несколько посттрансляционных модификаций, таких как ассоциация с одной или более химическими структурными единицами (например, метильными группами, ацетатными группами, ацетильными группами, фосфатными группами, формильными фрагментами, изопреноидными группами, сульфатными группами, полиэтиленгликолевыми фрагментами, липидными фрагментами, углеводными фрагментами, биотиновыми фрагментами и т. д.). Термин «аминокислота» используют взаимозаменяемо с «аминокислотным остатком», и он может относиться к свободной аминокислоте и/или к аминокислотному остатку пептида. Из контекста, в котором используют данный термин, будет очевидно, относится он к свободной аминокислоте или остатку пептида.

[46] Животное. Используемый в данном документе термин «животное» относится к любому представителю царства животные. В некоторых вариантах осуществления «животное» относится к людям на любой стадии развития. В некоторых вариантах осуществления «животное» относится к отличному от человека животному на любой стадии развития. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой млекопитающее (например, грызуна, мышь, крысу, кролика, обезьяну, собаку, кошку, овцу, крупный рогатый скот, примата и/или свинью). В некоторых вариантах осуществления к животным относятся без ограничения млекопитающие, птицы, рептилии, земноводные, рыбы, насекомые и/или черви. В некоторых вариантах осуществления животное может являться трансгенным животным, модифицированным методами генетической инженерии животным и/или клоном.

[47] Примерно или приблизительно. Используемый в данном документе термин «примерно» или «приблизительно», применяемый к одному или нескольким представляющим интерес значениям, относится к значению, которое подобно указанному эталонному значению. В определенных вариантах осуществления термин «примерно» или «приблизительно» относится к диапазону значений, которые находятся в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше в любом направлении (больше или меньше) от указанного эталонного значения, если иное не указано или иное не очевидно из контекста (кроме случаев, когда такое число превышает 100% возможного значения).

[48] Доставка. Используемый в данном документе термин «доставка» охватывает и местную, и системную доставку. Например, доставка мРНК охватывает ситуации, при которых мРНК доставляют в целевую ткань, и кодируемый белок или пептид экспрессируется и удерживается в целевой ткани (что также называется «местным распределением» или «местной доставкой»), и ситуации, при которых мРНК доставляют в целевую ткань, и кодируемый белок или пептид экспрессируется и секретируется в систему кровообращения пациента (например, в сыворотку), системно распространяется и поглощается другими тканями (что также называется «системным распределением» или «системной доставкой»).

[49] Эффективность. Используемый в данном документе термин «эффективность» или его грамматические эквиваленты относятся к улучшению значения биологически значимой конечной точки, связанной с доставкой мРНК, которая кодирует соответствующий белок или пептид. В некоторых вариантах осуществления биологическая конечная точка представляет собой защиту от поражения хлоридом аммония в определенные моменты времени после введения.

[50] Инкапсулирование. Используемый в данном документе термин «инкапсулирование» или грамматические эквиваленты относятся к способу заключения отдельной молекулы мРНК в наночастицу.

[51] Экспрессия. Используемый в данном документе термин «экспрессия» мРНК относится к трансляции мРНК в пептид (например, антиген), полипептид или белок (например, фермент), а также может включать, как указано в контексте, посттрансляционную модификацию пептида, полипептида или полностью собранного белка (например, фермента). В настоящей заявке термины «экспрессия» и «выработка» и их грамматический эквивалент используют взаимозаменяемо.

[52] Улучшать, увеличивать или уменьшать. Используемые в данном документе термины «улучшать», «увеличивать» или «уменьшать» или их грамматические эквиваленты указывают на значения, выраженные относительно исходного измерения, например измерения у того же индивидуума до начала лечения, описанного в данном документе, или измерения в контрольном образце или субъекте (или нескольких контрольных образцах или субъектах) в отсутствие лечения, описанного в данном документе. «Контрольный образец» представляет собой образец, подвергнутый воздействию тех же условий, что и тестируемый образец, за исключением того, что он не содержит тестируемого изделия. Термин «контрольный субъект» представляет собой субъекта, страдающего той же формой заболевания, что и субъект, которого подвергают лечению, который приблизительно того же возраста, что и субъект, которого подвергают лечению.

[53] Примеси. Используемый в данном документа термин «примеси» относится к веществам внутри ограниченного количества жидкости, газа или твердого вещества, которые отличаются от химического состава целевого материала или соединения. Примеси также называют загрязнителями.

[54] In vitro. Используемый в данном документе термин «in vitro» относится к событиям, которые происходят в искусственной среде, например в тестовой пробирке или реакционном сосуде, в культуре клеток и т. д., а не в многоклеточном организме.

[55] In vivo. Используемый в данном документе термин «in vivo» относится к событиям, которые происходят в многоклеточном организме, например в организме человека и отличного от человека животного. В контексте систем на основе клеток термин может быть использован в отношении событий, которые происходят в живой клетке (в противоположность, например, системам in vitro).

[56] Выделенный. Используемый в данном документе термин «выделенный» относится к веществу и/или структурной единице, которые были (1) отделены по меньшей мере от некоторых компонентов, с которыми они ассоциируются изначально при выработке (в природе и/или в экспериментальных условиях), и/или (2) произведены, получены и/или изготовлены человеком. Выделенные вещества и/или структурные единицы могут быть отделены от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99% других компонентов, с которыми они изначально были ассоциированы. В некоторых вариантах осуществления выделенные средства являются на приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99% чистыми. В контексте данного документа вещество является «чистым», если оно практически не содержит других компонентов. В контексте данного документа расчет чистоты в процентах выделенных веществ и/или структурных единиц не должен включать вспомогательные вещества (например, буфер, растворитель, воду и т. д.).

[57] Местное распределение или доставка. Используемые в данном документе термины «местное распределение», «местная доставка» или грамматический эквивалент относятся к тканеспецифической доставке или распределению. Обычно для местного распределения или доставки требуется, чтобы пептид или белок (например, фермент), кодируемый мРНК, транслировался и экспрессировался внутриклеточно или с ограниченной секрецией, что позволяет избежать попадания в систему кровообращения пациента.

[58] Матричная РНК (мРНК). Используемый в данном документе термин «матричная РНК (мРНК)» относится к полинуклеотиду, который кодирует по меньшей мере один пептид, полипептид или белок. мРНК, используемая в данном документе, охватывает как модифицированную, так и немодифицированную РНК. мРНК может включать одну или несколько кодирующих и некодирующих областей. мРНК может быть получена посредством очистки из природных источников, получена с использованием рекомбинантных систем экспрессии и необязательно очищена, химически синтезирована и т. д. При необходимости, например в случае химически синтезированных молекул, мРНК может содержать аналоги нуклеозидов, такие как аналоги, имеющие химически модифицированные основания или сахара, модификации остова и т. д. Последовательность мРНК представлена в 5'-3'-направлении, если не указано иное. В некоторых вариантах осуществления мРНК представляет собой или содержит природные нуклеозиды (например, аденозин, гуанозин, цитидин, уридин), аналоги нуклеозидов (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, C-5-пропинилцитидин, C-5-пропинилуридин, 2-аминоаденозин, C5-бромуридин, C5-фторуридин, C5-йодуридин, C5-пропинилуридин, C5-пропинилцитидин, C5-метилцитидин, 2-аминоаденозин, 7-деазааденозин, 7-деазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, O(6)-метилгуанин, 2-тиоцитидин, псевдоуридин и 5-метилцитидин); химически модифицированные основания; биологически модифицированные основания (например, метилированные основания); интеркалированные основания; модифицированные сахара (например, 2'-фторрибоза, рибоза, 2'-дезоксирибоза, арабиноза и гексоза) и/или модифицированные фосфатные группы (например, фосфоротиоаты и 5'-N-фосфорамидитные связи).

[59] Нуклеиновая кислота. Используемый в данном документе термин «нуклеиновая кислота» в его самом широком смысле относится к любому соединению и/или веществу, которое включено или может быть включено в полинуклеотидную цепь. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой соединение и/или вещество, которое включено или может быть включено в полинуклеотидную цепь посредством фосфодиэфирной связи. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» относится к отдельным остаткам нуклеиновой кислоты (например, нуклеотидам и/или нуклеозидам). В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» относится к полинуклеотидной цепи, содержащей отдельные остатки нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» охватывает РНК, а также одно- и/или двухцепочечную ДНК и/или cDNA. Более того, термины «нуклеиновая кислота», «ДНК», «РНК» и/или подобные термины охватывают аналоги нуклеиновых кислот, т. е. аналоги, имеющие отличный от фосфодиэфирного остов.

[60] Пациент. Используемые в данном документе термины «пациент» или «субъект» относятся к любому организму, которому может быть введена предусмотренная композиция, например, для экспериментальных, диагностических, профилактических, косметических и/или терапевтических целей. К типичным пациентам относятся животные (например, млекопитающие, такие как мыши, крысы, кролики, отличные от человека приматы и/или люди). В некоторых вариантах осуществления пациентом является человек. К человеку относятся внутриутробные и послеродовые формы.

[61] Фармацевтически приемлемый Термин «фармацевтически приемлемый», используемый в данном документе, относится к веществам, которые, в рамках здравого медицинского суждения, подходят для применения в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, в соответствии с разумным соотношением польза/риск.

[62] Фармацевтически приемлемая соль. Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны из уровня техники. Например, S. M. Berge и соавт. подробно описывают фармацевтически приемлемые соли в J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19. К фармацевтически приемлемым солям соединений по настоящему изобретению относятся соли, полученные из подходящих неорганических и органических кислот и оснований. Примерами фармацевтически приемлемых нетоксичных солей присоединения кислоты являются соли аминогруппы, образованные с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, серная кислота и перхлорная кислота, или с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота или малоновая кислота, или соли, полученные с применением других способов, применяемых в данной области техники, таких как ионный обмен. К другим фармацевтически приемлемым солям относятся адипатные, альгинатные, аскорбатные, аспартатные, бензолсульфонатные, бензоатные, бисульфатные, боратные, бутиратные, камфоратные, камфорсульфонатные, цитратные, циклопентанпропионатные, диглюконатные, додецилсульфатные, этансульфонатные, формиатные, фумаратные, глюкогептонатные, глицеролфосфатные, глюконатные, гемисульфатные, гептаноатные, гексаноатные, гидройодидные, 2-гидроксиэтансульфонатные, лактобионатные, лактатные, лауратные, лаурилсульфатные, малатные, малеатные, малонатные, метансульфонатные, 2-нафталинсульфонатные, никотинатные, нитратные, олеатные, оксалатные, пальмитатные, памоатные, пектинатные, персульфатные, 3-фенилпропионатные, фосфатные, пикратные, пивалатные, пропионатные, стеаратные, сукцинатные, сульфатные, тартратные, тиоцианатные, п-толуолсульфонатные, ундеканоатные, валератные соли и т. п. Соли, полученные из соответствующих оснований, включают соли щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммония и N⁺(C_1-4алкил)₄. Типичные соли щелочных или щелочноземельных металлов включают соли натрия, лития, калия, кальция, магния и т. п. Дополнительные фармацевтически приемлемые соли включают, когда это целесообразно, нетоксичные соли аммония, соли четвертичного аммония и соли катионов аминов, образованные с помощью противоионов, таких как галогенид, гидроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нитрат, сульфонат и арилсульфонат. К дополнительным фармацевтически приемлемым солям относятся соли, образованные в результате кватернизации амина с использованием подходящего электрофила, например алкилгалогенида, с образованием четвертичной алкилированной аминосоли.

[63] Активность. Используемый в данном документе термин «активность» или его грамматические эквиваленты относятся к экспрессии белка(белков) или пептида(пептидов), которые кодирует мРНК, и/или к получаемому в результате биологическому эффекту.

[64] Соль. Используемый в данном документе термин «соль» относится к ионному соединению, которое является или может быть результатом реакции нейтрализации между кислотой и основанием.

[65] Системное распределение или доставка. Используемые в данном документе термины «системное распределение», «системная доставка» или их грамматический эквивалент относятся к механизму доставки или распределения или к подходу к таковым, которые влияют на все тело или весь организм. Как правило, системное распределение или доставку осуществляют через систему кровообращения организма, например кровоток. Этому противопоставляется определение «местное распределение или местная доставка».

[66] Субъект. Используемый в данном документе термин «субъект» относится к человеку или любому отличному от человека животному (например, к мыши, крысе, кролику, собаке, кошке, крупному рогатому скоту, свинье, овце, лошади или примату). К человеку относятся внутриутробные и послеродовые формы. Во многих вариантах осуществления субъектом является человек. Субъект может представлять собой пациента, что относится к человеку, обращающемуся к поставщику медицинских услуг для диагностики или лечения заболевания. Термин «субъект» используют в данном документе взаимозаменяемо с «индивидуумом» или «пациентом». Субъект может являться пораженным заболеванием или нарушением, или предрасположенным к заболеванию или нарушению, но у него могут проявляться или не проявляться симптомы заболевания или нарушения.

[67] Практически. Используемый в данном документе термин «практически» относится к качественному состоянию проявления полной или почти полной меры или степени представляющих интерес характеристики или свойства. Специалисту средней квалификации в области биологии будет понятно, что биологические и химические явления редко, если вообще когда-либо, доходят до завершения и/или подходят к завершению, или достигают абсолютного результата, или избегают его. Таким образом, термин «практически» используют в данном документе для обозначения потенциального отсутствия завершенности, присущей многим биологическим и химическим явлениям.

[68] Целевые ткани. Используемый в данном документе термин «целевые ткани» относится к любой ткани, пораженной подлежащим лечению заболеванием. В некоторых вариантах осуществления к целевым тканям относятся те ткани, которые демонстрируют ассоциированную с заболеванием патологию, симптом или признак.

[69] Лечение. Используемые в данном документе термины «лечить», «лечение» или «подвергать лечению» относятся к любому способу, используемому для частичного или полного ослабления, облегчения, смягчения, подавления, предупреждения, отсрочки начала, уменьшения тяжести и/или снижения частоты возникновения одного или нескольких симптомов или признаков конкретного заболевания, нарушения и/или состояния. Средство лечения можно вводить субъекту, у которого не проявляются признаки заболевания и/или проявляются только ранние признаки заболевания, с целью снижения риска развития патологии, связанной с заболеванием.

[70] Выход. Используемый в данном документе термин «выход» относится к проценту мРНК, извлекаемой после инкапсулирования, по сравнению с общей мРНК в качестве исходного материала. В некоторых вариантах осуществления термин «извлечение» применяют взаимозаменяемо с термином «выход».

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[71] В настоящем изобретении предусмотрен улучшенный способ составления липидных наночастиц и инкапсулирования мРНК. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ инкапсулирования матричной РНК (мРНК) в липидные наночастицы, включающий стадии (а) смешивания одного или нескольких липидов в растворе липидов с одной или несколькими мРНК в растворе мРНК с образованием мРНК, инкапсулированной в LNP (мРНК-LNP), в растворе для образования LNP; (b) замены раствора для образования LNP на раствор для составления лекарственного продукта с получением мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта; и (c) нагревания мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта. Неожиданно было обнаружено, что включение стадии (c) в такой способ обеспечивает значительно более высокий уровень инкапсулирования мРНК-LNP по сравнению с инкапсулированием тех же мРНК-LNP после стадии (b).

[72] В некоторых вариантах осуществления новый способ составления в результате обеспечивает получение состава на основе мРНК с более высокой активностью (экспрессией пептида или белка) и более высокой эффективностью (улучшением значения биологически значимой конечной точки) как in vitro, так и in vivo с потенциально лучшей переносимостью по сравнению с тем же составом на основе мРНК, полученным без дополнительной стадии нагревания мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта (стадии (c)). Более высокая активность и/или эффективность такого состава может обеспечивать прием более низкой дозы и/или менее частый прием дозы лекарственного продукта. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к улучшенному липидному составу, содержащему катионный липид, вспомогательный липид и PEG-модифицированный липид.

[73] В некоторых вариантах осуществления получаемый в результате уровень инкапсулирования мРНК-LNP после стадии (c) увеличивается на 10% или больше по сравнению с эффективностью инкапсулирования для той же мРНК-LNP после стадии (b). В некоторых вариантах осуществления получаемый в результате процент инкапсулирования мРНК-LNP после стадии (c) увеличивается на пять процентных пунктов или больше по сравнению с процентом инкапсулирования для той же мРНК-LNP после стадии (b). Для доставки нуклеиновых кислот достижение высокой эффективности инкапсулирования имеет решающее значение для достижения защиты лекарственного вещества и уменьшения потери активности in vivo.

[74] В последующих разделах подробно описаны различные аспекты настоящего изобретения. Применение разделов не предназначено для ограничения настоящего изобретения. Каждый раздел может применяться в отношении любого аспекта настоящего изобретения.

