АНТИТЕЛА К TIGIT И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 C12N15/13 C12N15/63 A61K39/395 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к антителам к TIGIT и применению этих антител и их композиций в лечении рака.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

TIGIT (иммунорецептор Т-клеток с доменами Ig (иммуноглобулиновый) и ITIM (тирозин-содержащий ингибирующий мотив иммунорецептора)) представляет собой иммунорегуляторный рецептор, состоящий из внеклеточного иммуноглобулинового домена, трансмембранной области I типа и двух мотивов ITIM, экспрессирующийся преимущественно на активированных Т клетках и NK клетках (Stanietsky et al., PNAS.2009, 106, 17858-17863). TIGIT распознает такие лиганды, как рецептор вируса полиомиелита (PVR, CD155) и нектин 2 (PVRL2/CD112), которые сверхэкспрессируются на множестве различных опухолевых клетках. Сообщалось, что TIGIT связывается с лигандом PVR с высокой аффинностью. Связывание TIGIT с лигандом будет активировать ингибиторные сигналы, опосредованные следующими двумя мотивами, присутствующими в цитоплазматическом хвосте TIGIT: тирозин-подобным мотивом хвоста иммунорецептора (ITT) и иммунодоминантным тирозин-содержащим ингибирующим мотивом (ITIM) (Liu et al., Cell death and differentiation 2013, 20, 456-464; Stanietsky et al., European journal of immunology, 2013, 43, 2138-2150). Лиганд поверхности опухолевой клетки, путем связывания с ITIM доменом TIGIT на поверхностях NK клеток и Т клеток, ингибирует цитотоксичность NK клеток и активность Т клеток, и тем самым опосредует механизм иммунной инвазии опухолевых клеток. В ряде патентных документов сообщалось, что антитела к TIGIT, блокирующие связывание TIGIT с его лигандом, могут применяться в лечении таких заболеваний, как опухоли, за счет ингибирования TIGIT-опосредованной иммуносупрессии (WO 2004/024068, WO 2009/126688, WO 2015/009856 и WO 2016/028656).

Существует потребность в разработке других более эффективных, специфичных, безопасных и/или стабильных фармацевтических агентов, которые в отдельности или в комбинации с другими фармацевтическими агентами могут позволять клеткам иммунной системы атаковать опухолевые клетки за счет уменьшения ингибиторной активности человеческого TIGIT.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предложено антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, характеризующиеся наличием последовательности CDR с уникальным составом и способные связываться с TIGIT с высокой аффинностью и высокой специфичностью. Предложенное антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент может применяться в виде монотерапии или в комбинации с другими видами терапии и/или противоопухолевыми фармацевтическими средствами для лечения, например, рака.

В одном аспекте данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с TIGIT с высокой специфичностью.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит от 1 до 3 определяющих комплементарность областей тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1 и 11, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2 и 12, и HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 3 и 13.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12, и HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит от 1 до 3 определяющих комплементарность областей легкой цепи, выбранных из определяющих комплементарность областей легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 6 или 16, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 7 или 17, LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 8 или 18.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 17, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 18.

В некоторых воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и определяющие комплементарность области легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8.

В некоторых воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и определяющие комплементарность области легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12, HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13, LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 17, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 18.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), где вариабельная область тяжелой цепи (VH) содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 4, 14, 21, 23, 25, 27 и 29.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область легкой цепи (VL), где вариабельная область легкой цепи (VL) содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 9, 19, 22, 24, 26, 28 и 30.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 4, 14, 21, 23, 25, 27 и 29, и где VL содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 9, 19, 22, 24, 26, 28 и 30.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 19.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 21, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 28.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30.

В некоторых воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит легкую цепь и/или тяжелую цепь, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи приведена в SEQ ID NO: 31 или 32, и/или аминокислотная последовательность легкой цепи приведена в SEQ ID NO: 32 или 34.

В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела, описанного в данном документе, приведена в SEQ ID NO: 31, и аминокислотная последовательность легкой цепи приведена в SEQ ID NO: 32; или аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела приведена в SEQ ID NO: 33, и аминокислотная последовательность легкой цепи приведена в SEQ ID NO: 34.

В некоторых воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, обладает свойством перекрестного связывания с белками TIGIT человека и яванского макака.

В некоторых воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, обладает свойством блокирования или ингибирования связывания TIGIT с его естественными лигандами PVR или/и PVRL2.

В некоторых воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, блокирует или ингибирует биологическую активность, опосредованную TIGIT.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой мышиное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой целое антитело, одноцепочечное антитело, Fab-антитело, Fab'-антитело, (Fab')2-антитело или биспецифическое (мультиспецифическое) антитело.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой IgG любого подтипа, такого как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

В данном изобретении предложена молекула выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующая вышеупомянутое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В данном изобретении предложен рекомбинантный или экспрессирующий вектор, который содержит одну или более вышеупомянутых последовательностей нуклеиновых кислот, где вектор подходит для рекомбинантной продукции вышеупомянутого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

В данном изобретения предложена клетка-хозяин, которая содержит один или более вышеупомянутых рекомбинантных или экспрессирующих векторов, или одну или более вышеупомянутых молекул нуклеиновой кислоты, или экспрессирует антитело по любому из вышеупомянутых воплощений.

В данном изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая композицию вышеупомянутого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

В некоторых воплощениях вышеупомянутая фармацевтическая композиция дополнительно содержит антагонист оси PD-1.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, обладает по меньшей мере одним из следующих свойств:

1) связывание с человеческим TIGIT с K_D по меньшей мере приблизительно 5 нМ, по меньшей мере приблизительно 1 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,01 нМ или по меньшей мере приблизительно 0,001 нМ;

2) перекрестная реакция с TIGIT яванского макака.

Второй аспект данного изобретения также относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе. Такой способ включает обеспечение молекулы выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, или экспрессирующего вектора, содержащего такую молекулу нуклеиновой кислоты, в частности, вектора для рекомбинантного получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе, в клетке-хозяине.

Третий аспект данного изобретения также относится к клетке-хозяину, содержащей один или более вышеупомянутых рекомбинантных или экспрессирующих векторов, и к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе, где способ включает: культивирование клетки-хозяина и очистку и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

В данном изобретении также предложен способ получения вышеупомянутого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий: культивирование вышеупомянутой клетки-хозяина и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры.

Четвертый аспект данного изобретения также относится к способу лечения рака у субъекта, включающему: введение субъекту эффективного количества любого из антител к TIGIT или их антигенсвязывающих фрагментов или их фармацевтических композиций, описанных в данном документе.

В одном воплощении данное изобретение также относится к применению антител к TIGIT или их антигенсвязывающих фрагментов в изготовлении лекарственного средства для лечения рака у субъекта.

В данном изобретении также предложено применение вышеупомянутого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина или фармацевтической композиции в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения заболевания или расстройства, опосредованного TIGIT, где предпочтительно, заболевание или расстройство представляет собой рак.

Пятый аспект данного изобретения также относится к совместному введению одной или более терапий (например, способов лечения и/или других терапевтических агентов) субъекту, имеющему рак. В некоторых воплощениях вышеупомянутая терапия включает: введение субъекту эффективного количества антитела к TIGIT или его антигенсвязывающего фрагмента или их фармацевтической композиции согласно любому из воплощений, описанных в данном документе. В некоторых воплощениях способы лечения включают хирургическое лечение и лучевую терапию. В некоторых воплощениях вышеупомянутые другие терапевтические агенты выбраны из химиотерапевтических веществ, антагонистов оси PD-1 и других терапевтических агентов, мишенью которых являются опухоли, где предпочтительными являются антагонисты оси PD-1.

В одном воплощении данное изобретение также относится к применению антител к TIGIT или их антигенсвязывающих фрагментов в изготовлении лекарственного средства для лечения рака у субъекта.

В некоторых воплощениях антагонист оси PD-1 выбран из антитела к PD-1, антитела к PD-L1 и антитела к PD-L2.

Шестой аспект данного изобретения также относится к способу определения TIGIT в образце, включающему: а) приведение в контакт образца с любым из антител к TIGIT или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе; и б) определение образования комплекса антитела к TIGIT или его фрагмента с TIGIT. В одном воплощении антитело к TIGIT имеет детектируемую метку.

В некоторых воплощениях данное изобретение относится к набору или изделию, содержащему любое из антител к TIGIT или их фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых воплощениях набор или изделие содержит антитело к TIGIT или его фрагмент, описанный в данном документе, возможно фармацевтически приемлемый эксципиент и возможно один или более других терапевтических агентов (например, химиотерапевтический агент, антагонист оси PD-1 или терапевтический агент, мишенью которого является опухоль).

Данное изобретение также охватывает любую комбинацию воплощений, описанных в данном документе. Любое из описанных воплощений или любая их комбинация применимы к любым антителам к TIGIT или их фрагментам, способам и применениям, описанным в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 проиллюстрировано влияние гибридомных антител на активность Т-клеток при определении в люциферазном тесте.

На Фиг. 2 проиллюстрировано связывание химерных антител с TIGIT при определении методом Elisa.

На Фиг. 3 проиллюстрировано влияние химерных антител на активность Т-клеток при определении в люциферазном тесте.

На Фиг. 4 проиллюстрировано связывание гуманизированных антител с TIGIT при определении методом ELISA.

На Фиг. 5 проиллюстрировано влияние гуманизированных антител на активность Т-клеток при определении в люциферазном тесте.

На Фиг. 6 проиллюстрировано влияние гуманизированных антител на блокирование связывания TIGIT с лигандом PVR при определении методом FACS.

На Фиг. 7 проиллюстрировано исследование эффективности гуманизированных антител к TIGIT и их комбинации с антителом к PD-1 у трансгенных по TIGIT мышей с опухолями МС38.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предложено антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, характеризующиеся наличием последовательности CDR с уникальным составом и способный связываться с TIGIT с высокой аффинностью и высокой специфичностью. Предложенное антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент может применяться в виде монотерапии или в комбинации с другими видами терапии и/или противоопухолевыми фармацевтическими средствами для лечения, например, рака.

Определения

Если не указано иное, при осуществлении данного изобретения используют стандартные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, известные специалистам в области техники.

