СПОСОБ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО ЖИДКОСТНО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ АЛКИЛФОСФОНОВЫХ И/ИЛИ О-АЛКИЛАЛКИЛФОСФОНОВЫХ КИСЛОТ В ВОДНОМ РАСТВОРЕ Российский патент 2018 года по МПК G01N30/02 

Область техники

Заявленное изобретение относится к области аналитической химии, а именно к количественному определению малых концентраций О-алкилалкилфосфоновой или алкилфосфоновой кислоты в объектах окружающей среды и биологических объектах с целью установления факта применения фосфорорганических боевых отравляющих веществ.

Алкилфосфоновые и О-алкилалкилфосфоновые кислоты (фиг. 1) являются так называемыми «маркерами» применения фосфорорганических боевых отравляющих веществ (далее - ФБОВ), таких как зарин, зоман, VX, RVX и других. ФБОВ в объектах окружающей среды, в организме человека и животных подвергаются различным трансформациям, основная из которых - гидролиз, сначала до О-алкилалкилфосфоновой кислоты, затем до алкилфосфоновой кислоты. Наличие этих продуктов трансформации («маркеров») в тех или иных объектах указывает на контакт этого объекта с ФБОВ - т.е. на факт применения, производства, хранения или транспортировки ФБОВ. Эти маркеры определяют в основном с помощью хромато-масс-спектрометрических методов.

Уровень техники

Из уровня техники известны следующие решения.

Известен способ количественного определения производных метилфосфоновой кислоты - О-алкиловых эфиров в водных растворах методом реакционной газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектированием, используемый в системах войсковой и промышленной индикации для определения фосфорорганических веществ, а также при решении задач по проведению экологического мониторинга, в количественном химическом анализе О-алкилметилфосфонатов. Осуществляют реакцию дериватизации путем химической модификации анализируемых веществ. Проводят алкилирование диметилсульфатом в присутствии N,N,N-трибутил-N-бензиламмонийхлорида в гетерофазных условиях с образованием хроматографируемых производных, регистрируемых с чувствительностью 2⋅10^-8 мг/мл методом газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектированием (RU 2213959, G01N 30/06. 10.10.2003).

Недостатком известного способа является то, что для определения концентрации аналита необходимо проводить его дериватизацию, которая включает следующие стадии: проведение реакции алкилирования аналитов с предложенными реагентами и очитка с помощью твердофазной экстракции, при которой происходит избавление от воды в пробе. При использовании данного метода аналитик проводит достаточно долгое время в непосредственном контакте с пробой. Такой процесс является сложным, трудоемким и занимающим большое количество времени.

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография позволяет обойтись без дериватизации, однако при этом алкилфосфоновые кислоты очень слабо удерживаются на большинстве коммерчески доступных неподвижных фаз. Слабое удерживание приводит к плохому разрешению пиков на хроматограмме, соэлюированию с компонентами образца, мешающими определению, что приводит к снижению чувствительности хромато-масс-спектрометрического определения аналитов.

Известен способ определения концентрации алкилфосфоновых и О-алкилалкилфосфоновых кислот в водных растворах, включающий разделение на анионообменной хроматографической колонке «OasisWAXLC». В качестве подвижной фазы А используют 10 мМ раствор ацетата аммония с добавкой 5% метанола, фазы Б - 0,3% раствор гидроксида аммония в воде с добавкой 20% метанола. Скорость потока составляет 0,25 мл/мин. Соединения детектируют масс-спектрометрически с ионизацией электрораспылением (US 8048305, C02F 1/42, 11.01.2011).

Недостатком данного способа является то, что в нем используют анионообменный сорбент, который не обеспечивает возможность определения концентрации алкилфосфоновых кислот в реальных объектах, поскольку в них присутствует большое количество солей, которые растворяются в воде, распадаясь на ионы (диссоциируют), что приводит к снижению времени удерживания аналитов на анионообменном сорбенте и к снижению чувствительности при определении концентрации исследуемых кислот.

Известен способ определения концентрации алкилфосфоновых и О-алкилалкилфосфоновых кислот в водных растворах, включающий дериватизацию алкилфосфоновых кислот бромидом п-(9-антролокси)фенацила, разделение на колонке с октадецилсиликагелем и флуоресцентное детектирование; в качестве источника возбуждения используют лазер с длиной волны 325 нм («Fluorescence detection of alkylphosphonic acids using p-(9-anthroyloxy)phenacyl bromide», M.C. Roach, L.W. Ungar, R.N. Zare, L.M. Reimer, D.L. Pompliano, J.W. Frost, «Analytical Chemistry», 1987, v. 59, №7, p. 1056-1059).