Матричная РНК (мРНК)

[75] Настоящее изобретение можно применять для инкапсулирования любой мРНК. мРНК обычно считается типом РНК, которая переносит информацию от ДНК к рибосоме. Как правило, у эукариотических организмов процессинг мРНК предусматривает добавление «кэпа» на 5'-конце и «хвоста» на 3'-конце. Типичный кэп представляет собой 7-метилгуанозиновый кэп, который представляет собой гуанозин, присоединенный посредством 5'-5'-трифосфатной связи к первому транскрибируемому нуклеотиду. Присутствие кэпа важно для обеспечения устойчивости к нуклеазам, присутствующим в большинстве эукариотических клеток. Добавление хвоста, как правило, представляет собой событие полиаденилирования, при котором полиадениловый фрагмент добавляется к 3'-концу молекулы мРНК. Присутствие данного «хвоста» служит для защиты мРНК от разрушения экзонуклеазой. Матричная РНК транслируется рибосомами в ряд аминокислот, которые составляют белок.

[76] мРНК могут быть синтезированы согласно любому из ряда известных способов. Например, мРНК согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы посредством транскрипции in vitro (IVT). Вкратце, IVT, как правило, осуществляют с использованием линейной или кольцевой ДНК-матрицы, содержащей промотор, пула рибонуклеотидтрифосфатов, буферной системы, которая может содержать DTT и ионы магния, и соответствующей РНК-полимеразы (например, РНК-полимеразы T3, T7 или SP6), ДНКазы I, пирофосфатазы и/или ингибитора РНКазы. Точные условия будут варьировать в зависимости от конкретного применения.

[77] В некоторых вариантах осуществления синтезированная in vitro мРНК перед составлением и инкапсулированием может подвергаться очистке для удаления нежелательных примесей, в том числе различных ферментов и других реагентов, применяемых во время синтеза мРНК.

[78] Настоящее изобретение может быть использовано для составления и инкапсулирования мРНК различной длины. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение может быть использовано для составления и инкапсулирования синтезированной in vitro мРНК длиной приблизительно 1 т. н., 1,5 т. н., 2 т. н., 2,5 т. н., 3 т. н., 3,5 т. н., 4 т. н., 4,5 т. н., 5 т. н., 6 т. н., 7 т. н., 8 т. н., 9 т. н., 10 т. н., 11 т. н., 12 т. н., 13 т. н., 14 т. н., 15 т. н. или 20 т. н. или больше. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение может быть использовано для составления и инкапсулирования синтезированной in vitro мРНК, длина которой варьирует в диапазоне приблизительно 1-20 т. н., приблизительно 1-15 т. н., приблизительно 1-10 т. н., приблизительно 5-20 т. н., приблизительно 5-15 т. н., приблизительно 5-12 т. н., приблизительно 5-10 т. н., приблизительно 8-20 т. н. или приблизительно 8-15 т. н.

[79] Настоящее изобретение можно применять для составления и инкапсулирования мРНК, которая является немодифицированной, или мРНК, содержащей одну или несколько модификаций, которые обычно увеличивают стабильность. В некоторых вариантах осуществления модификации выбраны из модифицированных нуклеотидов, модифицированных сахарофосфатных остовов и 5'- и/или 3'-нетранслируемой области.

[80] В некоторых вариантах осуществления модификации мРНК могут включать модификации нуклеотидов РНК. Модифицированная мРНК согласно настоящему изобретению может включать, например, модификации остова, модификации сахаров или модификации оснований. В некоторых вариантах осуществления мРНК можно синтезировать из встречающихся в природе нуклеотидов и/или аналогов нуклеотидов (модифицированных нуклеотидов), в том числе без ограничения пуринов (аденина (A), гуанина (G)) или пиримидинов (тимина (T), цитозина (C), урацила (U)), и, в качестве модифицированных нуклеотидов, аналогов или производных пуринов и пиримидинов, таких как, например, 1-метиладенин, 2-метиладенин, 2-метилтио-N-6-изопентениладенин, N6-метиладенин, N6-изопентениладенин, 2-тиоцитозин, 3-метилцитозин, 4-ацетилцитозин, 5-метилцитозин, 2,6-диаминопурин, 1-метилгуанин, 2-метилгуанин, 2,2-диметилгуанин, 7-метилгуанин, инозин, 1-метилинозин, псевдоурацил (5-урацил), дигидроурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-(карбоксигидроксиметил)-урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, 5-метил-2-тиоурацил, 5-метилурацил, сложный метиловый эфир N-урацил-5-оксиуксусной кислоты, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, сложный метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота (v), 1-метилпсевдоурацил, квеуозин, бета-D-маннозилквеуозин, вибутоксозин, а также фосфороамидаты, фосфоротиоаты, пептидные нуклеотиды, метилфосфонаты, 7-деазагуанозин, 5-метилцитозин, псевдоуридин, 5-метилцитидин и инозин. Получение таких аналогов известно специалисту в данной области техники, например, из патента США № 4373071, патента США № 4401796, патента США № 4415732, патента США № 4458066, патента США № 4500707, патента США № 4668777, патента США № 4973679, патента США № 5047524, патента США № 5132418, патента США № 5153319, патента США № 5262530 и № 5700642, раскрытие которых включено в данный документ в их полном объеме посредством ссылки.

[81] Как правило, синтез мРНК предусматривает добавление «кэпа» на 5'-конце и «хвоста» на 3'-конце. Присутствие кэпа важно для обеспечения устойчивости к нуклеазам, присутствующим в большинстве эукариотических клеток. Присутствие «хвоста» служит для защиты мРНК от разрушения экзонуклеазой.

[82] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления мРНК содержат 5'-кэп-структуру. 5'-Кэп обычно добавляют следующим образом: сначала терминальная РНК-фосфатаза удаляет одну из концевых фосфатных групп из 5'-нуклеотида, оставляя два концевых фосфата, затем гуанозинтрифосфат (GTP) добавляется к концевым фосфатам посредством гуанилилтрансферазы, образуя 5'5'5-трифосфатную связь, а затем атом азота в положении 7 гуанина метилируется метилтрансферазой. 2'-O-метилирование также может происходить по первому основанию и/или второму основанию после остатков 7-метилгуанозинтрифосфата. Примеры кэп-структур включают без ограничения m7GpppNp-РНК, m7GpppNmp-РНК и m7GpppNmpNmp-РНК (где m обозначает 2'-О-метильные остатки).

[83] В некоторых вариантах осуществления мРНК содержат 5'- и/или 3'-нетранслируемую область. В некоторых вариантах осуществления 5'-нетранслируемая область включает один или более элементов, которые влияют на стабильность или трансляцию мРНК, например, элемент, чувствительный к железу. В некоторых вариантах осуществления 5'-нетранслируемая область может составлять от приблизительно 50 до 500 нуклеотидов в длину.

[84] В некоторых вариантах осуществления 3'-нетранслируемая область включает один или более из сигнала полиаденилирования, сайта связывания для белков, которые влияют на стабильность или положение мРНК в клетке, или один или более сайтов связывания для miRNA. В некоторых вариантах осуществления 3'-нетранслируемая область может составлять от приблизительно 50 до 500 нуклеотидов в длину или больше.

[85] Хотя в некоторых вариантах осуществления может быть необходима мРНК, полученная в результате реакций транскрипции in vitro, предусматривается, что и другие источники мРНК входят в объем настоящего изобретения, в том числе мРНК, полученная из бактерий, грибов, растений и/или животных.

[86] Настоящее изобретение можно применять для составления и инкапсулирования мРНК, кодирующей ряд белков. Неограничивающие примеры мРНК, подходящих для настоящего изобретения, включают мРНК, кодирующие спинномозговой мотонейрон 1 (SMN), альфа-галактозидазу (GLA), аргининосукцинатсинтетазу (ASS1), орнитинтранскарбамилазу (OTC), фактор IX (FIX), фенилаланингидроксилазу (PAH), эритропоэтин (EPO), рецептор трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR) и люциферазу светлячка (FFL). Ниже перечислены иллюстративные последовательности мРНК, раскрытые в данном документе.

Кодон-оптимизированная кодирующая последовательность человеческой ОТС

AUGCUGUUCAACCUUCGGAUCUUGCUGAACAACGCUGCGUUCCGGAAUGGUCACAACUUCAUGGUCCGGAACUUCAGAUGCGGCCAGCCGCUCCAGAACAAGGUGCAGCUCAAGGGGAGGGACCUCCUCACCCUGAAAAACUUCACCGGAGAAGAGAUCAAGUACAUGCUGUGGCUGUCAGCCGACCUCAAAUUCCGGAUCAAGCAGAAGGGCGAAUACCUUCCUUUGCUGCAGGGAAAGUCCCUGGGGAUGAUCUUCGAGAAGCGCAGCACUCGCACUAGACUGUCAACUGAAACCGGCUUCGCGCUGCUGGGAGGACACCCCUGCUUCCUGACCACCCAAGAUAUCCAUCUGGGUGUGAACGAAUCCCUCACCGACACAGCGCGGGUGCUGUCGUCCAUGGCAGACGCGGUCCUCGCCCGCGUGUACAAGCAGUCUGAUCUGGACACUCUGGCCAAGGAAGCCUCCAUUCCUAUCAUUAAUGGAUUGUCCGACCUCUACCAUCCCAUCCAGAUUCUGGCCGAUUAUCUGACUCUGCAAGAACAUUACAGCUCCCUGAAGGGGCUUACCCUUUCGUGGAUCGGCGACGGCAACAACAUUCUGCACAGCAUUAUGAUGAGCGCUGCCAAGUUUGGAAUGCACCUCCAAGCAGCGACCCCGAAGGGAUACGAGCCAGACGCCUCCGUGACGAAGCUGGCUGAGCAGUACGCCAAGGAGAACGGCACUAAGCUGCUGCUCACCAACGACCCUCUCGAAGCCGCCCACGGUGGCAACGUGCUGAUCACCGAUACCUGGAUCUCCAUGGGACAGGAGGAGGAAAAGAAGAAGCGCCUGCAAGCAUUUCAGGGGUACCAGGUGACUAUGAAAACCGCCAAGGUCGCCGCCUCGGACUGGACCUUCUUGCACUGUCUGCCCAGAAAGCCCGAAGAGGUGGACGACGAGGUGUUCUACAGCCCGCGGUCGCUGGUCUUUCCGGAGGCCGAAAACAGGAAGUGGACUAUCAUGGCCGUGAUGGUGUCCCUGCUGACCGAUUACUCCCCGCAGCUGCAGAAACCAAAGUUCUGA (SEQ ID NO: 1)

Кодон-оптимизированная кодирующая последовательность человеческой ASS1

AUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAAGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCAUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCAACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCACUGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGCCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGA (SEQ ID NO: 2)

Кодон-оптимизированная кодирующая последовательность человеческого CFTR

AUGCAACGCUCUCCUCUUGAAAAGGCCUCGGUGGUGUCCAAGCUCUUCUUCUCGUGGACUAGACCCAUCCUGAGAAAGGGGUACAGACAGCGCUUGGAGCUGUCCGAUAUCUAUCAAAUCCCUUCCGUGGACUCCGCGGACAACCUGUCCGAGAAGCUCGAGAGAGAAUGGGACAGAGAACUCGCCUCAAAGAAGAACCCGAAGCUGAUUAAUGCGCUUAGGCGGUGCUUUUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGCAUCUUCCUCUACCUGGGAGAGGUCACCAAGGCCGUGCAGCCCCUGUUGCUGGGACGGAUUAUUGCCUCCUACGACCCCGACAACAAGGAAGAAAGAAGCAUCGCUAUCUACUUGGGCAUCGGUCUGUGCCUGCUUUUCAUCGUCCGGACCCUCUUGUUGCAUCCUGCUAUUUUCGGCCUGCAUCACAUUGGCAUGCAGAUGAGAAUUGCCAUGUUUUCCCUGAUCUACAAGAAAACUCUGAAGCUCUCGAGCCGCGUGCUUGACAAGAUUUCCAUCGGCCAGCUCGUGUCCCUGCUCUCCAACAAUCUGAACAAGUUCGACGAGGGCCUCGCCCUGGCCCACUUCGUGUGGAUCGCCCCUCUGCAAGUGGCGCUUCUGAUGGGCCUGAUCUGGGAGCUGCUGCAAGCCUCGGCAUUCUGUGGGCUUGGAUUCCUGAUCGUGCUGGCACUGUUCCAGGCCGGACUGGGGCGGAUGAUGAUGAAGUACAGGGACCAGAGAGCCGGAAAGAUUUCCGAACGGCUGGUGAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCAGUGAAGGCCUACUGCUGGGAAGAGGCCAUGGAAAAGAUGAUUGAAAACCUCCGGCAAACCGAGCUGAAGCUGACCCGCAAGGCCGCUUACGUGCGCUAUUUCAACUCGUCCGCUUUCUUCUUCUCCGGGUUCUUCGUGGUGUUUCUCUCCGUGCUCCCCUACGCCCUGAUUAAGGGAAUCAUCCUCAGGAAGAUCUUCACCACCAUUUCCUUCUGUAUCGUGCUCCGCAUGGCCGUGACCCGGCAGUUCCCAUGGGCCGUGCAGACUUGGUACGACUCCCUGGGAGCCAUUAACAAGAUCCAGGACUUCCUUCAAAAGCAGGAGUACAAGACCCUCGAGUACAACCUGACUACUACCGAGGUCGUGAUGGAAAACGUCACCGCCUUUUGGGAGGAGGGAUUUGGCGAACUGUUCGAGAAGGCCAAGCAGAACAACAACAACCGCAAGACCUCGAACGGUGACGACUCCCUCUUCUUUUCAAACUUCAGCCUGCUCGGGACGCCCGUGCUGAAGGACAUUAACUUCAAGAUCGAAAGAGGACAGCUCCUGGCGGUGGCCGGAUCGACCGGAGCCGGAAAGACUUCCCUGCUGAUGGUGAUCAUGGGAGAGCUUGAACCUAGCGAGGGAAAGAUCAAGCACUCCGGCCGCAUCAGCUUCUGUAGCCAGUUUUCCUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAGGAAAACAUCAUCUUCGGCGUGUCCUACGAUGAAUACCGCUACCGGUCCGUGAUCAAAGCCUGCCAGCUGGAAGAGGAUAUUUCAAAGUUCGCGGAGAAAGAUAACAUCGUGCUGGGCGAAGGGGGUAUUACCUUGUCGGGGGGCCAGCGGGCUAGAAUCUCGCUGGCCAGAGCCGUGUAUAAGGACGCCGACCUGUAUCUCCUGGACUCCCCCUUCGGAUACCUGGACGUCCUGACCGAAAAGGAGAUCUUCGAAUCGUGCGUGUGCAAGCUGAUGGCUAACAAGACUCGCAUCCUCGUGACCUCCAAAAUGGAGCACCUGAAGAAGGCAGACAAGAUUCUGAUUCUGCAUGAGGGGUCCUCCUACUUUUACGGCACCUUCUCGGAGUUGCAGAACUUGCAGCCCGACUUCUCAUCGAAGCUGAUGGGUUGCGACAGCUUCGACCAGUUCUCCGCCGAAAGAAGGAACUCGAUCCUGACGGAAACCUUGCACCGCUUCUCUUUGGAAGGCGACGCCCCUGUGUCAUGGACCGAGACUAAGAAGCAGAGCUUCAAGCAGACCGGGGAAUUCGGCGAAAAGAGGAAGAACAGCAUCUUGAACCCCAUUAACUCCAUCCGCAAGUUCUCAAUCGUGCAAAAGACGCCACUGCAGAUGAACGGCAUUGAGGAGGACUCCGACGAACCCCUUGAGAGGCGCCUGUCCCUGGUGCCGGACAGCGAGCAGGGAGAAGCCAUCCUGCCUCGGAUUUCCGUGAUCUCCACUGGUCCGACGCUCCAAGCCCGGCGGCGGCAGUCCGUGCUGAACCUGAUGACCCACAGCGUGAACCAGGGCCAAAACAUUCACCGCAAGACUACCGCAUCCACCCGGAAAGUGUCCCUGGCACCUCAAGCGAAUCUUACCGAGCUCGACAUCUACUCCCGGAGACUGUCGCAGGAAACCGGGCUCGAAAUUUCCGAAGAAAUCAACGAGGAGGAUCUGAAAGAGUGCUUCUUCGACGAUAUGGAGUCGAUACCCGCCGUGACGACUUGGAACACUUAUCUGCGGUACAUCACUGUGCACAAGUCAUUGAUCUUCGUGCUGAUUUGGUGCCUGGUGAUUUUCCUGGCCGAGGUCGCGGCCUCACUGGUGGUGCUCUGGCUGUUGGGAAACACGCCUCUGCAAGACAAGGGAAACUCCACGCACUCGAGAAACAACAGCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCCACCUCCUCUUAUUACGUGUUCUACAUCUACGUCGGAGUGGCGGAUACCCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCAGAGGACUGCCGCUGGUCCACACCUUGAUCACCGUCAGCAAGAUUCUUCACCACAAGAUGUUGCAUAGCGUGCUGCAGGCCCCCAUGUCCACCCUCAACACUCUGAAGGCCGGAGGCAUUCUGAACAGAUUCUCCAAGGACAUCGCUAUCCUGGACGAUCUCCUGCCGCUUACCAUCUUUGACUUCAUCCAGCUGCUGCUGAUCGUGAUUGGAGCAAUCGCAGUGGUGGCGGUGCUGCAGCCUUACAUUUUCGUGGCCACUGUGCCGGUCAUUGUGGCGUUCAUCAUGCUGCGGGCCUACUUCCUCCAAACCAGCCAGCAGCUGAAGCAACUGGAAUCCGAGGGACGAUCCCCCAUCUUCACUCACCUUGUGACGUCGUUGAAGGGACUGUGGACCCUCCGGGCUUUCGGACGGCAGCCCUACUUCGAAACCCUCUUCCACAAGGCCCUGAACCUCCACACCGCCAAUUGGUUCCUGUACCUGUCCACCCUGCGGUGGUUCCAGAUGCGCAUCGAGAUGAUUUUCGUCAUCUUCUUCAUCGCGGUCACAUUCAUCAGCAUCCUGACUACCGGAGAGGGAGAGGGACGGGUCGGAAUAAUCCUGACCCUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACCCUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUCGACGUGGACAGCCUGAUGCGAAGCGUCAGCCGCGUGUUCAAGUUCAUCGACAUGCCUACUGAGGGAAAACCCACUAAGUCCACUAAGCCCUACAAAAAUGGCCAGCUGAGCAAGGUCAUGAUCAUCGAAAACUCCCACGUGAAGAAGGACGAUAUUUGGCCCUCCGGAGGUCAAAUGACCGUGAAGGACCUGACCGCAAAGUACACCGAGGGAGGAAACGCCAUUCUCGAAAACAUCAGCUUCUCCAUUUCGCCGGGACAGCGGGUCGGCCUUCUCGGGCGGACCGGUUCCGGGAAGUCAACUCUGCUGUCGGCUUUCCUCCGGCUGCUGAAUACCGAGGGGGAAAUCCAAAUUGACGGCGUGUCUUGGGAUUCCAUUACUCUGCAGCAGUGGCGGAAGGCCUUCGGCGUGAUCCCCCAGAAGGUGUUCAUCUUCUCGGGUACCUUCCGGAAGAACCUGGAUCCUUACGAGCAGUGGAGCGACCAAGAAAUCUGGAAGGUCGCCGACGAGGUCGGCCUGCGCUCCGUGAUUGAACAAUUUCCUGGAAAGCUGGACUUCGUGCUCGUCGACGGGGGAUGUGUCCUGUCGCACGGACAUAAGCAGCUCAUGUGCCUCGCACGGUCCGUGCUCUCCAAGGCCAAGAUUCUGCUGCUGGACGAACCUUCGGCCCACCUGGAUCCGGUCACCUACCAGAUCAUCAGGAGGACCCUGAAGCAGGCCUUUGCCGAUUGCACCGUGAUUCUCUGCGAGCACCGCAUCGAGGCCAUGCUGGAGUGCCAGCAGUUCCUGGUCAUCGAGGAGAACAAGGUCCGCCAAUACGACUCCAUUCAAAAGCUCCUCAACGAGCGGUCGCUGUUCAGACAAGCUAUUUCACCGUCCGAUAGAGUGAAGCUCUUCCCGCAUCGGAACAGCUCAAAGUGCAAAUCGAAGCCGCAGAUCGCAGCCUUGAAGGAAGAGACUGAGGAAGAGGUGCAGGACACCCGGCUUUAA (SEQ ID NO: 3)

