ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Уровень техники
В настоящее время мир находится в состоянии чрезвычайной ситуации в области здравоохранения из-за наличия массовой инфекции вирусом SARS-CoV2.
Несмотря на все усилия медицинского и научного сообщества в области здравоохранения, не было найдено ни одного излечивающего лечения или лечения, уничтожающего вирус.
На основании вышеизложенного были предприняты бесчисленные усилия, чтобы помочь пациентам, страдающим этим заболеванием, исправить это патологическое состояние и его возможные последствия.
Инфекция, вызванная вирусом SARS-CoV2, приводит к массовой гибели клеток в лёгких и других органах, что сопровождается состоянием гипервоспаления, что вызывает фиброз лёгких у выздоровевших больных и смерть у больных с полиорганной недостаточностью.
В попытке контролировать воспалительный процесс, приводящий к альвеолярной деструкции и фиброзу с последующей потерей функции органа дыхания, показано действие моноклональных антител к рецептору IL-6 (тоцилизумаб) и оценено использование мезенхимальных клеток-предшественников.
Общим знаменателем этих исследований является модулирование воспалительной реакции, тем самым сокращая период указанного состояния и потенциально ограничивая развитие фиброза лёгких.
Роль некоторых иммунодепрессантов, таких как кортикостероиды, колхицин и ингибиторы сигнального пути JAK/STAT, также оценивается как ресурс для модуляции иммунного ответа.
На основании вышеизложенной информации использование иммунорегулятора, а не иммунодепрессанта, такого как коллагенполивинилпирролидон, (зарегистрированный товарный знак Fibroquel; код SSA: 010 000 3999), который имеет механизм действия, в котором он соответствующим образом: отрицательно модулирует экспрессию IL-1β, IL-8, TNF-α, TGF-β1, IL-17, Cox-1, молекул адгезии лейкоцитов (ELAM-1, VCAM-1 и ICAM-1), значительно увеличивает уровни медиаторов и стимулирует механизмы модуляции воспаления (экспрессию IL-10 и количество регуляторных Т-клеток); аналогичным образом, он уменьшает фиброз тканей и может оказывать влияние на контроль цитокинового шторма, возникающего из-за гипервоспаления, вызванного синдромом активации макрофагов (вторичный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз).
Важно отметить, что коллагенполивинилпирролидон (коллаген-ПВП) был защищён мексиканским патентом № 264089 и его аналогами как в Европе, так и в других юрисдикциях. Патент '089 описывает и подтверждает использование коллагена-ПВП для модуляции хронического воспаления суставов, где все результаты в отношении ревматоидного артрита (РА) и остеоартрита (ОА) подробно обсуждаются с использованием различных подходов, которые охватывают клинические, патологические, гистологические, биомеханические, биохимические и иммунологические аспекты анализа тканей полости пораженного сустава и, в частности, как РА, так и ОА, рассматривая их как аутоиммунные и неаутоиммунные воспалительные процессы соответственно; было предложено использовать препарат на основе коллагена-ПВП для лечения этих заболеваний и проанализированы его взаимодействия с клетками в организме человека, чтобы избежать нежелательных побочных эффектов, таких как токсичность и иммуногенность, в поисках альтернативы, позволяющей избежать хирургического вмешательства.
Механизм регуляции воспаления, вызываемый полимеризованным коллагеном I типа, поддерживается двумя моделями: первая, неаутоиммунное воспаление [модель остеоартрита (ОА)] и вторая, аутоиммунное воспаление [модель ревматоидного артрита (РА)].
Модель неаутоиммунного (ОА) и аутоиммунного (АР) воспаления
Совместное культивирование хряща и синовиальной оболочки проводили у 9 пациентов с РА и 8 пациентов с ОА, перенесших эндопротезирование тазобедренного или коленного сустава (Табл. 1). Ткань сустава культивировали с (а) RPMI (контроль), (б) 1% полимеризованным коллагеном типа I в течение 7 дней. Собирали супернатанты и ткани через 1 и 7 дней. В культуральных супернатантах определяли концентрацию IL-1β, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α и IFN-γ с помощью ИФА и результаты нормализовали на концентрацию общего белка. Экспрессию IL-1β и TNF-α оценивали с помощью гистохимии.
Демографические и клинические данные пациентов подробно представлены на Фиг. 1.
Синтез провоспалительных цитокинов в хрящевых и синовиальных культурах пациентов с РА или ОА
В патофизиологию ОА и РА вовлечено большое количество цитокинов (про- и противовоспалительных) и факторов роста. Было показано, что среди провоспалительных цитокинов ключевую роль в развитии этих заболеваний играют IL-1β и TNF-α. Добавление полимеризованного коллагена I типа к совместным культурам RA или OA снижало тканевую экспрессию TNF-α по сравнению с контролем в синовиальной ткани (Фиг. 2).
Фиг. 2. Влияние полимеризованного коллагена I типа на экспрессию TNF-α. (A) Клетки, иммунореактивные к TNF-α, в синовиальной ткани совместных культур. (B) Иммунореактивные TNF-α+ клетки в хряще из совместных культур. Ревматоидный артрит (РА): левая панель. Остеоартрит (ОА): правая панель. Базальные: ткань в базальных условиях. Контрольный день 7: контрольная ткань, выращенная на среде RPMI в течение 7 дней и не подвергавшаяся никакой обработке. Каждое культивирование проводили в трёх повторах для каждого состояния, из которых анализировали не менее двух срезов каждой из тканей. Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (SEM) процентного содержания иммунореактивных клеток в 9 совместных культурах пациентов с РА и 8 с ОА. *p≤0,002.
Уровни провоспалительных цитокинов в супернатантах хрящевой и синовиальной совместных культур от пациентов с РА или ОА
Аналогичным образом, добавление полимеризованного коллагена типа I к совместным культурам РА или OA снижало экспрессию IL-1β и TNF-α по сравнению с контролем в супернатантах на 7-й день культивирования (Фиг. 3 и Фиг. 4 соответственно).
Фиг. 3. Влияние полимеризованного коллагена I типа на экспрессию IL-1β в супернатантах совместных культур хряща и синовиальной оболочки пациентов с ревматоидным артритом (РА) или остеоартритом (ОА). Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для 9 совместных культур хрящевой и синовиальной ткани пациентов с РА и для 8 совместных культур пациентов с ОА. Каждое культивирование проводили в трёх повторах для каждого условия. Результаты нормализовали по концентрации общего белка в супернатанте, определённой микрометодом Фолина-Леври. РА: левая панель. ОА: панель справа. Базальные: ткань в базальных условиях. Контрольный день 7: контрольная ткань, выращенная на среде RPMI в течение 7 дней и не подвергавшаяся никакой обработке. *p≤0,008.
Фиг. 4. Влияние полимеризованного коллагена I типа на экспрессию TNF-α в супернатантах совместных культур хряща и синовиальной ткани пациентов с ревматоидным артритом (РА) или остеоартритом (ОА). Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для 9 совместных культур хряща и синовиальной оболочки пациентов с РА и для 8 совместных культур пациентов с ОА. Каждое культивирование проводили в трёх повторах для каждого условия. Результаты нормализовали по концентрации общего белка в супернатанте, определенной микрометодом Фолина-Леври. АР: левая панель. ОА: панель справа. Базальные: ткань в базальных условиях. Контрольный день 7: контрольная ткань, выращенная на среде RPMI в течение 7 дней и не подвергавшаяся никакой обработке. *p≤0,008.