Для лучшего понимания данного изобретения далее приводятся определения некоторых технических и научных терминов. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют обычное значение, известное специалистам в области, к которой относится данное изобретение. Определения и терминологию, используемую в области техники, специалисты могут найти, в частности, в документе Current Protocolsin Molecular Biology (Ausubel). Для сокращенного обозначения аминокислотных остатков применяются стандартные 3-буквенные и/или 1-буквенные коды, которые используются в области техники для обозначения одной из 20 общепринятых L-аминокислот.Термины в единственном числе, используемые в данном документе (включая формулу изобретения) охватывают их формы во множественном числе, если из контекста явным образом не следует противоположное.

Термин «приблизительно», используемый в комбинации с численным значением, предназначен для того, чтобы охватывать численные значения в диапазоне на 5% ниже от указанной нижней границы и на 5% выше указанной верхней границы.

В данном описании термин «TIGIT», полным названием которого является Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM, относится к любому естественному TIGIT любого позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. Данный термин охватывает «полноразмерный» не прошедший процессинг TIGIT и TIGIT в любой форме, образующейся в результате внутриклеточного процессинга, или любой его фрагмент. Термин также охватывает варианты TIGIT природного происхождения, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. В одном воплощении TIGIT относится к полноразмерному TIGIT человека и яванского макака или его фрагментам (таким как его зрелые фрагменты, лишенные сигнального пептида). В одном воплощении человеческий TIGIT относится к зрелому TIGIT, идентичному последовательности аминокислотных остатков 22-244 (Genbank регистрационный номер NP 776160.2) (SEQ ID NO: 31) (аминокислотные остатки 1-21 являются лидерным пептидом). В одном воплощении человеческий TIGIT относится к внеклеточному домену, идентичному последовательности аминокислотных остатков 22-141 (Genbank регистрационный номер NP 776160.2). В одном воплощении человеческий TIGIT относится к внеклеточному домену, идентичному последовательности аминокислотных остатков 22-245 (Genbank регистрационный номер NP_776160.2).

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» определяют как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в референтной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей (с расстановкой пропусков (гэпов) при необходимости) для достижения наибольшего процента идентичности последовательностей, не принимая какие-либо консервативные замены за часть идентичной последовательности. Для осуществления выравнивания последовательностей могут применяться различные способы, известные в области техники, например, с применением программ, имеющихся в открытом доступе, таких как BLAST, BLAST-2, ALIGN или MEGALIGN (DNASTAR). Специалист в данной области может определить подходящие параметры для выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения наибольшего выравнивания по всей длине выровненных последовательностей.

Термин «иммунный ответ» относится к действию, например, лимфоцитов, антиген-презентирующих клеток, фагоцитов, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых вышеупомянутыми клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), что приводит к избирательному повреждению, деструкции или элиминации из организма человека инвазивных патогенов, клеток или тканей, зараженных патогенами, раковых клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей.

Термин «путь передачи сигнала» или «сигнальная активность» относится к биохимической причинной взаимосвязи, инициируемой взаимодействием белок-белок (таким как связывание фактора роста с рецептором) и приводящей к передаче сигнала из одной части клетки в другую часть клетки. В целом, передача включает специфическое фосфорилирование одного или более остатков тирозина, серина и треонина на одном или более белках в серии реакций, вызывающих передачу сигнала. Предпоследний процесс обычно включает события в ядре, приводящие к изменению экспрессии генов.

Термины «активность» или «биологическая активность» или термины «биологические свойства» или «биологические характеристики» могут использоваться в данном документе взаимозаменяемо и включают аффинность и специфичность эпитопа/антигена, способность нейтрализовать или являться антагонистом активности TIGIT in vivo или in vitro, IC50, стабильность антитела in vivo и иммуногенные свойства антитела, но не ограничиваются перечисленными. Другие идентифицируемые биологические свойства или характеристики антитела, известные в области техники, включают, например, перекрестную реактивность (т.е. перекрестную реактивность с гомологами целевого пептида, не являющимися человеческими, или с другими белками или тканями в целом), и способность поддерживать высокий уровень экспрессии белка в клетках млекопитающих. Вышеупомянутые свойства или характеристики наблюдают, определяют или оценивают с применением методик, хорошо известных в области техники, включая ELISA, FACS или анализ на основе поверхностного плазмонного резонанса с помощью анализатора BIACORE, неограниченные исследования нейтрализации in vitro или in vivo, связывание с рецептором, образование и/или секрецию цитокинов или факторов роста, передачу сигнала и иммуногистохимическое исследование срезов ткани различного происхождения (включая человеческие, приматов или любого другого происхождения).

«Антитело» относится к любой форме антитела, обладающего желаемой биологической активностью. Так, оно используется в самом широком смысле и, в частности, включает, без ограничения, моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), гуманизированные антитела, полностью человеческие антитела, химерные антитела и однодоменные верблюжьи антитела.

«Выделенное антитело» относится к очищенному состоянию связывающегося соединения и в этом случае означает, что молекула по существу свободна от других биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы, или от других материалов, таких как клеточный дебрис или культуральная среда. Термин «выделенный» не означает полного отсутствия таких веществ или отсутствия воды, буферов или солей, за исключением случаев, когда они присутствуют в количествах, которые будут существенно интерферировать с экспериментальным или терапевтическим применением связывающихся соединений, описанных в данном документе.

«Моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве. Моноклональное антитело является высоко специфичным и направлено против единственного эпитопа антигена. Напротив, стандартные препараты (поликлональных) антител обычно включают большое количество антител, направленных против различных эпитопов (или специфичных к различным эпитопам). Прилагательное «моноклональный» указывает на характеристику антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как получение антитела каким-либо конкретным способом.

«Полноразмерное антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, при естественном происхождении содержащей четыре полипептидные цепи, включая две тяжелые (Н) цепи (около 50-70 кДа в полноразмерном виде) и две легкие (L) цепи (около 25 кДа в полноразмерном виде), соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном документе VH) и константной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном документе СН). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в данном документе VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL можно далее подразделить на высоко вариабельные области, определяющие комплементарность (CDR)), и более консервативные области, называемыми каркасными областями (FR), которые перемежаются с CDR. Каждая область VH или VL состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных в следующем порядке в направлении от амино-конца к карбокси-концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающиеся домены, которые взаимодействуют с антигенами. Константные области антитела могут опосредовать связывание иммуноглобулинов с тканями или факторами организма-хозяина, включая связывание различных клеток иммунной системы (например, эффекторных клеток) с первым компонентом (Clq) классического пути комплемента.

«Антигенсвязывающий фрагмент» антитела («родительского антитела») включает фрагмент или производное антитела, как правило, включая по меньшей мере один фрагмент антигенсвязывающей области, или вариабельной области (например, одну или более CDR) родительского антитела, которое сохраняет по меньшей мере некоторую специфичность связывания родительского антитела. Примеры связывающих фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, диатело, линейное антитело, молекулу одноцепочечного антитела, такого как sc-Fv, а также наноантитело и мультиспецифическое антитело, образованное фрагментами антитела, но не ограничиваются ими. Связывающийся фрагмент или производное обычно сохраняет по меньшей мере 10% антигенсвязывающей активности, когда антигенсвязывающая активность выражается на основе молярной концентрации. Предпочтительно, связывающийся фрагмент или производное сохраняет по меньшей мере 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% или более антигенсвязывающей аффинности родительского антитела. Также предполагается, что антигенсвязывающий фрагмент антитела может включать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, которые существенным образом не меняют его биологической активности (обозначаются «консервативными вариантами» или «консервативными функциональными вариантами» антитела). Термин «связывающееся соединение» относится как к антителу, так и к его связывающемуся фрагменту.

«Одноцепочечное Fv» или «scFv» антитело относится к фрагменту антитела, содержащему домены VH и VL антитела, причем эти домены присутствуют в единой полипептидной цепи. В целом, полипептид Fv также содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена.

«Доменное антитело» представляет собой иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, который содержит только вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи. В некоторых случаях две или более областей VH связаны ковалентной связью с пептидным линкером с образованием двухвалентного доменного антитела. Две области VH двухвалентного доменного антитела могут быть нацелены на один и тот же антиген или на различные антигены.

«Двухвалентное антитело» содержит два антигенсвязывающих сайта. В некоторых случаях два сайта связывания обладают одинаковой антигенной специфичностью. Однако, двухвалентное антитело может быть биспецифическим.

«Диатело» относится к небольшому фрагменту антитела, имеющему два антигенсвязывающих сайта и содержащему вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в составе одной полипептидной цепи (VH-VL или VL-VH). Домены принудительно спаривают с комплементарными доменами другой цепи при помощи линкера, длина которого недостаточна для спаривания двух доменов одной и той же цепи, с образованием двух антигенсвязывающих сайтов.

«Химерное антитело» представляет собой антитело, имеющее вариабельные домены первого антитела и константные домены второго антитела, причем первое и второе антитела происходят от разных биологических видов. Обычно вариабельный домен получают от антитела экспериментального животного, такого как грызун («родительское антитело»), а последовательность константного домена получают от человеческого антитела, поэтому менее вероятно, что полученное химерное антитело будет индуцировать нежелательный иммунный ответ у субъекта-человека по сравнению с родительским антителом грызуна.

«Гуманизированное антитело» относится к форме антитела, содержащей последовательности как человеческого антитела, так и антитела, не являющегося человеческим (такого как мышиное или крысиное). Как правило, гуманизированное антитело содержит по существу весь по меньшей мере один, а обычно, два вариабельных домена, в которых гипервариабельные петли целиком или по существу целиком соответствуют таковым иммуноглобулинов, не являющихся человеческими, и каркасные (FR) области целиком или по существу целиком являются таковыми последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) человеческого иммуноглобулина.

«Полностью человеческое антитело» относится к антителу, которое содержит только последовательности иммуноглобулина человека. Полностью человеческое антитело может содержать углеводные цепи мышиного происхождения, если его производит мышь, мышиные клетки или гибридомы, происходящие из мышиных клеток. Аналогично, «мышиное антитело» относится к антителу, которое содержит только последовательности иммуноглобулина мыши. В альтернативном варианте, полностью человеческое антитело может содержать углеводные цепи крысиного происхождения, если его производит крыса, крысиные клетки или гибридомы, происходящие из крысиных клеток. Аналогично, «крысиное антитело» относится к антителу, которое содержит только последовательности иммуноглобулина крысы.