Сравнительная кодон-оптимизированная кодирующая последовательность мРНК человеческого CFTR

AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUCGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAGAUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAAUUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCGGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACACAUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACACUCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACGCUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUUCUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGCGAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCAUUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA (SEQ ID NO: 4)

Кодон-оптимизированная кодирующая последовательность человеческой PAH

AUGAGCACCGCCGUGCUGGAGAACCCCGGCCUGGGCCGCAAGCUGAGCGACUUCGGCCAGGAGACCAGCUACAUCGAGGACAACUGCAACCAGAACGGCGCCAUCAGCCUGAUCUUCAGCCUGAAGGAGGAGGUGGGCGCCCUGGCCAAGGUGCUGCGCCUGUUCGAGGAGAACGACGUGAACCUGACCCACAUCGAGAGCCGCCCCAGCCGCCUGAAGAAGGACGAGUACGAGUUCUUCACCCACCUGGACAAGCGCAGCCUGCCCGCCCUGACCAACAUCAUCAAGAUCCUGCGCCACGACAUCGGCGCCACCGUGCACGAGCUGAGCCGCGACAAGAAGAAGGACACCGUGCCCUGGUUCCCCCGCACCAUCCAGGAGCUGGACCGCUUCGCCAACCAGAUCCUGAGCUACGGCGCCGAGCUGGACGCCGACCACCCCGGCUUCAAGGACCCCGUGUACCGCGCCCGCCGCAAGCAGUUCGCCGACAUCGCCUACAACUACCGCCACGGCCAGCCCAUCCCCCGCGUGGAGUACAUGGAGGAGGAGAAGAAGACCUGGGGCACCGUGUUCAAGACCCUGAAGAGCCUGUACAAGACCCACGCCUGCUACGAGUACAACCACAUCUUCCCCCUGCUGGAGAAGUACUGCGGCUUCCACGAGGACAACAUCCCCCAGCUGGAGGACGUGAGCCAGUUCCUGCAGACCUGCACCGGCUUCCGCCUGCGCCCCGUGGCCGGCCUGCUGAGCAGCCGCGACUUCCUGGGCGGCCUGGCCUUCCGCGUGUUCCACUGCACCCAGUACAUCCGCCACGGCAGCAAGCCCAUGUACACCCCCGAGCCCGACAUCUGCCACGAGCUGCUGGGCCACGUGCCCCUGUUCAGCGACCGCAGCUUCGCCCAGUUCAGCCAGGAGAUCGGCCUGGCCAGCCUGGGCGCCCCCGACGAGUACAUCGAGAAGCUGGCCACCAUCUACUGGUUCACCGUGGAGUUCGGCCUGUGCAAGCAGGGCGACAGCAUCAAGGCCUACGGCGCCGGCCUGCUGAGCAGCUUCGGCGAGCUGCAGUACUGCCUGAGCGAGAAGCCCAAGCUGCUGCCCCUGGAGCUGGAGAAGACCGCCAUCCAGAACUACACCGUGACCGAGUUCCAGCCCCUGUACUACGUGGCCGAGAGCUUCAACGACGCCAAGGAGAAGGUGCGCAACUUCGCCGCCACCAUCCCCCGCCCCUUCAGCGUGCGCUACGACCCCUACACCCAGCGCAUCGAGGUGCUGGACAACACCCAGCAGCUGAAGAUCCUGGCCGACAGCAUCAACAGCGAGAUCGGCAUCCUGUGCAGCGCCCUGCAGAAGAUCAAGUAA (SEQ ID NO: 5)

[87] В некоторых вариантах осуществления мРНК, подходящая для настоящего изобретения, имеет нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления мРНК, подходящая для настоящего изобретения, содержит нуклеотидную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO: 4.

Раствор мРНК

[88] мРНК может быть предоставлена в растворе для обеспечения смешивания с раствором липидов, таким образом чтобы мРНК могла быть инкапсулирована в липидные наночастицы. Подходящий раствором мРНК может представлять собой любой водный раствор, содержащий мРНК, подлежащую инкапсулированию, в различных концентрациях. Например, подходящий раствор мРНК может содержать мРНК в концентрации, составляющей приблизительно 0,01 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,06 мг/мл, 0,07 мг/мл, 0,08 мг/мл, 0,09 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,15 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,7 мг/мл, 0,8 мг/мл, 0,9 мг/мл или 1,0 мг/мл или больше. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор мРНК может содержать мРНК в концентрации, находящейся в диапазоне приблизительно 0,01-1,0 мг/мл, 0,01-0,9 мг/мл, 0,01-0,8 мг/мл, 0,01-0,7 мг/мл, 0,01-0,6 мг/мл, 0,01-0,5 мг/мл, 0,01-0,4 мг/мл, 0,01-0,3 мг/мл, 0,01-0,2 мг/мл, 0,01-0,1 мг/мл, 0,05-1,0 мг/мл, 0,05-0,9 мг/мл, 0,05-0,8 мг/мл, 0,05-0,7 мг/мл, 0,05-0,6 мг/мл, 0,05-0,5 мг/мл, 0,05-0,4 мг/мл, 0,05-0,3 мг/мл, 0,05-0,2 мг/мл, 0,05-0,1 мг/мл, 0,1-1,0 мг/мл, 0,2-0,9 мг/мл, 0,3-0,8 мг/мл, 0,4-0,7 мг/мл или 0,5-0,6 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор мРНК может содержать мРНК в концентрации вплоть до приблизительно 5,0 мг/мл, 4,0 мг/мл, 3,0 мг/мл, 2,0 мг/мл, 1,0 мг/мл, 0,09 мг/мл, 0,08 мг/мл, 0,07 мг/мл, 0,06 мг/мл или 0,05 мг/мл.

[89] Как правило, подходящий раствор мРНК также может содержать буферное средство и/или соль. В целом, буферные средства могут включать HEPES, сульфат аммония, бикарбонат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия, фосфат калия и фосфат натрия. В некоторых вариантах осуществления подходящая концентрация буферного средства может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 до 100 мМ, от 0,5 до 90 мМ, от 1,0 до 80 мМ, от 2 до 70 мМ, от 3 до 60 мМ, от 4 до 50 мМ, от 5 до 40 мМ, от 6 до 30 мМ, от 7 до 20 мМ, от 8 до 15 мМ или от 9 до 12 мМ. В некоторых вариантах осуществления подходящая концентрация буферного средства составляет приблизительно 0,1 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ, 2 мМ, 4 мМ, 6 мМ, 8 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ или 50 мМ или больше.

[90] Иллюстративные соли могут включать хлорид натрия, хлорид магния и хлорид калия. В некоторых вариантах осуществления подходящая концентрация солей в растворе мРНК может находиться в диапазоне от приблизительно 1 мМ до 500 мМ, от 5 мМ до 400 мМ, от 10 мМ до 350 мМ, от 15 мМ до 300 мМ, от 20 мМ до 250 мМ, от 30 мМ до 200 мМ, от 40 мМ до 190 мМ, от 50 мМ до 180 мМ, от 50 мМ до 170 мМ, от 50 мМ до 160 мМ, от 50 мМ до 150 мМ или от 50 мМ до 100 мМ. Концентрация соли в подходящем растворе мРНК составляет приблизительно 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ, 30 мМ, 40 мМ, 50 мМ, 60 мМ, 70 мМ, 80 мМ, 90 мМ или 100 мМ или больше.

[91] В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор мРНК может иметь pH в диапазоне приблизительно 3,5-6,5, 3,5-6,0, 3,5-5,5, 3,5-5,0, 3,5-4,5, 4,0-5,5, 4,0-5,0, 4,0-4,9, 4,0-4,8, 4,0-4,7, 4,0-4,6 или 4,0-4,5. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор мРНК может иметь pH, составляющий приблизительно 3,5, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,1, 6,3 и 6,5 или не больше.

[92] Для получения раствора мРНК, подходящего для настоящего изобретения, можно применять различные способы. В некоторых вариантах осуществления мРНК может быть непосредственно растворена в буферном растворе, описанном в данном документе. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК может быть получен путем смешивания исходного раствора мРНК с буферным раствором до смешивания с раствором липидов для инкапсулирования. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК может быть получен путем смешивания исходного раствора мРНК с буферным раствором непосредственно перед смешиванием с раствором липидов для инкапсулирования. В некоторых вариантах осуществления подходящий исходный раствор мРНК может содержать мРНК в воде в концентрации, составляющей приблизительно 0,2 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,8 мг/мл, 1,0 мг/мл, 1,2 мг/мл, 1,4 мг/мл, 1,5 мг/мл или 1,6 мг/мл, 2,0 мг/мл, 2,5 мг/мл, 3,0 мг/мл, 3,5 мг/мл, 4,0 мг/мл, 4,5 мг/мл или 5,0 мг/мл или больше.

[93] В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК получают путем смешивания исходного раствора мРНК с буферным раствором с применением насоса. К иллюстративным насосам относятся без ограничения шестеренчатые насосы, перистальтические насосы и центробежные насосы. Как правило, буферный раствор смешивают при скорости, превышающей скорость для исходного раствора мРНК. Например, буферный раствор можно смешивать при скорости, которая является в по меньшей мере 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x или 20x большей, чем скорость для исходного раствора мРНК. В некоторых вариантах осуществления буферный раствор смешивают при скорости потока в диапазоне приблизительно 100-6000 мл/минута (например, приблизительно 100-300 мл/минута, 300-600 мл/минута, 600-1200 мл/минута, 1200-2400 мл/минута, 2400-3600 мл/минута, 3600-4800 мл/минута, 4800-6000 мл/минута или 60-420 мл/минута). В некоторых вариантах осуществления буферный раствор смешивают при скорости потока, составляющей приблизительно 60 мл/минута, 100 мл/минута, 140 мл/минута, 180 мл/минута, 220 мл/минута, 260 мл/минута, 300 мл/минута, 340 мл/минута, 380 мл/минута, 420 мл/минута, 480 мл/минута, 540 мл/минута, 600 мл/минута, 1200 мл/минута, 2400 мл/минута, 3600 мл/минута, 4800 мл/минута или 6000 мл/минута или больше.

[94] В некоторых вариантах осуществления исходный раствор мРНК смешивают при скорости потока в диапазоне приблизительно 10-600 мл/минута (например, 5-50 мл/минута, 10-30 мл/минута, приблизительно 30-60 мл/минута, приблизительно 60-120 мл/минута, приблизительно 120-240 мл/минута, приблизительно 240-360 мл/минута, приблизительно 360-480 мл/минута или приблизительно 480-600 мл/минута). В некоторых вариантах осуществления исходный раствор мРНК смешивают при скорости потока, составляющей приблизительно 5 мл/минута, 10 мл/минута, 15 мл/минута, 20 мл/минута, 25 мл/минута, 30 мл/минута, 35 мл/минута, 40 мл/минута, 45 мл/минута, 50 мл/минута, 60 мл/минута, 80 мл/минута, 100 мл/минута, 200 мл/минута, 300 мл/минута, 400 мл/минута, 500 мл/минута или 600 мл/минута или больше.

Раствор липидов

[95] Согласно настоящему изобретению раствор липидов содержит смесь липидов, подходящую для образования липидных наночастиц для инкапсулирования мРНК. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов получен на основе этанола. Например, подходящий раствор липидов может содержать смесь требуемых липидов, растворенных в чистом этаноле (т. е. 100% этаноле). В другом варианте осуществления подходящий раствор липидов получен на основе изопропилового спирта. В другом варианте осуществления подходящий раствор липидов получен на основе диметилсульфоксида. В другом варианте осуществления подходящий раствор липидов представляет собой смесь подходящих растворителей, в том числе без ограничения этанола, изопропилового спирта и диметилсульфоксида.

[96] Подходящий раствор липидов может содержать смесь требуемых липидов при различных концентрациях. Например, подходящий раствор липидов может содержать смесь требуемых липидов при общей концентрации, составляющей приблизительно 0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 1,0 мг/мл, 2,0 мг/мл, 3,0 мг/мл, 4,0 мг/мл, 5,0 мг/мл, 6,0 мг/мл, 7,0 мг/мл, 8,0 мг/мл, 9,0 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл или 100 мг/мл или больше. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов может содержать смесь требуемых липидов при общей концентрации в диапазоне приблизительно 0,1-100 мг/мл, 0,5-90 мг/мл, 1,0-80 мг/мл, 1,0-70 мг/мл, 1,0-60 мг/мл, 1,0-50 мг/мл, 1,0-40 мг/мл, 1,0-30 мг/мл, 1,0-20 мг/мл, 1,0-15 мг/мл, 1,0-10 мг/мл, 1,0-9 мг/мл, 1,0-8 мг/мл, 1,0-7 мг/мл, 1,0-6 мг/мл или 1,0-5 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов может содержать смесь требуемых липидов при общей концентрации, составляющей не более приблизительно 100 мг/мл, 90 мг/мл, 80 мг/мл, 70 мг/мл, 60 мг/мл, 50 мг/мл, 40 мг/мл, 30 мг/мл, 20 мг/мл или 10 мг/мл.

[97] Любые требуемые липиды можно смешивать при любых соотношениях, подходящих для инкапсулирования мРНК. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов содержит смесь требуемых липидов, в том числе катионные липиды, вспомогательные липиды (например, липиды, отличные от катионных, и/или липиды на основе холестерина) и/или пегилированные липиды. В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов содержит смесь требуемых липидов, в том числе один или более катионных липидов, один или более вспомогательных липидов (например, липиды, отличные от катионных, и/или липиды на основе холестерина) и один или более пегилированных липидов.

