СПОСОБ ХАРАКТЕРИЗАЦИИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК G01N30/86 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам оценки качества синтетических олигонуклеотидов, для дальнейшего использования в различных типах полимеразной цепной реакции (ПЦР) и клеточной биологии и может быть использовано в медицинской, фармакологической, пищевой, микробиологической промышленности при проведении анализов жидких и твердых биосубстратов, объектов окружающей среды, пищевых продуктов.

Уровень техники

Синтетическое олигонуклеотиды - это короткие фрагменты нуклеиновых кислот с заданной химической формулой (последовательностью). Синтетические олигонуклеотиды находят широкое применение в молекулярной биологии и медицине, например, как антисмысловые олигонуклеотиды, праймеры для секвенирования и амплификации ДНК, зонды для определения комплементарных последовательностей ДНК и РНК, инструменты для сайт-направленного мутагенеза и сайтов рестрикции, а также для синтеза искусственных генов.

Наиболее распространенный метод синтеза синтетических олигонуклеотидов - это твердофазный фосфорамидидный синтез. После завершения синтеза олигонуклеотид отделяют от носителя, удаляют защитные группы, используемые во время синтеза, и очищают полученный продукт при помощи кинирования, электрофореза или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Перед дальнейшим использованием синтетический олигонуклеотид проходит через стадию характеризации, которая предусматривает установление его концентрации, чистоты, а также подтверждение сиквенса путем установления его элементного состава.

Для характеризации олигонуклеотидов известны способы, основанные на сочетании спектрофотометрии, ВЭЖХ, а также различных методов масс-спектрометрии. В качестве критерия соответствия экспериментально полученного сиквенса теоретическому используется пересчет точной массы синтезированного олигонуклеотида, полученной в ходе масс-спектрометрического анализа, в элементный состав, при этом масса в Дальтонах должна быть определена с точностью до 3-4 знака после запятой и относительным отклонением от теоретического значения менее миллионных долей (м.д).

Из уровня техники известен способ характеризации олигонуклеотидов с помощью спектрофотометрии, основанный на поглощении олигонуклеотидами пучка света длиной в 260 нанометров (нм) (Andrey V. Tataurov, Yong You, Richard Owczarzy, Predicting ultraviolet spectrum of single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids, Biophysical Chemistry, Volume 133, Issues 1-3, 2008, Pages 66-70, SSN 0301-4622, https://doi.Org/10.1016/j.bpc.2007.12.004.). Данный способ, при учете коэффициента экстинкции, позволяет определить концентрацию олигонуклеотидов в смеси и наличие органических и белковых примесей.

К недостаткам данного способа можно отнести невозможность определения наличия других примесей нуклеиновой природы и соответственно точного определения состава, синтезированного олигонуклеотида.

Также из уровня техники известен способ характеризации олигонуклеотидов при помощи ВЭЖХ, основанный на разделении анализируемой смеси на хроматографической колонке и последующего анализа при помощи различных детекторов, таких как: детекторы ультрафиолетового излучения, флуоресцентные и кондуктометрические (Deshmukh, Ranjit & Cole, Douglas & Sanghvi, Yogesh. (2000). Purification of antisense oligonucleotides. // Methods in enzymology. 313. 203-26. 10.1016/S0076-6879(00)13014-9). Данный способ позволяет определить как концентрацию, так и чистоту синтезированного олигонуклеотида.

К недостаткам данного способа можно отнести невозможность определения точного состава синтезированного олигонуклеотида, так как метод ВЭЖХ позволяет определить только концентрацию и чистоту, но не позволяет определить точную молекулярную массу исследуемого образца, это в свою очередь не позволяет определить элементный состав, который в свою очередь определяет дальнейшее качество работы синтезированных олигонуклеотидов и проводимых с ними манипуляций (ПЦР-реакции, секвенирование, синтез искусственных генов и другие).

Также из уровня техники известен способ характеризации синтетических олигонуклеотидов с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием на основе квадрупольного масс-спектрометра (Apffel A, Chakel JA, Fischer S, Lichtenwalter К, Hancock WS. Analysis of Oligonucleotides by HPLC-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 1997 Apr 1; 69(7): 1320-5. doi: 10.1021/ac960916h. PMID: 21639339). Данный способ позволяет определить чистоту, концентрацию и экспериментальную массу синтетического олигонуклеотида, приблизительно соответствующую усредненной массе теоретического сиквенса.