Недостатком способа является то, что на хроматограмме присутствует побочный продукт реакции, полученный в результате дериватизации, что снижает точность определения концентрации кислот. Пределы обнаружения и разрешение в способе не указаны, но отмечено, что разделение на колонке осуществляют с использованием сорбента Adsorbosphere C₁₈ (250 × 1 мм) при скорости потока 0,05 мл/мин.

Применение данного способа приводит к высоким временным затратам, поскольку несмотря на значительную длину колонки и низкую скорость потока при осуществлении данного способа получают высокое значение времени удержания аналитов на сорбенте - 30 минут. Кроме того, недостатком известного способа является то, что для определения концентрации аналита необходимо проводить его дериватизацию, что является сложным процессом, занимающим большое количество времени.

Наиболее близким аналогом является способ определения концентраций алкилфосфоновых кислот в водных растворах, включающий разделение аналитов на хроматографической колонке с пористым графитированным сорбентом Hypercarb (150×2,1 мм, 7 мкм) в изократическом режиме 0,1% раствором карбоновой кислоты (использовали муравьиную, уксусную, трифторуксусную, гептафторбутановую и нонафторпентановую кислоты). Для детектирования используют масс-спектрометрический детектор. За счет относительно большой длины колонки и добавления карбоновых кислот в элюент обеспечивается разделение алкилфосфоновых кислот. Коэффициенты удерживания для наиболее слабо удерживаемых аналитов (метилфосфоновой, этилфосфоновой и н-пропилфосфоновой кислот) не превысили k = 3 при элюировании раствором муравьиной кислоты и скорости потока 20 мкл/мин, из чего следует, что времена удерживания слабо удерживаемых аналитов практически неотличимы от мертвого времени колонки (мертвое время в наиболее близком аналоге оценено по хроматограмме: t_m = 4.7 мин, мертвый объем в наиболее близком аналоге: V_m = 0.94 мл). При анализе реальных объектов многие мешающие определению компоненты (соли и другая органика) вымываются в области малых времен удерживания, что приводит к снижению чувствительности и селективности определения («Liquid chromatography analysis of phosphonic acids on porous graphitic carbon stationary phase with evaporative light-scattering and mass spectrometry detection», J.-P. Mercier, Ph. Morin, M. Dreux, A. Tambute, «Journal of Chromatography A», 1999, v. 849, pp. 197-207).

Таким образом, недостатками наиболее близкого аналога являются малые коэффициенты емкости, получаемые за счет применения вышеуказанного изократического режима разделения аналитов на хроматографической колонке, когда колонка уравновешена раствором муравьиной кислоты и концентрация данной кислоты не меняется в течение всего эксперимента, что приводит к низкой чувствительности определения концентраций исследуемых кислот.

Раскрытие изобретения

Алкилфосфоновые и О-алкилалкилфосфоновые кислоты являются очень гидрофильными соединениями, их определение методом обращенно-фазной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием затруднительно по причине их очень слабого удерживания на сорбентах. Это приводит к снижению селективности и чувствительности определения, поскольку время удержания кислот на сорбенте является близким к мертвому времени колонки. В связи с этим технической проблемой заявленного изобретения является преодоление технических недостатков, присущих аналогам, что ведет к необходимости создания способа определения алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот в водных растворах с высокой точностью, при котором достигается оптимальное значение времени удерживания удержания исследуемых алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот на сорбенте, чтобы оно не было близким к мертвому и при этом было как можно меньше.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение коэффициента емкости (коэффициента массового распределения), что приводит к повышению разрешения пиков аналитов на хроматограмме и к более высокой точности и чувствительности определения концентрации кислот.

Техническая проблема решается за счет осуществления способа определения концентрации алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот в водном растворе, согласно которому проводят жидкостно-хроматографическое разделение кислот в хроматографической колонке, заполненной по длине пористым графитированным углеродным сорбентом, при этом хроматографическую колонку используют с длиной, равной 30-150 мм, предварительно промывают ее водой со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин в течение не менее 15 минут, после чего осуществляют введение в колонку пробы исследуемого водного раствора в количестве 5-20 мкл со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин, затем осуществляют ввод 0,01-0,5% об. водного раствора муравьиной кислоты со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин для элюирования введенной в колонку пробы с последующим определением концентрации алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот масс-спектрометрическим методом по градуировочной зависимости, предварительно построенной для алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот в водном растворе.

В заявленном способе используют сорбент, относящийся к группе углеродных сорбентов. Такой сорбент, в отличие от анионообменного, не снижает время удерживания на нем аналитов при наличии солей, присутствующих в исследуемых реальных объектах, и, следовательно, чувствительность при определении концентрации исследуемых кислот не снижается. Выбор графитизированного углеродного сорбента обусловлен также возможностью его работы в широком диапазоне pH (0-14) и температуры (10-200°С).

