БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА, РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ И ИНГИБИРОВАНИЯ ФИТОПАТОГЕНОВ Российский патент 2025 года по МПК A01N25/10 

Область техники

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, а именно к биостимуляторам роста и развития растений и биофунгицидов патогенных грибов, и может быть использовано в растениеводстве для предпосевной обработки семян сельскохозяйственных растений, повышения их всхожести, улучшения роста, защиты от возбудителей грибных болезней.

Уровень техники

Одним из важных направлений совершенствования технологии выращивания сельскохозяйственных культур является разработка эффективной системы применения регуляторов роста растений и защиты от фитопатогенов. Использование препаратов на основе биологически активных веществ пролонгированного действия является альтернативным приемом по сравнению с синтетическими средствами стимулировании роста и защиты растений. Препараты на основе биодеградируемых биополимеров могут быть использованы в системе экологического и органического земледелия, а также при выращивании зеленой продукции и овощей в условиях защищенного грунта, в которых повышен риск накопления химических компонентов питательных растворов и средств защиты растений. Использование нанотехнологий для получения агронанохимикатов позволяет повысить стабильность и эффективность препаратов, а также снизить концентрацию активного вещества.

Хитозан - деацетилированное производное природного полисахарида хитина, проявляющее биологическую активность в отношении широкого спектра биохимических процессов в растениях и позиционируемое как основа биопрепаратов для растениеводства и овощеводства с высоким потенциалом продуктивности (см. статьи Mukhtar Ahmed K.B., Khan M.M.A., Siddiqui H., Jahan A. Chitosan and its oligosaccharides, a promising option for sustainable crop production- a review // Carbohydr. Polym. 2020. 227, 115331; Новикова И.И., Попова Э.В., Краснобаева И.Л., Коваленко Н.М. Биологическое обоснование использования индукторов устойчивости на основе хитозана для повышения эффективности биофунгицидов // С.-х. биол. 2021. 56(3), 511). Биохимическая активность хитозана повышается путем создания комплекса с биологически активными органическими кислотами (см. статью Шиповская А.Б., Малинкина О.Н., Гегель Н.О., Зудина И.В., Луговицкая Т.Н. Структура и свойства солевых комплексов хитозана с диастереомерами аскорбиновой кислоты // Известия Академии наук. Серия химическая. 2021. 9, 1765), например с аспарагиновой кислотой (см. статью Шиповская А.Б., Луговицкая Т.Н., Зудина И.В. Биоцидная активность наночастиц аспарагината хитозана // Микробиология. 2023. 92(1), 68).

Наноструктурированные макромолекулы за счет своего размера и увеличенной площади поверхности обладают, с одной стороны, повышенной способностью к проникновению в ткани и клеточные стенки, а с другой - к более высокой физико-химической активности (см. статью Rodrigues S.M., Demokritou P., Dokoozlian N., Hendren C.O., Karn B., Mauter M.S., Lowry G.V. Nanotechnology for sustainable food production: promising opportunities and scientific challenges // Environ. Sci. Nano. 2017. 4(4), 767). Наночастицы хитозана обладают собственной биостимулирующей и антистрессовой активностью (см. статью Gohari G., Farhadi H., Panahirad S., Zareei E., Labib P., Jafari H., Mahdavinia G., Hassanpouraghdam M.B., Ioannou A., Kulak M., Fotopoulos V. Mitigation of salinity impact in spearmint plants through the application of engineered chitosanmelatonin nanoparticles // Int. J. Biol. Macromol. 2022. 224, 893) или способностью к адсорбции биоактивных компонентов, например, Se (см. статью Ding X., Chen L., Guo J., Gai J., Yang S. A small RNA of miR2119b from soybean CMS line acts as a negative regulator of male fertility in transgenic Arabidopsis // Plant Physiol. Biochem. 2021. 167, 210), металлов (см. статью Bidast S., Golchin A., Mohseni A. The beneficial effects of bare and CMC-supported α-FeOOH, Fe₃O₄, and α-Fe₂O₃ nanoparticles on growth, nutrient content, and essential oil of summer savory (Satureja hortensis L.) under Cd, Pb and Zn stresses // Environ. Sci. Pollut. Res. 2023. 30(32), 78182) и стимуляторов роста. Наноструктурированный хитозан проявляет также антимикробные свойства против патогенных грибов, вирусов и бактерий, что открывает перспективы его использования при разработке альтернативных высокоэффективных биоцидных агентов (см. статью Hoang N.H., Le Thanh T., Sangpueak R., Treekoon J., Saengchan C., Thepbandit W., Papathoti N.K., Kamkaew A., Buensanteai N. Chitosan nanoparticles-based ionic gelation method: a promising candidate for plant disease management // Polymers. 2022. 14(4), 662).

Известна композиция на основе хитозана (cм. патент РФ №2144768, МПК A01N43/16, опубл. 27.01.2000), содержащая (в мас.%): хитозан с молекулярной массой 8-500 кД и степенью деацетилирования 70-90 мольн.% − 0.1-0.3; молочную кислоту - 0.07-0.21; янтарную кислоту - 0.03-0.09; калий кремнекислый мета - 0.02-0.06; диметилсульфоксид - 0.01-0.03; вода - остальное, при pH раствора 6.0-6.5 и при соотношении хитозан : органическая кислота, в мас.ч., равном 1 : 1.

Недостаток композиции состоит в том, что ее состав является многокомпонентным и содержит неорганические соединения, которые чужды естественному обмену веществ в растениях, а также в единственном направлении практического применения в области защиты растений от возбудителей болезней, а именно - защиты культуры риса от пирикуляриоза.

Известна композиция на основе хитозана (см. патент РФ №2257711, МПК A01N 25/32, опубл.10.08.2005), снижающая содержание нитратов в растениеводческой продукции, содержащая хитозан с молекулярной массой 20-150 кД, органические кислоты - смесь янтарной, аскорбиновой и сорбиновой кислот в массовом соотношении 2:1:1, активаторы нитрат- и нитритредуктаз - нитрат железа, аммоний молибденовокислый, индолилуксусную кислоту и этилендиаминтетрауксусную кислоту в массовом соотношении 20:5:1:1, или нитрат железа, аммоний молибденовокислый, индолилуксусную кислоту, N,N-дикарбоксиметилглутаминовую кислоту в массовом соотношении 20:5:1:1, и усилители синтеза хлорофилла - 2-оксоглутаровую и L-глутаминовую кислоты в массовом соотношении 30:1, а также поверхностно-активное вещество при следующем соотношении вышеуказанных компонентов (в мас.%): хитозан - 15-25; органические кислоты - 15-25; активаторы нитрат- и нитритредуктаз - 25-30; усилители синтеза хлорофилла - 29-35; поверхностно-активное вещество - 1-3. Композиция позволяет усилить ассимиляцию неорганического азота растения и снижает содержание нитратов в растениеводческой продукции.