К недостаткам данного способа относится недостаточное разрешение квадрупольного масс-анализатора (Δm=0,7 Да, где под Am подразумевается ширина масс-спектрометрического пика на 50% его высоты), которое не позволяет разрешать изотопные пики у ионов с зарядом более 2, а также ограниченный диапазон определяемых масс (<2000 Да), что в свою очередь не позволяет произвести пересчет массы в элементный состав и подтвердить тем самым сиквенс синтетического олигонуклеотида.

Из уровня техники известен способ характеризации синтезированного олигонуклеотида с использованием масс-спектрометрии матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ), при котором образец смешивается с небольшими органическими соединениями (матрицей) в соотношении 1:1000 и более и нанесен на проводящую подложку (Jurinke С., Oeth Р, van den Boom D. MALDI-TOF mass spectrometry: a versatile tool for high-performance DNA analysis. Mol Biotechnol. 2004 Feb; 26(2): 147-64). Данный способ позволяет определять массу олигонуклеотидов на основании масс-спектров однозарядных ионов, которые образуются при использовании метода ионизации МАЛДИ. Масса однозарядного иона соответствует массе анализируемого олигонуклеотида.

К недостаткам данного способа относятся прежде всего сложность получения количественных результатов, недостаточное разрешение прибора на высоких массах, а также невозможность определения точной массы, которая может быть пересчитана в теоретический элементный состав олигонуклеотида согласно его сиквенсу.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемым результатам является способ характеризации синтетических олигонуклеотидов с использованием масс-спектрометрии ион-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР-ФП), в котором анализируемый олигонуклеотид определяется по главному изотопному пику (Miriam Guzman-Lorite, Frederic Rosu, Maria Luisa Marina, Maria Conception Garcia, Valerie Gabelica, miRNA and DNA analysis by negative ion electron transfer dissociation and infrared multiple-photon dissociation mass spectrometry, Analytica Chimica Acta, Volume 1299, 2024, 342431, ISSN 0003-2670). При этом его масса может быть определена с точностью до 4 знака после запятой и относительным отклонением от теоретического значения менее 5 м.д. при использовании внутренней калибровки шкалы масс, что позволяет произвести пересчет массы в элементный состав, который напрямую отражает идентичность полученного в ходе синтеза сиквенса теоретическому.

К недостатку способа можно отнести длительный цикл сканирования (до 10 сек), необходимый для получения сверхвысокого разрешения (порядка 10000000 m/Δm), что делает невозможным использование такого разрешения в методе ИЦР-ФП для анализа олигонуклеотидов в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией, которая позволяет получать фракции анализируемых веществ в виде узких хроматографических пиков, требующих для регистрации высокой скорости сканирования (менее 1 сек). Снижение скорости сканирования ячейки ИЦР приводит к снижению разрешения и падению точности определения массы по главному изотопомеру. Таким образом, точный пересчет массы олигонуклеотида в его элементный состав становится невозможным.

Техническая проблема, решаемая использованием разработанного способа, состоит в расширении арсенала средств характеризации синтетических олигонуклеотидов.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено изобретение, является упрощение процесса характеризации синтетических олигонуклеотидов путем сочетания метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием высокого разрешения (более 20000 m/Am), при котором происходит более точное определение чистоты, концентрации, а также соответствия экспериментально наблюдаемого сиквенса теоретическому за счет пересчета массы первого изотопомера наблюдаемого масс-спектра в элементный состав.

Технический результат достигается за счет реализации способа характеризации синтетических олигонуклеотидов с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием высокого разрешения, включающего хроматографическое разделение анализируемого олигонуклеотида на хроматографической колонке с обращенно-фазовым сорбентом С18, детектирование хроматографического потока осуществляют при помощи масс-спектрометра высокого разрешения, оснащенного источником ионизации электрораспылением (ИЭР), в режиме отрицательных ионов, при этом регистрируют многозарядные ионы с зарядовыми числами от 3 до 7, далее определяют зарядовое число наиболее интенсивного многозарядного иона по следующей формуле: z=1/[(m/z)2-(m/z)1], где (m/z)1 - масса меньшего соседнего изотопного пика, a (m/z)2 - масса большего изотопного пика, далее вычисляют экспериментальную масса синтетического олигонуклеотида по формуле: М=z⋅(m/z+1,0073), где z - зарядовое число, m/z - значение отношения массы к заряду иона в масс-спектре для первого изотопного пика многозарядного иона, затем производят сравнение полученной экспериментальной массы олигонуклеотида с теоретической массой данной олигонуклеотидной последовательности по первому изотопному пику, при этом критерием соответствия является отклонение экспериментально полученного значения от теоретического не выше чем на 5 м.д. При этом регистрируют многозарядные ионы с зарядовыми числами 4 и 5.