[98] Иллюстративная смесь липидов для применения в контексте настоящего изобретения состоит из четырех липидных компонентов: катионного липида, липида, отличного от катионного (например, DSPC, DPPC, DOPE или DEPE), липида на основе холестерина (например, холестерина) и PEG-модифицированного липида (например, DMG-PEG2K). В некоторых вариантах осуществления молярное соотношение катионного(катионных) липида(липидов), и липида(липидов), отличного(отличных) от катионного, и липида(липидов) на основе холестерина, и PEG-модифицированного(модифицированных) липида(липидов) может составлять приблизительно 20-50:25-35:20-50:1-5 соответственно. В некоторых вариантах осуществления соотношение катионного(катионных) липида(липидов), и липида(липидов), отличного(отличных) от катионного, и липида(липидов) на основе холестерина, и PEG-модифицированного(модифицированных) липида(липидов) составляет примерно 20:30:48,5:1,5 соответственно. В некоторых вариантах осуществления соотношение катионного(катионных) липида(липидов), и липида(липидов), отличного(отличных) от катионного, и липида(липидов) на основе холестерина, и PEG-модифицированного(модифицированных) липида(липидов) составляет приблизительно 40:30:20:10 соответственно. В некоторых вариантах осуществления соотношение катионного(катионных) липида(липидов), и липида(липидов), отличного(отличных) от катионного, и липида(липидов) на основе холестерина, и PEG-модифицированного(модифицированных) липида(липидов) составляет приблизительно 40:30:25:5 соответственно. В некоторых вариантах осуществления соотношение катионного(катионных) липида(липидов), и липида(липидов), отличного(отличных) от катионного, и липида(липидов) на основе холестерина, и PEG-модифицированного(модифицированных) липида(липидов) составляет приблизительно 40:32:25:3 соответственно. В некоторых вариантах осуществления соотношение катионного(катионных) липида(липидов), и липида(липидов), отличного(отличных) от катионного, и липида(липидов) на основе холестерина, и PEG-модифицированного(модифицированных) липида(липидов) составляет приблизительно 50:25:20:5.

[99] В некоторых вариантах осуществления смесь липидов для применения в контексте настоящего изобретения может содержать не более трех отдельных липидных компонентов. В некоторых вариантах осуществления один отдельный липидный компонент в такой смеси представляет собой катионный липид на основе холестерина или на основе имидазола. Иллюстративная смесь липидов может состоять из трех липидных компонентов: катионного липида (например, катионного липида на основе холестерина или имидазола, такого как ICE, HGT4001 или HGT4002), липида, отличного от катионного (например, DSPC, DPPC, DOPE или DEPE), и PEG-модифицированного липида (например, DMG-PEG2K). Молярное соотношение катионного липида, и липида, отличного от катионного, и PEG-модифицированного липида может составлять приблизительно 55-65:30-40:1-15 соответственно. В некоторых вариантах осуществления для применения в контексте настоящего изобретения особенно подходит молярное соотношение катионного липида (например, липида на основе холестерина или на основе имидазола, такого как ICE, HGT4001 или HGT4002), и липида, отличного от катионного (например, DSPC, DPPC, DOPE или DEPE), и PEG-модифицированного липида (например, DMG-PEG2K) 60:35:5.

Катионные липиды

[100] Используемая в данном документе фраза «катионные липиды» относится к любому из ряда липидных соединений, которые имеют суммарный положительный заряд при выбранном pH, например физиологическом pH. Некоторые катионные липиды были описаны в литературе, многие из которых коммерчески доступны. В частности, подходящие катионные липиды для применения в композициях и способах по настоящему изобретению включают описанные в международных публикациях патентных заявок WO 2010/053572 (и в частности, C12-200, описанный в параграфе [00225]) и WO 2012/170930, обе из которых включены в данный документ посредством ссылки. В определенных вариантах осуществления к катионным липидам, подходящим для композиций и способов по настоящему изобретению, относится ионизируемый катионный липид, описанный в предварительной заявке на патент США № 61/617468, поданной 29 марта 2012 года (включенной в данный документ посредством ссылки), такой как, например, (15Z,18Z)-N,N-диметил-6-(9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-ил)тетракоза-15,18-диен-1-амин (HGT5000), (15Z,18Z)-N,N-диметил-6-((9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-ил)тетракоза-4,15,18-триен-1-амин (HGT5001) и (15Z,18Z)-N,N-диметил-6-((9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-ил)тетракоза-5,15,18-триен-1-амин (HGT5002).

[101] В некоторых вариантах осуществления к катионным липидам, подходящим для композиций и способов по настоящему изобретению, относятся такие катионные липиды, как 3,6-бис(4-(бис((9Z,12Z)-2-гидроксиоктадека-9,12-диен-1-ил)амино)бутил)пиперазин-2,5-дион (OF-02).

[102] В некоторых вариантах осуществления катионные липиды, подходящие для композиций и способов по настоящему изобретению, включают катионный липид, описанный в WO 2015/184256 A2 под названием «Биоразлагаемые липиды для доставки нуклеиновых кислот» (Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids), которая включена в данный документ посредством ссылки, такой как 3-(4-(бис(2-гидроксидодецил)амино)бутил)-6-(4-((2-гидроксидодецил)(2-гидроксиундецил)амино)бутил)-1,4-диоксан-2,5-дион («Target 23»), 3-(5-(бис(2-гидроксидодецил)амино)пентан-2-ил)-6-(5-((2-гидроксидодецил)(2-гидроксиундецил)амино)пентан-2-ил)-1,4-диоксан-2,5-дион («Target 24»).

[103] В некоторых вариантах осуществления к катионным липидам, подходящим для композиций и способов по настоящему изобретению, относится катионный липид, описанный в WO 2013/063468 и в предварительной заявке США под названием «Липидные составы для доставки матричной РНК» (Lipid Formulations for Delivery of Messenger RNA), обе из которых включены в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления катионный липид предусматривает соединение формулы I-c1-a,

I-c1-a,

или его фармацевтически приемлемую соль, где

каждый R² независимо представляет собой водород или C_1-3алкил;

каждый q независимо составляет 2-6;

каждый R' независимо представляет собой водород или C_1-3алкил;

и каждый R^L независимо представляет собой C_8-12алкил.

[104] В некоторых вариантах осуществления каждый R² независимо представляет собой водород, метил или этил. В некоторых вариантах осуществления каждый R² независимо представляет собой водород или метил. В некоторых вариантах осуществления каждый R² представляет собой водород.

[105] В некоторых вариантах осуществления каждый q независимо составляет 3-6. В некоторых вариантах осуществления каждый q независимо составляет 3-5. В некоторых вариантах осуществления каждый q составляет 4.

[106] В некоторых вариантах осуществления каждый R' независимо представляет собой водород, метил или этил. В некоторых вариантах осуществления каждый R' независимо представляет собой водород или метил. В некоторых вариантах осуществления каждый R' независимо представляет собой водород.

[107] В некоторых вариантах осуществления каждый R^L независимо представляет собой C_8-12алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый R^L независимо представляет собой n-C_8-12алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый R^L независимо представляет собой C_9-11алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый R^L независимо представляет собой n-C_9-11алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый R^L независимо представляет собой C₁₀алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый R^L независимо представляет собой n-C₁₀алкил.

[108] В некоторых вариантах осуществления каждый R² независимо представляет собой водород или метил; каждый q независимо составляет 3-5; каждый R' независимо представляет собой водород или метил; и каждый R^L независимо представляет собой C_8-12алкил.

[109] В некоторых вариантах осуществления каждый R² представляет собой водород; каждый q независимо составляет 3-5; каждый R' представляет собой водород; и каждый R^L независимо представляет собой C_8-12алкил.

[110] В некоторых вариантах осуществления каждый R² представляет собой водород; каждый q составляет 4; каждый R' представляет собой водород; и каждый R^L независимо представляет собой C_8-12алкил.

[111] В некоторых вариантах осуществления катионный липид предусматривает соединение формулы I-g,

или его фармацевтически приемлемую соль, где каждый R^L независимо представляет собой C_8-12алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый R^L независимо представляет собой n-C_8-12алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый R^L независимо представляет собой C_9-11алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый R^L независимо представляет собой n-C_9-11алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый R^L независимо представляет собой C₁₀алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый R^L представляет собой n-C₁₀алкил.

[112] В конкретных вариантах осуществления подходящий катионный липид представляет собой cKK-E12 или (3,6-бис(4-(бис(2-гидроксидодецил)амино)бутил)пиперазин-2,5-дион). Ниже представлена структура cKK-E12:

.

[113] К другим подходящим катионным липидам относятся расщепляемые катионные липиды, которые описаны в международной публикации патентной заявки WO 2012/170889, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению предусматривают катионный липид следующей формулы:

где R₁ выбран из группы, состоящей из имидазола, гуанидиния, амино, имина, енамина, необязательно замещенного алкиламино (например, такого алкиламино, как диметиламино) и пиридила; где R₂ выбран из группы, состоящей из одной из следующих двух формул:

и где каждый из R₃ и R₄ независимо выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного, в разной степени насыщенного или ненасыщенного C₆-C₂₀алкила и необязательно замещенного, в разной степени насыщенного или ненасыщенного C₆-C₂₀ацила; и где n представляет собой нуль или любое положительное целое число (например, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать и больше). В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению предусматривают катионный липид «HGT4001», имеющий структуру соединения

(HGT4001),

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению предусматривают катионный липид «HGT4002», имеющий структуру соединения

(HGT4002),

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению предусматривают катионный липид «HGT4003», имеющий структуру соединения

(HGT4003),

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению предусматривают катионный липид «HGT4004», имеющий структуру соединения

(HGT4004),

и его фармацевтически приемлемые соли. В определенных вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению предусматривают катионный липид «HGT4005», имеющий структуру соединения

(HGT4005),

[114] и его фармацевтически приемлемые соли.

[115] Дополнительные иллюстративные катионные липиды включают липиды формулы I,

и их фармацевтически приемлемые соли,

где

R представляет собой («OF-00»),

R представляет собой («OF-01»),

R представляет собой («OF-02»), или

R представляет собой («OF-03»)

(см., например, Fenton, Owen S., et al. "Bioinspired Alkenyl Amino Alcohol Ionizable Lipid Materials for Highly Potent In Vivo mRNA Delivery." Advanced materials (2016)).

[116] В некоторых вариантах осуществления один или более катионных липидов, подходящих для настоящего изобретения, могут представлять собой N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид или «DOTMA». (Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); патент США № 4897355). Другие подходящие катионные липиды включают, например, 5-карбоксиспермилглициндиоктадециламид или «DOGS», 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминий или «DOSPA» (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); патент США № 5171678; патент США № 5334761), 1,2-диолеоил-3-диметиламмонийпропан или «DODAP», 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан или «DOTAP».

[117] Дополнительные иллюстративные катионные липиды также включают 1,2-дистеарилокси-N,N-диметил-3-аминопропан или «DSDMA», 1,2-диолеилокси-N, N-диметил-3-аминопропан или «DODMA», 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан или «DLinDMA», 1,2-дилиноленилокси-N, N-диметил-3-аминопропан или «DLenDMA», N-диолеил-N, N-диметиламмония хлорид или «DODAC», N, N-дистеарил-N, N-диметиламмония бромид или «DDAB», N-(1,2-димиристилоксипроп-3-ил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтиламмония бромид или «DMRIE», 3-диметиламино-2-(холест-5-ен-3-бета-оксибутан-4-окси)-1-(цис, цис-9,12-октадекадиенокси)пропан или «CLinDMA», 2-[5'-(холест-5-ен-3-бета-окси)-3'-оксапентокси)-3-диметил-1-(цис,цис-9',12'-октадекадиенокси)пропан или «CpLinDMA», N, N-диметил-3,4-диолеилоксибензиламин или «DMOBA», 1,2-N,N'-диолеилкарбамил-3-диметиламинопропан или «DOcarbDAP», 2,3-дилинолеоилокси-Ν,Ν-диметилпропиламин или «DLinDAP», 1,2-N, N'-дилинолеилкарбамил-3-диметиламинопропан или «DLincarbDAP», 1,2-дилинолеоилкарбамил-3-диметиламинопропан или «DLinCDAP», 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан или «DLinDMA», 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан или «DLin-K-XTC2-DMA» и 2-(2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-ил)-1,3-диоксолан-4-ил)-N, N-диметилэтанамин (DLin-KC2-DMA)) (см. WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28: 172-176 (2010)) или их смеси. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); PCT публикация WO 2005/121348A1). В некоторых вариантах осуществления один или более из катионных липидов включают по меньшей мере один из фрагмента имидазола, диалкиламино или гуанидиния.

[118] В некоторых вариантах осуществления один или более катионных липидов могут быть выбраны из XTC (2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан), MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат), ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12-диенил)тетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-5-амин)), NC98-5 (4,7,13-трис(3-оксо-3-(ундециламино)пропил)-N1,N16-диундецил-4,7,10,13-тетраазагексадекан-1,16-диамид), DODAP (1,2-диолеил-3-диметиламмонийпропан), HGT4003 (WO 2012/170889, идеи которой включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте), ICE (WO 2011/068810, идеи которой включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте), HGT5000 (предварительная заявка на патент США № 61/617468, идеи которой включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте) или HGT5001 (цис или транс) (предварительная заявка на патент № 61/617468), липидоидов на основе аминоспиртов, таких как те, которые раскрыты в WO 2010/053572, DOTAP (1,2-диолеил-3-триметиламмонийпропан), DOTMA (1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. «Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids» J. Contr. Rel. 2005, 107, 276-287), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C. et al. «Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery» Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, K.T. et al. «Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing» PNAS 2010, 107, 1864-1869), N1GL, N2GL, V1GL и их комбинаций.

[119] В некоторых вариантах осуществления один или более катионных липидов представляют собой аминолипиды. Аминолипиды, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают те, которые описаны в WO 2017180917, которая включена в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные аминолипиды в WO 2017180917 включают те, которые описаны в абзаце [0744], такие как DLin-MC3-DMA (MC3), (13Z,16Z)-N,N-диметил-3-нонилдокоза-13,16-диен-1-амин (L608) и соединение 18. Другие аминолипиды включают соединение 2, соединение 23, соединение 27, соединение 10 и соединение 20. Дополнительные аминолипиды, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают те, которые описаны в WO 2017112865, которая включена в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные аминолипиды в WO 2017112865 включают соединение согласно одной из формул (I), (Ia1)-(Ia6), (lb), (II), (Ila), (III), (IIIa), (IV), (17-1), (19-1), (19-11) и (20-1) и соединения из абзацев [00185], [00201], [0276]. В некоторых вариантах осуществления катионные липиды, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают те, которые описаны в WO2016118725, которая включена в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные катионные липиды из WO 2016118725 включают такие липиды, как KL22 и KL25. В некоторых вариантах осуществления катионные липиды, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают те, которые описаны в WO 2016118724, которая включена в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные катионные липиды из WO 2016118725 включают такие липиды, как KL10, 1,2-дилинолеилокси-N, N-диметиламинопропан (DLin-DMA) и KL25.

[120] В некоторых вариантах осуществления катионные липиды составляют по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 70% от общего количества липидов в подходящем растворе липидов по весу или по молярности. В некоторых вариантах осуществления катионный(катионные) липид(липиды) составляет(составляют) приблизительно 30-70% (например, приблизительно 30-65%, приблизительно 30-60%, приблизительно 30-55%, приблизительно 30-50%, приблизительно 30-45%, приблизительно 30-40%, приблизительно 35-50%, приблизительно 35-45% или приблизительно 35-40%) от общего количества смеси липидов по весу или по молярности.

Отличные от катионных/ вспомогательные липиды

[121] Используемая в данном документе фраза «липид, отличный от катионного» относится к любому нейтральному, цвиттерионному или анионному липиду. Используемая в данном документе фраза «анионный липид» относится к любому из ряда липидных соединений, которые несут суммарный отрицательный заряд при выбранном pH, например физиологическом pH. Липиды, отличные от катионных, включают без ограничения дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (POPC), пальмитоилолеоил-фосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), 1,2-диэрукоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DEPE), 16-O-монометил PE, 16-O-диметил PE, 18-1-транс PE, 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламин (SOPE) или их смесь. В некоторых вариантах осуществления смесь липидов для применения в контексте настоящего изобретения может включать DSPC в качестве липидного компонента, отличного от катионного. В некоторых вариантах осуществления смесь липидов для применения в контексте настоящего изобретения может включать DPPC в качестве липидного компонента, отличного от катионного. В некоторых вариантах осуществления смесь липидов для применения в контексте настоящего изобретения может включать DOPE в качестве липидного компонента, отличного от катионного. В других вариантах осуществления смесь липидов для применения в контексте настоящего изобретения может включать DEPE в качестве липидного компонента, отличного от катионного.

[122] В некоторых вариантах осуществления липиды, отличные от катионных, могут составлять по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 70% от общего количества липидов в подходящем растворе липидов по весу или по молярности. В некоторых вариантах осуществления липид(липиды), отличный(отличные) от катионного, составляет(составляют) приблизительно 30-50% (например, приблизительно 30-45%, приблизительно 30-40%, приблизительно 35-50%, приблизительно 35-45% или приблизительно 35-40%) от общего количества липидов в подходящем растворе липидов по весу или по молярности.