Аналогичная картина наблюдалась в отношении концентрации IL-8 в супернатантах совместных культур (Фиг. 5). Однако наибольшее снижение было выявлено в совместных культурах тканей пациентов с РА, получавших полимеризованный коллаген I типа. В культурах не были обнаружены определяемые уровни IL-12 и IFN-γ.
Фиг. 5. Влияние полимеризованного коллагена I типа на экспрессию IL-8 в супернатантах совместных культур хрящевой и синовиальной тканей пациентов с ревматоидным артритом (РА) или остеоартритом (ОА). Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для 9 совместных культур хряща и синовиальной оболочки пациентов с РА и для 8 совместных культур пациентов с ОА. Каждое культивирование проводили в трёх повторах для каждого условия. Результаты нормализовали по концентрации общего белка в супернатанте, определённой микрометодом Фолина-Леври. РА: левая панель. ОА: панель справа. Базальные: ткань в базальных условиях. Контрольный день 7: контрольная ткань, выращенная на среде RPMI в течение 7 дней и не подвергавшаяся никакой обработке. *p≤0,006.
Уровни противовоспалительных факторов в супернатантах хрящевой и синовиальной совместных культур от пациентов с РА или ОА
Добавление полимеризованного коллагена типа I к совместным культурам РА или ОА увеличивало концентрацию IL-10 в супернатантах совместных культур в 10-25 раз до статистически значимых уровней на 7-й день по сравнению с 1-м днём культивирования (Фиг. 6).
Фиг. 6. Влияние полимеризованного коллагена I типа на экспрессию IL-10 в супернатантах совместных культур хряща и синовиальной ткани пациентов с ревматоидным артритом (РА) или остеоартритом (ОА). Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для 9 совместных культур хряща и синовиальной оболочки пациентов с РА и для 8 совместных культур пациентов с ОА. Каждое культивирование проводили в трёх повторах для каждого условия. Результаты нормализовали по концентрации общего белка в супернатанте, определённой микрометодом Фолина-Леври. РА: левая панель. ОА: панель справа. Базальные: ткань в базальных условиях. Контрольный день 7: контрольная ткань, выращенная на среде RPMI в течение 7 дней и не подвергавшаяся никакой обработке. *p≤0,006.
Экспрессия генов про- и противовоспалительных цитокинов в совместных культурах тканей хряща и синовиальной ткани больных РА или ОА
Оценка экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов показала, что добавление полимеризованного коллагена I типа в совместные культуры тканей суставов пациентов с РА негативно регулирует транскрипцию таких генов, как TNF-α и IL-23 (Фиг. 7а, б) и положительно - регуляторных Т-клеток, FOXP3, на статистически значимых уровнях по сравнению с контролем (Фиг. 7б).
Фиг. 7. Влияние полимеризованного коллагена I типа на экспрессию генов про- и противовоспалительных цитокинов и факторов в тканях совместных культур хрящевой и синовиальной тканей больных ревматоидным артритом (РА). (а) Количественная оценка экспрессии генов IL-1β, TNF-α, IL-6 и IL-10 и (б) Количественная оценка экспрессии генов IL-23 и Foxp3 с помощью ОТ-ПЦР в тканях синовиальной оболочки и хряще, совместно культивируемых в течение 7 дней. Столбцы показывают среднее значение ± стандартное отклонение уровней транскриптов образцов, нормализованное по экспрессии конститутивного гена GADPH, определённой с помощью 2ΔΔCt. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для 9 совместных культур хряща и синовиальной оболочки пациентов с РА. Каждое культивирование проводили в трёх повторах для каждого условия. Базальные: ткань в базальных условиях. Контрольный день 7: контрольная ткань, выращенная на среде RPMI в течение 7 дней и не подвергавшаяся никакой обработке. Значения *p≤0,05 считались статистически значимыми.
В то время как добавление полимеризованного коллагена I типа к совместным культурам тканей суставов пациентов с ОА индуцировало отрицательную регуляцию экспрессии гена TNF-α, оно же приводило к положительной регуляции Foxp3 на статистически значимых уровнях по сравнению с контролем (Фиг. 8).
Фиг. 8. Влияние полимеризованного коллагена I типа на экспрессию генов про- и противовоспалительных цитокинов и факторов в совместных культурах тканей хряща и синовиальной ткани больных остеоартрозом (ОА). (а) Количественная оценка экспрессии генов IL-1β, TNF-α, IL-6 и IL-10, (б) IL-23 и Foxp3 методом ОТ-ПЦР в совместно культивируемых тканях хряща и синовиальной оболочки в течение 7 дней. Столбцы показывают среднее значение ± стандартное отклонение уровней транскриптов образцов, нормализованное по экспрессии конститутивного гена GADPH, определённой с помощью 2ΔΔCt. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение 8 совместных культур от пациентов с ОА. Каждое культивирование проводили в трёх повторах для каждого условия. Базальные: ткань в базальных условиях. Контрольный день 7: контрольная ткань, выращенная на среде RPMI в течение 7 дней и не подвергавшаяся никакой обработке. Значения *p ≤ 0,05 считались статистически значимыми.
В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что добавление полимеризованного коллагена I типа к совместным культурам хряща и синовиальной оболочки пациентов с РА снижало синтез провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, IL-8, IL-23 и TNF-α на уровне гена и белка, что может быть прямо или косвенно связано с наблюдаемым усилением регуляторных механизмов воспаления, опосредованным повышением уровня IL-10 и экспрессией гена Foxp3 в регуляторных Т-клетках.
При обоих заболеваниях синовиальная оболочка, а не хрящ, по-видимому, является тканью, которая вносит наибольший вклад в синтез растворимых провоспалительных факторов.
Действие полимеризованного коллагена типа I, по-видимому, зависит от стадии активации клеток, как показано Jou I-M, и др., 2005 и Furuzawa-Carballeda и др., 2003, поскольку добавление полимерного ателопептида коллагена типа I к покоящимся клеткам не вызывает никакого ответа, то есть, не имеет никакого эффекта.
Полученные результаты согласуются с анализом различных белков внеклеточного матрикса, которые использовались в качестве потенциально терапевтических молекул в животных моделях:
a) аутоиммунные заболевания, такие как РА, при которых синтетические пептиды фибронектина, как было оценено, ингибируют или прерывают инфильтрацию воспалительных клеток в полость сустава (Hines KL, 1994; Wahl SM, 1994), или тромбоспондин-1 (TSP-1) и ангиостатин (фрагменты плазминогена) в качестве стратегии ингибирования ангиогенеза (Yin G, 2002; Jou I-M, 2005);
b) Подавление или ингибирование роста опухоли и метастазирования, например эндостатин (фрагменты коллагена XVIII)-ангиостатином и растворимым Tie-2, которые усиливают подавление роста опухоли предстательной железы и меланомы (Scappaticci FA, 2001; Raikwar SP, 2005) или комплексами эндостатина с ДНК в катионных липосомах для предотвращения метастазирования остеосаркомы (Peterszegi G, 1998; Pasco S, 2003; Honerbeck W, 2003; Maquart FX, 2004; Bellon F, 2004; Duca L, 2004; Pasco S, 2004; Maquart FX, 2005).
