Пептиды с противоопухолевой активностью Российский патент 2025 года по МПК C07K7/06 C07K7/08 A61K38/08 A61K38/10 A61P35/00 

Область техники

Изобретение относится к химии органических соединений, фармакологии и медицине и касается новых пептидов, характеризующихся противоопухолевой активностью, которые, в частности, могут использоваться для профилактики и лечения опухолевых заболеваний у субъекта.

Уровень техники

Рак является одним из наиболее распространенных заболеваний во всем мире, и в настоящее время широко используемые методы лечения включают химиотерапию, хирургию, лучевую терапию, трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток и иммунотерапию. Опухоли представляют большую угрозу здоровью человека и до сих пор остаются одним из наиболее опасных заболеваний с высокой смертностью для человека, поэтому открытие новых высокоэффективных и высококачественных противораковых препаратов является важной темой исследований во всем мире. Исследования молекулярных механизмов рака активно ведутся. Несмотря на достигнутый прогресс, многие из разработанных в настоящее время методов лечения основаны на хирургическом вмешательстве.

Пептиды все чаще разрабатываются для использования в качестве терапевтических средств для лечения многих заболеваний, включая рак. Терапевтические пептиды обладают преимуществами целевой специфичности и низкой токсичности. Пептиды могут вызывать гибель клеток посредством многочисленных механизмов, включая разрушение мембраны и последующий некроз, апоптоз, ингибирование опухолевого ангиогенеза, иммунную регуляцию, нарушение клеточных сигнальных путей, регуляцию клеточного цикла, пути восстановления ДНК или пути гибели клеток [Caroline М. Li et al/ Novel Peptide Therapeutic Approaches for Cancer Treatment/ Cells. 2021 Nov; 10(11): 2908].

Из уровня техники известны de novo разработанные пептиды и модифицированные пептиды с противоопухолевой активностью (CN109071622, WO2023277514, WO2021112662). Целый ряд противоопухолевых пептидов в настоящее время находятся на стадии клинических исследований [Wararat Chiangjong et al/ Anticancer peptide: Physicochemical property, functional aspect and trend in clinical application (Review)/ Int J Oncol. 2020 Sep; 57(3): 678-696].

Таким образом, попытки создания новых пептидных молекул с фармакологической активностью представляются целесообразными и актуальными.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка и создание новых эффективных противоопухолевых средств, перспективных для применения в клинической практике для терапии и/или профилактики противоопухолевых заболеваний.

Техническим результатом изобретения является разработка и получение новых пептидных соединений, обладающих противоопухолевым (цитотоксическим и антипролиферативным) действием и являющихся перспективными для применения в терапии опухолевых заболеваний у субъекта, в частности в терапии меланомы, метастатической аденокарциномы поджелудочной железы, карциномы легкого.

Указанный технический результат достигается посредством разработки и создания пептида с противоопухолевой активностью, имеющего последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 13, 14 или 15, или его фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение также включает применение пептида по изобретению в качестве противоопухолевого средства.

Предметом настоящего изобретения также является применение пептида по изобретению для получения фармацевтической композиции с противоопухолевой активностью для лечения и/или профилактики опухолевого заболевания у субъекта.

В частных вариантах воплощения изобретения заболевание представляет собой меланому, метастатическую аденокарциному поджелудочной железы, карциному легкого, рак молочной железы, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак печени, рак пищевода.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека.

Предметом настоящего изобретения также является фармацевтическая композиция с противоопухолевой активностью для лечения и/или профилактики опухолевого заболевания у субъекта, содержащая эффективное количество пептида по изобретению и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В частных вариантах воплощения изобретения фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой носитель, наполнитель и/или растворитель.

В частных вариантах воплощения изобретения заболевание представляет собой меланому, метастатическую аденокарциному поджелудочной железы, карциному легкого, рак молочной железы, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак печени, рак пищевода.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека.

Настоящее изобретение также включает получение соединений (пептидов) по изобретению.

Настоящее изобретение также включает способ лечения и/или профилактики опухолевого заболевания у субъекта, посредством введения субъекту пептида по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению.

