Способ клонального микроразмножения копеечника дагестанского Российский патент 2025 года по МПК A01H4/00 

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности, к способам размножения редких и исчезающих, а также лекарственных видов растений, и может быть использовано для массового получения посадочного материала копеечника дагестанского (Hedysarum daghestanicum Rupr. еx Boiss), трудно воспроизводящегося в естественных условиях (занесенного в Красную Книгу РФ и Республики Дагестан), имеющего, как и многие другие представители рода Hedysarum, ценнейший химический состав с широким спектром биологической активности. Полученные растения-регенеранты могут использоваться для пополнения интродукционных коллекций ботанических садов, а также для возвращения в природные места обитания. Растения рода копеечник имеют ценный химический состав и широко используются в народной и традиционной медицине.

Копеечник дагестанский (Hedysarum daghestanicum Rupr. еx Boiss.) -узколокальный эндемик Дагестана, внесенный в Красную книгу РФ (1) и Дагестана (2), уязвимый вид со второй категорией редкости. Бесстебельный стержнекорневой многолетник, произрастающий на сухих известняковых склонах, на каменистых местах в среднем горном поясе на высоте 800 - 1500 м над уровнем моря. Фармакологические свойства растений рода Hedysarum L. обусловлены наличием большого количества химических соединений, обладающих широчайшим спектром биологической активности (3,4). Сапонины, тритерпеноидные сапонины и тритерпены, кумарины, а также фенольные соединения (ксантоны, флавоноиды, птерокарпены, куместаны, бензофураны, оксибензойная и оксикоричная кислоты) считаются основными активными компонентами копеечника (3,5). Применение клонального микроразмножения позволит получить однородный посадочный материал, сократить период размножения культуры, осуществлять размножение круглый год при экономии посадочных площадей.

Известны способы культивирования других видов рода копеечник, однако эффективность клонального микроразмножения и его особенности имеют выраженную видовую и даже сортовую специфику, определяясь как генотипом, так и возрастом материнского растения, особенностями состава среды. Основной способ размножения копеечника дагестанского - семенной, однако семенная продуктивность низкая и семенное возобновление слабое (6).

В настоящее время в культуру in vitro введены некоторые представители рода Hedysarum L.- в частности, копеечник забытый, копеечник альпийский (7). Авторами описаны процедуры получения каллусных тканей и культивирования корней. В то же время для целей клонального микроразмножения предпочтительнее использование прямого органогенеза. Помимо этого, существует способ получения вторичных метаболитов в культуре клеток, тканей и органов копеечника чайного, предполагающий получение каллусных культур, «hairy roots» и растений-регенерантов (8). Введен в культуру in vitro копеечник альпийский, являющийся источником магниферина, из которого получают препарат «Алпизарин» с противовирусной и иммуностимулирующей активностью. Однако в работе описана длительная двухступенчатая стерилизация семян с использованием водного раствора гипохлорита натрия и диацида с предварительным промыванием в мыльной воде для получения стерильных проростков, где выход стерильных проростков составлял 65-98%, а жизнеспособных - 74-77%. Описана регенерация адвентивных побегов копеечника альпийского, где в качестве исходного материала использованы семена, которые подвергали двухэтапной стерилизации, что увеличивает длительность подготовки биоматериала (9).

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ размножения копеечника чайного (Hedysarum theinum Krasnob.) путем получения микропобегов, заключающийся в том, что вызревшие стерильные семена копеечника чайного высаживают на безгормональную среду МС, через 20-30 сут. побеги пересаживают на среду МС с добавлением по 5 мкМ БАП и ГК и 2,5 мг/л кинетина, затем побеги делят и пересаживают на среды с БАП, глютамином и аденин сульфатом (10). Недостатком способа является стерилизация семян сулемой - токсичным препаратом, после которого необходимо длительное промывание семян дистиллированной водой, использование на этапе микроразмножения чередования сред с высоким и низким содержанием БАП, а на этапе укоренения - и гидропонной установки, что не всегда осуществимо.

В результате анализа литературных данных и патентного поиска установлено, что исследования, направленные на разработку способа получения копеечника дагестанского (Hedysarum daghestanicum Rupr. еx Boiss.), отсутствуют.

Заявляемый способ воспроизведения копеечника дагестанского основан на использовании клонального микроразмножения, и включает эффективную схему стерилизации семян перекисью водорода, введения в культуру in vitro на среду МС, содержащую ИМК и БАП, двухэтапного микрочеренкования на среде МС + БАП, укоренения на среде ½ МС + НУК и обработку «Корневином» и «Эпином-Экстра» на этапе адаптации к почвогрунту.

Задача изобретения - разработка способа клонального микроразмножения копеечника дагестанского (Hedysarum daghestanicum Rupr. еx Boiss.). Данный способ основан на использовании в качестве первичного материала семян, упрощения процедуры стерилизации, подбора регуляторов роста для микрочеренковния; использования дополнительной экзогенной обработки регуляторами роста на этапе укоренения и адаптации к почве. Достоинство этого метода состоит в том, что он позволяет ускоренно массово получать посадочный материал копеечника дагестанского (Hedysarum daghestanicum Rupr. еx Boiss).