«Изотипы» антител относятся к типам антител (например, IgM, IgE и IgG (таким как IgG1, IgG2 или IgG4)), обусловленным генами константных областей тяжелой цепи. Изотипы также включают модифицированные формы одного из указанных типов, в котором модификации осуществлены для изменения функции Fc, например, для усиления или ослабления эффекторной функции или связывания с рецепторами Fc.

Термин «антагонист оси PD-1» относится к молекуле, которая ингибирует взаимодействие связывающегося лиганда оси PD-1 с одним или более его связывающимися лигандами, тем самым устраняя дисфункцию Т-клеток, являющуюся следствием передачи сигнала от сигнальной оси PD-1, результатом чего является восстановление или усиление функции Т-клеток (например, пролиферации, образования цитокинов и уничтожения клеток-мишеней). В данном описании антагонисты оси PD-1 включают антагонисты PD-1 (например, антитела против PD-1), антагонисты PD-L1 (например, антитела против PD-L1) и антагонисты PD-L2 (например, антитела против PD-L2).

Термин «антагонист PD-1» относится к молекуле, которая уменьшает, блокирует, ингибирует, устраняет или интерферирует с передачей сигнала, являющейся результатом взаимодействия PD-1 с одним или более его связывающимися лигандами (такими как PD-L1 и PD-L2). В некоторых воплощениях антагонист PD-1 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L1 с одним или более его связывающимися лигандами. В некоторых конкретных воплощениях антагонист PD-1 ингибирует связывание PD-1 с PD-L1 и/или PD-L2. Например, антагонист PD-1 включает антитело к PD-1, его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, слитый белок, олигопептид и другие молекулы, которые уменьшают, блокируют, ингибируют, устраняют или интерферируют с передачей сигнала, являющейся результатом взаимодействия PD-1 с PD-L1 и/или PD-L2. В одном воплощении антагонист PD-1 снижает отрицательные костимулирующие сигналы, опосредованные белками или через белки клеточной поверхности, экспрессируемые на Т лимфоцитах (передачу сигнала, опосредованную через PD-1), тем самым делая дисфункциональные Т-клетки менее дисфункциональными (например, усиливая эффекторный ответ на распознавание антигена). В некоторых воплощениях антагонист PD-1 представляет собой антитело к PD-1. В конкретном воплощении антагонист PD-1 представляет собой ниволумаб, пембролизумаб, пидилизумаб или любое антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент, изложенный в WO 2014/206107.

Термин «антагонист PD-L1» относится к молекуле, которая уменьшает, блокирует, ингибирует, устраняет или интерферирует с передачей сигнала, являющейся результатом взаимодействия PD-L1 с одним или более его связывающимися лигандами (такими как PD-1 и В7-1). В некоторых воплощениях он представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L1 с его связывающимися лигандами. В конкретном аспекте антагонист PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 с PD-1 и/или В7-1. В некоторых воплощениях антагонист PD-L1 включает антитело к PD-L1, его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, слитый белок, олигопептид и другие молекулы, которые уменьшают, блокируют, ингибируют, устраняют или интерферируют с передачей сигнала, являющейся результатом взаимодействия PD-L1 с одним или более его связывающимися лигандами (такими как PD-1 и В7-1). В одном воплощении антагонист PD-L1 снижает отрицательные костимулирующие сигналы, опосредованные белками или через белки клеточной поверхности, экспрессируемые на Т-лимфоцитах (передачу сигнала, опосредованную через PD-L1), тем самым усиливая активность Т-клеток (например, усиливая эффекторный ответ на распознавание антигена). В некоторых воплощениях антагонист PD-L1 представляет собой антитело к PD-L1. В конкретном аспекте антитело к PD-L1 представляет собой атезолизумаб, дурвалумаб или любой его антигенсвязывающий фрагмент, изложенный в WO 2018/153320.

Термин «антагонист PD-L2» относится к молекуле, которая уменьшает, блокирует, ингибирует, устраняет или интерферирует с передачей сигнала, являющейся результатом взаимодействия PD-L2 с одним или более его связывающимися лигандами (такими как PD-1). В некоторых воплощениях антагонист PD-L2 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L2 с одним или более его связывающимися лигандами. В конкретном аспекте антагонист PD-L2 ингибирует связывание PD-L2 с PD-1. В некоторых воплощениях антагонист PD-L2 включает антитело к PD-L2, его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, слитый белок, олигопептид и другие молекулы, которые уменьшают, блокируют, ингибируют, устраняют или интерферируют с передачей сигнала, являющейся результатом взаимодействия PD-L2 с одним или более его связывающимися лигандами (такими как PD-1). В одном воплощении антагонист PD-L2 снижает отрицательные ко-стимулирующие сигналы, опосредованные белками или через белки клеточной поверхности, экспрессируемые на Т-лимфоцитах (передачу сигнала, опосредованную через PD-L2), тем самым усиливая активность Т-клеток (например, усиливая эффекторный ответ на распознавание антигена).

Термин «этиглимаб» относится к антителу, идентичному последовательности с регистрационным номером CAS: 2044984-83-8, или антителом его изотипа. В конкретном воплощении этиглимаб имеет изотип IgG4.

Термин «нуклеиновая кислота» или «полинуклеотид» относится к дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) или рибонуклеиновой кислоте (РНК) или их полимерам как в одно-, так и в двуцепочечной форме. Кроме явным образом ограниченных случаев, термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги естественных нуклеотидов, обладающих свойствами связывания, аналогичными таковым референтной нуклеиновой кислоты, и метаболизирующиеся аналогичным способом с естественными нуклеотидами (см. патент US 8278036 (Kariko et al.), в котором изложена молекула мРНК, в которой уридин заменен на псевдоуридин, способ синтеза молекулы мРНК и способ доставки терапевтического белка in vivo). Если не указано иное, подразумевается, что конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также включает ее консервативно модифицированные варианты (например, вырожденные замены кодонов), аллели, ортологи, ОНП и комплементарные последовательности, также как и последовательности, указанные явным образом. В частности, вырожденные замены кодонов могут достигаться путем создания последовательностей, в которых третье положение в одном или более выбранных (или всех) кодонах замещено неоднозначными основаниями и/или остатками дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

«Конструкция» относится к любой рекомбинантной полинуклеотидной молекуле (такой как плазмида, космида, вирус, автономно реплицирующаяся молекула полинуклеотида, фаг или линейная или кольцевая одноцепочечная или двуцепочечная молекула полинуклеотида ДНК или РНК), происходящей из любого источника, способной интегрироваться в геном или реплицироваться автономно и содержащей молекулу полинуклеотида, причем одна или более молекул полинуклеотида функционально соединены (т.е. функционально связаны). Рекомбинантная конструкция обычно содержит полинуклеотид по данному изобретению, функционально связанный с последовательностями, регулирующими инициацию транскрипции, которые будут направлять транскрипцию полинуклеотида в клетке-хозяине. Для направления экспрессии нуклеиновых кислот по данному изобретению можно использовать как гетерологичнные, так и негетерологичные (т.е. эндогенные) промоторы.

«Вектор» относится к любой рекомбинантной полинуклеотидной конструкции, которая может применяться в целях трансформации (т.е. внедрения гетерологичной ДНК в клетку-хозяина). Одним типом вектора является «плазмида», которая относится к двуцепочечной петле ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вектор на основе вируса, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в геном вируса. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их внедряют (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при внедрении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном документе обозначают «экспрессирующими векторами».

Термин «экспрессирующий вектор» в данном документе относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной реплицироваться и экспрессировать целевой ген после трансформации, трансфекции или трансдукции клетки-хозяина. Экспрессирующий вектор содержит один или более маркеров селекции по фенотипу и ориджин репликации для обеспечения поддержания вектора и осуществления репликации в хозяине при необходимости.

Если не указано или явным образом не следует из контекста иное, «активация», «стимуляция» и «воздействие» для клетки или рецептора могут иметь одинаковое значение. Например, клетку или рецептор активируют, стимулируют или воздействуют на них лигандом. «Лиганды» включают естественные и синтетические лиганды, такие как цитокины, варианты цитокинов, аналоги, мутантные белки и связывающиеся соединения, являющиеся производными антител. «Лиганды» также включают небольшие молекулы, такие как пептидомиметики цитокинов и пептидомиметики антител. «Активация» может относиться к активации клетки, регулируемой внутренними механизмами и внешними факторами или факторами окружающей среды. «Ответ/реакция», например, ответ клетки, ткани, органа или организма включает изменения в биологическом или физиологическом поведении (например, концентрации, плотности, адгезии или миграции, степени экспрессии генов или степени дифференцировки в составе биологического компартмента), где изменения связаны с активацией, стимуляцией или воздействием или связаны с внутренним механизмом, таким как генетическое программирование.

В данном описании термин «лечить», «проводить лечение» или «лечение» любого заболевания или расстройства относится в одном воплощении к смягчению заболевания или расстройства (т.е. замедлению или остановке или уменьшению прогрессирования заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом воплощении «лечить», «проводить лечение» или «лечение» относится к смягчению или ослаблению по меньшей мере одного физического параметра, включая такие физические параметры, которые могут не различаться пациентом. В другом воплощении «лечить», «проводить лечение» или «лечение» относится к физическому (например, стабилизации различимых симптомов), физиологическому (например, стабилизации физиологических параметров) изменению заболевания или расстройства или к тому и другому. В случае когда это не описано напрямую, способы для оценки лечения и/или предупреждения заболевания обычно хорошо известны в области техники.

«Субъект» включает любого человека или животного, не являющегося человеком. Термин «животное, не являющееся человеком» включает всех позвоночных, например, млекопитающих и не млекопитающих, таких как приматы, не являющиеся человеком, овцы, собаки, кошки, лошади, домашний скот, куры, амфибии и рептилии. В данном документе термин «cyno» относится к яванскому макаку.

Введение «в комбинации с» одним или более чем одним терапевтическим агентом включает одновременное (совместное) введение и последовательное введение в любом порядке.