Настоящее изобретения также включает способ блокирования и/или ингибирования и/или подавления роста опухоли с помощью пептида по изобретению или фармацевтических композиций по изобретению.

Подробное раскрытие изобретения

Определения и термины

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения. Следующие определения применяются в данном документе, если иное не указано явно.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Термин «необязательный» или «необязательно» или «опциональный» или «опционально», используемый в данном документе, означает, что описываемое впоследствии событие или обстоятельство может, но не обязательно, произойти, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых оно не происходит.

Термин "аминокислота" относится и к природным аминокислотам (включая как L- аминокислоты, так и D- аминокислоты). Аминокислоты обозначают стандартными сокращениями, например: аргинин (Arg; R), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; K), фенилаланин (Phe; F), триптофан (Trp; W), изолейцин (Ile; I), валин (Val; V), пролин (Pro; Р), тирозин (Tyr; Y), метионин (Met; М), серии (Ser; S), аланин (Ala; А), аспарагиновая кислота (Asp; D), глицин (Gly; G).

Термины «изолированный» и «очищенный», применяемые по отношению к веществу (например, пептиду и т.п.), указывают на то, что вещество по существу не содержит, по меньшей мере, ни одно вещество, которое также может входить в натуральный источник. Таким образом, изолированный или очищенный пептид относится к пептиду, который по существу не содержит другой клеточный материал, например, углевод, липид и другие загрязняющие белки из источника клеток или ткани, из которого получают пептид. Если пептид синтезируют химическим путем, изолированный или очищенный пептид относится к пептиду, который по существу не содержит вещество-предшественник или другое химическое вещество. Фраза «по существу не содержит клеточный материал» включает получение пептида, при котором пептид отделяют от клеточных компонентов из клеток, из которых пептид выделен или где он был рекомбинантно произведен. Таким образом, пептид, который по существу не содержит клеточный материал, включает пептидные препараты, которые содержат менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, или 5%, 3%, 2% или 1% (на основании сухой массы) других клеточных материалов.

Если пептид производят рекомбинантным способом, изолированный или очищенный пептид, который по существу не содержит среду для культивирования, и пептид, который по существу не содержит среду для культивирования, включает пептидные препараты, которые содержат среду для культивирования, менее чем приблизительно 20%, 10% или 5%, 3%, 2% или 1% (на основании сухой массы) от объема пептидного препарата.

Альтернативно, если пептид синтезируют химическим путем, изолированный или очищенный пептид по существу не содержит вещество-предшественник или другое химическое вещество, и пептид, который по существу не содержит вещество-предшественник или другое химическое вещество, включает пептидные препараты, которые содержат вещество-предшественник или другие химические вещества, менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5%, 3%, 2% или 1% (на основании сухой массы) от объема пептидного препарата. В предпочтительном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению являются изолированными или очищенными.

Соединения, составляющие суть данного изобретения, могут существовать в меченой радиоизотопом форме, т.е. указанные соединения могут содержать один или несколько атомов, чья атомная масса или массовое число отличается от атомной массы или массового числа наиболее распространенных природных изотопов. Радиоизотопы водорода, углерода, фосфора, хлора включают ³Н, ¹⁴С, ³²Р, ³⁵S, и ³⁶Cl, соответственно. Соединения данного изобретения, которые содержат такие радиоизотопы и/или другие радиоизотопы других атомов, находятся в сфере настоящего изобретения. Тритиевые, т.е. ³Н и углеродные, т.е. ¹⁴С радиоизотопы являются особенно предпочтительными благодаря простоте приготовления и обнаружения.

Соединения настоящего изобретения, меченые радиоактивными изотопами, могут быть получены с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области. Меченые соединения могут быть получены с помощью процедур, описанными здесь, простой заменой немеченых реагентов соответствующими мечеными реагентами.