Недостатками предлагаемой композиции является ее многокомпонентность, высокая стоимость реагентов. Композиция предусматривает использование низкомолекулярного хитозана. Снижение нитратов в почве, безусловно, приводит к улучшению экологической чистоты урожая, однако композиция не оказывает ускоряющего действия на рост и развитие растений.

Известно получение и применение агрохимической композиции на основе полидисперсного хитозана (см. патент РФ №2675485, МПК A01N 43/16, опубл. 19.12. 2018). Композиция содержит от 0.001 до 70% полидисперсного хитозана и одной или более нефитотоксичных кислот или их солей, при этом кислота выбрана из соляной, серной, фосфорной, молочной, муравьиной, уксусной, пировиноградной, щавелевой, малоновой, янтарной, адипиновой, лимонной, глутаминовой, бензойной, салициловой, 2-(индолил-3)уксусной, 4-(индолил-3)масляной, сорбиновой, гуминовой, метионина. Для получения композиции осуществляют постепенное введение хитозана с молекулярной массой от 10 до 300 кДа и степенью деацетилирования от 65 до 98 мольн.% в условия деполимеризации под действием минеральных или органических кислот, окислителей, нитрозирующих агентов или ферментов при температуре 50-140°С в течение 30-300 мин. Изобретение позволяет увеличить урожайность агрокультур, повысить выживаемость растений в условиях стресса, снизить пестицидную нагрузку в процессе культивирования растений.

Недостатками предлагаемой агрохимической композиции является то, что для получения полидисперсного хитозана используется градиентная деполимеризация полимера при высокой температуре, в ряде случаев превышающей 100°С. В предпочтительных вариантах для градиентной деполимеризации применяются агрессивные минеральные кислоты (соляная, серная, фосфорная, азотистая), органические и неорганические пероксиды, галогены, что может существенно снижать как экологическую чистоту готового продукта, так и его биологическую активность.

Известен биостимулятор роста бахчевых и овощных культур (см. патент РФ №2504953, МПК A01N 25/10, опубл. 27.01.2014). Он представляет собой раствор, содержащий низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой 10-25 кДа, 0.5-1% водный раствор молочной кислоты и молочную сыворотку. Согласно предложенному способу получения биостимулятора хитин ракообразных деацетилируют 45%-ным раствором гидроксида натрия при гидромодуле 1:10 и получают высокомолекулярный хитозан. Полученный хитозан промывают водой до рН 7, сушат конвективным способом и фракционируют посредством просеивания. Затем растворяют в 0.2 М ацетатном буфере и проводят гидролиз ферментным препаратом папаином с концентрацией 0.3-0.5% или ферментным препаратом протосубтилином с концентрацией 2-3% и осаждают полученный низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой 10-25 кДа 10% раствором гидроксида натрия. Промывают водопроводной водой до pH 8 и сушат до остаточной влажности 8-10%. Растворяют полученный низкомолекулярный хитозан в 0.5-1% растворе молочной кислоты и добавляют молочную сыворотку. Данная группа изобретений обеспечивает повышение энергии прорастания и всхожести семян, увеличение урожайности бахчевых и овощных культур.

Недостатком данного биостимулятора и способа его получения является многостадийность процесса получения низкомолекулярного хитозана, сложность его реализации, а применение биостимулятора ограничено только бахчевыми и овощными культурами.

Известна композиция на основе водных растворов хитозана, обладающая биологической активностью (см. патент РФ №2127056, МПК A01N63/00, C05G3/02, опубл. 10.03.1999), содержащая янтарную кислоту, молочную кислоту или смесь одной из них с глутаминовой кислотой при соотношениях компонентов в мас. %: хитозан с молекулярной массой 41.6-800 кДа и степенью деацетилирования 75-90 мольн.% ‒ 0.004-0.5; органическая кислота - 0.004-0.5; вода - остальное - до 100: при pH раствора 5.6-6.0 и при соотношении хитозан : органическая кислота (в масс. частях) 1 : 1. Изобретение позволяет получить эффект биологической защиты растений от поражения, улучшает экологические условия труда, предохраняет окружающую среду и продукцию от загрязнения остатками пестицидов.

Недостатком является отсутствие фунгицидной активности биопрепарата, проявившееся в том, что не было установлено значимого прямого ингибирующего действия композиции заявленного состава даже в высоких концентрациях (0.1-0.2 мас.% по хитозану) на фитопатогенный гриб (возбудитель корневой гнили зерновых культур) в чистой культуре in vitro.

Известен способ получения полимерных наночастиц из аспарагината хитозана, предусматривающий смешивание хитозана с кислотой и получение целевого продукта (см. патент РФ №2713138, МПК C08B 37/08, B82B 3/00, опубл. 03.02.2020). При этом используют порошок высокомолекулярного хитозана, в качестве кислоты используют порошок L-аспарагиновой кислоты, которые смешивают и диспергируют в воде для получения раствора аспарагината хитозана с концентрацией в нем хитозана (0.2-1.8)⋅10^-2 М и концентрацией L-аспарагиновой кислоты (1.5-3.0)⋅10^-2 М при мольном соотношении [хитозан(-NH₂)] : [кислота] = 0.07-0.60. В полученный раствор аспарагината хитозана при перемешивании добавляют раствор хлорида натрия для получения водной дисперсии с концентрацией в ней хлорида натрия (2.5-10)⋅10^-2 М и содержащей наночастицы аспарагината хитозана. Дополнительно для получения стабилизированных наночастиц аспарагината хитозана после добавления раствора хлорида натрия в водную дисперсию дополнительно вводят тетроглицеролат кремния до его концентрации в дисперсии (0.2-0.3)⋅10^-2 М и перемешивают смесь в течение 48 часов. Изобретение направлено на получение биологически активных и устойчивых к агрегации наночастиц аспарагината хитозана и может быть использовано в фармацевтической промышленности и медицине для создания новых (в том числе персонализированных) лекарственных форм, а также для ускорения роста клеточной популяции человеческих фибробластов.

Недостатками полимерных наночастиц из аспарагината хитозана является присутствие в составе препарата хлорида натрия. Использование наночастиц хитозана такого состава в сельском хозяйстве может вызывать засоленность почвы хлоридами и, соответственно, оказывать разрушающее влияние на растительные клетки, снижать продуктивность и урожайность растений. О ростостимулирующей и фунгицидной активности для растительных культур в способе не сообщалось.