Достижение технического результата связано с ускоренным получением массового посадочного материала копеечника дагестанского путем использования эффективной и простой схемы стерилизации исходного материала (семян), подбором регуляторов роста для высокой частоты побегообразования и укоренения микропобегов, а также успешной адаптации регенерантов к условиям ex vitro.

Сущность предлагаемого изобретения. Изобретение представляет собой способ размножения растений копеечника дагестанского (Hedysarum daghestanicum Rupr. еx Boiss.) методом культуры in vitro, включающий получение стерильных проростков из обработанных пероксидом водорода семян путем посадки их на среду Мурасиге-Скуга (11), дополненную 0.5 мг/л ИМК и 2.5 мг/л БАП, выделение из них узловых эксплантов и получение из них побегов на такой же среде; последующее микрочеренкование побегов-регенерантов на среде с БАП (0.5 мг/л) при температуре 23-25°С и освещении 3000 лк; их укоренение на среде Мурасиге-Скуга при разбавленной (1/1) минеральной основе и половинной дозе сахарозы с добавлением НУК (2 мг/л); адаптацию пробирочных растений к условиям почвенной культуры (ex vitro) путем промывания их корней раствором «Эпина-экстра», обволакивания в препарате «Корневин» перед помещением в грунт и дальнейшего периодического полива раствором «Эпина-экстра».

Технический результат достигается эффективной и простой схемой стерилизации исходного материала (семян), подбором регуляторов роста для высокой частоты побегообразования и укоренения микропобегов, а также успешной адаптации к условиям ex vitro путем использования обработки «Корневином» и «Эпином-экстра».

Предлагаемый способ реализуют следующим образом:

В качестве первичного материала используют скарфицированные семена, обработанные наждачной бумагой. Замачивают их 5 минут в мыльной воде, затем промывают водопроводной, далее - в стерильных условиях ламинар-бокса в пакетиках из фильтровальной бумаги на 30 сек помещают в этиловый спирт, и затем - в 10 % перекись водорода (H₂O₂) на 10 минут. В других вариантах семена либо не обрабатывали этиловым спиртом, либо экспонировали в пероксиде водорода в течение 5 минут, либо в сулеме (0.1% HgCl₂) в течение 10 минут с последующим трехкратным промыванием дистиллированной водой (15, 10, 5 минут) (таблица 1). Стерильные семена помещают на гормональную среду МС (9), содержащую 0.5 мг/л ИМК и 2.5 мг/л БАП для увеличения выхода стерильных проростков, из которых затем выделяют семядольные узловые экспланты и на этапе собственно размножения помещают их на среду МС, содержащую 0.5 мг/л ИМК и 2.5 мг/л БАП. Полученные микропобеги размножают в трех последующих пассажах на средах с разным гормональным составом (0.5 мг/л БАП; 2.5 мг/л БАП; 0.5 мг/л кинетина; 2.5 мг/л кинетина; 0.5 мг/л ИМК; 0.5 мг/л ИМК + 0.5 мг/л БАП; 0.5 мг/л ИМК + 0.5 мг/л БАП) (таблица 2). Более высокие показатели частоты закладки почек и регенерации побегов, достигающие 100 % и их количества на эксплант, составившие в 1 пассаже к 40 сут. культивирования 8.8 шт. для почек и 7.0 шт. для сформированных побегов, были отмечены на среде с 0.5 мг/л БАП. Побегообразование на узловых эксплантах копеечника дагестанского отражено на фиг. 1.

Далее микропобеги укореняют на среде Мурасиге-Скуга с добавлением НУК (2 мг/л) на среде с разбавленной 1:1 минеральной основой (включающей макро- и микросоли) (фиг. 2). Адаптацию пробирочных растений к условиям почвенной культуры (ex vitro) осуществляют путем тщательного промывания корней (и очищения их от остатков агара) раствором «Эпина-экстра», обволакивания корней пробирочных растений в препарате «Корневин» перед помещением в грунт и дальнейшего периодического полива «Эпином-экстра».

Таблица 1 - Эффективность стерилизации семян копеечника дагестанского для получения асептических проростков

Вещество Время экспозиции Выход стерильных проростков Выход жизнеспособных проростков Н₂О₂,10 % 5 мин 65 65 Н₂О₂,10 % 10 мин 90 90 Этиловый спирт + Н₂О₂ 1 сек + 10 мин 100 100 Сулема, 0.1 % 100 50

Таблица 2 - Морфогенез узловых эксплантов копеечника дагестанского (Hedysarum daghestanicum Rupr. еx Boiss.)