Липиды на основе холестерина

[123] В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов содержит один или более липидов на основе холестерина. Например, к подходящим катионным липидам на основе холестерина относятся, например, DC-Chol (N,N-диметил-N-этилкарбоксамидохолестерин), 1,4-бис(3-N-олеиламино-пропил)пиперазин (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997), патент США № 5744335) или ICE. В некоторых вариантах осуществления липид(липиды) на основе холестерина составляет(составляют) по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70% от общего количества липидов в подходящем растворе липидов по весу или по молярности. В некоторых вариантах осуществления липид(липиды) на основе холестерина составляет(составляют) приблизительно 30-50% (например, приблизительно 30-45%, приблизительно 30-40%, приблизительно 35-50%, приблизительно 35-45% или приблизительно 35-40%) от общего количества липидов в подходящем растворе липидов по весу или по молярности.

Пегилированные липиды

[124] В некоторых вариантах осуществления подходящий раствор липидов содержит один или более пегилированных липидов. Например, в настоящем изобретении также предусмотрено применение полиэтиленгликоль (PEG)-модифицированных фосфолипидов и дериватизированных липидов, таких как дериватизированные церамиды (PEG-CER), в том числе N-октаноил-сфингозин-1-[сукцинил(метоксиполиэтиленгликоль)-2000] (церамид C8 PEG-2000). Рассматриваемые PEG-модифицированные липиды включают без ограничения цепь полиэтиленгликоля длиной до 2 кДа, до 3 кДа, до 4 кДа или до 5 кДа, ковалентно присоединенную к липиду с алкильной(алкильными) цепью(цепями) длиной C₆-C₂₀. В некоторых вариантах осуществления PEG-модифицированный или пегилированный липид представляет собой пегилированный холестерин или PEG-2К. Например, подходящий раствор липидов может содержать PEG-модифицированный липид, такой как 1,2-димиристоил-рац-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль-2000 (DMG-PEG2K). В некоторых вариантах осуществления особенно применимыми заменяемыми липидами являются PEG-церамиды, имеющие более короткие ацильные цепи (например, C₁₄ или C₁₈).

[125] PEG-модифицированный фосфолипид и дериватизированные липиды могут составлять по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70% от общего количества липидов в подходящем растворе липидов по весу или по молярности. В некоторых вариантах осуществления PEG-модифицированный фосфолипид и дериватизированные липиды составляют от приблизительно 0% до приблизительно 20%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 20%, от приблизительно 1% до приблизительно 15%, от приблизительно 1,5% до приблизительно 5% общего количества липида, присутствующего в липосомной транспортной среде-носителе. В некоторых вариантах осуществления один или более PEG-модифицированных липидов составляют приблизительно 1,5%, приблизительно 2%, приблизительно 3%, приблизительно 4% или приблизительно 5% от общего количества липидов по молярному соотношению. В некоторых вариантах осуществления пегилированный(пегилированные) липид(липиды) на основе холестерина составляет(составляют) приблизительно 30-50% (например, приблизительно 30-45%, приблизительно 30-40%, приблизительно 35-50%, приблизительно 35-45% или приблизительно 35-40%) от общего количества липидов в подходящем растворе липидов по весу или по молярности.

[126] Различные комбинации липидов, т. е. катионных липидов, липидов, отличных от катионных, PEG-модифицированных липидов и необязательно холестерина, которые можно применять для получения предварительно образованных липидных наночастиц и которые входят в их состав, описаны в литературе и в данном документе. Например, подходящий раствор липидов может содержать cKK-E12, DOPE, холестерин и DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, холестерин и DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, холестерин и DMG-PEG2K; HGT5001, DOPE, холестерин и DMG-PEG2K; cKK-E12, DPPC, холестерин и DMG-PEG2K; C12-200, DPPC, холестерин и DMG-PEG2K; HGT5000, DPPC, холестерин и DMG-PEG2K; HGT5001, DPPC, холестерин и DMG-PEG2K; или ICE, DOPE и DMG-PEG2K. Дополнительные комбинации липидов описаны в уровне техники, например в заявке на патент США № 62/420421 (подана 10 ноября 2016 года), заявке на патент США № 62/421021 (подана 11 ноября, 2016 года), заявке на патент США № 62/464327 (подана 27 февраля 2017 года) и заявке согласно PCT под названием «Новый состав на основе липидных наночастиц на основе ICE для доставки мРНК» (Novel ICE-based Lipid Nanoparticle Formulation for Delivery of mRNA), поданной 10 ноября 2017 года, раскрытия которых включены в данный документ в их полном объеме посредством ссылки. Выбор катионных липидов, липидов, отличных от катионных, и/или PEG-модифицированных липидов, которые составляют смесь липидов, а также относительного молярного соотношения таких липидов друг с другом основан на характеристиках выбранного(выбранных) липида(липидов) и природе и характеристиках подлежащей инкапсулированию мРНК. К дополнительным факторам, которые необходимо учитывать, относится, например, насыщенность алкильной цепи, а также размер, заряд, pH, pKa, фузогенность и токсичность выбранного(выбранных) липида(липидов). Таким образом, можно соответствующим образом корректировать молярные соотношения.

Образование мРНК-LNP

[127] Ранее был описан способ образования LNP, инкапсулирующих мРНК (мРНК-LNP), путем смешивания описанного выше раствора мРНК с описанным выше раствором липидов с получением раствора для образования LNP, подходящего для образования мРНК-LNP. Например, в патенте США № 9668980 под названием «Инкапсулирование матричной РНК» (Encapsulation of messenger RNA), полное раскрытие которого включено в данный документ во всей своей полноте, предусмотрен способ инкапсулирования матричной РНК (мРНК) в липидные наночастицы путем смешивания раствора мРНК и раствора липидов, где раствор мРНК и/или раствор липидов нагревают до заданной температуры, превышающей температуру окружающей среды, перед смешиванием с образованием липидных наночастиц, которые обеспечивают инкапсуляцию мРНК. Альтернативно, раствор мРНК и раствор липидов можно примешать в раствор для образования LNP, что обеспечивает образование мРНК-LNP без нагревания любого одного или нескольких из раствора мРНК, раствора липидов и раствора для образования LNP.

[128] В случае определенных составов на основе наночастиц из катионных липидов и мРНК для достижения увеличения уровня инкапсулирования мРНК раствор мРНК содержит цитратный буфер. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК с цитратным буфером нагревают, например, до 65 градусов Цельсия. В данных способах или методах необходимо, чтобы нагревание происходило до стадии смешивания раствора мРНК с раствором липидов (т. е. нагревание отдельных компонентов), поскольку было обнаружено, что нагревание после смешивания раствора мРНК с раствором липидов (после образования наночастиц), показано, что нагревание раствора для образования LNP не увеличивает эффективность инкапсулирования мРНК в липидных наночастицах. В некоторых вариантах осуществления один или оба из раствора мРНК и раствора липидов выдерживают и смешивают при температуре окружающей среды.

[129] Используемый в данном документе термин «температура окружающей среды» относится к температуре в комнате или к температуре, которая окружает представляющий интерес объект без нагревания или охлаждения. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды, при которой выдерживают один или более растворов, составляет приблизительно 35°С, 30°C, 25°C, 20°C или 16°C или меньше. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды, при которой выдерживают один или более растворов, находится в диапазоне приблизительно 15-35°C, приблизительно 15-30°C, приблизительно 15-25°C, приблизительно 15-20°C, приблизительно 20-35°C, приблизительно 25-35°C, приблизительно 30-35°C, приблизительно 20-30°C, приблизительно 25-30°C или приблизительно 20-25°C. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды, при которой выдерживают один или более растворов, составляет 20-25°C.

[130] Следовательно, заданная температура, превышающая температуру окружающей среды, как правило, превышает приблизительно 25°C. В некоторых вариантах осуществления заданная температура, подходящая для настоящего изобретения, составляет приблизительно 30°C, 37°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C или 70°C или больше. В некоторых вариантах осуществления заданная температура, подходящая для настоящего изобретения, находится в диапазоне приблизительно 25-70°C, приблизительно 30-70°C, приблизительно 35-70°C, приблизительно 40-70°C, приблизительно 45-70°C, приблизительно 50-70°C или приблизительно 60-70°C. В конкретных вариантах осуществления заданная температура, подходящая для настоящего изобретения, составляет приблизительно 65°C.

[131] В некоторых вариантах осуществления перед смешиванием раствор мРНК или раствор липидов, или как первый, так и второй, можно нагреть до заданной температуры, превышающей температуру окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК и раствор липидов нагревают до заданной температуры отдельно перед смешиванием. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК и раствор липидов смешивают при температуре окружающей среды, а затем после смешивания нагревают до заданной температуры. В некоторых вариантах осуществления раствор липидов нагревают до заданной температуры и смешивают с раствором мРНК при температуре окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК нагревают до заданной температуры и смешивают с раствором липидов при температуре окружающей среды.

[132] В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК нагревают до заданной температуры путем добавления исходного раствора мРНК, имеющего температуру окружающей среды, к нагретому буферному раствору с достижением требуемой заданной температуры.

[133] В некоторых вариантах осуществления перед смешиванием раствор липидов, содержащий растворенные липиды, можно нагреть до заданной температуры, превышающей температуру окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления раствор липидов, содержащий растворенные липиды, отдельно нагревают до заданной температуры перед смешиванием с раствором мРНК. В некоторых вариантах осуществления раствор липидов, содержащий растворенные липиды, смешивают при температуре окружающей среды с раствором мРНК, а затем после смешивания нагревают до заданной температуры. В некоторых вариантах осуществления раствор липидов, содержащий растворенные липиды, нагревают до заданной температуры и смешивают с раствором мРНК при температуре окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления нагревание раствора мРНК, раствора липидов или раствора для образования LNP не происходит до или после стадии смешивания одного или нескольких липидов в растворе липидов с одной или несколькими мРНК в растворе мРНК с образованием мРНК, инкапсулированной в LNP (мРНК-LNP), в растворе для образования LNP.

[134] В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК и раствор липидов смешивают с применением насоса. Поскольку процедура инкапсулирования с таким смешиванием может происходить в широком диапазоне масштабов, для достижения требуемого масштаба можно применять насосы различных типов. Однако обычно требуется применять безимпульсный проточный насос. Используемый в данном документе термин «безимпульсный проточный насос» относится к любому насосу, который может создавать непрерывный поток со стабильной скоростью потока. Типы подходящих насосов могут включать без ограничения шестеренчатые насосы и центробежные насосы. Иллюстративные шестеренчатые насосы включают без ограничения шестеренчатые насосы Cole-Parmer или Diener. Иллюстративные центробежные насосы включают без ограничения насосы, производимые компаниями Grainger или Cole-Parmer.

[135] Раствор мРНК и раствор липидов можно смешивать при различных скоростях потока. Как правило, раствор мРНК можно смешивать при скорости, превышающей скорость для раствора липидов. Например, раствор мРНК можно смешивать со скоростью, которая в по меньшей мере 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x или 20x больше, чем скорость для раствора липидов.

[136] Подходящие скорости потока для смешивания можно определить, исходя из масштабов. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК смешивают при скорости потока приблизительно 40-400 мл/минута, 60-500 мл/минута, 70-600 мл/минута, 80-700 мл/минута, 90-800 мл/минута, 100-900 мл/минута, 110-1000 мл/минута, 120-1100 мл/минута, 130-1200 мл/минута, 140-1300 мл/минута, 150-1400 мл/минута, 160-1500 мл/минута, 170-1600 мл/минута, 180-1700 мл/минута, 150-250 мл/минута, 250-500 мл/минута, 500-1000 мл/минута, 1000-2000 мл/минута, 2000-3000 мл/минута, 3000-4000 мл/минута или 4000-5000 мл/минута. В некоторых вариантах осуществления раствор мРНК смешивают при скорости потока приблизительно 200 мл/минута, приблизительно 500 мл/минута, приблизительно 1000 мл/минута, приблизительно 2000 мл/минута, приблизительно 3000 мл/минута, приблизительно 4000 мл/минута или приблизительно 5000 мл/минута.

[137] В некоторых вариантах осуществления раствор липидов смешивают при скорости потока в диапазоне приблизительно 25-75 мл/минута, 20-50 мл/минута, 25-75 мл/минута, 30-90 мл/минута, 40-100 мл/минута, 50-110 мл/минута, 75-200 мл/минута, 200-350 мл/минута, 350-500 мл/минута, 500-650 мл/минута, 650-850 мл/минута или 850-1000 мл/минута. В некоторых вариантах осуществления раствор липидов смешивают при скорости потока приблизительно 50 мл/минута, приблизительно 100 мл/минута, приблизительно 150 мл/минута, приблизительно 200 мл/минута, приблизительно 250 мл/минута, приблизительно 300 мл/минута, приблизительно 350 мл/минута, приблизительно 400 мл/минута, приблизительно 450 мл/минута, приблизительно 500 мл/минута, приблизительно 550 мл/минута, приблизительно 600 мл/минута, приблизительно 650 мл/минута, приблизительно 700 мл/минута, приблизительно 750 мл/минута, приблизительно 800 мл/минута, приблизительно 850 мл/минута, приблизительно 900 мл/минута, приблизительно 950 мл/минута или приблизительно 1000 мл/минута.

Раствор для составления лекарственного продукта

[138] Настоящее изобретение отчасти основано на неожиданном открытии того, что после смешивания раствора мРНК и раствора липидов с получением раствора для образования LNP, в котором образуются LNP с инкапсулированной мРНК, и последующей замены раствора для образования LNP на раствор, который представляет собой раствор для составления лекарственного продукта (например, 10% трегалозу), уровень инкапсулирования мРНК в LNP может быть дополнительно увеличен путем нагревания раствора для составления лекарственного продукта, который содержит мРНК-LNP, а также некоторую свободную мРНК, которая не была инкапсулирована в растворе для образования LNP.

[139] Замену раствора, содержащего мРНК-LNP, с раствора для образования LNP на раствор для составления лекарственного продукта можно осуществить с помощью любой из ряда методик замены буфера, известных из уровня техники. Например, в некоторых вариантах осуществления данную замену раствора осуществляют путем диафильтрации. В некоторых вариантах осуществления стадия замены раствора для образования LNP на раствор для составления лекарственного продукта с получением мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта сопровождается очисткой и/или концентрированием мРНК-LNP. Можно применять различные способы для осуществления замены раствора вместе с очисткой мРНК-LNP или концентрированием мРНК-LNP в растворе. В некоторых вариантах осуществления раствор заменяют и мРНК-LNP очищают с помощью фильтрации в тангенциальном потоке. Фильтрация в тангенциальным потоке (TFF), также называемая фильтрацией в перекрестном потоке, представляет собой тип фильтрации, где подлежащий фильтрации материал пропускают тангенциально поперек фильтра, а не через него. При TFF пермеат, который не нужен, проходит через фильтр, в то время как ретентат (мРНК-LNP и свободная мРНК), который нужен, проходит вдоль фильтра и собирается после этого. Важно отметить, что в случае TFF материал, который нужен, как правило, содержится в ретентате, что противоположно тому, с чем обычно сталкиваются при традиционной тупиковой фильтрации.

[140] В зависимости от подлежащего фильтрации материала TFF обычно применяют либо для микрофильтрации, либо для ультрафильтрации. Микрофильтрацию, как правило, определяют как случаи, когда фильтр имеет размер пор от 0,05 мкм до 1,0 мкм включительно, тогда как при ультрафильтрации, как правило, задействуют фильтры с размером пор менее 0,05 мкм. Размер пор также определяет номинальные пределы молекулярной массы (NMWL), также называемые границей отсечки по молекулярной массе (MWCO) для конкретного фильтра, при этом микрофильтрационные мембраны, как правило, имеют NMWL более 1000 килодальтон (кДа), а ультрафильтрационные фильтры имеют NMWL от 1 кДа до 1000 кДа.

[141] Основным преимуществом фильтрации в тангенциальном потоке является то, что частицы, в отношении которых фильтр является непроницаемым, которые могут агрегироваться в фильтре и блокировать его (что иногда называют «остатком на фильтре») при традиционной «тупиковой» фильтрации, вместо этого переносятся по поверхности фильтра. Данное преимущество позволяет широко применять фильтрацию в тангенциальном потоке в промышленных способах, при которых необходима непрерывная работа, поскольку время простоя значительно сокращается, потому что обычно не нужно снимать и очищать фильтры.

[142] Фильтрацию в тангенциальном потоке можно применять для нескольких целей, в том числе среди прочего для замены раствора, концентрирования и очистки. Концентрирование представляет собой способ, при котором из раствора удаляют растворитель, при этом остаются молекулы растворенного вещества. Для эффективного концентрирования образца применяют мембрану с NMWL или MWCO, которые существенно ниже молекулярной массы подлежащих удерживанию молекул растворенного вещества. Обычно специалист может выбрать фильтр с NMWL или MWCO в три-шесть раз ниже молекулярной массы целевой(целевых) молекулы(молекул).

[143] Диафильтрация представляет собой способ фракционирования, при котором мелкие частицы, которые не нужны, пропускаются через фильтр, тогда как более крупные наночастицы, которые нужны, сохраняются в ретентате без изменения концентрации данных наночастиц в растворе. Диафильтрацию зачастую применяют для удаления солей или реакционных буферов из раствора. Диафильтрация может быть либо непрерывной, либо периодической. При непрерывной диафильтрации раствор для диафильтрации добавляют к подаваемому образцу с той же скоростью, с которой образуется фильтрат. При периодической диафильтрации раствор сначала разводят, а затем снова концентрируют до исходной концентрации. Периодическую диафильтрацию можно повторять до тех пор, пока не будет достигнута требуемая концентрация наночастиц.