Соединения настоящего изобретения могут существовать в свободной форме или, если требуется, в виде фармацевтически приемлемой соли или другого производного. Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к таким солям, которые, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д., и отвечают разумному соотношению пользы и риска. Фармацевтически приемлемые соли аминов, карбоновых кислот, фосфонатов и другие типы соединений хорошо известны в медицине. Соли могут быть получены in situ в процессе выделения или очистки соединений изобретения, а также могут быть получены отдельно, путем взаимодействия свободной кислоты или свободного основания соединения изобретения с подходящим основанием или кислотой, соответственно. Примером фармацевтически приемлемых, нетоксичных солей кислот могут служить соли аминогруппы, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная, бромоводородная, фосфорная, серная и хлорная кислоты, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, малеиновая, винная, янтарная или малоновая кислоты, или полученные другими методами, используемыми в данной области, например, с помощью ионного обмена. К другим фармацевтически приемлемым солям относятся адипинат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, глюконат, гемисульфат, гептанат, гексанат, гидройодид, 2-гидрокси-этансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурил сульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, п-толуолсульфонат, ундеканат, валериат и подобные. Типичные соли щелочных и щелочноземельных металлов содержат натрий, литий, калий, кальций, магний и другие. Кроме того, фармацевтически приемлемые соли могут содержать, если требуется, нетоксичные катионы аммония, четвертичного аммония и амина, полученные с использованием таких противоионов, как галогениды, гидроксиды, карбоксилаты, сульфаты, фосфаты, нитраты, низшие алкил сульфонаты и арил сульфонаты.

Пептиды по настоящему изобретению могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковых цепей, фосфорилирование при условии, что такие модификации не разрушают биологическую активность исходного пептида. Другие иллюстративные модификации включают введение D-аминокислот или других миметиков аминокислот, которые можно использовать, например, для увеличения времени полувыведения пептидов из сыворотки.

Заявленные пептиды могут быть включены в состав других крупных молекул (белков, пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов) без изменения их фармакологической активности или с целью придания им новых свойств. Кроме того, производные заявленного пептида могут быть получены путем химической модификации концевых участков аминокислот.

Пептиды по изобретению могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или трет-бутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным концам пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-флуоренилметокси-карбонильная группа может быть размещена на аминных концах пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть добавлена к карбоксильным концам пептидов.

Под «терапевтически эффективным количеством» подразумевается такое количество соединения, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.

Под «профилактически эффективным количеством» подразумевается такое количество соединения, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на профилактику опухолевых заболеваний. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, методики введения препарата, комбинированного применения с другими препаратами и т.п.Для профилактического лечения терапевтически или профилактически эффективное количество представляет собой то количество, которое будет эффективно в предотвращении опухолевого заболевания.

Термин «пациент» («субъект») охватывает все виды млекопитающих, предпочтительно человека, которые используют соединения в рамках данного изобретения как путем самостоятельного введения, так и/или введения пациенту другим лицом для лечения и/или профилактики заболевания или медицинского состояния.

Термины «лечение», «терапия» охватывают лечение патологических состояний у млекопитающих, предпочтительно у человека, и включают: а) блокирование (приостановку) течения заболевания, б) облегчение тяжести заболевания, т.е. индукцию регрессии заболевания.

Термин «профилактика», «предотвращение», «превентивная терапия» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у человека, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Пациенты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания по сравнению с общим населением. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых еще не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.

Термин «уменьшение риска» охватывает терапию, которая снижает частоту возникновения клинической стадии заболевания. Примерами уменьшения риска заболевания является первичная и вторичная профилактика заболевания.

При условии, что способы и композиции по настоящему изобретению пригодны в отношении лечения злокачественной опухоли, лечение считается эффективным, если оно достигает клинических преимуществ, например, уменьшение размера, распространения или метастатических свойств злокачественной опухоли, замедление прогрессирования злокачественной опухоли, ослабление клинических симптомов злокачественной опухоли, продление периода выживания, подавление послеоперационных рецидивов у субъекта. Если лечение применяется профилактически, эффективность означает, что лечение замедляет или предотвращает образование злокачественной опухоли, или предупреждает или ослабляет клинические симптомы злокачественной опухоли. Эффективность определяют по отношению к любым общеизвестным способам для диагностики или лечения конкретного типа опухоли.