Известен способ получения полимерных наночастиц из аспарагината хитозана, предусматривающий смешивание хитозана с кислотой и получение целевого продукта (см. патент РФ №2727360, МПК C08B 37/003, B82B 3/00, опубл. 21.07.2020). Используют порошок высокомолекулярного хитозана, в качестве кислоты используют порошок L-аспарагиновой кислоты, которые смешивают и диспергируют в воде для получения раствора аспарагината хитозана с концентрацией в нём хитозана (1.8-3.5)⋅10^-2 М и концентрацией L-аспарагиновой кислоты (1.5-3.0)⋅10^-2 М при мольном соотношении [хитозан(-NH₂)] : [кислота] = 0.6-2.3. Полученный раствор аспарагината хитозана фильтруют, формируют тонкую плёнку этилового спирта, на поверхность которой напыляют раствор аспарагината хитозана в объемном соотношении [аспарагинат хитозана] : [спирт] = 1 : 1. Оставляют для испарения жидкости при температуре 20±2°С не более 1 часа для получения наночастиц в виде порошка. Изобретение направлено на получение биологически активных, кинетически стабильных наночастиц хитозана размером 50-80 нм при упрощении способа получения и сохранении высокой биологической активности полимерной системы.

Недостатком является использование для получения порошка наночастиц этилового спирта, являющегося осадителем хитозановых полимеров и приводящего к формированию частично или полностью водонерастворимой формы хитозана и, соответственно, снижению биологической активности готового препарата. Кроме того, препарат на основе таких наночастиц не проявляет ростостимулирующее и фунгицидное действие в отношении растительных культур.

Наиболее близким к заявляемому является биостимулятор роста растений из аспарагината хитозана (см. патент РФ №2782614, МПК А01N25/00, опубл. 31.10.2022), содержащий хитозан с молекулярной массой 200 кДа ‒ 0.01-0.001 г/л, L-аспарагиновую кислоту ‒ 0.01-0.001 г/л, воду – остальное. Биостимулятор роста растений из аспарагината хитозана получают по реакции солеобразования хитозана с аспарагиновой кислотой в водной среде. Используют хитозан со средневязкостной молекулярной массой 200 кДа и степенью деацетилирования 82±2 мольн.% производства ЗАО «Биопрогресс, РФ; L-аспарагиновую кислоту, полученную биокаталитическим синтезом с использованием штамма E.coli ВКПМ 7188, производства ЗАО «Биоамид», РФ; дистиллированную воду. Порошок хитозана с молекулярной массой 200 кДа и степенью деацетилирования 82 мольн.% и порошок L-аспарагиновой кислоты при соблюдении мольного соотношения [хитозан]:[кислота]=0.8-1.3, диспергируют в 1 л дистиллированной воды при 40-50°С с использованием магнитной мешалки в течение 2-3-х часов до полного растворения. Готовый раствор аспарагината хитозана высушивают распылительной или лиофильной сушкой до получения воздушно-сухого порошка с влажностью не более 8-10%. Для получения биостимулятора порошок воздушно-сухого аспарагината хитозана растворяют в воде из расчета 0.10-0.75 г порошка на 1 л воды для обработки семян или 0.01-0.1 г на 10 л воды для полива вегетирующих растений. Биостимулятор повышает всхожесть тест-семян (пшеница, овес, морковь, руккола, фасоль, тыква), а также ускоряет рост и развитие тест-растений (салат, шпинат), что приводит к увеличению их зеленой массы и, соответственно, урожайности по сравнению с контролем (проращивание и полив с использованием воды).

Недостатками биостимулятора в предлагаемой форме являются относительно высокий расход компонентов, используемый для обработки семян, и неустановленная фунгицидная активность в отношении фитопатогенных грибов и возбудителей болезней растений. Кроме того, раствор аспарагината хитозана агрегативно и седиментационно не стабилен: на 5 сут. после приготовления раствора наблюдается опалесценция, а на 7 сут. − фазовое разделение с выпадением осадка (см. статьи Lugovitskaya T.N., Shipovskaya A.B., Shmakov S.L., Shipenok X.M. Formation, structure, properties of chitosan aspartate and metastable state of its solutions for obtaining nanoparticles // Carbohydrate Polymers. 2022. 277, 118773; Shipenok K.M., Lugovitskaya T.N., Shipovskaya A.B. Structure formation during the synthesis of chitosan L- and D-asparaginate nano-particles // Russian Journal of Physical Chemistry A. 2024. 98(7), 1584).

Раскрытие сущности

Техническая проблема заявляемого изобретения заключается в получении биологически активных наночастиц L- или D-аспарагината хитозана без использования хлорида натрия и этилового спирта, повышении агрегативной и седиментационной стабильности препарата на основе предлагаемой композиции наночастиц L- или D-аспарагината хитозана, эффективности биостимулятора роста растений при обработке семян, фунгицидной активности в отношении фитопатогенных грибов в чистой культуре in vitro.

Технический результат - получение биологически активных и устойчивых к агрегации наночастиц L- или D-аспарагината хитозана при упрощении способа их формирования, повышение стабильности раствора наночастиц L- или D-аспарагината хитозана, стимуляция роста проростков зерновых, зернобобовых и овощных культур, фунгицидная активность в отношении фитопатогенных грибов.

Для решения поставленной проблемы и достижения заявляемого результата авторами получен наноструктурированный природный полиэлектролит ‒ катионный аспарагинат хитозана - в форме самопроизвольно формирующихся полых наночастиц, способных сохранять солевую (заряженную) форму биополимера и, соответственно, его биологическую активность.