«Терапевтически эффективное количество», «терапевтически эффективная доза» и «эффективное количество» относятся к количеству антитела к TIGIT или его антигенсвязывающему фрагменту, изложенным в данном документе, которое эффективно для предупреждения или смягчения одного или более симптомов заболевания или состояния или прогрессирования заболевания или состояния при введении в отдельности или в комбинации с другими терапевтическими средствами в клетку, ткань или субъекту. Терапевтически эффективная доза также относится к количеству антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, достаточному для того, чтобы вызвать смягчение симптомов, например, к количеству для лечения, излечения, предупреждения или смягчения связанного состояния, или способствующему лечению, излечению, предупреждению или смягчению такого состояния. Когда активный ингредиент вводят индивидууму в виде монотерапии, терапевтически эффективная доза относится к количеству ингредиента. В случае введения в комбинации терапевтически эффективная доза относится к объединенному количеству активных ингредиентов, обеспечивающему терапевтический эффект, независимо от того, вводят ли активные ингредиенты в комбинации, последовательно или одновременно. Эффективное количество терапевтического агента будет приводить к увеличению диагностического индекса или параметров по меньшей мере на 10%, обычно по меньшей мере на 20%, предпочтительно, по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 50%.

«Рак» и «раковый» относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Данное определение охватывает доброкачественные и злокачественное новообразования, а также спящие опухоли или микрометастазы. Примеры рака включают карциному, лимфому, лейкоз, бластому, саркому и лейкоз, но не ограничиваются ими. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточную карциному, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого), рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка или желудочный рак (включая рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак толстой и прямой кишки, рак эндометрия или рак матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак печени и различные типы рака головы и шеи, а также В-клеточную лимфому (включая фолликулярную неходжкинскую лимфому (НХЛ) низкой степени злокачественности, НХЛ из малых лимфоцитов (МЛ), фолликулярную НХЛ средней степени злокачественности, диффузную НХЛ средней степени злокачественности, иммунобластную НХЛ высокой степени злокачественности, лимфобластную НХЛ высокой степени злокачественности, мелкоклеточную НХЛ с нерассеченными ядрами высокой степени злокачественности, НХЛ с массивным поражением лимфоузлов, лимфому из мантийных клеток, СПИД-ассоциированные лимфомы и макроглобулинемию Вальденстрема), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), острый лимфобластный лимфолейкоз (ОЛЛ), волосатоклеточный лейкоз, хронический миелобластный лейкоз, пост-трансплантационные лимфопролиферативные расстройства (ПТЛР) и аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозом, отеком (например, связанную с опухолями мозга) и синдром Мейгса.

Антитело к TIGIT и его получение

Термины «антитело к ТЮ1Т», «анти-TIGIT», «антитело против TIGIT» или «антитело, связывающееся с TIGIT» относятся к антителу, которое способно связываться с белком TIGIT или его фрагментом с достаточной аффинностью, так что антитело может применяться в качестве диагностического и/или терапевтического агента, мишенью которого является TIGIT.

Для получения изложенного в данном документе антитела может применяться любой подходящий способ получения антител. В качестве иммуногена (антигена) для получения антитела может применяться TIGIT в любой подходящей форме. В качестве примера, а не ограничения, в качестве иммуногена может применяться любой вариант TIGIT или его фрагмент. В некоторых воплощениях клетки гибридомы, продуцирующие мышиные моноклональные антитела к человеческому TIGIT, могут быть получены способами, известными в области техники. Эти способы включают гибридомные технологии, первоначально описанные Kohler et al., (1975) (Nature 256:495-497), но не ограничиваются ими. Предпочтительно, выделяют спленоциты мыши и сливают с клетками миеломы мыши с применением ПЭГ или методом электрошока согласно стандартным схемам. Затем проводят скрининг клеток гибридомы, секретирующих антитело, обладающее ингибирующей TIGIT активностью. Последовательность ДНК вариабельной области иммуноглобулина клеток гибридомы, изложенной в данном документе, можно определять при помощи метода на основе ПЦР с вырожденными праймерами.

Антитела, происходящие от грызунов (например, мыши) могут индуцировать нежелательную иммуногенность антител при применении в качестве терапевтических агентов in vivo. Повторное применение антител индуцирует в человеческом организме иммунный ответ на терапевтические антитела. Такие иммунные ответы приводят по меньшей мере к потере терапевтической эффективности, а в тяжелых случаях к аллергической реакции с возможным летальным исходом. Один из способов снижения иммуногенности антител грызунов включает получение химерных антител, когда вариабельную область мышиного происхождения сливают с константной областью человеческого происхождения (Liu et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-43). Однако, сохранение интактной вариабельной области грызунов в химерном антителе может по-прежнему вызывать опасную иммуногенность у пациентов. Пересадка петель областей, определяющих комплементарность (CDR), вариабельного домена грызунов на каркасную область человеческого происхождения (т.е., гуманизация) применялась для дальнейшей минимизации последовательностей грызунов (Jones et al., (1986) Nature 321:522; Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534).

В некоторых воплощениях химерные или гуманизированные антитела, изложенные в данном изобретении, могут быть получены на основе последовательностей моноклональных антител, полученных в мышиных гибридомах. ДНК, кодирующая тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина, может быть получена из целевой мышиной гибридомы и модифицирована стандартными молекулярно-биологическими методами таким образом, чтобы содержать последовательность иммуноглобулина, не являющегося мышиным (например, человеческого).

В некоторых воплощениях химерные тяжелые цепи и химерные легкие цепи для химерных антител к TIGIT, описанных в данном документе, могут быть получены путем функционального связывания вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей иммуноглобулина, происходящего из гибридомы, с константными областями человеческого IgG, соответственно, с применением способов, известных в области техники (см., например, патент US No.4,816,567 (Cabilly et al.)). В некоторых воплощениях химерные антитела, изложенные в данном документе, содержат константные области, которые могут быть выбраны из человеческих IgG любого подтипа, таких как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, предпочтительно, IgG4.

В некоторых воплощениях химерные антитела к TIGIT, изложенные в данном документе, могут быть получены путем «смешивания и комбинирования» плазмиды, экспрессирующей химерную легкую цепь, с плазмидой, экспрессирующей химерную тяжелую цепь, для трансфекции экспрессирующих клеток. Связывание с TIGIT таких антител, полученных путем «смешивания и комбинирования», можно оценивать с применением вышеуказанных анализов связывания и других стандартных анализов связывания (например, ELISA).

Точные аминокислотные границы CDR вариабельных областей антител, изложенных в данном документе, можно определять с применением любой из хорошо известных схем, включая предложенную Chothia, основанную на трехмерной структуре антител и топологии петель CDR (Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; A1-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273:927-948 (1997)), предложенную Kabat, основанную на вариабельности последовательности антитела (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)), AbM (University of Bath), Contact (University College London), международной базы данных ImMunoGeneTics (IMGT) (1999 Nucleic Acids Research, 27, 209-212) и определения CDR, предложенного North, основанного на кластеризации методом распространения близости (affinity propagation) с использованием большого числа кристаллических структур. Границы CDR антител, изложенных в данном документе, могут быть определены специалистом в области техники согласно любой схеме (например, различным системам присваивания или комбинирования), известной из уровня техники.

Следует отметить, что границы CDR вариабельных областей одного и того же антитела, полученные на основе различных систем присваивания, могут различаться. Это означает, что последовательности CDR вариабельных областей одного и того же антитела, установленные с применением различных систем присваивания, различаются. Таким образом, когда речь заходит об определении антитела с конкретными последовательностями CDR, определенными в данном изобретении, антитело также охватывает антитела, последовательности вариабельных областей которых содержат конкретные последовательности CDR, но чьи заявленные границы CDR отличаются от конкретных границ CDR, определенных в данном изобретении, вследствие использования различных схем (например, различных систем присваивания или комбинирования).

Антитела с различной специфичностью (например, с разными сайтами связывания к разным антигенам) имеют разные CDR. Однако, хотя CDR варьируют от антитела к антителу, в связывании антигена принимает участие только ограниченное число аминокислотных положений в CDR. Наименьшую перекрывающуюся область можно определить с применением по меньшей мере двух методов из методов Kabat, Chothia, AbM, Contact и North, таким образом получая «наименьшую связывающуюся единицу» для связывания антигена. Наименьшая связывающаяся единица может быть частью CDR. Специалистам в области техники будет очевидно, что остатки в остальной части последовательностей CDR можно определять по структуре антитела и укладке белка. Следовательно, варианты любых CDR, представленных в данном документе, также входят в объем данного изобретения. Например, в варианте одного CDR аминокислотный остаток наименьшей связывающейся единицы может оставаться неизменным, тогда как остальные остатки CDR, определенные согласно Kabat или Chothia, могут быть замещены консервативными аминокислотными остатками.

Для гуманизированных антител, описанных в данном документе, области CDR мышиного происхождения могут быть встроены в каркасные области человеческих первичных иммуноглобулинов с применением способов, известных в области техники. См. патент US №5225539 (Winter et al.) и патенты US №5530101, 5585089, 5693762 и 6180370 (Queen et al.). Вкратце, авторы изобретения находили в базе данных генов иммуноглобулинов человека NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) последовательности генов первичных IgG человека, гомологичные последовательностям кДНК вариабельных областей мышиного антитела, и, в принципе, гуманизация достигалась путем пересадки выбранных CDR. Однако замена петли CDR все еще не позволяет всегда получать антитела с такими же свойствами связывания, как и у исходного антитела. Зачастую требуются замены каркасных остатков (FR) (остатков, участвующих в поддержании петли CDR) в гуманизированных антителах для поддержания аффинности связывания антигена. Вкратце, гуманизация включает следующие стадии: А. сравнение последовательности гена каждого антитела-кандидата с последовательностью гена человеческого антитела в зародышевой конфигурации для нахождения последовательности с высокой гомологией; В. анализ и исследование аффинности HLA-DR и выбор каркасной последовательности человеческого антитела в зародышевой конфигурации с низкой аффинностью; и С.анализ аминокислотных последовательностей каркасных областей вариабельных областей и их периферии с применением технологии компьютерного моделирования и применение молекулярной стыковки для исследования способов их пространственного и стереохимического комбинирования. Анализировали отдельные ключевые аминокислоты в последовательности гена антител-кандидатов, способные взаимодействовать с TIGIT и поддерживать пространственную структуру, рассчитывая электростатическую силу, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофильность и гидрофобность, а также значения энтропии, и пересаживали на выбранную каркасную область гена человеческого антитела в зародышевой конфигурации. Аминокислотные сайты каркасных областей, которые следовало сохранять, картировали. После этого синтезировали гуманизированные антитела.