[144] В композицию раствора для составления лекарственного продукта могут входить различные компоненты, встречающиеся в составах лекарственных продуктов. Например, в некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта может содержать буфер, такой как, например, PBS.

[145] В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта может содержать буферное средство или соль. Иллюстративное буферное средство может включать HEPES, сульфат аммония, бикарбонат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия, фосфат калия и фосфат натрия. Иллюстративная соль может включать хлорид натрия, хлорид магния и хлорид калия.

[146] В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, в том числе без ограничения криопротектор. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, в том числе без ограничения одно или более из трегалозы, сахарозы, маннозы, лактозы и маннита. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит трегалозу. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит сахарозу. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит маннозу. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит лактозу. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит маннит.

[147] В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем сахара, такого как трегалоза, сахароза, манноза, лактоза и маннит. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем трегалозы. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем сахарозы. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем маннозы. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем лактозы. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий от 5% до 20% вес/объем маннита.

[148] В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем сахара, такого как трегалоза, сахароза, манноза, лактоза и маннит. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем трегалозы. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем сахарозы. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем маннозы. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем лактозы. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем маннита.

[149] В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта не содержит один или оба из неводного растворителя, такого как этанол и цитрат. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит только остаточный цитрат. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит только остаточный неводный растворитель, такой как этанол. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит менее чем приблизительно 10 мМ (например, менее чем приблизительно 9 мМ, приблизительно 8 мМ, приблизительно 7 мМ, приблизительно 6 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 4 мМ, приблизительно 3 мМ, приблизительно 2 мМ или приблизительно1 мМ) цитрата. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта содержит менее чем приблизительно 25% (например, менее чем приблизительно 20%, приблизительно 15%, приблизительно 10%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2% или приблизительно 1%) неводного растворителя, такого как этанол. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта не требует какой-либо дополнительной последующей обработки (например, замены буфера и/или дополнительных стадий очистки и/или дополнительных вспомогательных веществ) перед лиофилизацией. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта не требует какой-либо дополнительной последующей обработки (например, замены буфера и/или дополнительных стадий очистки и/или дополнительных вспомогательных веществ) перед введением в стерильную емкость флакона, шприца или другого сосуда. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта не требует какой-либо дополнительной последующей обработки (например, замены буфера и/или дополнительных стадий очистки и/или дополнительных вспомогательных веществ) перед введением субъекту.

[150] В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH от pH 4,5 до pH 7,5. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH от pH 5,0 до pH 7,0. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH от pH 5,5 до pH 7,0. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH выше pH 4,5. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH выше pH 5,0. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH выше pH 5,5. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH выше pH 6,0. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта имеет pH выше pH 6,5.

[151] В некоторых вариантах осуществления улучшенный или увеличенный количественный показатель инкапсулирования мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта после нагревания сохраняется после последовательного замораживания-оттаивания раствора для составления лекарственного продукта. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта представляет собой 10% трегалозу и может быть заморожен в стабильном состоянии.

[152] В некоторых вариантах осуществления мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта после нагревания могут быть заморожены в стабильном состоянии (например, с сохранением повышенного уровня инкапсулирования) в приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45% или приблизительно 50% растворе трегалозы. В некоторых вариантах осуществления раствор для составления лекарственного продукта не требует какой-либо последующей очистки или обработки и может храниться в замороженной форме в стабильном состоянии.

Предусмотренные LNP, инкапсулирующие мРНК (мРНК-LNP)

[153] Способ согласно настоящему изобретению в результате обеспечивает более высокую активность и эффективность, что делает возможным применение более низких доз, тем самым сдвигая терапевтический индекс в положительном направлении. В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению в результате обеспечивает получение однородных частиц с малыми размерами. В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению в результате обеспечивает получение однородных частиц с малыми размерами 200 нм или меньше. В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению в результате обеспечивает получение однородных частиц с малыми размерами 150 нм или меньше. В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению в результате обеспечивает получение однородных частиц с малыми размерами, а также значительное повышение эффективности инкапсулирования и/или степени извлечения мРНК по сравнению со способом, известным из уровня техники.

[154] Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрена композиция, содержащая очищенные наночастицы с инкапсулированной мРНК, описанные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления основная доля наночастиц с инкапсулированной мРНК в композиции, т. е. более чем приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% очищенных наночастиц, имеют размер приблизительно 150 нм (например, приблизительно 145 нм, приблизительно 140 нм, приблизительно 135 нм, приблизительно 130 нм, приблизительно 125 нм, приблизительно 120 нм, приблизительно 115 нм, приблизительно 110 нм, приблизительно 105 нм, приблизительно 100 нм, приблизительно 95 нм, приблизительно 90 нм, приблизительно 85 нм или приблизительно 80 нм). В некоторых вариантах осуществления практически все очищенные наночастицы имеют размер приблизительно 150 нм (например, приблизительно 145 нм, приблизительно 140 нм, приблизительно 135 нм, приблизительно 130 нм, приблизительно 125 нм, приблизительно 120 нм, приблизительно 115 нм, приблизительно 110 нм, приблизительно 105 нм, приблизительно 100 нм, приблизительно 95 нм, приблизительно 90 нм, приблизительно 85 нм или приблизительно 80 нм). Описываемый в данном документе иллюстративный способ обычно приводит к получению композиций липидных наночастиц, в которых липидные наночастицы имеют средний размер приблизительно 150 нм или меньше, например от 75 нм до 150 нм, в частности от 100 нм до 150 нм.

[155] Кроме того, с помощью способа по настоящему изобретению получают однородные наночастицы с узким диапазоном размеров частиц. Например, более чем приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% очищенных наночастиц в композиции, предусмотренной настоящим изобретением, имеют размер в диапазоне приблизительно 75-200 нм (например, приблизительно 75-150 нм, приблизительно 75-140 нм, приблизительно 75-135 нм, приблизительно 75-130 нм, приблизительно 75-125 нм, приблизительно 75-120 нм, приблизительно 75-115 нм, приблизительно 75-110 нм, приблизительно 75-105 нм, приблизительно 75-100 нм, приблизительно 75-95 нм, приблизительно 75-90 нм или 75-85 нм). В некоторых вариантах осуществления практически все очищенные наночастицы имеют размер в диапазоне приблизительно 75-200 нм (например, приблизительно 75-150 нм, приблизительно 75-140 нм, приблизительно 75-135 нм, приблизительно 75-130 нм, приблизительно 75-125 нм, приблизительно 75-120 нм, приблизительно 75-115 нм, приблизительно 75-110 нм, приблизительно 75-105 нм, приблизительно 75-100 нм, приблизительно 75-95 нм, приблизительно 75-90 нм или 75-85 нм).

[156] В некоторых вариантах осуществления дисперсность или мера неоднородности по размеру молекул (PDI) наночастиц в композиции, предусмотренной настоящим изобретением, составляет менее чем приблизительно 0,23 (например, менее чем приблизительно 0,3, 0,2, 0,19, 0,18, 0,17, 0,16, 0,15, 0,14, 0,13, 0,12, 0,11, 0,10, 0,09 или 0,08). Описываемый в данном документе иллюстративный способ обычно обеспечивает получение композиций липидных наночастиц с PDI приблизительно 0,15 или меньше, например от приблизительно 0,01 до 0,15.

[157] В некоторых вариантах осуществления более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% наночастиц в композиции, предусмотренной настоящим изобретением, инкапсулируют мРНК в каждой отдельной частице. В некоторых вариантах осуществления практически все наночастицы в композиции инкапсулируют мРНК в каждой отдельной частице.

[158] В некоторых вариантах осуществления LNP согласно настоящему изобретению содержит по меньшей приблизительно 1 мг, 5 мг, 10 мг, 100 мг, 500 мг или 1000 мг инкапсулированной мРНК. В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению обеспечивает в результате более чем приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% извлечение мРНК.

[159] В некоторых вариантах осуществления композиция согласно настоящему изобретению составлена таким образом, чтобы было возможным введение доз субъекту. В некоторых вариантах осуществления композиция на основе LNP с инкапсулированной мРНК, которые описаны в данном документе, составлена с концентрацией дозы менее чем приблизительно 1,0 мг/кг липидных наночастиц с мРНК (например, 0,6 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,016 мг/кг, 0,05 мг/кг и 0,016 мг/кг). В некоторых вариантах осуществления дозу снижают ввиду неожиданного обнаружения того факта, что более низкие дозы обеспечивают высокую активность и эффективность. В некоторых вариантах осуществления дозу снижают на приблизительно 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45% или 40%.

[160] В некоторых вариантах осуществления активность LNP с инкапсулированной мРНК, полученных по настоящему изобретению, является на от более 100% (т. е., на более чем 200%, на более чем 300%, на более чем 400%, на более чем 500%, на более чем 600%, на более чем 700%, на более чем 800% или на более чем 900%) до на более чем 1000% более высокой при получении с включением стадии (c).

ПРИМЕРЫ

[161] Хотя определенные соединения, композиции и способы по настоящему изобретению были описаны конкретно в соответствии с определенными вариантами осуществления, следующие примеры служат исключительно для иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для его ограничения.

Липидные материалы

[162] Составы, описанные в следующем примере, если не указано иное, содержат многокомпонентную смесь липидов с различными соотношениями, в которой используют один или более катионных липидов, вспомогательных липидов (например, липидов, отличных от катионных, и/или липидов на основе холестерина) и пегилированных липидов, предназначенных для инкапсулирования различных материалов на основе нуклеиновых кислот, как рассмотрено ранее.

Пример 1. Увеличенный уровень инкапсулирования мРНК в липидных наночастицах, достигаемый с помощью дополнительной стадии нагревания раствора для составления лекарственного продукта

[163] В данном примере проиллюстрирован иллюстративный способ по настоящему изобретению для обеспечения увеличенного уровня инкапсулирования мРНК в липидной наночастице путем применения способа A и последующей замены раствора для составления LNP, содержащего мРНК-LNP и свободную мРНК, на раствор для составления лекарственного продукта и нагревания такого раствора лекарственного продукта. Используемый в данном документе термин «способ A» относится к традиционному способу инкапсулирования мРНК путем смешивания мРНК со смесью липидов, например, без предварительного образования липидных наночастиц из липидов, как описано в опубликованной заявке на патент США с серийным № US2018/0008680, полное содержание которой включено посредством ссылки.

[164] Иллюстративный способ А составления показан на ФИГ. 1. В данном способе, в некоторых вариантах осуществления, отдельно получали раствор липидов, в котором растворены липиды, являющиеся компонентами LNP (например, раствор, содержащий этанол), и водный раствор мРНК (содержащий цитрат с pH 4,5). В частности, раствор липидов (катионный липид, вспомогательные липиды, цвиттерионные липиды, PEG-липиды и т. д.) получали путем растворения липидов в этаноле. Раствор мРНК получали путем растворения мРНК в цитратном буфере, в результате чего получали мРНК в цитратном буфере с pH 4,5. Затем обе смеси нагревали до 65°C перед смешиванием. Затем эти два раствора смешивали с помощью насосной системы с получением LNP с инкапсулированной мРНК в растворе для образования LNP, содержащем раствор смеси липидов и раствор мРНК. В некоторых случаях два раствора смешивали с помощью системы шестеренчатого насоса. В определенных вариантах осуществления два раствора смешивали с применением «T»-образного участка соединения («Y»-образного участка соединения).

[165] Затем раствор для образования LNP, содержащий мРНК-LNP и свободную мРНК, подвергали диафильтрации с помощью способа TFF. В качестве части данного способа удаляли раствор для образования LNP и заменяли на раствор для составления лекарственного продукта, содержащий 10% трегалозы. Как можно видеть на ФИГ. 2, полученные мРНК-LNP и свободную мРНК в растворе для составления лекарственного продукта затем нагревали до 65°C в течение 15 минут. После нагревания мРНК-LNP и свободную мРНК в растворе для составления лекарственного продукта охлаждали и хранили при 2-8°C для последующего анализа.

[166] Вышеописанный способ инкапсулирования, показанный наФИГ. 2, осуществляли для 12 различных мРНК-LNP, как более подробно описано в представленной ниже таблице 1. В случае каждого тестируемого изделия количество мРНК, инкапсулированной в образованных LNP, измеряли до и после нагревания в растворе для составления лекарственного продукта с 10% трегалозы с применением аналитического набора RiboGreen для измерения свободной РНК согласно опубликованным способам с последующим расчетом для определения инкапсулированной мРНК. Кроме того, тот же анализ применяли для измерения количества мРНК, инкапсулированной в образованных LNP, после последовательного замораживания-оттаивания с целью определения, остается ли увеличенный уровень инкапсулирования, наблюдаемый в результате нагревания мРНК-LNP в составе лекарственного продукта, в целом постоянным при последовательном замораживании-оттаивании мРНК-LNP.

Таблица 1. мРНК-LNP, полученные согласно настоящему изобретению

Тестируемое изделие Катионный липид Соотношение липидов в LNP (катионный липид : PEG-модифицированный липид : холестерин : DOPE) мРНК Уровень инкапсулирования до нагревания, % Уровень инкапсулирования после нагревания, % Уровень инкапсулирования после замораживания-оттаивания, % Размер (нм)/ PDI до нагревания Размер (нм)/ PDI после нагревания 1 Катионный липид №1 40 : 1,5 : 28,5 : 30 FFL 31,6 78,8 Не тестировали 220,3/
0,149 236/
0,129 2 Катионный липид №2 40 : 3 : 25 : 32 OTC 69,9 90,6 Не тестировали 114,9/
0,1 114,7/0,08 3 Катионный липид №3 20 : 1,5 : 48,5 : 30 EPO 75 80 Не тестировали 134/
0,378 125,1/0,213 4 Катионный липид №3 20 : 1,5 : 48,5 : 30 FFL 54 69 Не тестировали 145,7/
0,373 133,6/0,207 5 Катионный липид №4 20 : 1,5 : 48,5 : 30 EPO 35 69 Не тестировали 125,3/
0,088 130,7/0,106 6 Катионный липид №4 20 : 1,5 : 48,5 : 30 FFL 25 58 Не тестировали 134,6/
0,132 137,9/0,117 7 Катионный липид №5 40 : 3 : 25 : 32 OTC 35 91 67,7 120/
0,20 118,5/0,218 8 Катионный липид №5 40 : 5 : 25 : 30 OTC 14,2 77,9 64,9 172,2/
0,215 120,3/0,1 9 Катионный липид №6 40 : 5 : 25 : 30 EPO 58,5 73,1 75,3 116,3/
0,173 117,3/0,15 10 Катионный липид №6 40 : 5 : 25 : 30 FFL 46,3 52,7 52,2 153,8/
0,168 150,9/0,169 11 Катионный липид №7 20 : 1,5 : 48,5 : 30 EPO 29,3 77 62,8 161,9/
0,035 141,2/0,024 12 Катионный липид №7 20 : 1,5 : 48,5 : 30 FFL 13,9 66 55 180,5/
0,028 147,4/0,041

[167] Как можно видеть из таблицы 1 и на ФИГ. 3, % инкапсулирования мРНК, инкапсулированной в образованных LNP, существенно отличался после нагревания в растворе для составления лекарственного продукта по сравнению с таковым непосредственно перед нагреванием в том же растворе для составления лекарственного продукта во всех тестируемых изделиях, которые были подвергнуты оценке. Более того, этот увеличенный уровень инкапсулирования сохранялась даже после последовательного замораживания-оттаивания мРНК-LNP в том же растворе для составления лекарственного продукта.

[168] В целом, из данных в этом примере видно, что для липидных наночастиц с инкапсулированной мРНК, полученных с помощью способа A с последующим нагреванием в растворе для составления лекарственного продукта, имело место существенное увеличение уровня инкапсулирования.

Пример 2. Экспрессия in vivo hEPO, доставляемого с помощью мРНК-LNP после нагревания раствора для составления лекарственного продукта

[169] Данный пример подтверждает, что для липидных наночастиц с инкапсулированной мРНК, полученных с помощью способа A с последующим нагреванием в растворе для составления лекарственного продукта, имело место существенное увеличение уровня инкапсулирования. Более того, данные из настоящего примера свидетельствуют о наличии экспрессии in vivo человеческого EPO (hEPO) у мышей после введения мРНК hEPO, инкапсулированной в липидных наночастицах, полученных согласно настоящему изобретению.

[170] В данном примере мРНК hEPO инкапсулировали в липидных наночастицах, показанных в таблице 2, как описано в примере 1. В случае каждого тестируемого изделия количество мРНК, инкапсулированной в образованных LNP, измеряли до и после нагревания в растворе для составления лекарственного продукта с 10 мМ цитрата в 10% сахарозе при использовании способа, описанного в примере 1.

[171] Как можно видеть из таблицы 2, уровень инкапсулирования в % для мРНК, инкапсулированной в образованных LNP, существенно отличался после нагревания в растворе для составления лекарственного продукта по сравнению с таковым непосредственно перед нагреванием в том же растворе для составления лекарственного продукта во всех тестируемых изделиях (каждое из которых содержало различные катионные липиды), которые были подвергнуты оценке.