Предварительное промывание хроматографической колонки в течение более 15 минут водой обеспечивает уравновешивание колонки, что повышает значение коэффициента емкости в заявленном способе. При промывании менее 15 минут коэффициент емкости существенно снижается.

Для построения градуировочной кривой используют алкилфосфоновые и/или О-алкилалкилфосфоновые кислоты с концентрацией 0,4-10 мкг/мл в количестве 5-20 мкл, что обусловлено пределами обнаружения кислот в заявленном способе.

Муравьиная кислота является летучей, что является необходимым свойством кислоты при использовании масс-спектрометрического детектора. Такая кислота не является прекурсором, в связи с чем с ней проще работать, чем с другими кислотами, например с уксусной кислотой. Диапазон концентраций муравьиной кислоты в элюенте (0,01% об. - 0,5% об.) является наиболее оптимальным. Более высокие концентрации кислоты существенно не меняют время удерживания аналитов, а также могут отрицательно влиять на интерфейс прибора.

Диапазон скорости потока элюента (0,1-0,2 мл/мин) выбран с учетом длины колонки и находящегося в ней графитизированного сорбента.

При введении в колонку 0,01-0,5% об. раствора муравьиной кислоты в деионизованной воде со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин (в течение времени, равного 1 с) после введения исследуемого раствора ее концентрация в колонке ступенчато повышается с 0 до 0,01-0,5% об., что обеспечивает достижение оптимального времени удержания исследуемых алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот на сорбенте (по результатам экспериментов - 4,9-16,5 мин). Выбор скорости потока обусловлен тем, что при элюировании со скоростью потока менее 0,1 мл/мин концентрация раствора муравьиной кислоты повышается более плавно, времена удерживания возрастают (более 16,5 мин), но при этом в начале анализа осуществляется вымывание аналитов более слабым элюентом, поскольку чем меньше концентрация кислоты, тем меньше сила элюента, что приводит к уширению и размытию пиков и ухудшению точности способа, снижению коэффициента емкости.

При элюировании со скоростью потока более 0,2 мл/мин концентрация раствора муравьиной кислоты увеличивается более резко, значение времени удержания снижается (менее 4,9 мин), что приводит к существенному снижению коэффициента емкости.

При достижении оптимального значения времени удержания исследуемых алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот на сорбенте достигается оптимальное время для анализа, необходимое для разделения кислот в хроматографической колонке, что обеспечивает повышение коэффициента емкости, точности и чувствительности при определении концентрации кислот.

Разрешение пиков аналитов можно выразить через коэффициенты емкости (например, для пары этил- и метил-фосфоновых кислот)

где Rs - разрешение,

t_m - мертвое время колонки (время прохождения через хроматографическую систему вещества, которое не удерживается на сорбенте),

k' - коэффициент емкости,

w₁ и w₂ - полуширина пиков соответствующих веществ.

Следовательно, чем больше разница между коэффициентами емкости кислот, тем больше разрешение.

Заявленный способ обеспечивает возможность использования колонок с различным значением длины (от 30 до 150 мм) с достижением технического результата - повышение коэффициента емкости (т.е. коэффициента массового распределения, равного 4,9-16,5), что приводит к повышению разрешения пиков аналитов на хроматограмме и к более высокой точности и чувствительности определения концентрации кислот. При увеличении длины колонки увеличиваются времена удерживания аналитов, так как определяемые вещества проходят через больший слой сорбента.

Градуировочную зависимость получают при осуществлении жидкостно-хроматографического разделения алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот на той же хроматографической колонке и при тех же параметрах, при каких проводят способ определения концентраций анализируемой пробы водного раствора определяемых кислот. Так, используют заполненную пористым графитированным углеродным сорбентом колонку с длиной, равной 30-150 мм. Предварительно промывают ее водой со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин в течение не менее 15 минут, после чего осуществляют введение в колонку водного раствора кислот с концентрацией 0,4-10 мкг/мл в количестве 5-20 мкл со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин, затем осуществляют введение водного раствора муравьиной кислоты с концентрацией 0,01-0,5% об. со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин для элюирования введенной в колонку пробы с последующим построением градуировочной зависимости.

Таким образом, предложенные параметры способа позволяют существенно увеличить времена удерживания исследуемых аналитов на сорбенте, что приводит к увеличению коэффициентов емкости (отношение количеств исследуемого компонента в неподвижной и подвижной фазах).

В частном случае реализации изобретения возможно осуществлять жидкостно-хроматографическое разделение, например, метилфосфоновой, этилфосфоновой и н-пропилфосфоновой кислот или метилфосфоновой, О-этилметилфосфоновой, О-изопропилметилфосфононовой и О-пинаколилметилфосфоновой кислот в водном растворе для определения их концентрации.