В некоторых воплощениях антитела к TIGIT или их антигенсвязывающие фрагменты, изложенные в данном документе, имеют аминокислотную последовательность, которая была мутирована путем делеции, вставки или замены аминокислот, но все еще обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с вышеупомянутыми антителами (в частности, в областях CDR, приведенных в вышеупомянутых последовательностях). В некоторых воплощениях при сравнении областей CDR, приведенных в конкретной последовательности по данному изобретению, изложенные в данном документе антитела имеют мутации (делеции, вставки или замены) не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в областях CDR.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит от 1 до 3 определяющих комплементарность областей тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1 и 11, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2 и 12, и HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 3 и 13.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12, и HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит от 1 до 3 определяющих комплементарность областей легкой цепи, выбранных из определяющих комплементарность областей легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 6 или 16, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 7 или 17, LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 8 или 18.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 17, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 18.

В некоторых воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и определяющие комплементарность области легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8.

В некоторых воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит определяющие комплементарность области тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и определяющие комплементарность области легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12, HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13, LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 17, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 18.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), где вариабельная область тяжелой цепи (VH) содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 4, 14, 21, 23, 25, 27 и 29.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область легкой цепи (VL), где вариабельная область легкой цепи (VL) содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 9, 19, 22, 24, 26, 28 и 30.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 4, 14, 21, 23, 25, 27 и 29; и

VL содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 9, 19, 22, 24, 26, 28 и 30.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 19.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 21, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 28.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой мышиное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой целое антитело, одноцепочечное антитело, Fab-антитело, Fab'-антитело, (Fab') 2-антитело или биспецифическое (мультиспецифическое) антитело.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой IgG любого подтипа, такого как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

В некоторых воплощениях модификация одной или более аминокислот может быть внедрена в Fc область антитела, предложенного в данном документе, с получением варианта Fc области. Вариант Fc области может содержать последовательность Fc области человеческого происхождения (например, Fc области IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую модификации (например, замены) аминокислот в одном или более аминокислотных положений.

В некоторых воплощениях может требоваться получение антител, модифицированных цистеином, таких как «сульфо-MAb», в которых один или более остатков антител замещены остатками цистеина.

В некоторых воплощениях предложенные антитела могут быть дополнительно модифицированы с целью введения других небелковых группировок, известных в данной области техники и легко доступных. Подходящие группировки для дериватизации антител включают водорастворимые полимеры, но не ограничиваются ими. Не являющиеся исчерпывающими примеры водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимер этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, глюкан, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (как гомополимер, так и случайный сополимер) и глюкан или поли(М-винил пирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимер пропропиленгликоля, сополимер полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированный полиол (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси, но не ограничиваются ими.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, обладает одним или более из следующих свойств: (1) специфическое связывание с человеческим белком TIGIT; (2) перекрестная реакция с TIGIT яванского макака; (3) ингибирование связывания TIGIT с PVR и/или PVRL2; (4) ингибирование опосредованной TIGIT передачи сигнала; (5) содействие активации антагониста оси PD-1 на Т клетках; и (6) существенное ингибирование роста опухолей при применении в отдельности или в комбинации с антагонистом оси PD-1.

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, может специфически связываться с TIGIT с KD приблизительно 1 нМ или более высокой аффинностью (например, 1 нМ - 2 пМ, 1 нМ, 100 пМ, 10 пМ или 2 пМ). В одном воплощении антитело, изложенное в данном документе, которое специфически связывается с человеческим TIGIT, также способно перекрестно реагировать с TIGIT яванского макака. В данном описании «перекрестная реактивность» относится к способности антитела реагировать с гомологичными белками других биологических видов. Связывается ли антитело специфически с человеческим TIGIT можно определить, проведя исследование любым способом, известным в области техники. Примеры способов исследования для определения аффинности связывания, известных в области техники, включают поверхностный плазмонный резонанс (например, BIACORE) или аналогичные методики (например, ForteBio).

В некоторых воплощениях антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, обладает ингибирующей активностью, например, ингибирует экспрессию (например, экспрессию TIGIT на поверхности клеток), активность и/или передачу сигнала TIGIT или интерферирует с взаимодействием между TIGIT и PVR и/или PVRL2. Антитело к TIGIT, предложенное в данном документе, полностью или частично снижает или регулирует экспрессию или активность TIGIT при связывании или взаимодействии с TIGIT (например, с человеческим TIGIT). Биологическая функция TIGIT полностью, существенным образом или частично снижается или регулируется при взаимодействии между антителами и человеческим полипептидом и/или пептидом TIGIT. Считается, что антитело, описанное в данном документе, способно полностью ингибировать экспрессию или активность TIGIT, когда уровень экспрессии или активности TIGIT снижается по меньшей мере на 95% (например, на 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) в присутствии антитела по сравнению с уровнем экспрессии или активности TIGIT в отсутствие взаимодействия (например, связывания) с антителом. Считается, что антитело, описанное в данном документе, способно существенно ингибировать экспрессию или активность TIGIT, когда уровень экспрессии или активности TIGIT снижается по меньшей мере на 50% (например, на 55%, 60%, 75%, 80%, 85% или 90%) в присутствии антитела к TIGIT по сравнению с уровнем экспрессии или активности TIGIT в отсутствие связывания с антителом к TIGIT. Считается, что антитело, описанное в данном документе, способно частично ингибировать экспрессию или активность TIGIT, когда уровень экспрессии или активности TIGIT снижается менее чем на 95% (например, на 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% или 90%) в присутствии антитела по сравнению с уровнем экспрессии или активности TIGIT в отсутствие взаимодействия (например, связывания) с антителом. Экспрессия антител

В одном аспекте данное изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей один или более экспрессирующих векторов, и к способу получения любого из антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, и способ включает: культивирование клетки-хозяина и очистку и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

В одном аспекте в данном изобретении предложена нуклеиновая кислота, кодирующая любое из вышеупомянутых антител к TIGIT или его фрагментов. Нуклеиновая кислота может включать нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи, или нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела.

В одном воплощении предложены один или более векторов, содержащих нуклеиновую кислоту. В одном воплощении вектор представляет собой экспрессирующий вектор.

В данном изобретении предложена клетка-хозяин млекопитающего для экспрессии рекомбинантных антител, изложенных в данном документе, которая включает ряд иммортализованных клеточных линий, доступных в Американской коллекции типовых культур (АТСС). Они включают, в частности, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки NS0, клетки SP2/0, клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомячка (ВНК), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека, клетки А549, клетки 293Ти многие другие линии клеток. Клетки хозяев-млекопитающих включаю Т-клетки человека, мыши, крысы, собаки, обезьяны, свиньи, козы, коровы, лошади и хомяка. Наиболее предпочтительные клеточные линии отбирают, определяя, какая клеточная линия имеет высокий уровень экспрессии.

В одном воплощении данного изобретения предложен способ получения антитела к TIGIT, где способ включает: внедрение экспрессирующего вектора в клетку-хозяина млекопитающего и культивирование клетки-хозяина в течение периода времени, достаточного для обеспечения экспрессии антитела в клетке-хозяине или, более предпочтительно, для обеспечения секреции антитела в среду, в которой растет клетка-хозяин, с получением антитела. Антитело может быть выделено из среды с применением стандартных способов очистки белка.

Вероятно, гликозилирование антител, экспрессируемых различными клеточными линиями, или в трансгенных животных, различается между собой. Однако, все антитела, кодируемые молекулами нуклеиновых кислот, представленными в данном документе, или содержащие аминокислотные последовательности, представленные в данном документе, являются неотъемлемыми частями данного изобретения, независимо от гликозилирования антитела. Аналогично, в некоторых воплощениях нефукозилированные антитела обладают преимуществами, поскольку они, как правило, обладают большей эффективностью in vitro и in vivo по сравнению с их фукозилированными аналогами, и маловероятно являются иммуногенными, поскольку их гликановые структуры являются нормальными компонентами естественных IgG человеческой сыворотки.

Фармацевтическая композиция и фармацевтический состав

В данном изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая одно или более моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с TIGIT. Следует понимать, что антитела к TIGIT или их антигенсвязывающие фрагменты или их фармацевтическая композиция, предложенные в данном документе, могут быть интегрированы в подходящий носитель, эксципиент и другие реагенты в составе для введения в комбинации, тем самым обеспечивая улучшенный перенос, доставку, переносимость и т.д.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к составу, который позволяет эффективно проявляться биологической активности входящих в него активных ингредиентов и не содержит дополнительных ингредиентов, обладающих токсичностью, неприемлемой для субъекта, которому вводят состав.

Фармацевтический состав, содержащий антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, предпочтительно в форме водного раствора или лиофилизированного состава, может быть получен путем смешивания антитела к TIGIT или его антигенсвязывающего фрагмента, изложенных в данном документе, имеющих желаемую чистоту, с одним или более возможными фармацевтическими эксципиентами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)).

Фармацевтическая композиция или препарат, изложенные в данном документе, могут дополнительно содержать один или более дополнительных активных ингредиентов, которые требуются для лечения по определенным показаниям, предпочтительно, активные ингредиенты обладают комплементарными активностями, которые не влияют друг на друга негативным образом. В некоторых воплощениях дополнительные активные ингредиенты представляют собой химиотерапевтические агенты, ингибиторы иммунных контрольных точек, ингибиторы роста, антибиотики или различные противоопухолевые или противораковые агенты, которые для удобства находятся в комбинации в количествах, эффективных для намеченного использования. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция, изложенная в данном документе, также содержит композицию полинуклеотида, кодирующего антитело к TIGIT или его антигенсвязывающий фрагмент.