В заключение, полимеризованный коллаген типа I индуцирует негативную регуляцию экспрессии некоторых провоспалительных цитокинов, стимулирует выработку противовоспалительных цитокинов и экспрессию Foxp3 в регуляторных Т-клетках, способствуя механизмам негативной модуляции воспаления.
Модель аутоиммунного воспаления (РА). Оценка регуляторного эффекта воспаления, индуктора иммунологической толерантности и механизма действия полимеризованного коллагена I типа в модели коллаген-индуцированного артрита (КИА) на мышах
Цель исследования состояла в том, чтобы оценить, способно ли внутримышечное применение полимеризованного коллагена I типа или полимеризованного коллагена I типа в сочетании с метотрексатом (MTX) предотвратить развитие или прогрессирование артрита, индуцированного инъекцией коллагена (КИА), у грызунов. Эффект определяли на клиническом, гистологическом и молекулярном уровне путём сравнения результатов с золотым стандартом лечения: МТХ.
Для этого были исследованы 3 модели:
Модель токсичности. Двадцати одному 8-недельному самцу мыши линии DBA1/OlaHsd вводили 100 мкл (а) плацебо (цитратный буфер), (б) полимеризованный коллаген типа I, (в) МТХ (2,5 мг/кг), (г) полимеризованный коллаген типа I (б) с MTX (в) (объём:объём), еженедельно в течение шести недель. Три животных были усыплены на шестой неделе и три на тринадцатой неделе. Для оценки воспалительного инфильтрата, преобладающих клеточных популяций и экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов брали селезенку, лимфатические узлы, суставную ткань, печень, лёгкие, почки и сердце.
Модель раннего артрита. Пятьдесят мышей с такими же характеристиками иммунизировали в основание хвоста 100 мкг куриного коллагена II типа, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда. На 21-й день в основание хвоста вносили бустер с помощью 100 мкг коллагена II типа, эмульгированного с неполным адъювантом Фрейнда. В один и тот же день стимуляции препараты (a-d) применяли каждую неделю в течение шести недель. Три животных были усыплены на шестой неделе и три на тринадцатой неделе. Для оценки воспалительного инфильтрата, преобладающих клеточных популяций и экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов брали селезенку, лимфатические узлы, суставную ткань, печень, лёгкие, почки и сердце.
Модель развившегося артрита. Артрит индуцировали, как и в предыдущей модели, у 50 мышей, и препараты вводили внутримышечно, после 2 недель бустерной терапии, каждую неделю в течение 6 недель. Три животных были усыплены на восьмой неделе и три на пятнадцатой неделе. Для оценки воспалительного инфильтрата, преобладающих клеточных популяций и экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов брали селезенку, лимфатические узлы, суставную ткань, печень, лёгкие, почки и сердце.
Гистологическая оценка. Воспалительный инфильтрат и архитектуру тканей оценивали с помощью окрашивания H&E и трихромом по Массону, а содержание протеогликанов - методом PAS.
Цитометрическая оценка. Используя FACS, определяли процент популяций Th1 (CD4+/IFN-γ+), Th2 (CD4+/IL-4+), Treg (CD4+/FOXP3+), Th17 (CD4+/IL-17+) и дендритных (CD4-/CD11c+) клеток в клетках селезенки.
Влияние полимеризованного коллагена I типа и смеси полимеризованного коллагена I типа и метотрексата (МТХ) в модели токсичности
Ни один из методов лечения, оцениваемых в исследовании, не вызывал токсичности у мышей. Её оценивали путём макроскопического и гистопатологического анализа почек, сердца, лёгких, селезенки, лимфатических узлов и задних конечностей. Все проанализированные ткани имели нормальную архитектуру. Воспалительных инфильтратов и других аномалий не выявлено.
Гистопатологический анализ действия полимеризованного коллагена I типа на модели раннего (профилактического) и длительного (позднего или паллиативного) артрита
Гистопатологический анализ был выполнен на задних лапах мышей с КИА двумя исследователями вслепую. Репрезентативные изображения окрашенных H&E и PAS срезов суставной ткани из групп КИА, обработанных (a) плацебо, (б) полимеризованным коллагеном типа I, (в) MTX, представлены на Фиг. 9. Мыши КИА демонстрировали типичный артрит, который характеризуется обширной инфильтрацией воспалительными клетками, синовиальной гиперплазией, сужением суставной щели и эрозией костей. Лечение полимеризованным коллагеном I типа уменьшило степень воспаления и сохранило структуру сустава. В то же время лечение полимеризованным ателопептидом коллагена I типа/МТХ привело к значительному уменьшению воспалительных инфильтратов и восстановлению тканевой архитектуры. МТХ индуцировал некоторые тканевые аномалии, такие как наличие узелков (аморфная фибриновая ткань) и плохое качество репарационной ткани, а также воспалительные инфильтраты. Эффект различных условий сохранялся до второго усыпления (Фиг. 10).
Фиг. 9. Паллиативный эффект полимеризованного коллагена I типа на гистологические повреждения у мышей с КИА. Окраска гематоксилином, эозином и PAS. (а) Репрезентативная часть первой мыши. (б) Репрезентативная часть второй мыши. Увеличение или усиление гистологии соответствует 100X.
Влияние полимеризованного коллагена I типа в модели раннего (профилактического) и длительного (позднего или паллиативного) артрита на процент субпопуляций CD4+ Т-клеток селезенки
Процент Th17-клеток селезенки у мышей без КИА (контроль) составил ~1,3%, а у мышей с КИА на модели раннего артрита 2,5% и 4,3% при первом и втором умерщвлении, соответственно (Фиг. 10а и б) и 2,4% и 3,6%, для первого и второго умерщвления, соответственно, в модели длительного артрита (Фиг. 10в и г).
Полимеризованный коллаген типа I (б), MTX (в) и их комбинация (г) вызывали устойчивое и статистически значимое снижение, которое поддерживало уровни провоспалительных клеток, Th17, в диапазонах, считающихся нормальными, как в начале модели артрита при первом и втором умерщвлении (1,0-1,4% и 0,9-1,35% соответственно, Фиг. 10А и B), а в модели длительного артрита при первом и втором умерщвлении (0,5-0,45% и 0,9- 1,45% соответственно, Фиг. 10в и г).
Количество циркулирующих клеток Th2 изменялось только во время первого умерщвления с обработкой полимеризованным коллагеном типа I (б) в модели раннего артрита (Фиг. 10г).
Следует отметить, что лечение раннего и длительного артрита полимеризованным коллагеном I типа (b) и смесью в сочетании с метотрексатом (d) индуцировало увеличение регуляторных Т-клеток Foxp3+ до статистически значимого уровня по сравнению с таковым у мышей с артритом, получавших (а) плацебо или носитель, и выше, чем у здоровых мышей как при первом, так и при втором умерщвлении (Фиг. 10а, б, в и г). В то время как (c) MTX индуцировал значительное снижение процента этих клеток в обеих моделях.