Способ основан на измерении массы первого изотопомера вместо главного, поскольку в последнем случае без приборов сверхвысокого разрешения невозможно увидеть тонкую картину его изотопного распределения, а для многозарядных ионов, полученных методом ИЭР, сверхвысокого разрешения современных приборов (до 10000000 m/Δm) оказывается недостаточно. Это позволяет производить пересчет точной массы олигонуклеотида в элементный состав при отсутствии влияния изотопных комбинаций на точную массу главного изотопомера и проводить анализ соответствия сиквенса синтетического олигонуклеотида его теоретическому составу, а также расширение технического арсенала средств для характеризации синтетических олигонуклеотидов. При этом предложенный нами способ возможно реализовать на приборах высокого разрешения (от 20000 m/Δm).

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется фигурами, где на фиг. 1 представлена ВЭЖХ хроматограмма синтетического олигонуклеотида, позволяющая оценить чистоту исследуемого аналита, один пик на графике свидетельствует об отсутствии примесей. Каждый хроматографический пик содержит масс-спектральную характеристику отдельного вещества. На фиг. 2 - изотопное распределение, на основании которого высчитывается точная масса синтетического олигонуклеотида.

Осуществление изобретения

Способ осуществляют следующим образом. Для перевода пробы исследуемого аналита в подходящую для дальнейшего анализа форму готовят 10 пикомолярный раствор анализируемого олигонуклеотида в деионизированной воде, объемом 100 мкл, раствор гомогенизируют с помощью шейкера, и переносят в герметичный инертный контейнер (виалу).

Затем проводят хроматографическое разделение анализируемого олигонуклеотида на хроматографической колонке с обращенно-фазовым сорбентом С18, длиной 100 мм, внутренним диаметром 2,1 мм и размером частиц сорбента 2,7 мкм. В качестве органической составляющей элюента используют ацетонитрил, в роли водной составляющей элюента - 20 мМ раствор ацетата аммония в воде. Разделение производится в градиентном режиме с ростом органической составляющей от 2 до 40% в потоке 0,4 мл/мин в течение 40 мин. Объем закола составляет 35 микролитров.

Детектирование хроматографического потока осуществляется при помощи масс-спектрометра высокого или сверхвысокого разрешения (например, АВ Sciex TripleTOF 5600+), оснащенного источником ионизации электрораспылением (ИЭР), в режиме отрицательных ионов. При этом регистрируют многозарядные ионы с зарядовыми числами (модуль заряда) от 3 до 7, для пересчета предпочтительнее использовать 4-зарядные или 5-зарядные ионы в связи с их высокой интенсивностью. В полученном масс-спектре находят наиболее интенсивный многозарядный ион и определяют его зарядовое число по следующей формуле: z=1/[(m/z)2-(m/z)1], где (m/z)1 - масса меньшего соседнего изотопного пика, a (m/z)2 - масса большего соседнего изотопного пика. Далее вычисляется экспериментальная масса синтетического олигонуклеотида по формуле: М=z⋅(m/z+1,0073), где z - зарядовое число, m/z - значение отношения массы к заряду иона в масс-спектре для первого изотопного пика многозарядного иона. После подсчета массу округляют до целого числа. После этого производят сравнение полученной экспериментальной массы олигонуклеотида с теоретической массой данной олигонуклеотидной последовательности по первому изотопному пику, полученной путем ее расчета на основании элементного состава и масс первых изотопов, входящих в него элементов. Критерием соответствия является отклонение экспериментально полученного значения от теоретического не выше чем на 5 м.д.