Медицинское применение антител

В одном аспекте данное изобретение относится к способу введения субъекту эффективного количества любого из антител к TIGIT или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, иммуноконъюгата, содержащего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или фармацевтической композиции для индукции противоопухолевой активности, опосредуемой Т-клетками или NK-клетками, или усиления иммунного ответа организма.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу введения субъекту эффективного количества любого из антител к TIGIT или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, иммуноконъюгата, содержащего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или фармацевтической композиции для лечения или замедления различных видов рака, иммуно-опосредованных заболеваний и заболеваний с дисфункцией Т-клеток.

В другом аспекте данное изобретение относится к совместному проведению субъекту одной или более терапий (например, способов лечения и/или дополнительных терапевтических агентов) в эффективном количестве. В некоторых воплощениях терапия включает хирургическое лечение и лучевую терапию. В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент выбран из химиотерапевтического агента и антагониста оси PD-1 (например, антитела к PD-1, антитела к PD-L1 или антитела к PD-L2).

В других аспектах данного изобретения предложено применение антитела к TIGIT или его антигенсвязывающего фрагмента, изложенных в данном документе, в изготовлении или получении лекарственного средства для лечения соответствующих заболеваний или расстройств, как указано выше. В данном изобретении также предложено применение антитела к TIGIT или его антигенсвязывающего фрагмента, изложенных в данном документе, и антагониста оси PD-1 (например, антитела к PD-1, антитела к PD-L1 или антитела к PD-L2) в изготовлении или получении лекарственного средства для лечения соответствующих заболеваний или расстройств, как указано выше.

В некоторых воплощениях способы и применения, описанные в данном документе, также включают: проведение индивидууму одной или более терапий (например, способов лечения и/или дополнительных терапевтических агентов). Антитело, изложенное в данном документе, может применяться в отдельности или в комбинации с другими агентами в составе терапии. Например, антитело можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом.

Способы диагностики и определения

В некоторых воплощениях любое из предложенных в данном документе антител к TIGIT или их антигенсвязывающих фрагментов можно применять для определения наличия TIGIT в биологическом образце. Термин «определение» в данном описании охватывает количественное и качественное определение. В некоторых воплощениях биологический образец представляет собой кровь, сыворотку или другие образцы жидкости биологического происхождения. В некоторых воплощениях биологический образец включает клетки или ткани.

Данное изобретение охватывает любые комбинации конкретных воплощений, описанных в данном документе. Дополнительные воплощения данного изобретения и полный объем его применения станут очевидны, исходя из подробного описания, приведенного ниже. При этом следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, раскрывающие предпочтительные воплощения данного изобретения, приведены исключительно в иллюстративных целях, поскольку на основе данного подробного описания могут быть произведены различные изменения и модификации, находящиеся в духе и в рамках изобретения, очевидные для специалиста в данной области. Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в данном документе, включая цитаты, включены во всей полноте путем ссылки во всех отношениях.

В данной заявке использованы следующие сокращения:

RLU: относительная единица люминесценции;

BSA: бычий сывороточный альбумин.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Рекомбинантный белок hTIGIT-ECD-mFC

Последовательность кДНК, кодирующую внеклеточный домен TIGIT, амплифицировали при помощи стандартной методики ПЦР, и амплифицированный фрагмент клонировали в самостоятельно сконструированную систему на основе плазмиды для экспрессии в эукариотах (MX2-mFc, содержащую Fc домен IgG2a мыши) с применением стандартной технологии клонирования, причем система на основе плазмиды для экспрессии в эукариотах содержала систему скрининга по устойчивости к пуромицину, с получением плазмиды, экспрессирующей рекомбинантный слитый белок hTIGIT-ECD-mFC. Рекомбинантный белок hTIGIT-ECD-mFC экспрессировали и очищали с применением экспрессирующих клеток 293Е.

Аминокислотная последовательность внеклеточного домена человеческого TIGIT (hTIGIT-ECD) представляет собой аминокислоты в положениях 24 155 последовательности, зарегистрированной в базе данных NCBI под номером NM 173799.4, и применяется для определения иммуногена и активности антител, изложенных в данном документе.

Последовательность внеклеточного домена TIGIT яванского макака (cynoTIGIT-ECD) представляет собой последовательность, зарегистрированную в базе данных NCBI под номером ХР 015300912.1, и применяется для определения активности антител, изложенных в данном документе.

Пример 2. Получение и скрининг гибридомных антител

Гибридомные антитела получали с применением стандартных методов молекулярной биологии. Кратко, рекомбинантный белок hTIGIT-ECD-mFC, служивший антигеном, смешивали с равным количеством иммунологического адъюванта и иммунизировали 5 самок мышей Balb/c в возрасте 6 недель. После первичной иммунизации осуществляли бустерную иммунизацию один раз на третью неделю после первой иммунизации, и затем один раз каждые две недели, суммарно 6 иммунизаций. После последней бустерной иммунизации отбирали мышей с высокими титрами антител к hTIGIT в качестве источника иммунных клеток для осуществления клеточного слияния. Клетки селезенки выделяли согласно стандартной методике получения гибридом и сливали с клетками миеломы мыши линии SP2/0 (АТСС) согласно стандартной методике электропорации (см. руководство к инструменту для электропорации ВТХ). Слитые клетки ресуспендировали в полной среде DMEM (Corning), содержащей HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин), и высаживали равномерно в 384-луночные планшеты, содержащие мышиные фидерные клетки.

Надосадочную жидкость, секретируемую моноклональными гибридомами, определяли на основе изначально заданных характеристик связывания антиген/антитело (таких как специфичность связывания с TIGIT, способность блокировать связывание TIGIT с PVR и блокирование биологической активности, опосредуемой TIGIT), надосадочную жидкость с антителами, секретированную гибридомами 2O18 и 23О20, использовали для дальнейшего изучения.

Пример 3. Влияние мышиных антител к TIGIT на активность Т-клеток

Активация Т-клеток достигалась путем стимуляции Т-клеточных рецепторов (TCR), распознающих специфические пептиды, презентируемые белками главного комплекса гистосовместимости класса I или класса II на антиген-презентирующих клетках (АРС). Затем активированные TCR инициировали каскад сигнальных событий, которые можно было отслеживать при помощи генов-репортеров, контролируемых транскрипционными факторами (такими как активирующий белок-1 (АР-1), ядерный фактор активированных Т-клеток (NFAT) или ядерный фактор энхансер легкой к-цепи активированных В клеток (NFkd)). Т-клеточные ответы регулировались композицией или индукцией вовлечения ко-рецепторов, экспрессируемых на Т-клетках. Белок программируемой клеточной гибели (PD1) и TIGIT были отрицательными регуляторами активности Т-клеток. PD-1 и TIGIT взаимодействовали со своими лигандами (PD-L1) и PVR (и/или PVRL2), соответственно, экспрессируемыми на клетках-мишенях, включая АРС или раковые клетки, что приводило к поступлению ингибиторного сигнала за счет рекрутирования фосфатазы к TCR сигналосоме, тем самым обеспечивая ингибирование положительного сигнала. Т-клеточную сигнализацию, индуцированную взаимодействием между АРС и Т-клетками измеряли путем конструирования двух генно-модифицированных стабильных клеточных линий, клеток Jurkat (Jurkat/NF AT-Luc/hPD-1-hTIGIT) и клеток СНО (CHO/hPD-L1-hPVRL2).

В частности, клетки СНО, стабильно экспрессирующие hPD-L1/hPVRL2, высаживали в 96-луночные планшеты по 5хЮ⁴ клеток/лунку и инкубировали в течение ночи при 37°С и 7% СО₂. После удаления клеточного супернатанта в каждую лунку добавляли по 40 мкл разведенного антитела к TIGIT (2O18, 23О20 или MBSA43) (исходная концентрация 10 мкг/мл, 3-кратное титрование) и/или заранее добавляли 40 мкл JS001 (0,5 мкг/мл). Добавляли 40 мкл репортерных клеток Jurkat, способных постоянно экспрессировать hPD-1/hTIGIT/NFAT-люциферазу, общее количество клеток составляло 1×10⁵. После 6 часов инкубации при 37°С и 7% СО₂, добавляли люциферазный реагент и регистрировали значения люминесценции при помощи считывающего устройства для микропланшетов.

MBSA43 представляло собой коммерческое антитело к человеческому TIGIT, приобретенное в компании ThermoFisher (кат.№16-9500-82).

JS001 представляло собой антитело к PD-1 (CN 201310258289, антитело 38) независимо разработанное Junshi Biosciences.

Данные анализировали при помощи GraphPad Prism 5 для расчета значений ЕС50 активации Т клеток под воздействием антител к TIGIT и, таким образом, оценивали влияние антител к TIGIT в отдельности или в комбинации с антителом к PD-1 (JS001) на активность Т клеток. На Фиг. 1 и в Таблице 1 ниже приведены подробности.

mIgG: антитело, служившее отрицательным контролем

Результаты свидетельствуют, что:

(1) антитела 2O18 и 23О20 могут существенно стимулировать активность Т-клеток;

(2) влияние антитела 2018 на активацию Т-клеток значительно лучше, чем у коммерческого антитела MBSA43;

(3) все антитела 2O18, 23О20 и MBSA43 оказывают синергетическое действие на активацию Т-клеток при применении в комбинации с антителом к PD-1 JS001.

Пример 4. Конструирование и экспрессия химерных антител

Последовательности ДНК вариабельных областей антител, экспрессируемых гибридомами 2O18 и 23О20, определяли с применением метода ПЦР с вырожденными праймерами.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности 2O18 и 23О20 показаны в Таблице 2.

Fc-фрагмент константной области тяжелой цепи IgG4 человека (SEQ ID NO: 35) и константную область легкой цепи клонировали из клеток крови человека (Beijing Blood Institute) и лигировали с плазмидой pCDNA3.1 для генной инженерии. Вышеупомянутые фрагменты последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи синтезировали в компании GenScript. Тяжелую и легкую цепи расщепляли Bspq I и затем лигировали в соответствующим образом обработанную плазмиду pCDNA3.1. Плазмиды, экспрессирующие химерные тяжелые цепи (ch-HC) или легкие цепи (ch-LC) IgG4, верифицировали путем секвенирования. Вышеупомянутыми различными плазмидами, экспрессирующими химерные тяжелые и легкие цепи, попарно трансфицировали экспрессирующие клетки, с получением 4 химерных антител, пронумерованных от ch1 до ch4 (см. Таблицу 3).