Что касается регуляторных клеток, ранее известных как супрессорные Т-клетки (от 5% до 15% периферических и тканевых CD4+ Т-клеток у здоровых людей), они проявляют внешнюю клеточную иммуносупрессию и толерантность к собственным и чужеродным антигенам. Клетки Treg модулируют естественный ход иммунных реакций, защищая ткани от воспаления, ограничивая повреждение и предотвращая аутоиммунитет. Они подавляют иммунные ответы, продуцируя гранзимы и перфорины, истощая IL-2, секретируя молекулы-супрессоры, такие как IL-19 и TGF-β1, и снижая функции антигенпрезентирующих клеток (АПК), кроме того, они способствуют анергии или апоптозу эффекторов Т-клеток. Таким образом, клетки Treg играют важную роль в восстановлении тканей и гомеостазе.
Фиг. 10. Влияние полимеризованного коллагена I типа в модели раннего (профилактического) и длительного (позднего или паллиативного) артрита на процент субпопуляций CD4+ Т-клеток селезенки. (а) Клетки селезенки, полученные ex vivo в модели раннего артрита во время первого умерщвления. (б) Клетки селезенки, полученные ex vivo в модели раннего артрита во время второго умерщвления. (в) Клетки селезенки, полученные ex vivo в модели длительного артрита во время первого умерщвления. (г) Клетки селезенки, полученные ex vivo в модели длительного артрита во время второго умерщвления. Внутриклеточную продукцию IL-17A, IL-4, IFN-γ и Foxp3 CD4+ T-клетками определяли с помощью проточной цитометрии. Результаты являются репрезентативными для 6 мышей, проанализированных в каждой группе. Горизонтальная пунктирная линия представляет средние нормальные значения, полученные у мышей без КИА (n = 3). Данные представляют собой среднее ± ESM. * p<0,05.
Влияние полимеризованного коллагена I типа в модели раннего (профилактического) и длительного (позднего или паллиативного) артрита на процент CD4-/CD11c+ дендритных клеток в селезенке
Клетки CD11c представляют собой дендритные клетки, которые связывают врожденный иммунный ответ с адаптивным за счёт рекрутирования иммунных эффекторных клеток, таких как NK-клетки, NKT (естественные Т-клетки-киллеры) и нейтрофилы. Кроме того, дендритные клетки выполняют основную функцию представления антигенов и направления иммунного ответа. В модели раннего артрита клетки CD11c были представлены в более низком и статистически значимом процентном соотношении при трёх обработках по сравнению с контролем во время второго умерщвления (Фиг. 11а). В то время как в модели развившегося артрита клетки CD11c присутствовали в более низком и статистически значимом проценте в трёх обработках по отношению к контролю, как в первом, так и во втором умерщвлении (Фиг. 11в, г).
Фиг. 12. Влияние полимеризованного коллагена I типа в модели раннего (профилактического) и длительного (позднего или паллиативного) артрита на процентное содержание клеток CD11c+ в селезенке. (а) Клетки селезенки, полученные ex vivo в модели раннего артрита во время первого умерщвления. (б) Клетки селезенки, полученные ex vivo в модели раннего артрита во время второго умерщвления. (в) Клетки селезенки, полученные ex vivo в модели длительного артрита во время первого умерщвления. (г) Клетки селезенки, полученные ex vivo в модели длительного артрита во время второго умерщвления. Экспрессию CD11c определяли с помощью проточной цитометрии. Результаты являются репрезентативными для 6 мышей, проанализированных в каждой группе. Горизонтальная пунктирная линия представляет средние нормальные значения, полученные у мышей без КИА (n = 3). Данные представляют собой среднее ± ESM. * p <0,05.
Влияние полимеризованного коллагена I типа в модели раннего (профилактического) и длительного (позднего или паллиативного) артрита на транскрипционный фактор NF-kB
Мы делаем вывод, что механизм действия полимеризованного коллагена I типа может быть обусловлен регуляцией транскрипционного фактора NF-κB и AP-1. В частности, NF-kB регулирует экспрессию провоспалительных ферментов, цитокинов, хемокинов, иммунорецепторов и молекул клеточной адгезии, а также апоптоз. В свете этих данных экспрессия NF-κBp65 и его ингибитора IκBα в спленоцитах была проанализирована ex vivo (Фиг. 12).
У мышей с КИА процент спленоцитов NF-kB+ и IκBα+ был выше, а процент NF-kB+/IκBα+ ниже по сравнению с мышами без КИА и при введении препаратов, особенно полимеризованного коллагена I типа или смеси в сочетании с метотрексатом как на ранних, так и на длительных моделях артрита (Фиг. 12). Процентное содержание комплексов NF-kB+ с его ингибитором IκBα+ возрастало до статистически значимого уровня в этих группах мышей с ранним и длительным артритом при лечении полимеризованным коллагеном I типа (лечение b) и МТХ с полимеризованным коллагеном I типа (лечение d), что предполагает негативную регуляцию фактора транскрипции и, следовательно, воспаления.
Фиг. 12. Влияние полимеризованного коллагена I типа в модели раннего (профилактического) и длительного (позднего или паллиативного) артрита на экспрессию ex vivo NF-κB и IκB-α в спленоцитах. (а) Клетки селезенки мышей с ранним артритом при первом умерщвлении. (б) Спленоциты, полученные сразу после второго умерщвления. (в) Клетки селезенки от мышей с моделью длительного артрита при первом умерщвлении. (г) Спленоциты, полученные сразу после второго умерщвления. Внутриклеточные уровни клеток NF-κBp65 и IκBα определяли с помощью проточной цитометрии. Результаты являются репрезентативными для 6 мышей, проанализированных в каждой группе. Горизонтальная пунктирная линия представляет средние нормальные значения, полученные у мышей (n = 3) без КИА. Данные представляют собой среднее ± SEM. * p <0,05.
Побочные эффекты
Не было свидетельств побочных эффектов после инъекции плацебо или различных видов лечения на протяжении всего исследования. Единственным наблюдаемым нежелательным явлением была боль, продолжавшаяся менее 15 минут в месте инъекции.
В заключение, с помощью модели токсичности можно было убедиться, что не было ни повреждения анализируемых органов, ни какой-либо токсичности при любом из оцениваемых условий.
Исследование показало, что как (а) полимеризованный коллаген I типа в качестве монотерапии, так и комбинация (г) полимеризованного коллагена I типа с метотрексатом проявляют как профилактическое, так и паллиативное действие в модели КИА за счёт негативной регуляции антигенной презентации (снижение популяции CD11c+), субпопуляции клеток Th17 (1,5-2,0Х и 3,0-4,0Х, соответственно) и положительной регуляции клеток Treg (5,0-6,0Х и 5,5-6,0, соответственно). Механизм действия, по-видимому, напрямую связан с регуляцией фактора транскрипции NF-kB.
Сустав мышей с КИА, обработанных полимеризованным коллагеном I типа (б), сохранял тканевую архитектуру, сходную с нормальной, без воспалительных инфильтратов, костных эрозий или потери суставной щели, а также содержания протеогликанов. Лечение полимеризованным коллагеном I типа было безопасным и эффективным. Никаких побочных эффектов не было.
На этом фоне становится ясно, что препарат, способный модулировать растворимые про- и противовоспалительные медиаторы, а также количество провоспалительных эффекторных клеток и клеток, регулирующих воспаление, может быть полезен для лечения различных воспалительных процессов, как острых, так и хронических, а также аутоиммунных и неаутоиммунных процессов короткой или длительной эволюции. Однако нельзя просто предполагать, что препарат эффективно действует при всех случаях воспаления, поэтому целью настоящего изобретения является оценка клинико-иммунологического эффекта внутримышечного введения полимеризованного коллагена I типа при цитокиновом шторме у пациентов с лёгкой до тяжёлой и потенциально полукритической формой заболевания вследствие COVID-19.