Пример 1. Определение соответствия сиквенса синтетического олигонуклеотида

В герметично закрывающуюся стеклянную виалу объемом 200 мкл помещают 10 мкл анализируемого синтетического олигонуклеотида и разбавляют его 90 мкл воды Milli-Q, сосуд герметично закрывают крышкой. Виала помещается в хроматографическую систему с предустановленной колонкой Agilent InfinityLab Poroshell 120 ЕС-С18, длиной 100 мм, внутренним диаметром 2,1 мм и размером частиц сорбента 2,7 мкм. В качестве элюента А используют ацетонитрил, в роли элюента В водный 20 мМ раствор ацетата аммония. Разделение производится в градиентном режиме с ростом элюента А от 2% до 40% в потоке 0,4 мл/мин в течение 40 минут. Объем закола в данном методе составляет 35 микролитров.

Исходя из теоретических данных, моноизотопная масса синтетического олигонуклеотида с сиквенсом 5-AGTCCCTGCCACACTCAG-3, имеющего формулу C₁₇₂H₂₂₀N₆₅O₁₀₅P₁₇, должна составлять 5401,9413 Да. Наиболее интенсивный многозарядныи ион, находится в диапазоне 1300-1500, по формуле z=1/[(m/z)2-(m/z)1] находим зарядность, экспериментальная (m/z)2 составила 1349,7290 Да, экспериментальная (m/z)1 составила 1349,4778 Да, z=1/[1349,7290-1349,4778], z=3,9808917, округляем до цельночисленного значения, заряд равен 4. Далее по формуле М=z⋅(m/z+l,0073), вычисляем массу олигонуклеотида, где m/z равна 1349,4778 Да, М=4⋅(1349,4778+1,0073), экспериментальная масса первого изотопоного пика составила: 5401,9404 Да, что соответствует отклонению менее чем на 5 м.д., и удовлетворяет выбранным критериям.

Пример 2. Определение соответствия сиквенса синтетического олигонуклеотида с модификациями 6 - FAM, 3-BHQ-1

В герметично закрывающуюся стеклянную виалу объемом 200 мкл помещают 10 мкл анализируемого синтетического олигонуклеотида и разбавляют его 90 мкл воды Milli-Q, сосуд герметично закрывают специальной крышкой, раствор гомогенизируют с помощью шейкера.

Виала помещается в хроматографическую систему с предустановленной колонкой Agilent Infinity Lab Porashell 120 EC-C18, длиной 100 мм, внутренним диаметром 2,1 мм и размером частиц сорбента 2,7 мкм. В качестве элюента А используют ацетонитрил, в роли элюента В водный 20 мМ раствор ацетата аммония. Разделение производится в градиентном режиме с ростом элюента А от 2% до 40% в потоке 0,4 мл/мин в течение 40 минут. Объем закола в данном методе составляет 35 микролитров.

Исходя из теоретических данных масса первого изотопного пика синтетического олигонуклеотида с сиквенсом 5-6-FAM-AGCGACTGCAGGAGGAGCTA-BHQ1-3, имеющего формулу C₂₄₈H₂₉₄N₉₃O₁₃₀P₂₁, должна составлять: 7304,3744 Да. Наиболее интенсивный многозарядный ион, находится в диапазоне 1300-1500, по формуле z=1[(m/z)2-(m/z)1] находим зарядность, экспериментальная (m/z)2 составила 1460,0686 Да, экспериментальная (m/z)1 составила 1459,8670 Да, z=l/[1460,0686-1459,8670], z=4,9603175, округляем до цельночисленного значения, заряд равен 5. Далее по формуле М=z⋅(m/z+1,0073), вычисляем массу олигонуклеотида, где m/z равна 1459,8670 Да, М=5⋅(1459,8670+1,0073) экспериментальная масса первого изотопного пика составила: 7304,3715 Да, что соответствует отклонению менее чем на 5 м.д.

Пример 3. Определение соответствия сиквенса синтетического олигонуклеотида с модификациями 6 - HEX, 3-BHQ-2

В герметично закрывающуюся стеклянную виалу объемом 200 мкл помещают 1 Омкл анализируемого синтетического олигонуклеотида и разбавляют его 90 мкл воды Milli-Q, сосуд герметично закрывают специальной крышкой, раствор гомогенизируют с помощью шейкера. Виала помещается в хроматографическую систему с предустановленной колонкой Agilent InfinityLab Porashell 120 ЕС-С18, длиной 100 мм, внутренним диаметром 2,1 мм и размером частиц сорбента 2,7 мкм. В качестве элюента А используют ацетонитрил, в роли элюента В водный 20 мМ раствор ацетата аммония. Разделение производится в градиентном режиме с ростом элюента А от 2% до 40% в потоке 0,4 мл/мин в течение 40 минут. Объем закола в данном методе составляет 35 микролитров. Детектирование спектра производят на предварительно откалиброванном масс-спектрометре. ВЭЖХ-МС характеристика анализируемого синтетического олинуклеотида представлен на фиг. 1 и 2.