Пример 5. Определение связывающей активности химерных антител к TIGIT с антигеном TIGIT методом ELISA

1 мкг/мл человеческого TIGIT-ECD-mFc иммобилизовали на поверхности 96-луночного планшета и инкубировали в течение 60-90 минут при постоянной температуре 37°С. Затем раствор из лунок удаляли, и лунки 3 раза промывали отмывочным буфером и блокировали в течение 60 минут при помощи PBS, содержащего 2% BSA. Затем планшет промывали 3 раза промывочным буфером, добавляли разведения химерных антител в различных концентрациях. Антитела инкубировали при 37°С в течение 60 минут и промывали планшет 3 раза промывочным буфером и добавляли aHTH-IgG4-HRP в разведении 1:5000. Систему инкубировали при 37°С в течение 30 минут и затем промывали три раза промывочным буфером и добавляли 100 мкл субстрата ТМВ для развития окрашивания. Систему инкубировали при 37°С в течение 30 минут и останавливали реакцию добавлением 10 мкл 2М раствора соляной кислоты. Измеряли поглощение при 450 нм с использованием считывающего устройства для планшетов.

Как показано на Фиг. 2, химерные антитела ch1 и ch4 связываются с человеческим TIGIT с более высокой специфичностью, а значения ЕС₅₀ химерных антител составляют 32,49 нг/мл и 8,932 нг/мл, соответственно.

Пример 6. Влияние химерных антител к TIGIT на активность Т-клеток

Согласно идее и методике эксперимента, описанного в Воплощении 3, влияние химерных антител ch1 и ch4 на активность Т-клеток определяли в эксперименте с репортерным геном люциферазы (люциферазный метод).

Как показано на Фиг. 3, химерные антитела ch1 и ch4 способны существенно усиливать флуоресцентные сигналы, т.е. способствовать активации Т-клеток крови, а значения ЕС₅₀ химерных антител составляют 76,64 нг/мл и 103,9 нг/мл, соответственно.

Пример 7. Гуманизация антител

Для гуманизации антител в базе данных генов иммуноглобулинов человека NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) находили последовательности генов IgG человека, гомологичные последовательностям кДНК вариабельных областей мышиного антитела. Затем определяли аминокислотные последовательности и точные границы CDR вариабельных областей согласно системе нумерации Kabat или системе нумерации IMGT. Последовательности CDR вариабельных областей мышиного антитела, определенные согласно IMGT, показаны в Таблице 4. В качестве матрицы для гуманизации выбирали IGVH и IGVk человека с высокой гомологией вариабельным областям мышиного антитела и гуманизировали путем пересаживания CDR. Вкратце, гуманизация включает следующие стадии: А. сравнение последовательности гена каждого антитела-кандидата с последовательностью гена человеческого антитела в зародышевой конфигурации для нахождения последовательности с высокой гомологией; В. анализ и исследование аффинности HLA-DR и выбор каркасной последовательности человеческого антитела в зародышевой конфигурации с низкой аффинностью; и С.анализ аминокислотных последовательностей каркасных областей вариабельных областей и их периферии с применением технологии компьютерного моделирования и применение молекулярной стыковки для исследования способов их пространственного и стереохимического комбинирования. Анализировали отдельные ключевые аминокислоты в последовательности гена антител-кандидатов, способные взаимодействовать с TIGIT и поддерживать пространственную структуру, рассчитывая электростатическую силу, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофильность и гидрофобность, а также значения энтропии, и пересаживали на выбранную каркасную область гена человеческого антитела в зародышевой конфигурации. Аминокислотные сайты каркасных областей, которые следовало сохранять, картировали. После этого синтезировали гуманизированные антитела. На основании вышеупомянутых факторов всего сконструировали 81 гуманизированное антитело для скрининга активности антител. Информация об аминокислотных последовательностях антител hu3, hu20, hu62, hu69 и hu81 приведена в Таблице 5, а информация о полноразмерной аминокислотной последовательности антител hu3 и hu20 приведена в Таблице 6.

Пример 8. Определение специфичности связывания гуманизированных антител с

человеческим TIGIT методом ELISA

Специфичность связывания гуманизированных антител с человеческим TIGIT определяли стандартным методом ELISA. А именно, 0,5 мкг/мл человеческого TIGIT-ECD-mFc иммобилизовали на поверхности 96-луночного планшета и инкубировали в течение 60 90 минут при постоянной температуре 37°С. Затем раствор из лунок удаляли, и промывали лунки 3 раза отмывочным буфером и блокировали в течение 60 минут при помощи PBS, содержащего 2% BSA. Затем планшет промывали 3 раза отмывочным буфером, добавляли разведения гуманизированных антител в различных концентрациях. Антитела инкубировали при 37°С в течение 60 минут и промывали планшет 3 раза отмывочным буфером и добавляли анти-IgG4-HRP в разведении 1:5000. Систему инкубировали при 37°С в течение 30 минут и затем промывали три раза отмывочным буфером и добавляли 100 мкл субстрата ТМВ для развития окрашивания. Систему инкубировали при 37°С в течение 30 минут и останавливали реакцию добавлением 10 мкл 2М раствора соляной кислоты. Измеряли поглощение при 450 нм с использованием считывающего устройства для планшетов.

Как показано на Фиг. 4, антитела hu3, hu20, hu62, hu69 и hu81 связываются с человеческим TIGIT с более высокой специфичностью, а значения ЕС₅₀ антител составляют 23,20 нг/мл, 37,84 нг/мл, 8,60 нг/мл, 10,66 нг/мл и 9,83 нг/мл, соответственно; специфичность связывания с TIGIT антител hu3, hu62, hu69 и hu81 существенно лучше, чем у контрольного антитела этигилимаб.

Пример 9. Влияние гуманизированных антител к TIGIT на активность Т-клеток

Согласно идее и методике эксперимента, описанного в воплощении 3, влияние гуманизированных антител hu3, hu20, hu62, hu69 и hu81, направленных против TIGIT, на активность Т-клеток определяли при помощи эксперимента с репортерным геном люциферазы (люциферазный метод).

Как показано на Фиг. 5, антитела hu3, hu20, hu62, hu69 и hu81 могут существенно усиливать флуоресцентные сигналы, т.е. способствовать активации Т-клеток крови, а значения ЕС₅₀ антител составляют 139,9 нг/мл, 42,39 нг/мл, 109,4 нг/мл, 102,7 нг/мл и 88,43 нг/мл, соответственно; влияние антител hu3, hu20, hu62, hu69 и hu81, способствующее активации Т-клеток крови существенно лучше, чем у контрольного антитела этигилимаб.

Пример 10. Определение влияния антител на блокирование связывания hTIGIT с его лигандом hPVR методом FACS

Влияние антител на блокирование связывания hTIGIT с его лигандом hPVR определяли при помощи конкурентного анализа методом проточной цитофлуориметрии (FACS). Вкратце, каждое из разведений антител в различных концентрациях (исходная концентрация 30 мкг/мл, разведение с шагом 1:3) смешивали с PVR-mFC (1 мкг/мл, 50 мкл) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем смесь инкубировали с клеточной суспензией (стабильная линия клеток 293F-hPVR, 2,5×10⁴ клеток/лунку) в течение 15 минут при 37°С. После 3-кратного элюирования PBS добавляли 100 мкл козьего антитела к IgG человека, конъюгированного с РЕ, и инкубировали систему в течение 30 минут в темноте. После 3-кратного элюирования PBS осуществляли детектирование методом FACS. Выделяли в гейт популяцию живых клеток на основе прямого/бокового светорассеяния (FSC/SSC) и измеряли среднее геометрическое значение их интенсивности флуоресценции.

Как показано на Фиг. 6, гуманизированные антитела, описанные в данном документе, могут эффективно блокировать связывание TIGIT с PVR на поверхности клеток.

Пример 11. Определение связывания гуманизированных антител с TIGIT различных биологических видов методом BIACORE

Аффинность антител, изложенных в данном документе, к TIGIT и кинетику их связывания определяли с применением Biacore Т200 (GE). Сначала в инструмент загружали чип СМ5 (GE) серии S и готовили козье антитело к Fc-фрагменту человеческого происхождения (Jackson ImmuneResearch), растворяя его в натрий-ацетатном буфере (рН 5,0) в концентрации 40 мкг/мл для иммобилизации на поверхности чипа. Буфер, используемый для детектирования связывания антитела с антигеном, представлял собой HBS-EP+ от GE Healthcare. Каждое из антител hu3 и hu20 разводили до 8 мкг/мл и иммобилизовали на поверхности чипа. Антиген hTIGIT Fc разводили до 20 нМ и пропускали по поверхности чипа со скоростью тока 30 мкл/мин в течение 180 с и регистрировали сигналы связывания и диссоциации антител и антигена. Полученные данные анализировали, используя модель связывания 1:1, с применением программного обеспечения Biacore Т200 Evaluation версии 3.0. Константы кинетики связывания антител с антигеном, а именно, константу скорости ассоциации ka (1/Ms), константу скорости диссоциации kd (1/s) и константу равновесного процесса диссоциации K_D (М) получали путем аппроксимации, результаты приведены в Таблице 7 ниже.

Результаты свидетельствуют, что антитела, раскрытые в данном документе, обладают высокой аффинностью как к человеческому TIGIT, так и к TIGIT яванского макака, и значения K_D антител к человеческому TIGIT составляют всего 0,13 нМ.

Пример 12. Ингибирование опухолевого роста у мышей гуманизированными антителами

Исследование относится к установлению модели рака толстой кишки МС38 на животных, гуманизированных мышах B-hPD-1/hTIGIT (приобретенных в компании Biocytogen Jiangsu Co., Ltd.; самки) и синергетическому противоопухолевому действию антител к TIGIT и антитела к PD1, вводимых в комбинации.

Каждой гуманизированной мыши B-hPD-1/hTIGIT осуществляли подкожную инокуляцию 0,1 мл клеток МС38, ресуспендированных в PBS в концентрации 5×10⁵ клеток/0,1 мл. Когда средний объем опухоли достигал 80-100 мм³, соответствующих мышей отбирали и равномерно распределяли в 8 экспериментальных групп по объему опухоли и массе тела, по 8 мышей в каждой группе, и начинали введение в день разделения на группы. Точная схема введения показана в Таблице 8 ниже.