Технический результат достигается тем, что биопрепарат на основе аспарагината хитозана, получаемый по реакции солеобразования хитозана с аспарагиновой кислотой в водной среде, согласно решению, представляет собой водную дисперсию покрытых полисилоксановой оболочкой наночастиц аспарагината хитозана, полученную взаимодействием аспарагината хитозана с тетраглицеролатом кремния, при следующем соотношении исходных компонентов, г/л:

хитозан с молекулярной массой 200 кДа 0.003-3.0 L- или D-аспарагиновая кислота 0.003-3.0 тетраглицеролат кремния 0.0018-1.8 глицерин 0.0012-1.2 вода остальное

Для стимуляции роста растений исходные компоненты взяты в количестве, г/л:

хитозан с молекулярной массой 200 кДа 0.003-3.0 L- или D-аспарагиновая кислота 0.003-3.0 тетраглицеролат кремния 0.0018-1.8 глицерин 0.0012-1.2 вода остальное

Для фунгицидной обработки растений исходные компоненты взяты в количестве, г/л:

хитозан с молекулярной массой 200 кДа 0.01-1.0 L- или D-аспарагиновая кислота 0.01-1.0 тетраглицеролат кремния 0.006-0.6 глицерин 0.004-0.4 вода остальное

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 - представлены проростки огурца (Cucumis sativus L.) сорта Нежинский из семян, пророщенных на воде (слева), замоченных в водной дисперсии наночастиц L-аспарагината хитозана (в центре) или D-аспарагината хитозана (справа); на фиг. 2 – представлены проростки пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.) сорта Новоершовская из семян, пророщенных на воде (слева), замоченных в водной дисперсии наночастиц L-аспарагината хитозана (в центре) или D-аспарагината хитозана (справа); на фиг. 3 - представлены проростки сои (Glycine max (L.) Merr.) сорта Натали из семян, пророщенных на воде (слева), замоченных в водной дисперсии наночастиц L-аспарагината хитозана (в центре) или D-аспарагината хитозана (справа); на фиг. 4 - представлен мицелий патогенного гриба Botrytis sp. (возбудителя серой гнили подсолнечника), культивируемый in vitro на питательной среде LB без добавок (слева) и с добавлением биопрепарата наночастиц L-аспарагината хитозана (верхний ряд) или D-аспарагината хитозана (нижний ряд) с концентрацией исходных компонентов хитозан : аспарагиновая кислота : тетраглицеролат кремния : глицерин (ХТЗ:AspA:Si:Гл) 0.01:0.01:0.006:0.004, 0.1:0.1:0.06:0.04 и 1.0:1.0:0.6:0.4 г/л (слева направо); на фиг. 5 - представлен мицелий патогенного гриба Sclerotinia cf. sclerotiorum (возбудителя склеротиниозной головчатой гнили подсолнечника), культивируемый in vitro на питательной среде LB без добавок (слева) и с добавлением биопрепарата наночастиц L-аспарагината хитозана (верхний ряд) или D-аспарагината хитозана (нижний ряд) с концентрацией исходных компонентов ХТЗ:AspA:Si:Гл = 0.01:0.01:0.006:0.004, 0.1:0.1:0.06:0.04 и 1.0:1.0:0.6:0.4 г/л (слева направо); на фиг. 6 - представлен мицелий патогенного гриба Rhizoctonia sp. (возбудитель ризоктониозной корневой гнили пшеницы), культивируемый in vitro на питательной среде LB без добавок (слева) и с добавлением биопрепарата наночастиц L-аспарагината хитозана (верхний ряд) или D-аспарагината хитозана (нижний ряд) с концентрацией исходных компонентов ХТЗ:AspA:Si:Гл=0.01:0.01:0.006:0.004, 0.1:0.1:0.06:0.04 и 1.0:1.0:0.6:0.4 г/л (слева направо); на фиг. 7 – Таблица 1. Характеристика водных дисперсий наночастиц ХТЗ⋅L-AspA, ХТЗ⋅D-AspA и наноструктурированной дисперсной системы ХТЗ⋅L-(D-)AspA + вода при разном времени хранения дисперсий; на фиг. 8 – Таблица 2. Морфометрические характеристики проростков огурца (Cucumis sativus L.) сорта Нежинский, пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.) сорта Новоершовская и сои (Glycine max (L.) Merr.) сорта Натали при замачивании семян в воде и в растворе биопрепарата наночастиц L- или D-аспарагината хитозана разной концентрации; на фиг. 9 – Таблица 3. Влияние биопрепарата наночастиц L- или D-аспарагината хитозана разной концентрации на рост in vitro мицелия фитопатогенных грибов.

Осуществление изобретения

Биопрепарат наночастиц L- или D-аспарагината хитозана получают по реакции солеобразования хитозана с L- или D-аспарагиновой кислотой в водной среде, сопровождающейся противоионной конденсацией поликатиона хитозана с противоионом кислотного остатка и самопроизвольным формированием полых наночастиц L- или D-аспарагината хитозана при сохранении солевой (заряженной) формы биополимера и, соответственно, его биологической активности.

Для получения биопрепарата наночастиц L- или D-аспарагината хитозана используют порошкообразный хитозан (ХТЗ) производства ЗАО «Биопрогресс» (г. Щелково, РФ) со средневязкостной молекулярной массой 200 кДа, степенью деацетилирования 82 мольн.% и влажностью 8±1 мас.%; L-аспарагиновую кислоту (L-AspA) производства ЗАО «Биоамид» (г. Саратов, РФ); D-аспарагиновую кислоту (D-AspA), приобретенную у ЗАО «Вектон» (г. Санкт-Петербург, РФ); 60 мас.% раствор тетраглицеролата кремния в глицерине (Si(OGly)₄), синтезированный в лабораторных условиях Института органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН (г. Екатеринбург, РФ); дистиллированную воду.

Процесс растворения ХТЗ в AspA и формирование наночастиц проводят на установке, состоящей из колбонагревателя Labdevices HMS-100D (Китай) с обратным холодильником и термометром для контроля температуры, фильтрующей и охлаждающей ячеек. Для гравиметрических измерений используют аналитические весы Ohaus Adventurer AR 1530, точность взвешивания ±0.002 г.

В колбу на 100 мл наливают 50 мл дистиллированной воды и нагревают до 50°С, затем засыпают расчетную навеску ХТЗ и перемешивают в течение 20 мин со скоростью 400 оборотов в минуту для набухания частиц полисахарида. Далее добавляют расчетную навеску L- или D-AspA и 50 мл воды, перемешивают при тех же условиях (температура, скорость вращения мешалки) в течение 2-3 часов до полного растворения ХТЗ и фильтруют через фильтр Шотта-160. В колбу на 100 мл отбирают 25 мл отфильтрованного водного раствора ХТЗ в L-AspA или ХТЗ в D-AspA, добавляют автоматической пипеткой-дозатором расчетное количество глицеринового раствора Si(OGly)₄, которое контролируют гравиметрически, перемешивают при тех же условиях (температура, скорость вращения мешалки) в течение 6 часов и охлаждают до комнатной температуры в термоустойчивом стакане с утеплением со скоростью охлаждения 15 град/час. В результате протекания золь-гель синтеза Si(OGly)₄ формируется агрегативно и седиментационно стабильная дисперсия наночастиц L- или D-аспарагината хитозана - ХТЗ⋅L-AspA или ХТЗ⋅D-AspA.