При условии, что способы и композиции по настоящему изобретению пригодны в отношении предупреждения (профилактики) злокачественной опухоли, термин предупреждение (профилактика) в настоящем документе включает любую работу, которая облегчает бремя смертности или заболеваемости, ассоциированных со злокачественными опухолями. Предупреждение (профилактику) можно проводить на первичном, вторичном и третичном профилактических уровнях. В то время как первичное предупреждение (профилактика) помогает избежать развития заболевания, вторичное и третичное предупреждение (профилактика) включает в себя предупреждение (профилактику) прогрессирования заболевания и появления симптомов, а также деятельность, предназначенную для снижения неблагоприятных воздействий существующего заболевания путем восстановления функций и уменьшения осложнений, ассоциированных с заболеванием. С другой стороны, предупреждение (профилактика) может включать в себя ослабление тяжести конкретного нарушения, например, обширную профилактическую терапию, предназначенную для уменьшения роста опухоли и метастазирования.

В контексте настоящего изобретения, лечение и/или предупреждение (профилактика) злокачественной опухоли и/или предупреждение (профилактика) ее послеоперационного рецидива включают в себя любое из событий, таких как ингибирование пролиферации злокачественных клеток, регрессию опухоли, инициацию ремиссии и подавление развития злокачественной опухоли, регрессию опухоли, а также уменьшение или ингибирование метастазирования, подавление послеоперационных рецидивов злокачественной опухоли, и продление периода выживания. Эффективное лечение и/или предупреждение (профилактика) злокачественной опухоли снижает смертность, улучшает прогноз индивидуума со злокачественной опухолью, снижает уровень опухолевых маркеров в крови, и облегчает выявляемые симптомы, ассоциированные со злокачественной опухолью. Например, облегчение или улучшение симптомов составляет эффективное лечение и/или предупреждение (профилактику), и включает состояние, при котором симптомы стабильны или улучшены, в частности, на 10%, 20%, 30% или больше.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что пептид, описанный в настоящем документе, может существовать и часто используется в виде своих фармацевтически приемлемых производных, таких как соли, пролекарства, метаболиты, сложные эфиры, простые эфиры, гидраты, полиморфы, сольваты, комплексы, энантиомеры или другие фармацевтически приемлемые производные. Поэтому предполагается, что ссылка на пептид, рассмотренный в настоящем документе, включает такие фармацевтически приемлемые соли, пролекарства, метаболиты, сложные эфиры, простые эфиры, гидраты, полиморфы, сольваты, комплексы, энантиомеры или любые другие их фармацевтически приемлемые производные.

Фармацевтические композиции

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат пептид по изобретению (или про-лекарственную форму, фармацевтически приемлемую соль или другое фармацевтически приемлемое производное) и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента вместе с соединением, составляющим сущность этого изобретения, и которые не разрушают фармакологическую активность этого соединения, и нетоксичны при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения.

Фармацевтические композиции, указанные в этом изобретении, содержат пептиды настоящего изобретения вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут включать любые растворители (в частности, вода), разбавители, дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители и эмульгаторы, консерванты, вяжущие вещества, смазки и т.д., подходящие для конкретной формы дозирования. Материалы, которые могут служить фармацевтическими приемлемыми носителями, включают, но не ограничены, моно - и олигосахариды, а также их производные; желатин; тальк; вспомогательные вещества, такие как масло какао и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое, хлопковое, кунжутное, оливковое, кукурузное и соевое масло и другие; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие какэтилолеат и этиллаурат; агар; буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; депирогенизированная вода; изотонический раствор, раствор Рингера; спиртовые и фосфатные буферные растворы. Также в составе композиции могут быть другие нетоксичные совместимые смазочные вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, разделительные жидкости, пленочные агенты, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать комбинацию двух или более пептидов по настоящему изобретению. Комбинация пептидов может быть в форме коктейля из смешанных пептидов, или они могут быть конъюгированы друг с другом стандартными способами. Например, пептиды могут быть химически связаны или могут экспрессироваться в виде последовательностей одиночного слитого полипептида.