[172] Затем мышам внутримышечным путем вводили однократную дозу в количестве 1 мкг/30 мкл липидных наночастиц с инкапсулированной мРНК hEPO, полученных с помощью способа A, после нагревания лекарственного состава. Уровни белка hEPO в сыворотке измеряли через 6 часов и 24 часа после введения.

[173] Уровни белка hEPO в сыворотке мышей после обработки можно применять для оценки активности мРНК при различных способах доставки. Как видно из таблицы 2, состав на основе липидных наночастиц с мРНК hEPO, введенный путем внутримышечной инъекции, приводил в результате к повышению уровней белка hEPO.

Таблица 2. Характеристики и экспрессия мРНК-LNP, полученных согласно настоящему изобретению in vivo

Композиция Размер (нм) PDI Эффективность инкапсулирования до нагревания Эффективность инкапсулирования после нагревания Содержание EPO через 6 часов (нг/мл) Содержание EPO через 24 часа (нг/мл) MATE-GLA4-E16: DMG-PEG: холестерин: DOPE 40:1.5:28,5:30 117 0,18 46% 67% 2,89±0,89 1,54±0,33 MATE-Suc2-E18:2: C8PEG2-церамид: холестерин: DOPE 40:1,5:28,5:30 122 0,48 50% 73% 5,20±0,39 1,17±0,21 MATE-Suc2-E14: C8PEG2-церамид: холестерин: DOPE 40:1,5:13,5:45 119 0,12 63% 75% 10,33±0,74 4,10±0,27

Пример 3. Экспрессия in vivo мРНК, доставляемой путем легочного введения

[174] Данный пример подтверждает, что для липидных наночастиц с инкапсулированной мРНК, полученных с помощью способа A с последующим нагреванием в растворе для составления лекарственного продукта, который применим для широкого спектра катионных липидов, имело место существенное увеличение уровня инкапсулирования. Более того, данные из настоящего примера свидетельствуют о наличии экспрессии in vivo мРНК у мышей после легочного введения мРНК, инкапсулированной в липидных наночастицах, полученных согласно настоящему изобретению.

[175] В данном примере мРНК инкапсулировали в липидных наночастицах, показанных в таблице 3, как описано в примере 1. В случае каждого тестируемого изделия количество мРНК, инкапсулированной в образованных LNP, измеряли до и после нагревания в растворе для составления лекарственного продукта с помощью способа, описанного в примере 1.

Таблица 3. Характеристики мРНК-LNP, полученных согласно настоящему изобретению

Образец Катионный липид Композиция (DMG-PEG2000: катионный липид: холестерин: DOPE) Размер (нм) PDI Эффективность инкапсулирования до нагревания, % Эффективность инкапсулирования после нагревания % A VD-3-DMA 5:40:25:30 66,88 0,19 53 80,9 B Катионный липид №8 5:60:0:35 68 0,127 57 92 C Катионный липид №9 5:60:0:35 55 0,178 56 77 D Катионный липид №10 5:40:25:30 72,09 0,13 29 93 E Катионный липид №11 5:60:0:35 63 0,201 49 86 F TL1-10D-PIP 3:40:25:32 143,2 0,244 63,8 76 G Катионный липид №12 5:60:0:35 71,9 0,193 58 64 H Катионный липид №13 5:60:0:35 64,8 0,152 55,0 89,4 I Катионный липид №14 5:60:0:35 61,1 0,14 53,0 88,2 J Катионный липид №15 5:60:0:35 55 0,224 58 68 K Катионный липид №16 5:60:0:35 50 0,171 44 89 L Катионный липид №17 5:40:25:30 53 0,204 59 89 M Катионный липид №18 5:40:25:30 50 0,258 55 96

[176] Как можно видеть из таблицы 3 и ФИГ. 4, уровень инкапсулирования в % для мРНК, инкапсулированной в образованных LNP, существенно отличался после нагревания в растворе для составления лекарственного продукта по сравнению с таковым непосредственно перед нагреванием в том же растворе для составления лекарственного продукта во всех тестируемых изделиях (каждое из которых содержало различные катионные липиды), которые были подвергнуты оценке.

[177] Затем мышам путем легочной доставки вводили 10 мкг мРНК-LNP, полученных с помощью способа A, после нагревания лекарственного состава. Через 24 часа после введения дозы измеряли уровень флуоресценции экспрессируемого белка. Уровень экспрессии белка, как результат доставленной мРНК, измеряли в единицах ф/с/см²/ср, как видно на ФИГ. 5. Из данных видно, что состав на основе липидных наночастиц с мРНК, вводимый путем легочной доставки, приводил в результате к получению высоких уровней экспрессии белка.

[178] В целом, из данных в этом примере видно, что мРНК-LNP, полученные согласно настоящему изобретению, приводят в результате к высокой эффективности инкапсулирования, что выражается в высокой экспрессии и активности.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

Специалистам в данной области техники известно или они смогут установить с использованием не более чем обычных экспериментов, многочисленные эквиваленты конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанного в данном документе. Объем настоящего изобретения не предназначен для ограничения приведенным выше описанием, а определяется следующей формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Транслейт Био, Инк.