Предварительное промывание колонки осуществляют, например, в течение не более 30 мин.

Заявленный способ возможно осуществлять в жидкостном хромато-масс-спектрометре со следующими техническими характеристиками:

- диапазон масс, m/z - до 102000;

- разрешение, R = 2М;

- максимальная скорость сканирования, аем/с - 15000;

- чувствительность в режиме электроспрея (режим SIM):

положительный ионы: 10 пг резерпина S/N > 600 (метод peak-zero), S/N > 1500 (метод RMS);

отрицательные ионы: 20 пг резерпина S/N > 60 (метод peak-zero), S/N > 150 (метод RMS);

- время переключения режимов анализа положительных/отрицательных ионов, с - 15 мс;

- максимальная температура нагрева линии десольватации, °С - 300;

- максимальная температура нагрева узла ионизации пробы, °С - от 300 до 500.

В частном случае реализации изобретения возможно использовать хроматографическую колонку с длиной, равной 30 мм, и диаметром 2,1 мм, что приводит к возможности использования меньшего количества сорбента, воды и раствора муравьиной кислоты, по сравнению с прототипом (где использовали колонку с высотой 150 мм и диаметром 2,1 мм), поскольку в заявленном изобретении предложены такие параметры, которые дают большее время удерживания аналита на сорбенте при уменьшении длины колонки. В качестве графитизированного углеродного сорбента возможно использовать сорбент с площадью поверхности частиц (120 ± 5%) м²/г, размером частиц (250 ± 5%) А и средним диаметром частиц (5 ± 5%) мкм. При этом используют хроматографическую колонку, заполненную пористым графитизированным углеродным сорбентом на 80-100%.

Предварительное промывание колонки возможно осуществлять в течение не более 30 мин, поскольку промывание колонки более 30 минут не приводит к существенному увеличению коэффициента емкости.

Введение водного раствора муравьиной кислоты в частном случае осуществляют в количестве 1-3 мл.

Описание чертежей

Заявленное изобретение поясняется чертежами, где изображено следующее:

на фиг. 1 - схема гидролиза ФБОВ,

на фиг. 2 - зависимость коэффициента емкости аналита от времени предварительной промывки колонки деионизованной водой,

на фиг. 3 - зависимость коэффициентов емкости аналита от концентрации муравьиной кислоты в элюенте,

на фиг. 4 - хроматограмма метилфосфоновой кислоты (МРА) и ее эфиров согласно примеру 2,

на фиг. 5 - хроматограмма метилфосфоновой кислоты (МРА) и ее этилового (ЕМРА), изопропилового (iPMPA) и пинаколилового (PiMPA) эфиров. Условия определения: Hypercarb 30×2.1, элюент: 0,5% об. НСООН в воде, температура колонки: 40°С, скорость потока: 0,2 мл/мин, концентрация каждого аналита: 1 мкг/мл, МС-детектирование. 1 - метилфосфоновая кислота, 2 - этилметилфосфоновая кислота, 3 - изопропилфосфоновая кислота, 4 - пинаколилфосфоновая кислота, согласно примеру 3.

На фигуре 1 в качестве радикалов обозначены R = СН₃ или С₂Н₅ или i-С₃Н₇ или n-С₃Н₇, R₁ = C₁-С₁₀алкил- или циклоалкил-.

При использовании в качестве ФБОВ зарина, R = СН₃, R₁ = i-CH₇, X = F.

При использовании в качестве ФБОВ - VX, R = СН₃, R₁ = С₂Н₅, X = SCH₂CH₂N(i-С₃Н₇)₂.

Позициями на фигурах обозначены:

1 - хроматограмма метилфосфоновой кислоты (МРА),

2 - хроматограмма этилфосфоновой кислоты (EtPA),

3 - хроматограмма н-пропилфосфоновой кислоты (n-PrPA),

4 - хроматограмма О-этилметилфосфоновой кислоты (ЕМРА),

5 - хроматограмма О-изопропилметилфосфононовой кислоты (iPMPA),

6 - хроматограмма О-пинаколилметилфосфоновой кислоты (PiMPA).

Зависимость коэффициентов емкости от времени промывки колонки водой при элюировании аналитов с сорбента Hypercarb 0,25% об. муравьиной кислотой в воде представлена на фигуре 2 и в таблице 1.

Осуществление изобретения

Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С.

Для приготовления растворов реагентов при осуществлении заявляемого способа используют деионизованную воду, полученную любым способом, сопротивление которой составляет (18,2 ± 5%) МОм × см.

Согласно заявляемому способу концентрацию алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот (маркеров применения фосфорорганических боевых отравляющих веществ) в водных растворах определяют следующим образом.