Предметом настоящего изобретения являются также лекарственные формы - класс фармацевтических композиций, структура которых оптимизирована для определенного способа введения в организм в терапевтической эффективной дозе, например, для введения в организм внутривенно, перорально, внутримышечно, подкожно, внутриглазным способом, ингаляционно, интраназально и сублингвально, в рекомендуемых дозировках.

Лекарственные формы этого изобретения могут содержать структуры, полученные методами использования липосом, методами микрокапсулирования, способами получения наноформ лекарственного средства или другими способами, известными в фармацевтике.

Для введения парентеральным способом используются водные суспензии, изотонические физиологические растворы или стерильные растворы для инъекций, совместимые агенты которых содержат фармакологические, например, пропиленгликоль или бутилен гликоль.

В частных вариантах воплощения изобретения, композиции по изобретению могут включать пептид настоящего изобретения, конъюгированный с полиэтиленгликолем, а именно конъюгация N-конца пептида с полиэтиленгликолем (далее - ПЭГ) [ACS Appl. Mater. Interfaces 2020, 12, 41, 46991-47001; https://doi.org/10.1021/acsami.0c13492]. Существуют различные вариации ПЭГ - в зависимости от его молекулярной массы.

Данный подход позволяет снизить иммуногенность, увеличить растворимость и период полувыведения белковых препаратов [Pasut G. Pegylation of biological molecules and potential benefits: pharmacological properties of certolizumab pegol. BioDrugs. 2014;28 Suppl 1:S15-S23. doi:10.1007/s40259-013-0064-z]. ПЭГ обладает высокой растворимостью в воде и многих органических растворителях, нетоксичен и неиммуногенен. ПЭГилирование биологически активных соединений позволяет повысить метаболическую стабильность за счет создания стерических затруднений, которые защищают молекулу от протеаз, и, таким образом, увеличить время циркуляции в условиях in vivo.

Методы терапевтического применения

Соединения настоящего изобретения является противоопухолевыми агентами, и поэтому они являются полезными для лечения и/или профилактики опухолевого заболевания.

Настоящее изобретение относится к способам лечения и/или профилактики злокачественной опухоли и/или профилактики, в частности ее послеоперационного рецидива, которые включают введение субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества пептида по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

В еще одном аспекте изобретение также относится к способам лечения или профилактики опухоли субъекта, включающим введение субъекту эффективного количества пептида по изобретению. В одном варианте воплощения изобретения субъект представляет собой человека, и пептид, согласно изобретению, может быть доставлен внутривенно, внутримышечно, перорально, эпидермально, подкожно, внутрикостно, внутрибрюшинно, внутриглазным способом, ингаляционно, интраназально и/или сублингвально, а также посредством системного введения или местного введения в непосредственной близости от участков-мишеней, но не ограничиваясь перечисленными. В некоторых вариантах воплощения изобретения способ введения включает подкожную или внутривенную инъекцию. Введение можно проводить путем одиночного введения или разделенным на несколько введений.

Злокачественные опухоли, для лечения которых могут применяться пептиды по изобретению, включают рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичников, острый миелолейкоз, хронический миелолейкоз (ХМЛ), лимфому, рак толстого кишечника, рак желудка, рак пищевода, рак печени, меланому, рак легких, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, почечно-клеточную карциному, рак почки, гепатоцеллюлярная карцинома, немелкоклеточный рак легкого и гастроинтестинальные стромальные опухоли, опухоль мягких тканей и т.п., но не ограничиваются вышеуказанными.

Соединение или композиции, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы в целях профилактики. Соответственно, соединение или композиция могут быть введены субъекту, потенциально подверженному риску развития опухолевого заболевания.