Другой целью настоящего изобретения является оценка применения лекарственного средства согласно настоящему изобретению в клиническом течении пациентов с диагнозом COVID-19.
Ещё одной целью настоящего изобретения является оценка клинического эффекта применения полимеризованного коллагенового препарата типа I, вводимого внутримышечно пациентам с диагнозом COVID-19 от лёгкой до полукритической степени.
Другой целью настоящего изобретения является предложение терапевтической схемы для препарата полимеризованного коллагена типа I, вводимого внутримышечно пациентам с диагнозом COVID-19 от лёгкой до умеренной степени тяжести (Таблица 1; критерии 1-4).
Ещё одной целью настоящего изобретения является предложение терапевтической схемы препарата полимеризованного коллагена типа I, вводимого внутримышечно пациентам с диагнозом тяжёлой или полукритической инфекции COVID-19 (Фиг. 1, Таблица 1; критерии 5-6).
Другой целью настоящего изобретения является демонстрация того, что коллаген-ПВП является препаратом, который оказывает регулирующее действие на цитокиновый шторм как на ранних, так и на поздних стадиях инфекции, вызванной SARS-CoV2 (COVID-19).
Ещё одной целью настоящего изобретения является экспериментальное подтверждение и демонстрация того, что коллаген-ПВП является препаратом, который можно использовать при гипервоспалительном процессе, наблюдаемом при инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV2 (COVID-19), с явственно положительными и очень важными эффектами, без нежелательных побочных эффектов, как это было продемонстрировано более двадцати лет назад.
Дополнительной целью настоящего изобретения является оценка на иммунологическом уровне эффекта внутримышечного введения полимеризованного коллагена I типа у пациентов с заболеванием от умеренной до тяжёлой степени, вызванным SARS-CoV2 (COVID-19).
Ещё одной целью настоящего изобретения является продемонстрировать, что полимеризованный коллаген типа I, вводимый внутримышечно, модифицирует постпневмонический фиброз, вызванный SARS-CoV2 (COVID-19), предотвращая развитие фиброзных осложнений у пациента, не вызывая побочных эффектов (на основе результатов предыдущих исследований).
Стоит отметить, что полимеризованный коллаген типа I был разработан в Мексике мексиканскими исследователями, и их исследование было одобрено и поддержано CONACyT в различных случаях (CONACyT SALUD 2002-01-7421; CONACyT SALUD 2003-C01-127/B1; CONACyT SALUD 2004-C01-65; INNOVAPYME C0003 2012-01), поэтому его применение поддерживается различными исследованиями, имеющими отношение к текущему кризису в области здравоохранения в Мексике и во всем мире.
Краткое описание настоящего изобретения
Применение препарата согласно настоящему изобретению, то есть применение коллаген-поливинилпирролидона (коллаген-ПВП), которое осуществляли внутримышечно, обусловлено его системным действием, поскольку он мог негативно регулировать экспрессию провоспалительных цитокинов, молекул адгезии лейкоцитов, и увеличение как IL-10, так и количества регуляторных Т-клеток, что может привести к важным преимуществам для лечения гипервоспалительной фазы, которую имеют пациенты с SARS-CoV2 (COVID-19).
Если этот препарат вводится внутримышечно, он может модифицировать постпневмонический фиброз, вызванный SARS-CoV2 (COVID-19), предотвращая синдром острой дыхательной недостаточности, тем самым предотвращая развитие фиброзных осложнений у пациента, не вызывая побочных эффектов (на основании результатов предыдущего исследования).
Вышеупомянутое применение оценивалось как адъювантное лечение в пилотном исследовании с двумя группами, одна с внутримышечным введением 1,5 мл активного ингредиента, а другая с 1,5 мл носителя, в течение 3 дней каждые 12 часов и в течение 4 дней каждые 24 часа, чтобы сделать всего 7 дней лечения общей дозой 15 мл коллаген-ПВП у пациентов с пневмонией лёгкой и средней степени тяжести, вызванной COVID-19 (Таблица 1; категории 1-4). Клиническое улучшение, изменение уровней системного воспаления и растворимых провоспалительных медиаторов, а также фиброз оценивали через 7 и 14 дней после лечения. Аналогичным образом оценивали эффект от внутримышечного введения 1,5 мл активного начала в течение 7 дней каждые 12 часов для получения в общей сложности 21 мл коллагена-ПВП у пациентов с тяжёлой или полукритической пневмонией, вызванной COVID-19 (Таблица 1; категории 5-6).
Классификация тяжести пневмонии COVID-19
Beigel JH, 2020
Описание фигур
Фиг. 1 представляет собой таблицу с демографическими и клиническими данными при РА и ОА.
На Фиг. 2 представлен график влияния полимеризованного коллагена I типа на экспрессию TNF-α.
На Фиг. 3 представлен график влияния полимеризованного коллагена типа I на экспрессию IL-1β в супернатантах хрящевых и синовиальных культур пациентов с ревматоидным артритом (РА) или остеоартритом (ОА).
На Фиг. 4 представлен график влияния полимеризованного коллагена I типа на экспрессию TNF-α в супернатантах совместных культур хряща и синовиальной ткани пациентов с ревматоидным артритом (РА) или остеоартритом (ОА).
На Фиг. 5 представлен график влияния полимеризованного коллагена типа I на экспрессию IL-8 в супернатантах совместных культур хряща и синовиальной ткани пациентов с ревматоидным артритом (РА) или остеоартритом (ОА).
На Фиг. 6 представлен график влияния полимеризованного коллагена типа I на экспрессию IL-10 в супернатантах совместных культур хряща и синовиальной ткани пациентов с ревматоидным артритом (РА) или остеоартритом (ОА).
На Фиг. 7 представлен график влияния полимеризованного коллагена I типа на экспрессию генов цитокинов, про- и противовоспалительных факторов в совместных культурах хрящевой и синовиальной тканей больных ревматоидным артритом (РА).
На Фиг. 8а представлен график влияния полимеризованного коллагена I типа на экспрессию генов цитокинов и про- и противовоспалительных факторов в тканях совместных культур хрящевой и синовиальной тканей пациентов с остеоартритом (ОА).
На Фиг. 8б представлен график влияния полимеризованного коллагена I типа на экспрессию цитокинов и гена Foxp3 при ОА.
На Фиг. 9 представлена картина паллиативного эффекта полимеризованного коллагена I типа на гистологическое повреждение у мышей с КИА. Окраска гематоксилином, эозином и PAS. (а) Репрезентативная часть первой мыши. (в) Репрезентативная часть второй мыши. Увеличение или усиление гистологии соответствует 100X.
На Фиг. 10а и 10б представлен график влияния полимеризованного коллагена типа I в модели раннего (профилактического) артрита на процент субпопуляций CD4+ Т-клеток селезенки при первом и втором умерщвлении (7 и 56 дней) после трансплантации, соответственно.
На Фиг. 10в и 10г представлен график влияния полимеризованного коллагена I типа в модели длительного (позднего или паллиативного) артрита на процентное содержание субпопуляций CD4+ T-клеток селезенки, при первом и втором умерщвлении (7 и 35 дней) после трансплантации, соответственно.