Исходную дисперсию наночастиц L- или D-аспарагината хитозана готовят при концентрации хитозана С_ХТЗ=3 г/л, концентрации L-(D-)аспарагиновой кислоты С_L-(D-)AspA=2-4 г/л, соблюдая мольное соотношение хитозан : аспарагиновая кислота [ХТЗ]:[AspA]=0.8-1.7, и концентрации 60 мас.% раствора тетраглицеролата кремния в глицерине 3.0 г/л - концентрации тетраглицеролата кремния С_Si=1.8 г/л, концентрации глицерина С_Гл=1.2 г/л.

Для получения рабочих водных дисперсий с необходимой концентрацией наночастиц ХТЗ⋅L-AspA или ХТЗ⋅D-AspA исходную дисперсию наночастиц разбавляют водой.

Основные характеристики наночастиц ХТЗ⋅L-(D-)AspA и удельную электропроводность наноструктурированной водной дисперсии наночастиц определяют методом динамического светорассеяния на Zetasizer Ultra версии Red Label Malvern Panalytical (Великобритания) при 23±2°С. Для характеристики используют следующие параметры: средний диаметр (d, нм), объемная доля (Q, %), индекс полидисперсности (P_i), дзета-потенциал (ζ, мВ), удельная электропроводность (χ, мСм/см).

Оценивают эффективность влияния биопрепарата на основе наночастиц L- или D-аспарагината хитозана как биостимулятора на всхожесть семян и параметры проростков тест-растений, а также как биофунгицида на рост мицелия фитопатогенных грибов в культуре in vitro. При этом, для получения водной дисперсии наночастиц для обработки семян разведение водой производят до получения водной дисперсии наночастиц L- или D-аспарагината с концентрацией исходных компонентов: хитозана С_ХТЗ=0.003-3.0 г/л, L- или D-аспарагиновой кислоты С_L-(D-)AspA=0.003‒3.0 г/л, тетраглицеролата кремния С_Si=0.0018-1.8 г/л, глицерина С_Гл=0.0012-1.2 г/л; для определения фунгицидной активности в чистых культурах фитопатогенов in vitro - С_ХТЗ=0.01-1.0 г/л, С_L-(D-)AspA=0.01-1.0 г/л, С_Si=0.006-0.6 г/л, С_Гл=0.004-0.4 г/л.

Опыты по оценке всхожести семян растений проводят в соответствии с ГОСТ 12038-84 «Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести» на фильтровальной бумаге. Перед проращиванием семена дезинфицируют 3%-ным раствором перекиси водорода и промывают стерильной дистиллированной водой, затем замачивают в растворе биостимулятора или воды в течение 2 часов. После этого тест-семена раскладывают на двух-трех слоях увлажненной бумаги в чашках Петри или между двух слоев увлажненной бумаги, которую скатывают в рулоны и помещают в стакан. Проращивание проводят в зависимости от вида тест-семян в соответствующих условиях: пшеница мягкая Triticum aestivum L. сорт Новоершовская при температуре 20°С в течение 7 суток в темноте (в рулонах); огурец Cucumis sativus L. сорт Нежинский при температуре 25°С в течение 7 суток в темноте (на бумаге в чашках Петри); соя Glycine max (L.) Merr. сорт Натали при 25°С в течение 7 суток в темноте (в рулонах). Для каждого объекта закладывают четыре повторности по 100 штук тест-семян в каждом. Всхожесть (лабораторную) оценивают отношением числа проростков к общему числу тест-семян, взятых для проведения эксперимента, и выражают в процентах. При подсчете проросших семян учитывают только нормально проросшие. Невсхожими семенами считают набухшие, но ненормально проросшие. У проростков оценивают морфологические признаки: длина побега, длина корня, сырая масса побега и корня.

Опыты по оценке роста мицелия проводят на чистых культурах патогенных грибов Botrytis sp. (возбудитель серой гнили подсолнечника), Sclerotinia cf. sclerotiorum (возбудитель склеротиниозной головчатой гнили подсолнечника), Rhizoctonia sp. (возбудитель ризоктониозной корневой гнили пшеницы). Фрагмент активно растущего мицелия патогенного гриба с агаризованной пительной среды LB 0.5×0.5 см помещают в центр чашки Петри на свежую питательную среду LB без дополнительных добавок (контроль) или с добавлением биопрепарата наночастиц L- или D-аспарагината хитозана. На этапе, когда в контрольном варианте мицелий патогена покрывает всю поверхность питательной среды, измеряют диаметр мицелия во всех вариантах опыта. Для каждого объекта в каждом варианте опыта закладывают четыре повторности.

Результаты всех экспериментов по оценке стимуляции роста и развития растений, ингибирования фитопатогенов подвергают однофакторному дисперсионному анализу с определением достоверности различий по F-критерию Фишера и расчетом наименьшей средней разницы (НСР) при уровне значимости 5% (р≤0.05).

Группа примеров получения водной дисперсии наночастиц L- или D-аспарагината хитозана, оценки их агрегативной и седиментационной стабильности.

Характеристика водных дисперсий наночастиц ХТЗ⋅L-AspA, ХТЗ⋅D-AspA и наноструктурированной системы ХТЗ⋅L-(D-)AspA + вода при разном времени хранения дисперсий приведена в таблице 1 (фиг. 7).

Пример 1. В круглодонную колбу наливают 50 мл дистиллированной воды, подогревают в условиях перемешивания на магнитной мешалке при 400 об/мин до 50°С, засыпают 0.3 г ХТЗ и перемешивают для набухания частиц ХТЗ в течение 20 мин. Затем добавляют 0.2 г L- или D-AspA и 50 мл дистиллированной воды, из расчета получения раствора ХТЗ в L- или D-AspA с С_ХТЗ=3.0 г/л, С_L-(D-)AspA=2.0 г/л, [ХТЗ]:[AspA]=0.8, продолжают перемешивать в тех же условиях в течение 3 час до полного растворения навесок и фильтруют через воронку Шотта-160. В отдельную круглодонную колбу отбирают 25 мл отфильтрованного раствора CS в L- или D-AspA, добавляют 0.08 г 60 мас.% глицеринового раствора Si(OGly)₄ из расчета получения готовой системы (водной дисперсии наночастиц) с С_Si=1.8 г/л, С_Гл=1.2 г/л, перемешивают при 50°С как написано выше в течение 6 час и охлаждают до комнатной температуры со скоростью 15 град/час.

Характеристика водных дисперсий наночастиц ХТЗ⋅L-AspA на 1-й день после приготовления - средний диаметр d = 1400 нм, объемная доля Q = 86%, индекс полидисперсности P_i = 0.6, дзета-потенциал ζ = 33 мВ, удельная электропроводность χ = 0.63 мСм/см, на 14-й день после приготовления - d = 1300 нм, Q = 90%, P_i = 0.4, ζ = 38 мВ, χ = 0.58 мСм/см. На 15-ый день хранения наблюдается фазовое разделение с выпадением осадка.