Для построения градуировочной зависимости осуществляют жидкостно-хроматографическое разделение алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот в хроматографической колонке жидкостного хромато-масс-спектрометра, на 80-100% заполненной пористым графитированным углеродным сорбентом. В примерах конкретного выполнения изобретения представлено разделение метилфосфоновой (МРА), этилфосфоновой (EtPA) и н-пропилфосфоновой (n-PrPA) кислот, а также метилфосфоновой (МРА), О-этилметилфосфоновой (ЕМРА), О-изопропилметилфосфононовой (iPMPA) и О-пинаколилметилфосфоновой (PiMPA) кислот. Однако изобретение не ограничивается использованием данных конкретных кислот, поскольку при использовании любых других кислот, относящихся к алкилфосфоновым и/или к О-алкилалкилфосфоновым - гомологов с более длинной углеродной цепочкой (до С ≤ 10), которым присуще более сильное удерживание на неподвижной фазе, и, следовательно, время их удерживания будет соответственно выше, чем в примерах. Кроме того, данные аналиты являются наиболее известными маркерами химоружия. Изопропилметилфосфоновая кислота является маркером зарина, пинаколилметилфосфоновая кислота - зомана, этилметилфосфоновая кислота - VX, метилфосфоновая кислота является маркером в целом на нервно-параллетические агенты, включая и зарин и зоман и др. Остальные (этил-, пропил-фосфоновые кислоты) входят в Перечень химикатов, подпадающих под действие раздела 2 Списка химикатов, оборудования и технологий, которые могут быть использованы при создании химического оружия и в отношении которых установлен экспортный контроль, утвержденного Указом Президента Российской Федерации от 28 августа 2001 г. №1082, а также Списка 2 Приложения по химикатам к Конвенции о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении.

Для построения градуировочной кривой готовят водные растворы алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот с концентрацией 0,4-10 мкг/мл.

Для разделения алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот используют хроматографическую колонку с длиной, равной 30-150 мм, предварительно промывают ее водой (уравновешивают) со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин в течение не менее 15 минут. Осуществляют введение в колонку водного раствора кислот в количестве 5-20 мкл со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин с помощью автосамплера (шприца). Затем осуществляют введение водного раствора муравьиной кислоты с концентрацией 0,01-0,5% об. со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин для элюирования введенной в колонку пробы. После чего проводят детектирование с помощью масс-спектрометрического детектора - регистрацию отрицательно-заряженных ионов исследуемых О-алкилалкилфосфоновых и/или алкилфосфоновых кислот на масс-спектроскопическом детекторе с построением градуировочной зависимости.

Затем осуществляют жидкостно-хроматографическое разделение исследуемых алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот на той же хроматографической колонке, заполненной пористым графитированным углеродным сорбентом, с длиной, равной 30-150 мм, с теми же параметрами, при которых осуществляют построение градуировочной кривой. Так, предварительно промывают колонку водой (уравновешивают) со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин в течение не менее 15 минут. Затем осуществляют введение с помощью автосамплера в колонку пробы раствора определяемых кислот с деионизированной водой в количестве 5-20 мкл со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин. После чего осуществляют введение водного раствора муравьиной кислоты с концентрацией 0,01-0,5% об. со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин для элюирования введенной в колонку пробы. Затем определяют концентрации алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот масс-спектрометрическим методом по градуировочной зависимости, предварительно построенной для алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот в водном растворе. При этом определяют высоту и/или площади пиков О-алкилалкилфосфоновых и/или алкилфосфоновых кислот в исследуемой пробе (водном растворе) на полученной хроматограмме, после чего рассчитывают их концентрацию (способ расчета концентрации описан в источнике - «Decision and detection limits for calibration curves», Hubaux A., Vos G., «Analytical Chemistry», 1970, V. 42, P. 849-855).

Для определения концентраций аналитов в пробах используют метод внешнего или внутреннего стандарта или их совместное сочетание путем оценки спектральных отношений площадей и/или высот пиков кислот. При применении метода внутреннего стандарта в качестве стандартов используют изотоп-меченные соединения определяемых аналитов.

Пределы обнаружения аналитов по дисперсии параметров градуировочной зависимости рассчитывают следующим образом.

Пусть градуировочная зависимость имеет вид

где Y - рассчитанное значение аналитического сигнала, x - концентрация вещества в градуировочном образце.

При этом дисперсия рассчитываемой по градуировочному уравнению величины Y_k имеет следующий вид:

где m - число экспериментальных измерений аналитического сигнала в ходе градуировки, а х_k - концентрация, соответствующая Y_k, s₀² - дисперсия разности между экспериментальными (y_k) и рассчитанными (Y_k) значениями аналитического сигнала.