На Фиг. 11а представлен график влияния полимеризованного коллагена типа I на раннюю КИА-модель дендритных клеток и лимфоцитов селезенки FACS при первом умерщвлении через 7 дней после трансплантации.
На Фиг. 11б представлен график влияния полимеризованного коллагена типа I на раннюю КИА-модель дендритных клеток и лимфоцитов селезенки FACS при втором умерщвлении через 56 дней после трансплантации.
На Фиг. 11в представлен график влияния полимеризованного коллагена типа I в расширенной модели КИА дендритных клеток и лимфоцитов селезенки FACS при первом умерщвлении через 7 дней после трансплантации.
На Фиг. 11г представлен график влияния полимеризованного коллагена типа I в расширенной модели КИА дендритных клеток и лимфоцитов селезенки FACS при втором умерщвлении через 35 дней после трансплантации.
На Фиг. 12а представлен график влияния полимеризованного коллагена типа I в модели раннего (профилактического) артрита при первом умерщвлении через 7 дней после трансплантации.
На Фиг. 12б представлен график действия полимеризованного коллагена I типа в модели раннего (профилактического) артрита при втором умерщвлении через 56 дней после трансплантации.
На Фиг. 12в представлен график влияния полимеризованного коллагена I типа в долгосрочной модели (паллиативная модель) на процент CD11c+ клеток селезенки при первом умерщвлении через 7 дней после трансплантации.
На Фиг. 12г представлен график влияния полимеризованного коллагена типа I в долгосрочной модели (паллиативная модель) на процентное содержание клеток CD11c+ селезенки при второй жертве через 35 дней после трансплантации.
На Фиг. 13 представлено графическое изображение симптоматической оценки пациента 60 лет с ожирением, пассивного курильщика с диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+), с 4-5 степенью тяжести заболевания на фоне лечения полимеризованным коллагеном I типа как функции времени.
На Фиг. 14 представлено графическое изображение оценки пациента 55 лет с артериальной гипертензией и ожирением, с COVID-19 (ОТ-ПЦР+), с 4-5 степенью тяжести заболевания во время лечения с использованием полимеризованного коллагена I типа.
На Фиг. 15 представлено графическое изображение оценки 52-летнего пациента с ожирением и диагнозом COVID-19 (RT-PCR+) со степенью тяжести заболевания 4-5 во время лечения полимеризованным коллагеном I типа.
На Фиг. 16 представлено графическое изображение оценки пациента 60 лет, без сопутствующих заболеваний, активного курильщика с диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+), с 4-5 степенью тяжести заболевания на фоне лечения полимеризованным коллагеном I типа.
На Фиг. 17 представлено графическое изображение оценки состояния пациента 56 лет с диабетом и гипертонией и диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+) с 4 степенью тяжести заболевания во время лечения с использованием полимеризованного коллагена I типа.
На Фиг. 18 представлено графическое изображение оценки группового симптоматического поведения пациентов с COVID-19 во время лечения (7 дней) и после лечения (7 дней) полимеризованным коллагеном I типа.
На Фиг. 19 представлено графическое изображение оценки группового симптоматического поведения пациентов с COVID-19 во время лечения (7 дней) и после лечения (7 дней) полимеризованным коллагеном I типа.
На Фиг. 20 представлена женщина 51 года с избыточным весом, без заболеваний, с диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+), с 4 степенью тяжести заболевания на фоне лечения полимеризованным коллагеном I типа.
На Фиг. 21 представлено графическое изображение оценки 51-летнего пациента мужского пола без дополнительных заболеваний с диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+) во время лечения с использованием полимеризованного коллагена I типа.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится к внутримышечному применению полимеризованного коллагена типа I для модификации постпневмонического фиброза, вызванного COVID-19, путем предотвращения синдрома острой дыхательной недостаточности, тем самым предотвращая развитие фиброзных осложнений у пациента без побочных эффектов.
Применение полимеризованного коллагена типа I оценивали в ходе адъювантной терапии в пилотном исследовании с двумя группами, одна с внутримышечным введением 1,5 мл активного ингредиента, а другая с 1,5 мл носителя, в течение 3 дней каждые 12 часов и в течение 4 дней каждые 24 часа, чтобы составить в общей сложности 7 дней лечения с общей дозой 15 мл коллаген-ПВП у пациентов с лёгкой и умеренной пневмонией, вызванной COVID-19 (Таблица 1; категории с 1 по 4).
Во втором варианте осуществления настоящего изобретения использовали 1,5 мл активного начала и еще один с 1,5 мл носителя в течение 7 дней каждые 12 часов для получения в общей сложности 21 мл коллагена-ПВП у пациентов с тяжёлой или полукритической пневмонией, вызванной COVID-19 (Таблица 1; категории 5-6).
Клиническое улучшение, изменение уровней системного воспаления и растворимых провоспалительных медиаторов, а также фиброз оценивали через 7 и 14 дней после лечения.
Внутримышечное применение полимеризованного коллагена каждые 12 ч в течение 3 дней, а затем каждые 24 ч в течение 4 дней у пациентов с лёгкой и тяжёлой формой заболевания COVID-19 или каждые 12 часов в течение 7 дней у пациентов с тяжёлой или полукритической формой заболевания COVID-19 основано на предложенной схеме лечения активного ревматоидного артрита (Фурузава-Карбальеда Дж., 2006).
Во всех случаях наступило клиническое улучшение. О клиническом улучшении сообщали индивидуально (Фиг. 13-17) и в группах (Фиг. 18-19) с учётом следующих параметров: процент SpO2, температура, частота сердечных сокращений, частота дыхания, интервалы кашля, боль в груди, головная боль, одышка, одинофагия, аносмия, потеря вкусовых ощущений, наличие артралгии и миалгии.
Описание симптомов до, во время и после лечения
Симптомы различались по интенсивности и частоте (Фиг. 13-17). На момент постановки диагноза у всех пациентов отмечалась десатурация, головная боль и изменение частоты дыхания, у 80% - лихорадка, изменение частоты сердечных сокращений, кашель, одышка, одинофагия, изменение вкуса, артралгия и миалгия. Только у 40% больных была обнаружена аносмия. Ни один из пациентов не сообщил о боли в груди.
Изменения уровней системного воспаления и растворимых провоспалительных медиаторов, а также фиброза оценивали через 7 и 14 дней после лечения для определения степени улучшения.
Примеры пациентов с лёгкой и средней степенью тяжести заболевания
У 5 больных (3 женщины), средний возраст 56,0 ± 3,4 года (диапазон: 52-60), с лёгким-среднетяжёлым течением заболевания, с симптомами, без потребности в кислороде и с потребность в нём для поддержания SpO2>92%, с данными рентгенографии или томографии лёгочных инфильтратов были зарегистрированы основные сопутствующие заболевания, представляющие собой факторы риска более серьезного заболевания (Фиг. 13-17), и их клиническая эволюция была определена с помощью внутримышечного введения коллагена-ПВП.
Сопутствующее лечение
Лечение было стандартизировано для всех пациентов с азитромицином 500 мг/24 ч; осельтамивиром 75 мг/12 ч; эноксапарином 40 мг/24 ч; адимодом 800 мг/12 ч; парацетамолом 1 г/8 ч; моксифлоксацином 400 мг/24 ч.