Для терапевтического применения соединения изобретения могут вводиться с помощью фармацевтической композиции в любой фармацевтической лекарственной форме любым способом введения. Лекарственные формы обычно включают фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для выбранной конкретной лекарственной формы. В частности, соединение по изобретению может вводиться ежедневно в течение периода времени, необходимого для лечения и/или профилактики заболеваний, имеющих отношение к пациенту, включая курс терапии, длящийся дни, месяцы, годы или всю жизнь пациента. Способы введения включают, но не ограничиваются внутривенно, внутримышечно, перорально, эпидермально, подкожно, внутрикостно, внутрибрюшинно, внутриглазным способом, ингаляционно, интраназально и/или сублингвально. Предпочтительным способом введения является внутривенный.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей ежедневную дозу указанного соединения в форме фиксированной единицы дозировки, и к комбинации, содержащей указанную фармацевтическую композицию или указанное соединение. В предпочтительном варианте осуществления указанную композицию для применения в соответствии с изобретением вводят один раз в день в дозировке 1 мг или более выбранного соединения по изобретению. Предпочтительная дозировка составляет 1-500 мг. Наиболее предпочтительная дозировка составляет 10-200 мг.

Один или несколько дополнительных фармакологически активных агентов могут вводиться в комбинации с пептидом по изобретению. Как правило, любые дополнительные одиночные или множественные активные агенты, отличные от соединений по изобретению, включая, но не ограничиваясь, другими противоопухолевыми лекарственными средствами, антителами, средствами для гормональной терапии и другими, могут использоваться в любой комбинации с соединением по изобретению в одной или отдельной лекарственной форме, позволяющей одновременное или последовательное терапевтическое действие активных агентов.

Осуществление изобретения

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Получение пептида по изобретению

Общие методики получения пептида по изобретению

Для получения пептидов по настоящему изобретению можно использовать хорошо известные способы. Например, для получения пептидов по настоящему изобретению можно использовать технологию рекомбинантных ДНК или химический синтез. Специалист в данной области техники может легко синтезировать пептиды согласно изобретению. Стандартные способы получения синтетических пептидов хорошо известны в данной области техники. Пептиды изобретения могут быть синтезированы с помощью таких обычно используемых способов как t-BOC или FMOC защита альфа-аминогрупп. Оба способа включают ступенчатый синтез, при этом одна аминокислота добавляется на каждой стадии, начиная от карбоксильного конца пептида. Пептиды изобретения также могут быть синтезированы методами твердофазного синтеза пептидов, хорошо известными в данной области техники.

Помимо этого, пептиды по изобретению могут быть получены не только путем химического синтеза, но также с помощью применения биотехнологических методов: могут быть синтезированы нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности аминокислот заявленных пептидов - данные нуклеотидные последовательности могут быть внедрены в клетки (с помощью векторов или нативных нуклеиновых кислот), и трансформированные таким образом клетки могут быть использованы для экспрессии заявленных пептидов. Указанные векторы и нуклеотидные последовательности могут быть введены в организм человека (и других живых организмов) для экспрессии заявленных пептидов непосредственно in vivo. Указанные методы также хорошо известны специалистам в данной области техники.

Пептиды по настоящему изобретению можно выделять из клеток-хозяев или продуктов реакции синтеза, после того как они были произведены в клетках-хозяевах при помощи технологии рекомбинантных ДНК или после того, как они были синтезированы химическим путем. То есть, пептиды по настоящему изобретению можно очищать или изолировать таким образом, что они, по существу, не содержат других белков и их фрагментов из клетки-хозяина, или любых других химических веществ.

Синтез пептидов по изобретению

Пептиды по изобретению синтезированы методом твердофазного Fmoc-синтеза с помощью автоматического синтезатора JBMS-96-A (Jianbang Pharmacy Technology Co.,Ltd.). Пептиды были очищены (чистота >95%) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (табл.2).

Некоторые частные варианты воплощения изобретения раскрыты в таблице 1 ниже.

ВЭЖХ пептидов по изобретению проводили на колонке YMC-Triart С18 (4.6*250mm*5um), элюируя 0,1% трифторуксусной кислоты в 100% воде (растворитель А) и 0,1% трифторуксусной кислоты в 100% ацетонитриле (растворитель В), при скорости потока 1 мл/мин.

Характеристика биологической активности

Для исследования противоопухолевой активности заявленных соединений были использованы следующие линии клеток: SK-MEL-2 (АТСС НТВ-68; злокачественная меланома; ООО «БиолоТ», Россия), метастатическая аденокарцинома поджелудочной железы (AsPC-1; центр коллективного пользования «Коллекция культур клеток позвоночных», Институт Цитологии РАН, Россия) и А549 (карцинома легкого; центр коллективного пользования «Коллекция культур клеток позвоночных», Институт Цитологии РАН, Россия).