Характеристика водных дисперсий наночастиц ХТЗ⋅D-AspA на 1-й день после приготовления - d = 1000 нм, Q = 80%, P_i = 0.6, ζ = 31 мВ, χ = 0.47 мСм/см, на 14-й день после приготовления - d = 500 нм, Q = 98%, P_i = 1.1, ζ = 25 мВ, χ = 0.52 мСм/см. На 15-й день хранения наблюдается фазовое разделение с выпадением осадка.

Пример 2 выполнен аналогично примеру 1. Отличие в том, что исходную систему готовят из расчета получения водной дисперсии наночастиц L- или D-аспарагината с концентрацией исходных компонентов - С_ХТЗ=3.0 г/л, С_L-(D-)AspA=3.0 г/л, [ХТЗ]:[ AspA]=1.3, С_Si=1.8 г/л, С_Гл = 1.2 г/л.

Характеристика водных дисперсий наночастиц ХТЗ⋅L-AspA на 1-ый день после приготовления - d = 1600 нм, Q = 90%, P_i = 0.4, ζ = 24 мВ, χ = 0.69 мСм/см, на 14-ый день после приготовления - d = 1600 нм, Q = 90%, P_i = 0.5, ζ = 20 мВ, χ = 0.60 мСм/см. Система сохраняет агрегативную и седиментационную устойчивость более 30 суток хранения в условиях комнатной атмосферы.

Характеристика водных дисперсий наночастиц ХТЗ⋅D-AspA на 1-ый день после приготовления - d = 1400 нм, Q = 85%, P_i = 0.5, ζ = 35 мВ, χ = 0.63 мСм/см, на 14-ый день после приготовления - d = 1400 нм, Q = 85%, P_i = 0.4, ζ = 39 мВ, χ = 0.58 мСм/см. Система сохраняет агрегативную и седиментационную устойчивость более 30 суток хранения в условиях комнатной атмосферы.

Пример 3 выполнен аналогично примеру 1. Отличие в том, что исходную систему готовят из расчета получения водной дисперсии наночастиц L- или D-аспарагината с концентрацией исходных компонентов - С_ХТЗ=3.0 г/л, С_L-(D-)AspA=4.0 г/л, [ХТЗ]:[ AspA]=1.7, С_Si=1.8 г/л, С_Гл=1.2 г/л.

Характеристика водных дисперсий наночастиц ХТЗ⋅L-AspA на 1-ый день после приготовления - d = 1500 нм, Q = 94%, P_i = 0.4, ζ = 37 мВ, χ = 0.73 мСм/см, на 14-ый день после приготовления - d = 1500 нм, Q = 92%, P_i = 0.4, ζ = 37 мВ, χ = 0.71 мСм/см, на 40-й день после приготовления - d = 1500 нм, Q = 90%, P_i = 0.4, ζ = 37 мВ, χ = 0.70 мСм/см, на 300-ый день после приготовления - d = 1200 нм, Q = 95%, P_i = 0.4, ζ = 36 мВ, χ = 0.73 мСм/см.

Характеристика водных дисперсий наночастиц ХТЗ⋅D-AspA на 1-ый день после приготовления - d = 1000 нм, Q = 92%, P_i = 0.9, ζ = 33 мВ, χ = 0.70 мСм/см, на 55-ый день после приготовления - d = 1200 нм, Q = 76%, P_i = 0.5, ζ = 35 мВ, χ = 0.73 мСм/см, на 125-ый день после приготовления - d = 1500 нм, Q = 66%, P_i = 0.6, ζ = 31 мВ, χ = 0.68 мСм/см,

Таким образом, покрытые полисилоксановой оболочкой наночастицы L- или D-аспарагината хитозана, полученные при мольном соотношении [ХТЗ]:[AspA]=1.3-1.7, агрегативно и седиментационно стабильны в течение 30-300 суток с момента приготовления. Для проведения испытаний по оценке стимуляции роста проростков зерновых, зернобобовых и овощных культур, а также фунгицидной активности в отношении фитопатогенных грибов целесообразно использовать биопрепарат агрегативно и седиментационно устойчивых наночастиц ХТЗ⋅L-AspA или ХТЗ⋅D-AspA с наименьшим содержанием свободной (не связанной с полимером) L- или D-аспарагиновой кислоты, т.е. полученный при мольном соотношении [ХТЗ]:[AspA]=1.3.

Группа примеров оценки всхожести тест-семян и морфометрических параметров проростков.

Сравнительная оценка влияния биостимулятора по сравнению с водой на всхожесть тест-семян и морфометрические параметры проростков растительных культур приведена в таблице 2 (фиг. 8).

Пример 4. Берут исходную дисперсию наночастиц L-аспарагината хитозана, полученную по примеру 2 при мольном соотношении [ХТЗ]:[AspA]=1.3 и концентрации исходных компонентов - С_ХТЗ=3.0 г/л, С_L-AspA=3.0 г/л, С_Si=1.8 г/л, С_Гл=1.2 г/л, или D-аспарагината хитозана, полученную по примеру 2 при мольном соотношении [ХТЗ]:[AspA]=1.3 и концентрации исходных компонентов- С_ХТЗ=3.0 г/л, С_D-AspA=3.0 г/л, С_Si=1.8 г/л, С_Гл = 1.2 г/л, и разбавляют водой для получения рабочих водных дисперсий наночастиц L-аспарагината хитозана с концентрацией исходных компонентов - С_ХТЗ=0.003 г/л, С_L-AspA=0.003 г/л, С_Si=0.0018 г/л, С_Гл=0.0012 г/л или D-аспарагината хитозана С_ХТЗ=0.003 г/л, С_D-AspA=0.003 г/л, С_Si=0.0018 г/л, С_Гл=0.0012 г/л для замачивания тест-семян огурца (Cucumis sativus L.) сорта Нежинский и последующим их проращивании на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри в контролируемых условиях.