Введение полимеризованного коллагена I типа
Описание симптомов до, во время и после лечения
Симптомы различались по интенсивности и частоте (Фиг. 13-17). На момент постановки диагноза у всех пациентов отмечалась десатурация, головная боль и изменение частоты дыхания, у 80% - лихорадка, изменение частоты сердечных сокращений, кашель, одышка, одинофагия, изменение вкуса, артралгия и миалгия. Только у 40% больных была обнаружена аносмия. Ни один из пациентов не сообщил о боли в груди.
За исключением одного пациента, который начал лечение полимеризованным коллагеном I типа на 5-й день после постановки диагноза COVID-19, остальные начали лечение в тот же день после постановки диагноза.
Во всех случаях лечения полимеризованным коллагеном I типа через 7 дней определялось повышение SpO2 (от 89% до 93%), исчезновение лихорадки, изменения частоты сердечных сокращений и одинофагии. У 20% больных сохранялись нарушения частоты дыхания, головная боль, аносмия и артралгия. Кашель, миалгия и потеря вкуса сохранялись у 40% больных. У 60% пациентов сохранялась одышка (Фиг. 13-17).
На 14-й день, то есть через 7 дней после лечения полимеризованным коллагеном I типа, определялось повышение pSO2 (от 90 до 94%), а у 20% больных отмечались лёгкие изменения частоты сердечных сокращений, кашель и снижение чувство вкуса. Остальные симптомы исчезли (Фиг. 13-17).
Фиг. 13. Симптоматическая оценка пациентов с COVID-19 во время лечения с использованием полимеризованного коллагена I типа. А) Рисунок и таблица принадлежат пациенту 60 лет с диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+), пассивному курильщику с ожирением и степенью тяжести заболевания 4-5. Такие симптомы, как B) pSO2, C) температура, D) частота сердечных сокращений, E) частота дыхания, F) продуктивный или непродуктивный кашель, G) боль в груди, H) головная боль, I) одышка, J) одинофагия, К) аносмия, L) потеря вкусовых ощущений, М) артралгия и N) миалгия, регистрировали в течение 14 дней после начала лечения полимеризованным коллагеном I типа. Дата постановки диагноза 29.04.2020 и начало лечения полимеризованным коллагеном I типа 09.05.2020.
Фиг. 14. Симптоматическая оценка пациентов с COVID-19 во время лечения с использованием полимеризованного коллагена I типа. A) Рисунок и таблица принадлежат больному 55 лет с диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+), с артериальной гипертензией и ожирением, 4-5 степенями тяжести заболевания. Такие симптомы, как B) pSO2, C) температура, D) частота сердечных сокращений, E) частота дыхания, F) продуктивный или непродуктивный кашель, G) боль в груди, H) головная боль, I) одышка, J) одинофагия, К) аносмия, L) потеря вкусовых ощущений, М) артралгия и N) миалгия, регистрировали в течение 14 дней после начала лечения полимеризованным коллагеном I типа. Дата постановки диагноза 04.04.2020, а начало лечения полимеризованным коллагеном I типа 04.05.2020.
Фиг. 15. Симптоматическая оценка пациентов с COVID-19 во время лечения с использованием полимеризованного коллагена I типа. A) Рисунок и таблица принадлежат больному 52 лет с диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+), ожирением и 4-5 степенью тяжести заболевания. Такие симптомы, как B) pSO2, C) температура, D) частота сердечных сокращений, E) частота дыхания, F) продуктивный или непродуктивный кашель, G) боль в груди, H) головная боль, I) одышка, J) одинофагия, К) аносмия, L) потеря вкусовых ощущений, М) артралгия и N) миалгия, регистрировали в течение 14 дней после начала лечения полимеризованным коллагеном I типа. Дата постановки диагноза 10.02.2020, а начало лечения полимеризованным коллагеном I типа 11.05.2020.
Фиг. 16. Симптоматическая оценка пациентов с COVID-19 во время лечения с использованием полимеризованного коллагена I типа. A) Рисунок и таблица принадлежат пациенту 60 лет с диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+), активному курильщику без сопутствующих заболеваний, 4-5 степени тяжести заболевания. Такие симптомы, как B) pSO2, C) температура, D) частота сердечных сокращений, E) частота дыхания, F) продуктивный или непродуктивный кашель, G) боль в груди, H) головная боль, I) одышка, J) одинофагия, К) аносмия, L) потеря вкусовых ощущений, М) артралгия и N) миалгия, регистрировали в течение 14 дней после начала лечения полимеризованным коллагеном I типа. Дата постановки диагноза 10.05.2020, а начало лечения полимеризованным коллагеном I типа 10.05.2020.
Фиг. 17. Симптоматическая оценка пациентов с COVID-19 во время лечения с использованием полимеризованного коллагена I типа. A) Рисунок и таблица принадлежат пациенту 60 лет с диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+), с сахарным диабетом и артериальной гипертензией, 4 степенью тяжести заболевания. Такие симптомы, как B) pSO2, C) температура, D) частота сердечных сокращений, E) частота дыхания, F) продуктивный или непродуктивный кашель, G) боль в груди, H) головная боль, I) одышка, J) одинофагия, К) аносмия, L) потеря вкусовых ощущений, М) артралгия и N) миалгия, регистрировали в течение 14 дней после начала лечения полимеризованным коллагеном I типа. Дата постановки диагноза 09.05.2020, а начало лечения полимеризованным коллагеном I типа 11.05.2020.
Побочные эффекты
Побочных эффектов не выявлено, за исключением боли в месте введения, которая сохранялась в течение 5-15 минут.
Согласно всем предыдущим Примерам, применение полимеризованного коллагена I типа или коллагена-ПВП в качестве терапевтического адъюванта при гипервоспалении и цитокиновом шторме, вызванных COVID-19, в анализируемой группе пациентов показало, что в конце лечения и в течение 7 суток при последующем наблюдении у пациентов наблюдалось увеличение SpO2, и ни один из них не нуждался в кислороде для поддержания сатурации >90% (Фиг. 18). Ни у одного из пациентов не было синдрома острой дыхательной недостаточности, и они не нуждались в госпитализации. Ни один пациент не умер. Это говорит о том, что полимеризованный коллаген I типа оказывает мощное системное регулирующее действие на воспаление. Осложнений, связанных с инфекцией SARS-CoV2 или из-за использования коллагена-ПВП, выявлено не было. У всех больных исчезли одышка и головная боль, нормализовались частота дыхания и температура (Фиг. 18 и 19). Аналогичным образом исчезли одинофагия, аносмия, артралгии и миалгии (Фиг. 19), все вышеперечисленное не вызывало побочных эффектов, за исключением боли в месте нанесения.
Фиг. 18. Групповое симптоматическое поведение пациентов с COVID-19 на фоне лечения (7 дней) и после лечения (7 дней) полимеризованным коллагеном I типа. А) pSO2, B) Температура, C) ЧСС, D) Частота дыхания, E) Одышка, F) Головная боль. Интенсивность представлена как Нет = 0, Лёгкая, переносимая = 1, Умеренная, беспокоящая = 2 и Тяжёлая, приводящая к потере трудоспособности = 3. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка для пролеченных пациентов (n = 5).