Доверительный интервал величины Y_i рассчитывали по формуле

где t(P, f) - коэффициент Стьюдента для вероятности Р и числа степеней свободы f = m-2. Вероятность принимали равной 0,95.

Для каждого Y_k обозначили верхнюю и нижнюю границы доверительного интервала как . Нашли Y_k^верхн для x_k = 0 (то есть рассчитали максимальный аналитический сигнал, который возможно с заданной вероятностью Р получить при отсутствии определяемого компонента в пробе):

Величина Y_min является пороговым значением аналитического сигнала: если в результате анализа получен сигнал Y_k < Y_min, то нельзя сделать вывод о наличии определяемого компонента в пробе, так как такой сигнал можно получить от пробы, не содержащей определяемого компонента. Пороговая величина концентрации, связанная с Y_min градуировочным уравнением

Если в результате анализа получен аналитический сигнал, меньший чем Y_min (уравнение 3), то концентрация определяемого компонента в пробе с заданной вероятностью (Р) не превышает x_min (уравнение 4). Пределом обнаружения метода является x_min, Y_min - критической минимальной величиной аналитического сигнала, ниже которой количественная интерпретация результатов анализа невозможна.

Таким образом, заявленный способ осуществляют со следующим градиентом:

Фаза А - деионизованная вода,

Фаза Б - раствор муравьиной кислоты в деионизованной воде,

0 - X мин - уравновешивание колонки деионизованной водой,

X мин - вкол аналитов (5-20 мкл),

Х-(Х + 10) мин - элюирование раствором муравьиной кислоты.

Примеры конкретного выполнения

Ниже представлены примеры, иллюстрирующие определение концентраций метилфосфоновой (МРА), этилфосфоновой (EtPA) и н-пропилфосфоновой (n-PrPA) кислот, а также метилфосфоновой (МРА), О-этилметилфосфоновой (ЕМРА), О-изопропилметилфосфононовой (iPMPA) и О-пинаколилметилфосфоновой (PiMPA) кислот. Предоставление результатов экспериментов именно по таким кислотам обусловлено тем, что они являются наименее удерживаемыми на графитизированном углеродном сорбенте.

Результаты экспериментов, представленные в примерах 1-5, были получены при проведении испытаний на модельных смесях. Однако при этом возможно осуществление заявленного способа и на реальных объектах. В таком случае при анализе пробы -водного объекта окружающей среды - при необходимости осуществляют его предварительную фильтрацию через мембранный фильтр с размером пор 0,2-0,45 мкм для избавления от крупных частиц во избежание поломки прибора и порчи колонки.

Пример 1

Осуществляли приготовление модельной смеси анализируемых соединений.

Деионизованную воду получали на установке «Millipore Simplicity» («Millipore», США). Для построения градуировочной кривой в мерную колбу, вместимостью 5 мл, вводили денонсированный водный раствор МРА, EtPA, n-PrPA, МРА, ЕМРА, iPMPA, PiPA кислот в ацетонитриле и доводили до метки деионизованной водой, до конечной концентрации 0,4-10 мкг/мл. Осуществляют перемешивание. Приготовленные растворы использовали для дальнейшего ВЭЖХ-МС анализа на хроматографической колонке «Thermo scientific» жидкостного хромато-масс-спектрометра «Shimadzu LCMS-2020», заполненной по длине графитизированным сорбентом, занимающим 90% колонки.

Для приготовления элюентов использовали раствор муравьиной кислоты в воде (50-100% об.) со степенью чистоты «for HPLC» (Sigma-Aldrich, США).

Полученные значения концентраций кислот, время удерживания, коэффициенты удерживания и разрешение пар соседних пиков аналитов на градуировочной кривой представлены в таблице 1. Пределы обнаружения для аналитов лежат в диапазоне от 0,4 до 0,6 мкг/мл.

[1] - данные, приведенные в способе, известном из наиболее близкого аналога, где элюирование осуществляли 0,1% об. раствором муравьиной кислоты («Liquid chromatography analysis of phosphonic acids on porous graphitic carbon stationary phase with evaporative light-scattering and mass spectrometry detection», Mercier J.-P., Morin Ph., Dreux M., Tambute A., «Journal of Chromatography A», 1999, Vol. 849, PP. 197-207).

Мертвое время колонки в способе, известном из наиболее близкого аналога: t_m = 4.7 мин, Мертвый объем в способе, известном из наиболее близкого аналога: V_m = 0.94 мл (оценено по хроматограмме).

При осуществлении способа, известного из наиболее близкого аналога, были получены малые значения коэффициента емкости - 0,8-2,6, из чего следует, что время удерживания аналита на сорбенте является соизмеримым с мертвым временем колонки.