Исходя из теоретических данных, масса первого изотопного пика синтетического олигонуклеотида с сиквенсом 5-5-НЕХ-ATCCACTGTGTCGACGAGCTG-BHQ2-3, имеющего формулу C₂₆₂H₃₁₀Cl₆N₉₀O₁₄₂P₂₂, должна составлять: 7879,2162 Да. Наиболее интенсивный многозарядный ион находится в диапазоне 1300-1600, по формуле z=1/[(m/z)2-(m/z)1] находим зарядность, экспериментальная (m/z)2 составила 1575,0363 Да, экспериментальная (m/z)1 составила 1574,8353 Да, z=l/[1575,0363-1574,8353], z=4,9751244, округляем до цельночисленного значения, заряд равен 5. Далее по формуле М=z⋅(m/z+1,0073) вычисляем массу олигонуклеотида, где m/z равна 1574,8353 Да, М=5⋅(1574,8353+1,0073), экспериментальная масса первого изотопомера составила: 7879,2130 Да, что соответствует отклонению менее чем на 5 м.д.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам оценки качества синтетических олигонуклеотидов, для дальнейшего использования в различных типах ПЦР и клеточной биологии и может быть использовано в медицинской, фармакологической, пищевой, микробиологической промышленности. Способ характеризации синтетических олигонуклеотидов с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием высокого разрешения включает хроматографическое разделение анализируемого олигонуклеотида на хроматографической колонке с обращенно-фазовым сорбентом С18. Детектирование хроматографического потока осуществляют при помощи масс-спектрометра высокого разрешения, оснащенного источником ионизации электрораспылением (ИЭР), в режиме отрицательных ионов. Регистрируют многозарядные ионы с зарядовыми числами от 3 до 7, определяют зарядовое число наиболее интенсивного многозарядного иона по следующей формуле: z=1/[(m/z)2-(m/z)1], где (m/z)1 - масса меньшего соседнего изотопного пика, a (m/z)2 - масса большего изотопного пика. Вычисляют экспериментальную массу синтетического олигонуклеотида по формуле: М=z⋅(m/z+1,0073), где z - зарядовое число, m/z - значение отношения массы к заряду иона в масс-спектре для первого изотопного пика многозарядного иона. Производят сравнение полученной экспериментальной массы олигонуклеотида с теоретической массой данной олигонуклеотидной последовательности по первому изотопному пику, при этом критерием соответствия является отклонение экспериментально полученного значения от теоретического не выше чем на 5 м.д. Техническим результатом является расширение арсенала средств характеризации синтетических олигонуклеотидов. 1 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ характеризации синтетических олигонуклеотидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием высокого разрешения и последующим анализом, включающий хроматографическое разделение анализируемого олигонуклеотида на хроматографической колонке с обращенно-фазовым сорбентом С18, детектирование хроматографического потока осуществляют при помощи масс-спектрометра высокого разрешения, оснащенного источником ионизации электрораспылением (ИЭР), в режиме отрицательных ионов, при этом регистрируют многозарядные ионы с зарядовыми числами от 3 до 7, далее определяют зарядовое число наиболее интенсивного многозарядного иона по следующей формуле: z=1/[(m/z)2-(m/z)1], где (m/z)1 - масса меньшего соседнего изотопного пика, a (m/z)2 - масса большего изотопного пика, далее вычисляют экспериментальную массу синтетического олигонуклеотида по формуле: М=z⋅(m/z+1,0073), где z - зарядовое число, m/z - значение отношения массы к заряду иона в масс-спектре для первого изотопного пика многозарядного иона, затем производят сравнение полученной экспериментальной массы олигонуклеотида с теоретической массой данной олигонуклеотидной последовательности по первому изотопному пику, при этом критерием соответствия является отклонение экспериментально полученного значения от теоретического не выше чем на 5 м.д.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что регистрируют многозарядные ионы с зарядовыми числами 4 и 5.