Примечание: а: вводимый объем рассчитывали таким образом, чтобы он составлял 10 мкл/г массы тела экспериментального животного;

б: BIW означает введение дважды в неделю;

i.p: внутрибрюшинная инъекция;

KLH hIgG4: антитело, служившее отрицательным контролем;

JS001: антитело к PD-1 (CN 2013102582892, антитело 38) независимо разработанное в Junshi Biosciences.

Объем опухоли и массу тела животного измеряли дважды в неделю на протяжение исследования, начиная с 6 дня (до введения) в течение 3 последовательных недель. Длинный диаметр (L) и короткий диаметр (W) каждой опухоли измеряли при помощи штангенциркуля и рассчитывали объем опухоли согласно следующей формуле: V = L × W²/2. Объем опухоли с течением времени у мышей в разных группах отмечали на графике. Для определения статистической значимости применяли дисперсионный анализ (ANOVA). Значение Р менее 0,05 считали статистически значимым во всех анализах.

По окончании 26-дневного эксперимента мышей подвергали эвтаназии. Ткани опухоли выделяли, фотографировали и взвешивали, измеряли массу и объем опухоли (конечный объем опухоли) в каждой группе мышей и рассчитывали относительную скорость ингибирования роста опухоли (TGI (%)).

Результаты:

(1) Как показано на Фиг. 7, в случае монотерапии через 3 недели введения у мышей с опухолями МС38 в группе введения 2 (JS001; 0,3 мг/кг), группе введения 3 (hu20; 1 мг/кг), группе введения 4 (hu20; 3 мг/кг) и группе введения 5 (hu20; 10 мг/кг) происходило существенное подавление опухолевого роста по сравнению с группой введения 1 (KLH hIgG4; 10 мг/кг), поскольку уменьшался объем опухоли и также замедлялся рост опухоли. В случае совместного введения в группах совместного введения наблюдалось более выраженное ингибирующее влияние на опухолевый рост у мышей с опухолями МС38 по сравнению с группами, получавшими монотерапию (группа 6 по сравнению с группой 3/группой 2; группа 7 по сравнению с группой 4/группой 2; группа 8 по сравнению с группой 5/группой 2), что означает, что совместное введение изложенного в данном документе моноклонального антитела hu20, направленного против TIGIT, и моноклонального антитела JS001, направленного против PD-1, демонстрирует хорошее синергетическое противоопухолевое действие.

(2) в данном изобретении также рассчитывали относительную скорость ингибирования опухолевого роста в каждой группе мышей в конце исследования на 26 день (после имплантации опухоли). Формула для расчета относительной скорости ингибирования опухолевого роста выглядит следующим образом:

Относительная скорость ингибирования опухолевого роста TGI (%) = [1 - (T_i - T₀)/(V_i - V₀)] × 100%,

где T_i - Т₀ = конечный объем опухоли в группе введения после введения -объем опухоли в группе введения до введения и V_i - V₀ = конечный объем опухоли в контрольной группе после введения объем опухоли в контрольной группе до введения (объем опухоли до введения на 6 день).

Результаты расчетов приведены в Таблице 9 ниже.

Среднее ± SD: среднее арифметическое ± стандартное отклонение

Результаты свидетельствуют, что на финальной стадии эксперимента (на 26 день после имплантации опухоли) относительная скорость ингибирования опухолевого роста TGI (%) в группах, где вводили антитело к TIGIT hu20 в комбинации с антителом к PD-1 JS001 была существенно выше, чем в группах, где вводили только hu20 или JS001 в отдельности (группа 6 по сравнению с группой 3/группой 2; группа 7 по сравнению с группой 4/группой 2; группа 8 по сравнению с группой 5/группой 2).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОЙСТЕЙ

Антитела к TIGIT и их применение

<110> Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd.

Suzhou Junmeng Biosciences Co., Ltd.

<120> ANTI-TIGIT ANTIBODIES AND APPLICATION THEREOF

<130> 204340 1PCWO

<150> CN 201910634309.9

<151> 2019-07-15

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Gly Tyr Ala Phe Thr Glu Tyr Thr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Ala Lys Leu Leu Arg Leu Met Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Leu Arg Leu Met Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 357

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 5

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaaga cttctggata cgcattcact gaatacacca tgcactgggt gaaacagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attaatccta acactggtgg tactacctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240

atggagttcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aaaattacta 300

cggctcatgt actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Gln Asp Val Arg Thr Ala

1 5

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Ser Ala Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

His Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys His Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 10

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgagg actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagacctgg cactttatta ctgtcatcaa cattatatta ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Ile Tyr Pro Gly Gly His Tyr Thr

1 5

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Thr Arg Tyr Tyr Gly Pro Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 118

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Leu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Arg His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly His Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Tyr Gly Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 354

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 15

caggtccagc tgcagcagtc tggagatgaa ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60

tcctgccagg ctgctggata caccttcact aactactgga tactttggat aaagcagagg 120

cctcgacatg gccttgagtg gattggagat atttaccctg gaggtcatta tactaattac 180

aatgagaaat tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca catcctccag tacagcctac 240

atgcaactca acagcctgac atctgaggac tctgccatct attactgtac aagatactat 300

ggtccctatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Gln Ser Leu Leu Tyr Asn Ser Asn Gln Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

Trp Ala Ser

1

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 19

<211> 113

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 19

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Asn

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 20

<211> 339

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 20

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctacctgtgt cagttggaga gaaggttact 60

atgagctgca agtccagtca gagcctttta tataatagta atcaaaagaa ctacttggcc 120

tggtaccagc agataccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactggg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300

ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339

<210> 21

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой

цепи

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Leu Arg Leu Met Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой

цепи

<400> 22

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой

цепи

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Leu Arg Leu Met Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой

цепи

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 25

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой

цепи

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Leu Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly His Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Tyr Gly Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой

цепи

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Asn

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 27

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой

цепи

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Leu Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly His Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Tyr Gly Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой

цепи

<400> 28

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Asn

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 29

<211> 118

<212>PRT

<213>Artificialsequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой

цепи

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Leu Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly His Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Tyr Gly Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой

цепи

<400> 30

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Asn

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 31

<211> 446

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Leu Arg Leu Met Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 32

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи

<400> 32

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 33

<211> 446

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Leu Arg Leu Met Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 34

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитела, специфически связывающиеся с TIGIT (иммунорецептор Т-клеток с доменами Ig (иммуноглобулиновый) и ITIM (тирозин-содержащий ингибирующий мотив иммунорецептора)), или антигенсвязывающие фрагменты антител, а также включающие их композиции. Также предложены молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, экспрессирующий вектор и клетка-хозяин для экспрессии антител или их антигенсвязывающих фрагментов, и терапевтическое применение антител. Изобретение может найти дальнейшее применение в терапии рака. 9 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 ил., 9 табл., 12 пр.

1. Выделенное антитело к TIGIT (иммунорецептор T-клеток с доменами Ig (иммуноглобулиновый) и ITIM (тирозин-содержащий ингибирующий мотив иммунорецептора)) или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или его антигенсвязывающий домен содержит определяющие комплементарность области тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и определяющие комплементарность области легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где:

(1) HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8; или

(2) HCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12, HCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13, LCDR1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 17, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 18.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где:

VH содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 4, 14, 21, 23, 25, 27 и 29; и/или

VL содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или обладает идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 9, 19, 22, 24, 26, 28 и 30.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), и антитело выбрано из:

(1) антитела, в котором VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9;

(2) антитела, в котором VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 19;

(3) антитела, в котором VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 21, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22;

(4) антитела, в котором VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24;

(5) антитела, в котором VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26;

(6) антитела, в котором VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 28, и

(7) антитела, в котором VH содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29, и VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела приведена в SEQ ID NO: 31 или 33, и/или аминокислотная последовательность легкой цепи антитела приведена в SEQ ID NO: 32 или 34.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 4, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела приведена в SEQ ID NO: 31, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела приведена в SEQ ID NO: 32; или аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела приведена в SEQ ID NO: 33, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела приведена в SEQ ID NO: 34.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, где антитело представляет собой мышиное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой целое антитело, одноцепочечное антитело, Fab-антитело, Fab'-антитело или (Fab')₂-антитело.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, где антитело представляет собой IgG любого подтипа, такого как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

9. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8.

10. Экспрессирующий вектор, содержащий одну или более молекул выделенных нуклеиновых кислот по п. 9, где вектор подходит для рекомбинантной продукции антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8.

11. Клетка-хозяин, экспрессирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, которая содержит один или более экспрессирующих векторов по п. 10 или одну или более молекул нуклеиновых кислот по п. 9.

12. Фармацевтическая композиция, ингибирующая активность TIGIT, где указанная композиция содержит композицию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

13. Фармацевтическая композиция по п. 12, дополнительно содержащая антагонист оси PD-1 (белок программируемой гибели клеток - 1).

14. Способ лечения рака у субъекта, включающий: введение субъекту эффективного количества антитела к TIGIT или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8 или фармацевтической композиции по любому из пп. 12, 13.

15. Способ по п. 14, дополнительно включающий: совместное введение субъекту одной или более терапий, включая хирургическое лечение и/или лучевую терапию, и/или введение одного или более других терапевтических агентов, включая химиотерапевтический агент, антагонист оси PD-1 и антиангиогенный агент.

16. Способ по п. 15, где терапевтический агент представляет собой антагонист оси PD-1.

17. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8 или фармацевтической композиции по п. 12 или 13 в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения заболевания или расстройства, опосредованного TIGIT, где предпочтительно заболевание или расстройство представляет собой рак.

18. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8, включающий: культивирование клетки-хозяина по п. 11 и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры.

19. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8 в комбинации с антагонистом оси PD-1 в изготовлении лекарственного средства для лечения рака у субъекта, где предпочтительно антагонист оси PD-1 выбран из антитела к PD-1, антитела к PD-L1 (лиганд 1 рецептора программируемой клеточной гибели) и антитела к PD-L2 (лиганд 2 рецептора программируемой клеточной гибели).