<120> УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ,

ЗАГРУЖЕННЫХ МРНК

<130> MRT-2085WO

<140> PCT/US20/32943

<141> 2020-05-14

<150> 62/847,837

<151> 2019-05-14

<160> 5

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 1065

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 1

augcuguuca accuucggau cuugcugaac aacgcugcgu uccggaaugg ucacaacuuc 60

augguccgga acuucagaug cggccagccg cuccagaaca aggugcagcu caaggggagg 120

gaccuccuca cccugaaaaa cuucaccgga gaagagauca aguacaugcu guggcuguca 180

gccgaccuca aauuccggau caagcagaag ggcgaauacc uuccuuugcu gcagggaaag 240

ucccugggga ugaucuucga gaagcgcagc acucgcacua gacugucaac ugaaaccggc 300

uucgcgcugc ugggaggaca ccccugcuuc cugaccaccc aagauaucca ucugggugug 360

aacgaauccc ucaccgacac agcgcgggug cugucgucca uggcagacgc gguccucgcc 420

cgcguguaca agcagucuga ucuggacacu cuggccaagg aagccuccau uccuaucauu 480

aauggauugu ccgaccucua ccaucccauc cagauucugg ccgauuaucu gacucugcaa 540

gaacauuaca gcucccugaa ggggcuuacc cuuucgugga ucggcgacgg caacaacauu 600

cugcacagca uuaugaugag cgcugccaag uuuggaaugc accuccaagc agcgaccccg 660

aagggauacg agccagacgc cuccgugacg aagcuggcug agcaguacgc caaggagaac 720

ggcacuaagc ugcugcucac caacgacccu cucgaagccg cccacggugg caacgugcug 780

aucaccgaua ccuggaucuc caugggacag gaggaggaaa agaagaagcg ccugcaagca 840

uuucaggggu accaggugac uaugaaaacc gccaaggucg ccgccucgga cuggaccuuc 900

uugcacuguc ugcccagaaa gcccgaagag guggacgacg agguguucua cagcccgcgg 960

ucgcuggucu uuccggaggc cgaaaacagg aaguggacua ucauggccgu gauggugucc 1020

cugcugaccg auuacucccc gcagcugcag aaaccaaagu ucuga 1065

<210> 2

<211> 1239

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 2

augagcagca agggcagcgu ggugcuggcc uacagcggcg gccuggacac cagcugcauc 60

cugguguggc ugaaggagca gggcuacgac gugaucgccu accuggccaa caucggccag 120

aaggaggacu ucgaggaggc ccgcaagaag gcccugaagc ugggcgccaa gaagguguuc 180

aucgaggacg ugagccgcga guucguggag gaguucaucu ggcccgccau ccagagcagc 240

gcccuguacg aggaccgcua ccugcugggc accagccugg cccgccccug caucgcccgc 300

aagcaggugg agaucgccca gcgcgagggc gccaaguacg ugagccacgg cgccaccggc 360

aagggcaacg accaggugcg cuucgagcug agcugcuaca gccuggcccc ccagaucaag 420

gugaucgccc ccuggcgcau gcccgaguuc uacaaccgcu ucaagggccg caacgaccug 480

auggaguacg ccaagcagca cggcaucccc auccccguga cccccaagaa ccccuggagc 540

auggacgaga accugaugca caucagcuac gaggccggca uccuggagaa ccccaagaac 600

caggcccccc ccggccugua caccaagacc caggaccccg ccaaggcccc caacaccccc 660

gacauccugg agaucgaguu caagaagggc gugcccguga aggugaccaa cgugaaggac 720

ggcaccaccc accagaccag ccuggagcug uucauguacc ugaacgaggu ggccggcaag 780

cacggcgugg gccgcaucga caucguggag aaccgcuuca ucggcaugaa gagccgcggc 840

aucuacgaga cccccgccgg caccauccug uaccacgccc accuggacau cgaggccuuc 900

accauggacc gcgaggugcg caagaucaag cagggccugg gccugaaguu cgccgagcug 960

guguacaccg gcuucuggca cagccccgag ugcgaguucg ugcgccacug caucgccaag 1020

agccaggagc gcguggaggg caaggugcag gugagcgugc ugaagggcca gguguacauc 1080

cugggccgcg agagcccccu gagccuguac aacgaggagc uggugagcau gaacgugcag 1140

ggcgacuacg agcccaccga cgccaccggc uucaucaaca ucaacagccu gcgccugaag 1200

gaguaccacc gccugcagag caaggugacc gccaaguga 1239

<210> 3

<211> 4443

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 3

augcaacgcu cuccucuuga aaaggccucg guggugucca agcucuucuu cucguggacu 60

agacccaucc ugagaaaggg guacagacag cgcuuggagc uguccgauau cuaucaaauc 120

ccuuccgugg acuccgcgga caaccugucc gagaagcucg agagagaaug ggacagagaa 180

cucgccucaa agaagaaccc gaagcugauu aaugcgcuua ggcggugcuu uuucuggcgg 240

uucauguucu acggcaucuu ccucuaccug ggagagguca ccaaggccgu gcagccccug 300

uugcugggac ggauuauugc cuccuacgac cccgacaaca aggaagaaag aagcaucgcu 360

aucuacuugg gcaucggucu gugccugcuu uucaucgucc ggacccucuu guugcauccu 420

gcuauuuucg gccugcauca cauuggcaug cagaugagaa uugccauguu uucccugauc 480

uacaagaaaa cucugaagcu cucgagccgc gugcuugaca agauuuccau cggccagcuc 540

gugucccugc ucuccaacaa ucugaacaag uucgacgagg gccucgcccu ggcccacuuc 600

guguggaucg ccccucugca aguggcgcuu cugaugggcc ugaucuggga gcugcugcaa 660

gccucggcau ucugugggcu uggauuccug aucgugcugg cacuguucca ggccggacug 720

gggcggauga ugaugaagua cagggaccag agagccggaa agauuuccga acggcuggug 780

aucacuucgg aaaugaucga aaacauccag ucagugaagg ccuacugcug ggaagaggcc 840

auggaaaaga ugauugaaaa ccuccggcaa accgagcuga agcugacccg caaggccgcu 900

uacgugcgcu auuucaacuc guccgcuuuc uucuucuccg gguucuucgu gguguuucuc 960

uccgugcucc ccuacgcccu gauuaaggga aucauccuca ggaagaucuu caccaccauu 1020

uccuucugua ucgugcuccg cauggccgug acccggcagu ucccaugggc cgugcagacu 1080

ugguacgacu cccugggagc cauuaacaag auccaggacu uccuucaaaa gcaggaguac 1140

aagacccucg aguacaaccu gacuacuacc gaggucguga uggaaaacgu caccgccuuu 1200

ugggaggagg gauuuggcga acuguucgag aaggccaagc agaacaacaa caaccgcaag 1260

accucgaacg gugacgacuc ccucuucuuu ucaaacuuca gccugcucgg gacgcccgug 1320

cugaaggaca uuaacuucaa gaucgaaaga ggacagcucc uggcgguggc cggaucgacc 1380

ggagccggaa agacuucccu gcugauggug aucaugggag agcuugaacc uagcgaggga 1440

aagaucaagc acuccggccg caucagcuuc uguagccagu uuuccuggau caugcccgga 1500

accauuaagg aaaacaucau cuucggcgug uccuacgaug aauaccgcua ccgguccgug 1560

aucaaagccu gccagcugga agaggauauu ucaaaguucg cggagaaaga uaacaucgug 1620

cugggcgaag gggguauuac cuugucgggg ggccagcggg cuagaaucuc gcuggccaga 1680

gccguguaua aggacgccga ccuguaucuc cuggacuccc ccuucggaua ccuggacguc 1740

cugaccgaaa aggagaucuu cgaaucgugc gugugcaagc ugauggcuaa caagacucgc 1800

auccucguga ccuccaaaau ggagcaccug aagaaggcag acaagauucu gauucugcau 1860

gagggguccu ccuacuuuua cggcaccuuc ucggaguugc agaacuugca gcccgacuuc 1920

ucaucgaagc ugauggguug cgacagcuuc gaccaguucu ccgccgaaag aaggaacucg 1980

auccugacgg aaaccuugca ccgcuucucu uuggaaggcg acgccccugu gucauggacc 2040

gagacuaaga agcagagcuu caagcagacc ggggaauucg gcgaaaagag gaagaacagc 2100

aucuugaacc ccauuaacuc cauccgcaag uucucaaucg ugcaaaagac gccacugcag 2160

augaacggca uugaggagga cuccgacgaa ccccuugaga ggcgccuguc ccuggugccg 2220

gacagcgagc agggagaagc cauccugccu cggauuuccg ugaucuccac ugguccgacg 2280

cuccaagccc ggcggcggca guccgugcug aaccugauga cccacagcgu gaaccagggc 2340

caaaacauuc accgcaagac uaccgcaucc acccggaaag ugucccuggc accucaagcg 2400

aaucuuaccg agcucgacau cuacucccgg agacugucgc aggaaaccgg gcucgaaauu 2460

uccgaagaaa ucaacgagga ggaucugaaa gagugcuucu ucgacgauau ggagucgaua 2520

cccgccguga cgacuuggaa cacuuaucug cgguacauca cugugcacaa gucauugauc 2580

uucgugcuga uuuggugccu ggugauuuuc cuggccgagg ucgcggccuc acugguggug 2640

cucuggcugu ugggaaacac gccucugcaa gacaagggaa acuccacgca cucgagaaac 2700

aacagcuaug ccgugauuau cacuuccacc uccucuuauu acguguucua caucuacguc 2760

ggaguggcgg auacccugcu cgcgaugggu uucuucagag gacugccgcu gguccacacc 2820

uugaucaccg ucagcaagau ucuucaccac aagauguugc auagcgugcu gcaggccccc 2880

auguccaccc ucaacacucu gaaggccgga ggcauucuga acagauucuc caaggacauc 2940

gcuauccugg acgaucuccu gccgcuuacc aucuuugacu ucauccagcu gcugcugauc 3000

gugauuggag caaucgcagu gguggcggug cugcagccuu acauuuucgu ggccacugug 3060

ccggucauug uggcguucau caugcugcgg gccuacuucc uccaaaccag ccagcagcug 3120

aagcaacugg aauccgaggg acgauccccc aucuucacuc accuugugac gucguugaag 3180

ggacugugga cccuccgggc uuucggacgg cagcccuacu ucgaaacccu cuuccacaag 3240

gcccugaacc uccacaccgc caauugguuc cuguaccugu ccacccugcg gugguuccag 3300

augcgcaucg agaugauuuu cgucaucuuc uucaucgcgg ucacauucau cagcauccug 3360

acuaccggag agggagaggg acgggucgga auaauccuga cccucgccau gaacauuaug 3420

agcacccugc agugggcagu gaacagcucg aucgacgugg acagccugau gcgaagcguc 3480

agccgcgugu ucaaguucau cgacaugccu acugagggaa aacccacuaa guccacuaag 3540

cccuacaaaa auggccagcu gagcaagguc augaucaucg aaaacuccca cgugaagaag 3600

gacgauauuu ggcccuccgg aggucaaaug accgugaagg accugaccgc aaaguacacc 3660

gagggaggaa acgccauucu cgaaaacauc agcuucucca uuucgccggg acagcggguc 3720

ggccuucucg ggcggaccgg uuccgggaag ucaacucugc ugucggcuuu ccuccggcug 3780

cugaauaccg agggggaaau ccaaauugac ggcgugucuu gggauuccau uacucugcag 3840

caguggcgga aggccuucgg cgugaucccc cagaaggugu ucaucuucuc ggguaccuuc 3900

cggaagaacc uggauccuua cgagcagugg agcgaccaag aaaucuggaa ggucgccgac 3960

gaggucggcc ugcgcuccgu gauugaacaa uuuccuggaa agcuggacuu cgugcucguc 4020

gacgggggau guguccuguc gcacggacau aagcagcuca ugugccucgc acgguccgug 4080

cucuccaagg ccaagauucu gcugcuggac gaaccuucgg cccaccugga uccggucacc 4140

uaccagauca ucaggaggac ccugaagcag gccuuugccg auugcaccgu gauucucugc 4200

gagcaccgca ucgaggccau gcuggagugc cagcaguucc uggucaucga ggagaacaag 4260

guccgccaau acgacuccau ucaaaagcuc cucaacgagc ggucgcuguu cagacaagcu 4320

auuucaccgu ccgauagagu gaagcucuuc ccgcaucgga acagcucaaa gugcaaaucg 4380

aagccgcaga ucgcagccuu gaaggaagag acugaggaag aggugcagga cacccggcuu 4440

uaa 4443

<210> 4

<211> 4443

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 4

augcagcggu ccccgcucga aaaggccagu gucgugucca aacucuucuu cucauggacu 60

cggccuaucc uuagaaaggg guaucggcag aggcuugagu ugucugacau cuaccagauc 120

cccucgguag auucggcgga uaaccucucg gagaagcucg aacgggaaug ggaccgcgaa 180

cucgcgucua agaaaaaccc gaagcucauc aacgcacuga gaaggugcuu cuucuggcgg 240

uucauguucu acgguaucuu cuuguaucuc ggggagguca caaaagcagu ccaaccccug 300

uuguuggguc gcauuaucgc cucguacgac cccgauaaca aagaagaacg gagcaucgcg 360

aucuaccucg ggaucggacu guguuugcuu uucaucguca gaacacuuuu guugcaucca 420

gcaaucuucg gccuccauca caucgguaug cagaugcgaa ucgcuauguu uagcuugauc 480

uacaaaaaga cacugaaacu cucgucgcgg guguuggaua agauuuccau cggucaguug 540

gugucccugc uuaguaauaa ccucaacaaa uucgaugagg gacuggcgcu ggcacauuuc 600

guguggauug ccccguugca agucgcccuu uugaugggcc uuauuuggga gcuguugcag 660

gcaucugccu uuuguggccu gggauuucug auuguguugg cauuguuuca ggcugggcuu 720

gggcggauga ugaugaagua ucgcgaccag agagcgggua aaaucucgga aagacucguc 780

aucacuucgg aaaugaucga aaacauccag ucggucaaag ccuauugcug ggaagaagcu 840

auggagaaga ugauugaaaa ccuccgccaa acugagcuga aacugacccg caaggcggcg 900

uauguccggu auuucaauuc gucagcguuc uucuuuuccg gguucuucgu ugucuuucuc 960

ucgguuuugc cuuaugccuu gauuaagggg auuauccucc gcaagauuuu caccacgauu 1020

ucguucugca uuguauugcg cauggcagug acacggcaau uuccgugggc cgugcagaca 1080

ugguaugacu cgcuuggagc gaucaacaaa auccaagacu ucuugcaaaa gcaagaguac 1140

aagacccugg aguacaaucu uacuacuacg gagguaguaa uggagaaugu gacggcuuuu 1200

ugggaagagg guuuuggaga acuguuugag aaagcaaagc agaauaacaa caaccgcaag 1260

accucaaaug gggacgauuc ccuguuuuuc ucgaacuucu cccugcucgg aacacccgug 1320

uugaaggaca ucaauuucaa gauugagagg ggacagcuuc ucgcgguagc gggaagcacu 1380

ggugcgggaa aaacuagccu cuugauggug auuauggggg agcuugagcc cagcgagggg 1440

aagauuaaac acuccgggcg uaucucauuc uguagccagu uuucauggau caugcccgga 1500

accauuaaag agaacaucau uuucggagua uccuaugaug aguaccgaua cagaucgguc 1560

auuaaggcgu gccaguugga agaggacauu ucuaaguucg ccgagaagga uaacaucguc 1620

uugggagaag gggguauuac auugucggga gggcagcgag cgcggaucag ccucgcgaga 1680

gcgguauaca aagaugcaga uuuguaucug cuugauucac cguuuggaua ccucgacgua 1740

uugacagaaa aagaaaucuu cgagucgugc guguguaaac uuauggcuaa uaagacgaga 1800

auccugguga caucaaaaau ggaacaccuu aagaaggcgg acaagauccu gauccuccac 1860

gaaggaucgu ccuacuuuua cggcacuuuc ucagaguugc aaaacuugca gccggacuuc 1920

ucaagcaaac ucauggggug ugacucauuc gaccaguuca gcgcggaacg gcggaacucg 1980

aucuugacgg aaacgcugca ccgauucucg cuugagggug augccccggu aucguggacc 2040

gagacaaaga agcagucguu uaagcagaca ggagaauuug gugagaaaag aaagaacagu 2100

aucuugaauc cuauuaacuc aauucgcaag uucucaaucg uccagaaaac uccacugcag 2160

augaauggaa uugaagagga uucggacgaa ccccuggagc gcaggcuuag ccucgugccg 2220

gauucagagc aaggggaggc cauucuuccc cggauuucgg ugauuucaac cggaccuaca 2280

cuucaggcga ggcgaaggca auccgugcuc aaccucauga cgcauucggu aaaccagggg 2340

caaaacauuc accgcaaaac gacggccuca acgagaaaag ugucacuugc accccaggcg 2400

aauuugacug aacucgacau cuacagccgu aggcuuucgc aagaaaccgg acuugagauc 2460

agcgaagaaa ucaaugaaga agauuugaaa gaguguuucu uugaugacau ggaaucaauc 2520

ccagcgguga caacguggaa cacauacuug cguuacauca cggugcacaa guccuugauu 2580

uucguccuca ucuggugucu cgugaucuuu cucgcugagg ucgcagcguc acuugugguc 2640

cucuggcugc uugguaauac gcccuugcaa gacaaaggca auucuacaca cucaagaaac 2700

aauuccuaug ccgugauuau cacuucuaca agcucguauu acguguuuua caucuacgua 2760

ggaguggccg acacucugcu cgcgaugggu uucuuccgag gacucccacu cguucacacg 2820

cuuaucacug ucuccaagau ucuccaccau aagaugcuuc auagcguacu gcaggcuccc 2880

auguccaccu ugaauacgcu caaggcggga gguauuuuga aucgcuucuc aaaagauauu 2940

gcaauuuugg augaccuucu gccccugacg aucuucgacu ucauccaguu guugcugauc 3000

gugauugggg cuauugcagu agucgcuguc cuccagccuu acauuuuugu cgcgaccguu 3060

ccggugaucg uggcguuuau caugcugcgg gccuauuucu ugcagacguc acagcagcuu 3120

aagcaacugg agucugaagg gaggucgccu aucuuuacgc aucuugugac caguuugaag 3180

ggauugugga cguugcgcgc cuuuggcagg cagcccuacu uugaaacacu guuccacaaa 3240

gcgcugaauc uccauacggc aaauugguuu uuguauuuga guacccuccg augguuucag 3300

augcgcauug agaugauuuu ugugaucuuc uuuaucgcgg ugacuuuuau cuccaucuug 3360

accacgggag agggcgaggg acgggucggu auuauccuga cacucgccau gaacauuaug 3420

agcacuuugc agugggcagu gaacagcucg auugaugugg auagccugau gagguccguu 3480

ucgagggucu uuaaguucau cgacaugccg acggagggaa agcccacaaa aaguacgaaa 3540

cccuauaaga augggcaauu gaguaaggua augaucaucg agaacaguca cgugaagaag 3600

gaugacaucu ggccuagcgg gggucagaug accgugaagg accugacggc aaaauacacc 3660

gagggaggga acgcaauccu ugaaaacauc ucguucagca uuagccccgg ucagcgugug 3720

ggguugcucg ggaggaccgg gucaggaaaa ucgacguugc ugucggccuu cuugagacuu 3780

cugaauacag agggugagau ccagaucgac ggcguuucgu gggauagcau caccuugcag 3840

caguggcgga aagcguuugg aguaaucccc caaaaggucu uuaucuuuag cggaaccuuc 3900

cgaaagaauc ucgauccuua ugaacagugg ucagaucaag agauuuggaa agucgcggac 3960

gagguuggcc uucggagugu aaucgagcag uuuccgggaa aacucgacuu uguccuugua 4020

gaugggggau gcguccuguc gcaugggcac aagcagcuca ugugccuggc gcgauccguc 4080

cucucuaaag cgaaaauucu ucucuuggau gaaccuucgg cccaucugga cccgguaacg 4140

uaucagauca ucagaaggac acuuaagcag gcguuugccg acugcacggu gauucucugu 4200

gagcaucgua ucgaggccau gcucgaaugc cagcaauuuc uugucaucga agagaauaag 4260

guccgccagu acgacuccau ccagaagcug cuuaaugaga gaucauuguu ccggcaggcg 4320

auuucaccau ccgauagggu gaaacuuuuu ccacacagaa auucgucgaa gugcaagucc 4380

aaaccgcaga ucgcggccuu gaaagaagag acugaagaag aaguucaaga cacgcgucuu 4440

uaa 4443

<210> 5

<211> 1359

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 5

augagcaccg ccgugcugga gaaccccggc cugggccgca agcugagcga cuucggccag 60

gagaccagcu acaucgagga caacugcaac cagaacggcg ccaucagccu gaucuucagc 120

cugaaggagg aggugggcgc ccuggccaag gugcugcgcc uguucgagga gaacgacgug 180

aaccugaccc acaucgagag ccgccccagc cgccugaaga aggacgagua cgaguucuuc 240

acccaccugg acaagcgcag ccugcccgcc cugaccaaca ucaucaagau ccugcgccac 300

gacaucggcg ccaccgugca cgagcugagc cgcgacaaga agaaggacac cgugcccugg 360

uucccccgca ccauccagga gcuggaccgc uucgccaacc agauccugag cuacggcgcc 420

gagcuggacg ccgaccaccc cggcuucaag gaccccgugu accgcgcccg ccgcaagcag 480

uucgccgaca ucgccuacaa cuaccgccac ggccagccca ucccccgcgu ggaguacaug 540

gaggaggaga agaagaccug gggcaccgug uucaagaccc ugaagagccu guacaagacc 600

cacgccugcu acgaguacaa ccacaucuuc ccccugcugg agaaguacug cggcuuccac 660

gaggacaaca ucccccagcu ggaggacgug agccaguucc ugcagaccug caccggcuuc 720

cgccugcgcc ccguggccgg ccugcugagc agccgcgacu uccugggcgg ccuggccuuc 780

cgcguguucc acugcaccca guacauccgc cacggcagca agcccaugua cacccccgag 840

cccgacaucu gccacgagcu gcugggccac gugccccugu ucagcgaccg cagcuucgcc 900

caguucagcc aggagaucgg ccuggccagc cugggcgccc ccgacgagua caucgagaag 960

cuggccacca ucuacugguu caccguggag uucggccugu gcaagcaggg cgacagcauc 1020

aaggccuacg gcgccggccu gcugagcagc uucggcgagc ugcaguacug ccugagcgag 1080

aagcccaagc ugcugccccu ggagcuggag aagaccgcca uccagaacua caccgugacc 1140

gaguuccagc cccuguacua cguggccgag agcuucaacg acgccaagga gaaggugcgc 1200

aacuucgccg ccaccauccc ccgccccuuc agcgugcgcu acgaccccua cacccagcgc 1260

aucgaggugc uggacaacac ccagcagcug aagauccugg ccgacagcau caacagcgag 1320

aucggcaucc ugugcagcgc ccugcagaag aucaaguaa 1359

<---

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен улучшенный способ составления липидных наночастиц и инкапсулирования мРНК, включающий стадию нагревания липидных наночастиц с инкапсулированной мРНК в растворе для составления лекарственного продукта. Изобретение является применимым для обеспечения при изготовлении мРНК-LNP более высокой степени или эффективности инкапсулирования по сравнению с традиционными подходами. 26 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 3 пр.

1. Способ инкапсулирования матричной РНК (мРНК) в липидные наночастицы (LNP), включающий стадии:

(a) смешивания одного или нескольких липидов в растворе липидов с одной или несколькими мРНК в растворе мРНК с образованием мРНК, инкапсулированной в LNP (мРНК-LNP), в растворе для образования липидных наночастиц (LNP), где раствор липидов и/или раствор мРНК нагревают до первой температуры выше температуры окружающей среды до смешивания, или где раствор мРНК и раствор липидов смешивают при температуре окружающей среды и нагревают до первой температуры выше температуры окружающей среды после смешивания, где первая температура составляет от приблизительно 60°C и 70°C;

(b) замены раствора для образования LNP на раствор для составления лекарственного продукта с получением мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта, где раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества; и

(c) нагревания мРНК-LNP в растворе для составления лекарственного продукта до второй температуры выше температуры окружающей среды, где вторая температура составляет от приблизительно 60°C и 70°C;

где эффективность инкапсулирования для мРНК-LNP, полученных на стадии (c), превышает эффективность инкапсулирования для мРНК-LNP, полученных на стадии (b).

2. Способ по п. 1, где на стадии (а) один или более липидов включают один или более катионных липидов, один или более вспомогательных липидов и один или более PEG-модифицированных липидов.

3. Способ по п. 2, где липиды дополнительно включают один или более липидов на основе холестерина, например холестерин.

4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (a) один или более катионных липидов выбраны из cKK-E12, OF-02, C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, ICE (на основе имидазола), HGT5000, HGT5001, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004, HGT4005, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA и DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, 3-(4-(бис(2-гидроксидодецил)амино)бутил)-6-(4-((2-гидроксидодецил)(2-гидроксиундецил)амино)бутил)-1,4-диоксан-2,5-диона, 3-(5-(бис(2-гидроксидодецил)амино)пентан-2-ил)-6-(5-((2-гидроксидодецил)(2-гидроксиундецил)амино)пентан-2-ил)-1,4-диоксан-2,5-диона, N1GL, N2GL, V1GL и их комбинаций.

5. Способ по любому из пп. 2-4, где на стадии (а) один или более вспомогательных липидов выбраны из дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерина (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (POPC), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламина (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилата (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламина (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE), 1,2-диэрукоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DEPE), 16-O-монометил-PE, 16-O-диметил-PE, 18-1-транс-PE, 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламина (SOPE) и их комбинаций.

6. Способ по п. 1, где на стадии (а) один или более PEG-модифицированных липидов содержат цепь полиэтиленгликоля длиной до 2 кДа, до 3 кДа, до 4 кДа или до 5 кДа, ковалентно присоединенную к липиду с алкильной(алкильными) цепью(цепями) длиной C₆-C₂₀.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где липидный компонент раствора липидов состоит из

(a) катионного липида,

(b) вспомогательного липида,

(c) липида на основе холестерина и

(d) PEG-модифицированного липида.

8. Способ по п. 7, где молярное соотношение катионного липида, и вспомогательного липида, и липида на основе холестерина, и PEG-модифицированного липида составляет приблизительно 20-50:25-35:20-50:1-5.

9. Способ по любому из пп. 1-6, где липидный компонент раствора липидов состоит из

(a) катионного липида,

(b) вспомогательного липида,

(c) PEG-модифицированного липида.

10. Способ по п. 9, где катионный липид представляет собой липид на основе холестерина или катионный липид на основе имидазола.

11. Способ по п. 9 или 10, где молярное соотношение катионного липида, и вспомогательного липида, и PEG-модифицированного липида составляет приблизительно 55-65:30-40:1-15.

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где мРНК кодирует белок или пептид.

13. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (c) раствор для составления лекарственного продукта нагревают путем применения в отношении раствора тепла от источника тепла, и раствор выдерживают при второй температуре, превышающей температуру окружающей среды, в течение 10-20 минут.

14. Способ по п. 13, где вторая температура, превышающая температуру окружающей среды, составляет приблизительно 65°C.

15. Способ по любому из предыдущих пунктов, где эффективность инкапсулирования после стадии (c) превышает эффективность инкапсулирования после стадии (b) на по меньшей мере 5% или больше.

16. Способ по любому из предыдущих пунктов, где эффективность инкапсулирования после стадии (c) является повышенной на по меньшей мере 10% или больше по сравнению с эффективностью инкапсулирования после стадии (b).

17. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (а) раствор липидов содержит липиды, растворенные в этаноле.

18. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (а) раствор мРНК содержит мРНК, растворенную в цитратном буфере.

19. Способ по любому из предыдущих пунктов, где раствор для составления лекарственного продукта включает криопротектор.

20. Способ по любому из предыдущих пунктов, где раствор для составления лекарственного продукта дополнительно содержит сахар.

21. Способ по п. 20, где сахар выбран из группы, состоящей из одного или нескольких из трегалозы, сахарозы, маннозы, лактозы и маннита.

22. Способ по п. 21, где сахар предусматривает трегалозу.

23. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (b) раствор для составления лекарственного продукта представляет собой водный раствор, содержащий приблизительно 10% вес/объем трегалозы.

24. Способ по любому из предыдущих пунктов, где в растворе для составления лекарственного продукта отсутствует как этанол, так и цитрат.

25. Способ по любому из предыдущих пунктов, где раствор липидов содержит этанол, раствор мРНК содержит цитрат, и в растворе для составления лекарственного продукта отсутствует как этанол, так и цитрат.

26. Способ по любому из предыдущих пунктов, где раствор мРНК имеет pH менее pH 5,0.

27. Способ по любому из предыдущих пунктов, где раствор для составления лекарственного продукта имеет pH от pH 5,0 до pH 7,0.