№
пассажа Концентрация гомонов,
мг/л Частота закладки почек, % Кол-во почек на эксплант, шт. Частота регенерации побегов, % Кол-во побегов на эксплант, шт. 1 БАП, 0.5 100 8.8±0.5 100 7.0±0.2 2 БАП, 0.5 100 6.2±0.3 100 4.4±0.2 БАП, 2.5 100 7.6±1.6 80 4.8±0.9 ИМК, 0.5 25 5.0±2.4 25 1.5±0.2 3 БАП, 0.5 100 7.7±1.4 100 3.2±0.5 БАП, 2.5 100 3.5±0.6 100 1.5±0.3 ИМК, 0.5 25 3.5±1.2 25 1.0±0.3 ИМК, 0.5+ БАП 0.5 100 5.0±1.5 80 3.2±0.9 ИМК, 0.5+ БАП, 2.5 100 4.8±0.2 100 2.3±0.2 Кинетин, 0.5 75 4.0±0.4 100 2.5±0.2 Кинетин, 2.5 100 3.5±0.6 100 1.5±0.3

Источники информации:

1. Красная книга Российской Федерации (растения и грибы) / редакционная коллегия: пред.: Ю.П. Трутнев [и др.]. - М.: Товарищество науч. изд. КМК, 2008. - 605 c.: Территория.

2. Красная книга Республики Дагестан / редакционная коллегия: пред.: Карачаев Н.А. [и др.]. - Махачкала: Типография ИП Джамалудинов М.А., 2020. - 800 с.

3. Dong, Y. Phytochemicals and biological studies of plants in genus Hedysarum / Y. Dong, D. Tang, N. Zhang [et al.] // Chemistry Central Journal. 2013. - V. 7, - N 124. - P. 1-13.

4. Имачуева, Д. Р. Фармакогностическое исследование видов рода копеечник, произрастающих на территории Северного Кавказа / Д. Р. Имачуева // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки : материалы IX Международной научно-практической конференции (12-14 декабря 2019., Владикавказ). - Владикавказ, 2019 - С. 98-100.

5. Гусейнов, А.О., Пиняскина Е.В. Алиева З.М. Фитохимический состав и фармакологические свойства видов рода Hedysarum L // Известия Дагестанского ГАУ. - Махачкала: Дагестанский государственный аграрный университет им. М.М. Джамбулатова, - 2023. - № 3 (19). - С. 11-22.

6. Зубаирова Ш.М. Особенности семенной продуктивности Hedysarum daghestanicum Rupr. еx Boiss.. в природных популяциях // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 6-2. - С. 352-355.

7. Ляпкова Н.С., Хадеева Н.В., Шаин С.С., Майсурян А.Н. Разработка методов культивирования тканей копеечника in vitro. // Биотехнология. - 1999. - № 1. - С.55-61.

8. Эрст А.А., Железниченко Т.В., Новикова Т.И., Дорогина О.В., Банаев Е.В. Эколого-географическая изменчивость копеечника чайного и особенности его размножения в культуре in vitro // Сибирский экологический журнал. - 2015. - 21 (1), - С. 87-92.

9. Михович Ж.Э., Скроцкая О.В., Портнягина Н.В. Особенности морфогенеза копеечника альпийского (Hedysarum alpinum L.) в культуре in vitro // Самарский научный вестник. - 2023. - Т. 12, - № 1. - С. 87-92.

10. Тихомирова Л. И., Патент RU2547593C2, 2013-08-14 Способ размножения копеечника чайного (hedysarum theinum krasnob.)

11. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - Киев: Наукова думка, 1980. - 488 с.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения копеечника дагестанского методом культуры in vitro и относится к способам размножения редких и исчезающих, а также лекарственных видов растений. Способ включает получение стерильных проростков Hedysarum daghestanicum из обработанных пероксидом водорода скарифицированных семян путем посадки их на среду Мурасиге-Скуга (МС), дополненную 0.5 мг/л ИМК и 2.5 мг/л БАП; выделение из них узловых эксплантов и получение из последних побегов на такой же среде; последующее микрочеренкование побегов-регенерантов на средах с БАП (0.5 мг/л) при температуре 23-25°С и освещении 3000 лк; их укоренение на среде Мурасиге-Скуга с половинными дозами минеральных солей и сахарозы и с добавлением НУК (2 мг/л) и адаптацию пробирочных растений к условиям почвенной культуры (ex vitro) путем промывания их корней раствором «Эпина-экстра», обволакивания в препарате «Корневин» перед помещением в грунт и дальнейшего периодического полива «Эпином-экстра». Изобретение позволяет получить большое количество выровненного экологически чистого посадочного материала. 2 ил., 2 табл.

Способ клонального микроразмножения копеечника, включающий использование в качестве первичного материала семян, отличающийся тем, что осуществляют микроклональное размножение копеечника дагестанского (Hedysarum daghestanicum Rupr. ex Boiss.), используют скарифицированные семена, обработанные пероксидом водорода, помещают семена на среду Мурасиге-Скуга, дополненную 0.5 мг/л ИМК и 2.5 мг/л БАП; выделяют из них узловые экспланты и получают из последних побеги на такой же среде; последующее микрочеренкование побегов-регенерантов осуществляют на средах с БАП 0.5 мг/л при температуре 23-25°С и освещении 3000 лк; укореняют их на среде Мурасиге-Скуга с половинными дозами минеральных солей и сахарозы и с добавлением НУК (2 мг/л) и адаптируют пробирочные растения к условиям почвенной культуры ex vitro путем промывания их корней раствором «Эпина-экстра», обволакивания в препарате «Корневин» перед помещением в грунт и дальнейшего периодического полива «Эпином-экстра».