Тест-семена огурца (Cucumis sativus L.) сорта Нежинский, замоченные в течение 2 часов в воде (1) или в биопрепарате ХТЗ⋅L-AspA с С_ХТЗ=0.003 г/л, С_L-AspA=0.003 г/л, С_Si=0.0018 г/л, С_Гл=0.0012 г/л (2) или С_ХТЗ=0.003 г/л, С_D-AspA=0.003 г/л, С_Si=0.0018 г/л, С_Гл=0.0012 г/л (3), проращивают в чашках Петри на фильтровальной бумаге, увлажненной дистиллированной водой при температуре 25°С в течение 7 суток в темноте. Всхожесть тест-семян в образце (1) составила 69.3%, в образце (2) - 97.3%, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 70.7%. Длина побега в образце (1) составила 6.3 см, в образце (2) - 7.0 см, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 6.8 см. Длина корня в образце (1) составила 6.8 см, в образце (2) - 12.2 см, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 11.0 см, что также достоверно превысило контроль. Масса побега сырая в образце (1) составила 147.2 мг, в образце (2) - 193.0 мг, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 214.1 мг, что также достоверно превысило контроль. Масса корня сырая в образце (1) составила 63.1 мг, в образце (2) - 138.8 мг, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 117.7 мг, что также достоверно превысило контроль. По остальным признакам проростки не различались.

Проростки огурца (Cucumis sativus L.) сорта Нежинский из тест-семян, пророщенных на воде (слева), замоченных в водной дисперсии наночастиц L-аспарагината хитозана (в центре) и D-аспарагината хитозана (справа) приведены на фиг. 1.

Пример 5 выполнен аналогично примеру 4. Отличие в том, что используют тест-семена пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.) сорта Новоершовская и проращивание проводят при температуре 20°С в рулонах из фильтровальной бумаги. Всхожесть тест-семян в образце (1) составила 88.0%, в образцах (2) и (3) - 87.0% и 82.0%, соответственно, данные по вариантам не различались. Длина побега в образце (1) составила 10.7 см, в образце (2) - 11.2 см, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 10.2 см. Длина корня в образце (1) составила 13.6 см, в образце (2) - 12.8 см, в образце (3) - 11.7 см, что было достоверно ниже контроля. Масса побега сырая в образце (1) составила 74.9 мг, в образце (2) - 85.4 мг, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 80.1 мг, что также достоверно превысило контроль. Масса корня сырая в образце (1) составила 60.5 мг, в образце (2) - 72.0 мг, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 57.4 мг.

Проростки пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.) сорта Новоершовская из тест-семян, пророщенных на воде (слева), замоченных в водной дисперсии наночастиц L-аспарагината хитозана (в центре) и D-аспарагината хитозана (справа) приведены на фиг. 2.

Пример 6 выполнен аналогично примеру 5. Отличие в том, что семена не замачивают, а проращивание проводят в рулонах, частично погруженных в водную дисперсию биопрепарата, и используют рабочую водную дисперсию наночастиц L-аспарагината хитозана с С_ХТЗ=0.03 г/л, С_L-AspA=0.03 г/л, С_Si=0.018 г/л, С_Гл=0.012 г/л (2) или D-аспарагината хитозана c С_ХТЗ=0.03 г/л, С_D-AspA=0.03 г/л, С_Si=0.018 г/л, С_Гл=0.012 г/л (3). Всхожесть тест-семян в образце (1) составила 92%, в образцах (2) и (3) - 92 и 88%, соответственно, данные по вариантам не различались. Длина побега в образце (1) составила 7.8 см, в образцах (2) и (3) – 6.7 и 7.6 см, соответственно, данные по вариантам не различались. Длина корня в образце (1) составила 6.8 см, в образцах (2) и (3) - 8.6 и 9.5 см, соответственно, что было достоверно выше контроля. Масса побега сырая в образце (1) составила 67.5 мг, в образцах (2) и (3) - 60.5 и 66.6 мг, соответственно, что достоверно не отличалось от контроля. Масса корня сырая в образце (1) составила 21.9 мг, в образцах (2) и (3) - 16.0 и 21.5 мг, соответственно, что достоверно не отличалось от контроля.

Пример 7 выполнен аналогично примеру 4. Отличие в том, что используют тест-семена сои (Glycine max (L.) Merr.) сорта Натали и проращивание проводят в рулонах из фильтровальной бумаги. Всхожесть тест-семян в образце (1) составила 72.0%, в образце (2) - 86.0%, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 76.0%. Длина побега в образце (1) составила 14.8 см, в образце (2) - 16.00 см, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 15.6 см, что также достоверно превысило контроль. Длина корня в образце (1) составила 13.7 см, в образце (2) - 15.9 см, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 13.4 см. Масса побега сырая в образце (1) составила 803.5 мг, в образце (2) - 858.9 мг, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 792.5 мг. Масса корня сырая в образце (1) составила 193.5 мг, в образце (2) - 278.2 мг, что достоверно превысило контроль, в образце (3) - 213.1 мг, что также достоверно превысило контроль. По остальным признакам проростки не различались.

Проростки сои (Glycine max (L.) Merr.) сорта Натали из тест-семян, пророщенных на воде (слева), замоченных в водной дисперсии наночастиц L-аспарагината хитозана (в центре) и D-аспарагината хитозана (справа) приведены на фиг. 3.

Пример 8 выполнен аналогично примеру 7. Отличие в том, что семена не замачивают, а проращивание проводят в рулонах, частично погруженных в водную дисперсию биопрепарата, и используют рабочую водную дисперсию наночастиц L-аспарагината хитозана с С_ХТЗ=0.03, 0.3 и 3 г/л, С_L-AspA=0.03, 0.3 и 3 г/л, С_Si=0.018, 0.18 и 1.8 г/л, С_Гл=0.012, 0.12 и 1.2 г/л (образцы 2, 4, 6) или D-аспарагината хитозана c С_ХТЗ=0.03, 0.3 и 3 г/л, С_D-AspA=0.03, 0.3 и 3 г/л, С_Si=0.018, 0.18 и 1.8 г/л, С_Гл=0.012, 0.12 и 1.2 г/л (образцы 3, 5, 7) г/л. Всхожесть тест-семян в образце (1) составила 74%, в образцах (2), (3), (4), (5), (6) и (7) - 74, 83, 93, 80, 87 и 83%, соответственно, данные по вариантам не различались. Длина побега в образце (1) составила 9.6 см, в образцах (2), (3), (4) - 11.0, 10.1, 11.0 см, соответственно, что достоверно превысило контроль, в образце (6) - 8.7 см, что не отличалось от контроля, в образцах (5) и (7) - 6.0 и 2.3 см, соответственно, что достоверно ниже контроля. Длина корня в образце (1) составила 8.5 см, в образце (4) – 10.3 см, что достоверно выше контроля, в образцах (2) и (3) - 9.8 и 10.1 см, соответственно, что не отличалось от контроля, в образцах (5), (6) и (7) - 5.0, 5.7 и 3.3 см, что достоверно ниже контроля. Масса побега сырая в образце (1) составила 746.8 мг, в образце (4) - 847.6 мг, что достоверно выше контроля, в образцах (2), (3), (5), (6) и (7) - 803.1, 797.5, 669.3, 742.6 и 423.9, соответственно, что не отличалось от контроля. Масса корня сырая в образце (1) составила 205.8 мг, в образцах (2), (3), (4), (5), (6) и (7) - 259.1, 218.0, 218.2, 151.3, 205.0 и 179.0 мг, соответственно, что достоверно не отличалось от контроля.