По полученным данным видно, что при осуществлении способа, согласно заявленному изобретению, достигается существенное повышение коэффициента емкости к при достижении оптимального времени удержания аналита на сорбенте, что приводит к повышению разрешения пиков аналитов на хроматограмме и к более высокой точности и чувствительности определения концентрации кислот.

Пример 2

Осуществляли измерение коэффициентов емкости аналитов МРА, EtPA, n-PrPA при различном времени промывании колонки деионизированной водой (таблица 2, фигура 2).

По представленным результатам можно сделать вывод, что осуществление промывки колонки в течение 15 минут является оптимальным, и дальнейшее увеличение времени промывки не приводит к существенному увеличению коэффициентов емкости. При снижении времени промывки менее 15 минут коэффициент емкости существенно снижается.

Пример 3

Осуществляли измерение коэффициентов емкости аналитов МРА, EtPA, n-PrPA при различной концентрации муравьиной кислоты в элюенте при осуществлении предварительной промывки колонки деионизованной водой в течение 20 минут (таблица 3, фигура 3).

При содержании муравьиной кислоты в элюенте от 0,01 до 0,5% об. коэффициенты емкости являются высокими.

Пример 4

Для построения градуировочного графика в мерную колбу на 5 мл вводили растворы метил-, этил- и н-пропилфосфоновой кислот в ацетонитриле для создания конечной концентрации в диапазоне от 0,1 до 10 мкг/мл и доводили деионизованной водой до 5 мл. Раствор тщательно перемешивали.

Для определения использовали жидкостной хромато-масс-спектрометр Shimadzu (Япония), состоящий из следующих модулей:

- квадрупольный масс-спектрометр LCMS-2020 с ионизацией электрораспылением (ESI), химической ионизацией при атмосферном давлении (APCI) и приставкой DUIS для одновременной ионизации в режимах ESI и APCI;

- два ВЭЖХ насоса LC-20;

- автосамплер SIL-20AC.

Полученные растворы с помощью автосамплера подавали в хроматографическую колонку (отношение длины (высоты) к диаметру составляет 30×2,1 мм) с пористым графитированным сорбентом «Hypercarb» (площадь поверхности 120 м²/г, размер частиц 250 средний диаметр частиц 5 мкм). Инжектируемый объем образца составил 20 мкл, скорость потока 0,2 мл/мин. Перед инжекцией анализируемого раствора колонку уравновешивали деионизованной водой в количестве, равном 2-6 мл, в течение 20 минут, при этом вымывая с колонки муравьиную кислоту от предыдущего анализа. После инжекции анализируемого раствора проводили градиентное разделение аналитов деионизованной водой, повышая концентрацию муравьиной кислоты в элюенте до 0,1% об. за 0,01 минуту. Элюирование проводили в течение 10 минут.

Детектирование проводили с помощью масс-спектрометрического детектора. Использовали параметры МС-детектора и интерфейса, указанные в таблице 4. Параметры МС-интерфейса и детектора не оптимизировали, использовали значения, рекомендованные производителем оборудования.

Параметры регистрации ионов аналитов представлены в таблице 5. Величины m/z (отношение массы регистрируемых ионов к их заряду) и режим регистрации ионов выбирали, исходя из строения определяемых веществ. Детектирование проводили в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов.

Регистрировали хроматограмму, по которой рассчитывали площади пиков алкилфосфоновых кислот, идентификацию веществ проводили по масс-спектру.

Условия определения: колонка Hypercarb 30×2.1, элюент: 0,1% об. НСООН в воде, температура колонки 40°С, скорость потока: 0,2 мл/мин, концентрация каждого аналита 1 мкг/мл, МС-детектирование. 1 - метилфосфоновая кислота, 2 - этилфосфоновая кислота, 3 - н-пропилфосфоновая кислота. Хроматограмма представлена на фиг. 4.

Пример 5.

Для разделения метилфосфоновой кислоты (МРА) и ее этилового (ЕМРА), изопропилового (iPMPA) и пинаколилового (PiMPA) эфиров в мерную колбу на 5 мл вводили растворы данных аналитов в ацетонитриле для создания конечной концентрации 0,5 мкг/мл и доводили деионизованной водой до 5 мл. Раствор тщательно перемешивали.

Для определения использовали жидкостной хромато-масс-спектрометр Shimadzu.

Полученный раствор подавали в хроматографическую колонку (30×2,1 мм) с пористым графитированным сорбентом Hypercarb. Инжектируемый объем образца составил 20 мкл, скорость потока 0,2 мл/мин. Перед инжекцией анализируемого раствора колонку уравновешивали деионизованной водой в течение 20 минут, при этом вымывая с колонки муравьиную кислоту от предыдущего анализа. Градиентное разделение аналитов проводили при повышении концентрации муравьиной кислоты в элюенте до 0,5% об. за 0,01 минуту. Элюирование проводили в течение 15 минут (фиг. 3).