Клетки культивировали с добавлением 10% FBS при 37°С и 5% СО₂ в следующих средах: Игла MEM - для линии SK-MEL-2; RPMI 1640 - для AsPC-1; DMEM - для А549. Смену сред осуществляли 2-3 раза в неделю. Клетки пассировали 1:3 по достижении 80-90% конфлюентности монослоя с использованием 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1.

Подсчет клеток проводили при помощи автоматического счетчика Luna-FM с использованием окрашивания трипановым синим. Клетки высаживали на 24-луночные планшеты по 5×10⁴ живых клеток на лунку в 450 мкл среды за 24 ч до внесения исследуемых веществ для формирования монослоя.

После чего растворы исследуемых пептидов вносили по 50 мкл таким образом, чтобы итоговая их концентрация в среде составляла 7 мкг/мл (n=6 повторений) и 70 мкг/мл (n=6 повторений). Для получения положительного контроля вместо действующего вещества в лунки вносили 50 мкл питательной среды с добавлением 10% FBS. Планшеты с пробами помещали на ночь (16 ч) в инкубатор при 37°С и 5% CO₂.

На следующий день для определения жизнеспособности клеток в опытных и контрольной группах использовали набор реактивов EZ4U (модификация теста МТТ). Осуществляли смену среды на 450 мкл свежей среды (Игла MEM или RPMI 1640 или DMEM, для соответствующей клеточной линии) с добавлением 10% FBS, вносили по 50 мкл активированного раствора EZ4U на лунку и инкубировали планшеты в течении 2 ч при 37°С.

Оптическую плотность раствора в лунках планшета измеряли при длине волны 450 нм, вычитая величину оптической плотности при 620 нм, как фоновую, с помощью многофункционального фотометра-имиджера Cytation 1 и выражали в % относительно положительного контроля. Полученные результаты представлены в таблицах 3-5.

Таким образом, результаты исследований, представленные в таблицах 3-5 демонстрируют, что соединения по изобретению характеризуются цитотоксическим и антипролиферативным действием в отношении исследованных клеточных линий. Кроме того, для пептидов АВР40 и NKM9 наблюдается дозозависимое усиление противоопухолевого действия.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к химии органических соединений, фармакологии и медицине и касается новых пептидов, характеризующихся противоопухолевой активностью, которые, в частности, могут использоваться для профилактики и лечения опухолевых заболеваний у субъекта. Кроме того, настоящее изобретение также включает применение пептидов по изобретению для лечения опухолевых заболеваний, а также фармацевтические композиции для лечения опухолевых заболеваний, которые включают пептиды по изобретению. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Пептид с противоопухолевой активностью, или его фармацевтически приемлемая соль, имеющий последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 15.

2. Применение пептида по п.1 в качестве противоопухолевого средства.

3. Применение пептида по п.1 для получения фармацевтической композиции с противоопухолевой активностью для лечения и/или профилактики опухолевого заболевания у субъекта.

4. Применение по п.3, характеризующееся тем, что заболевание представляет собой меланому, метастатическую аденокарциному поджелудочной железы, карциному легкого, рак молочной железы, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак печени, рак пищевода.

5. Применение по п.3, в котором субъект представляет собой человека.

6. Фармацевтическая композиция с противоопухолевой активностью для лечения и/или профилактики опухолевого заболевания у субъекта, содержащая эффективное количество пептида по п. 1 и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

7. Фармацевтическая композиция по п. 6, характеризующаяся тем, что фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой носитель, наполнитель и/или растворитель.

8. Фармацевтическая композиция по п. 6, характеризующаяся тем, что заболевание представляет собой меланому, метастатическую аденокарциному поджелудочной железы, карциному легкого, рак молочной железы, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак печени, рак пищевода.

9. Фармацевтическая композиция по п.6, где субъект представляет собой человека.