Фиг. 19. Групповое симптоматическое поведение пациентов с COVID-19 на фоне лечения (7 дней) и после лечения (7 дней) полимеризованным коллагеном I типа. А) Кашель, B) Одинофагия, C) Потеря вкуса, D) Аносмия, E) Артралгия, F) Миалгия. Интенсивность представлена как Нет = 0, Лёгкая, переносимая = 1, Умеренная, беспокоящая = 2 и Тяжёлая, приводящая к потере трудоспособности = 3. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка для пролеченных пациентов (n = 5).
Примеры пациентов с тяжёлым и полукритическим течением болезни
У 2 больных (1 женщина), средний возраст 51,0 ± 0,0 года, с тяжёлым полукритическим течением, с симптомами, с потребностью в кислороде для поддержания SpO2>92%, с рентгенологическими данными инфильтратов в обоих лёгких, основными сопутствующими заболеваниями которые представляют собой факторы риска более серьезного заболевания (Фиг. 20 и 21) и при использовании 1,5 мл внутримышечного коллагена-ПВП каждые 12 ч в течение 7 дней определяли их клиническую эволюцию.
Сопутствующее лечение
Лечение стандартизировали азитромицином 500 мг/24 ч в течение 6 дней; ивермектином по 12 мг каждые 24 часа в течение 2 дней.
Описание симптомов до, во время и после лечения
Симптомы различались по интенсивности и частоте (Фиг. 20 и 21). На момент постановки диагноза у пациентов отмечались десатурация, изменение частоты дыхания, лихорадка, изменение частоты сердечных сокращений, одышка, изменение вкусовых ощущений и артралгия.
Лечение полимеризованным коллагеном I типа пациенты начали поздно (между 10 и 15 днями после появления симптомов).
В обоих случаях у пациентов, получавших полимеризованный коллаген I типа, через 7 дней определяли повышение SpO2 (от 91 до 94%), исчезновение лихорадки, изменения частоты сердечных сокращений, частоты дыхания, головной боли и артралгий.
Побочные эффекты
Побочных эффектов не выявлено, за исключением боли в месте введения, которая сохранялась в течение 5-15 минут.
Фиг. 20. Симптоматическая оценка пациентов с COVID-19 во время лечения с использованием полимеризованного коллагена I типа. А) Рисунок и таблица принадлежат больному 51 года с диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+), с избыточной массой тела, активному курильщику и 6 степени тяжести заболевания. Симптомы, такие как B) pSO2, С) температура, D) частота сердечных сокращений, E) частота дыхания, F) продуктивный или непродуктивный кашель, G) боль в груди, H) головная боль, I) одышка, J) одинофагия, К) аносмия, L) потеря вкусовых ощущений, М) артралгия и N) миалгия, регистрировали в течение 7 дней лечения полимеризованным коллагеном I типа. Дата постановки диагноза 18.05.2020, а начало лечения полимеризованным коллагеном I типа 04.06.2020.
Фиг. 21. Симптоматическая оценка пациентов с COVID-19 во время лечения с использованием полимеризованного коллагена I типа. A) Рисунок и таблица принадлежат больному 51 года с диагнозом COVID-19 (ОТ-ПЦР+), активному курильщику и степени тяжести заболевания 6. Такие симптомы, как B) pSO2, C) температура, D) частота сердечных сокращений, E) частота дыхания, F) продуктивный или непродуктивный кашель, G) боль в груди, H) головная боль, I) одышка, J) одинофагия, K) аносмия, L) потеря вкусовых ощущений, M) артралгия и N) миалгия, регистрировали в течение 7 дней лечения полимеризованным коллагеном I типа. Дата постановки диагноза 23.05.2020, а начало лечения полимеризованным коллагеном I типа 04.06.2020.
Будучи описанным, как указано выше, настоящее изобретение заявлено как объект права собственности, который включает следующее:
Настоящее изобретение относится к применению полимеризованного коллагена типа I у пациентов с положительным результатом на COVID-19 и к внутримышечному режиму дозирования каждые 12 часов в течение 3 дней, а затем каждые 24 часа в течение 4 дней у пациентов с заболеванием COVID-19 от лёгкой до умеренной степени тяжести или к внутримышечному режиму дозирования каждые 12 часов в течение 7 дней у пациентов с тяжёлым или полукритическим заболеванием, вызванным COVID-19. Кроме того, анализировали клиническую эволюцию каждого пациента индивидуально (Фиг. 13-17 и 20-21) и по группам (Фиг. 18 и 19) с учётом следующих параметров: процент SpO2, температура, частота сердечных сокращений, частота дыхания, периоды кашля, боль в груди, головная боль, одышка, одинофагия, аносмия, потеря вкусовых ощущений, наличие артралгии и миалгии, при этом клиническое улучшение было зафиксировано во всех случаях. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 21 ил., 1 табл.
1. Способ лечения цитокинового шторма, воспаления и фиброза легких у пациентов, инфицированных вирусом SARS-CoV2 (COVID-19), при легкой и средней степени тяжести заболевания, включающий введение полимеризованного коллагена типа I каждые 12 ч в течение 3 дней, через 3 дня, каждые 24 ч в течение 4 дней.
2. Способ лечения цитокинового шторма, воспаления и фиброза легких у пациентов, инфицированных вирусом SARS-CoV2 (COVID-19), при тяжелых и крайне тяжелых состояниях, включающий введение полимеризованного коллагена типа I каждые 12 часов в течение 7 дней.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что полимеризованный коллаген I типа приготовлен в форме для внутримышечного введения.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полимеризованный коллаген I типа приготовлен в форме для внутримышечного введения в дозе 1,5 мл активного ингредиента в течение 3 дней каждые 12 часов и в течение 4 дней каждые 24 часа в общей сложности для 7 дней лечения общей дозой 15 мл полимеризованного коллагена I типа у пациентов с пневмонией COVID-19.
5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что полимеризованный коллаген I типа приготовлен в форме для внутримышечного введения в дозе 1,5 мл активного ингредиента в течение 7 дней каждые 12 с общей дозой 21 мл полимеризованного коллагена I типа у пациентов с пневмонией COVID-19.
6. Способ по п. 1 или 2 для формирования изменений уровней системного воспаления и растворимых провоспалительных медиаторов, а также фиброза, определяемых через 7 и 14 дней после лечения.
7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что у каждого пациента с положительным результатом на COVID-19 во время постановки диагноза оценивают десатурацию, головную боль и изменения частоты дыхания, лихорадку, изменения частоты сердечных сокращений, кашель, одышку, одинофагию, изменения вкусовых ощущений, артралгию и миалгию, аносмию и боль в груди для определения клинического улучшения.
8. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что на поздних стадиях заболевания COVID-19 оценивают десатурацию, головную боль и изменения частоты дыхания, лихорадку, изменения частоты сердечных сокращений, кашель, одышку, одинофагию, изменения чувства вкуса, артралгию и миалгию, аносмию и боль в груди для определения клинического улучшения.
| WO 2005115443 A1, 2005.12.08 | |||
| US 2015232842 A1, 26.07.2007 | |||
| Krotzsch-Gomez FE et al | |||
| Cytokine expression is downregulated by collagen-polyvinylpyrrolidone in hypertrophic scars | |||
| J Invest Dermatol., 1998 Nov; 111(5):828-34 | |||
| Moreno-Alvarez P et al | |||
| Aerosolized polymerized type I collagen reduces airway inflammation and remodelling in a guinea pig |