Параметры регистрации ионов и времена удерживания аналитов представлены в таблице 6. Величины m/z и режим регистрации ионов выбирали, исходя из строения определяемых веществ. Детектирование проводили в отрицательном режиме.

Хроматограмма метилфосфоновой кислоты (МРА) и ее этилового (ЕМРА), изопропилового (iPMPA) и пинаколилового (PiMPA) эфиров представлена на фигуре 3. Условия определения: собрент: Hypercarb 30×2.1, элюент: 0,5% об. НСООН в воде, температура колонки: 40°С, скорость потока: 0,2 мл/мин, концентрация каждого аналита: 1 мкг/мл, МС-детектирование. 1 - метилфосфоновая кислота, 4 - этилметилфосфоновая кислота, 5 - изопропилфосфоновая кислота, 6 - пинаколилфосфоновая кислота.

Значение мертвого времени используемой в заявленном изобретении хроматографической колонки V_m = 0.9 min.

Таким образом, заявленный способ определения концентрации алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот в водных растворах, включающий высокоэффективное жидкостно-хроматографическое (ВЭЖХ) разделение аналитов в режиме градиентного элюирования, обеспечивает повышение времени удерживания аналита на сорбенте, увеличение чувствительности и селективности определения.

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к количественному определению малых концентраций О-алкилалкилфосфоновой и/или алкилфосфоновой кислоты в объектах окружающей среды и биологических объектах с целью установления факта применения фосфорорганических боевых отравляющих веществ. Заявленный способ включает жидкостно-хроматографическое разделение упомянутых кислот в хроматографической колонке, заполненной пористым графитированным углеродным сорбентом, при котором хроматографическую колонку используют с длиной, равной 30-150 мм. При этом хроматографическую колонку предварительно промывают водой со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин в течение не менее 15 минут, после чего осуществляют введение в колонку пробы исследуемого водного раствора в количестве 5-20 мкл со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин. Затем осуществляют введение водного раствора муравьиной кислоты с концентрацией 0,01-0,5 об.% со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин для элюирования введенной в колонку пробы с последующим определением концентрации алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот масс-спектрометрическим методом по градуировочной зависимости, предварительно построенной для алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот в водном растворе. Технический результат - повышение коэффициента емкости (коэффициента массового распределения), что приводит к повышению разрешения пиков аналитов на хроматограмме и к более высокой точности и чувствительности определения концентрации кислот. 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл.

1. Способ определения концентрации алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот в водном растворе, характеризующийся тем, что осуществляют жидкостно-хроматографическое разделение упомянутых кислот в хроматографической колонке, заполненной пористым графитированным углеродным сорбентом, при этом хроматографическую колонку используют с длиной, равной 30-150 мм, предварительно промывают ее водой со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин в течение не менее 15 минут, после чего осуществляют введение в колонку пробы исследуемого водного раствора в количестве 5-20 мкл со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин, затем осуществляют ввод водного раствора муравьиной кислоты с концентрацией 0,01-0,5 об.% со скоростью потока 0,1-0,2 мл/мин для элюирования введенной в колонку пробы с последующим определением концентрации алкилфосфоновых и/или О-алкилалкилфосфоновых кислот масс-спектрометрическим методом с использованием предварительно построенной градуировочной зависимости.

2. Способ определения концентрации по п. 1, характеризующийся тем, что предварительное промывание колонки осуществляют в течение не более 30 мин.

3. Способ определения концентрации по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве алкилфосфоновых кислот определяют метилфосфоновую, этилфосфоновую и н-пропилфосфоновую кислоты.

4. Способ определения концентрации по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве О-алкилалкилфосфоновых кислот определяют О-этилметилфосфоновую, О-изопропилметилфосфононовую и О-пинаколилметилфосфоновую кислоты.

5. Способ определения концентрации по п. 1, характеризующийся тем, что используют хроматографическую колонку с длиной, равной 30 мм, и диаметром, равным 2,1 мм.

6. Способ определения концентрации по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве графитированного углеродного сорбента используют сорбент с площадью поверхности частиц (120±5%) м²/г, размером частиц (250±5%) и средним диаметром частиц (5±5%) мкм.

7. Способ определения концентрации по п. 1, характеризующийся тем, что используют хроматографическую колонку, на 80-100% заполненную пористым графитированным углеродным сорбентом.

8. Способ определения концентрации по п. 1, характеризующийся тем, что введение водного раствора муравьиной кислоты в частном случае осуществляют в количестве 1-3 мл.