Группа примеров оценки фунгицидной активности биопрепарата по подавлению роста мицелия патогенных грибов.

Влияние биопрепарата наночастиц L- или D-аспарагината хитозана разной концентрации на рост in vitro мицелия фитопатогенных грибов приведено в таблице 3 (фиг. 9).

Пример 9. В качестве контрольного варианта используют питательную среду LB без добавления биопрепарата (1). Берут полученную по примеру 2 исходную водную дисперсию наночастиц L-аспарагината хитозана с [ХТЗ]:[AspA]=1.3, С_ХТЗ=3.0 г/л, С_L-AspA=3.0 г/л, С_Si=1.8 г/л, С_Гл=1.2 г/л или полученную по примеру 2 водную дисперсию наночастиц D-аспарагината хитозана с [ХТЗ]:[AspA]=1.3, С_ХТЗ=3.0 г/л, С_D-AspA=3.0 г/л, С_Si=1.8 г/л, С_Гл=1.2 г/л разбавляют питательной средой LB до концентрации рабочих водных дисперсий наночастиц L-аспарагината хитозана с С_ХТЗ=0.01, 0.1 и 1.0 г/л, С_L-AspA=0.01, 0.1 и 1.0 г/л, С_Si=0.006, 0.06 и 0.6 г/л, С_Гл=0.004, 0.04 и 0.4 г/л (образцы 2, 3 и 4) или D-аспарагината хитозана с С_ХТЗ=0.01, 0.1 и 1.0 г/л, С_D-AspA=0.01, 0.1 и 1.0 г/л, С_Si=0.006, 0.06 и 0.6 г/л, С_Гл=0.004, 0.04 и 0.4 г/л (образцы 5, 6 и 7). Автоклавированную при 120°С в течение 20 минут контрольную и с добавкой биопрепарата питательную среду разливают по чашкам Петри. Фрагмент 0.5×0.5 см мицелия чистой культуры патогенного гриба Botrytis sp. (возбудителя серой гнили подсолнечника) помещают в центр чашки на поверхность питательной среды и культивируют при температуре 22°С до полного заполнения мицелием поверхности питательной среды в контрольном варианте (1). Диаметр мицелия в образце (1) составил 50.0 мм, в образцах (2) и (5) - 46.0 мм, в образце (3) - 45.0 мм, в образцах (4) и (6) - 42.0 мм, что достоверно ниже контроля, в образце (7) - 35.0 мм, что также достоверно ниже контроля.

Сравнительная оценка фунгицидной активности биопрепрата в отношении гриба Botrytis sp. по сравнению с контролем представлена на фиг. 4.

Пример 10. выполнен аналогично примеру 9. Отличие в том, что используют мицелий чистой культуры патогенного гриба Sclerotinia cf. sclerotiorum (возбудителя склеротиниозной головчатой гнили подсолнечника). Диаметр мицелия в образце (1) составил 51.3 мм, в образцах (2), (3), (5) и (6) - 50.0, 49.0, 50.2 и 50.6 мм, соответственно, в образце (4) и (7) - 41.0 и 42.0 мм, соответственно, что достоверно ниже контроля.

Сравнительная оценка фунгицидной активности биопрепрата в отношении гриба Sclerotinia cf. sclerotiorum по сравнению с контролем приведена на фиг. 5.

Пример 11. выполнен аналогично примеру 9. Отличие в том, что используют мицелий чистой культуры патогенного гриба Rhizoctonia sp. (возбудитель ризоктониозной корневой гнили пшеницы). Диаметр мицелия в образце (1) составил 49.4 мм, в образцах (2), (3), (5) и (6) - 49.6, 49.7, 48.9 и 48.9 мм, соответственно, в образцах (4) и (7) - 42.0 и 44.7 мм, соответственно, что достоверно ниже контроля.

Сравнительная оценка фунгицидной активности биопрепрата в отношении гриба Rhizoctonia sp. по сравнению с контролем приведена на фиг. 6.

Экспериментально установлено, что при использовании биопрепарата наночастиц L- или D-аспарагината хитозана, заявленных в примерах 2-11, технический результат изобретения достигается. На основании примеров 2 и 3 установлено формирование водных дисперсий агрегативно и седиментационно стабильных наночастиц L- или D-аспарагината хитозана. На основании примеров 4‒8 показана стимуляция параметров всхожести и роста проростков зерновых, зернобобовых и овощных культур. На основании примеров 9-11 установлена фунгицидная активность биопрепарата в отношении чистой культуры фитопатогенных грибов.

Таким образом, в изобретении при оценке всхожести тест-семян, роста и вегетации тест-растений показана высокая ростостимулирующая активность биопрепарата наночастиц L- или D-аспарагината хитозана, выражающаяся в увеличении темпов роста проростков и их массы по сравнению с контролем. Новый биопрепарат оказывает непосредственное фунгицидное влияние на рост мицелия патогенных грибов.

Биопрепарат наночастиц L- или D-аспарагината хитозана прост в применении, не требует специфических условий получения и отличается высокой стабильностью при хранении. Используемые для получения биопрепарата компоненты (хитозан, L- или D-аспарагиновая кислота, тетраглицеролат кремния, глицерин) относятся к классу биологически активных веществ и не наносят вред окружающей среде, животным и человеку.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Предложен биопрепарат на основе аспарагината хитозана для стимуляции роста и фунгицидной обработки растений, который представляет собой водную дисперсию покрытых полисилоксановой оболочкой наночастиц аспарагината хитозана, полученную взаимодействием аспарагината хитозана с тетраглицеролатом кремния. Изобретение обеспечивает стимулирование роста растений и обеспечивает фунгицидную обработку в отношении фитопатогенных грибов. 9 ил., 11 пр.

Биопрепарат на основе аспарагината хитозана для стимуляции роста и фунгицидной обработки растений, отличающийся тем, что он представляет собой водную дисперсию покрытых полисилоксановой оболочкой наночастиц аспарагината хитозана, полученную взаимодействием аспарагината хитозана с тетраглицеролатом кремния, при следующем соотношении исходных компонентов, г/л:

хитозан с молекулярной массой 200 кДа 0.003-3.0 L- или D-аспарагиновая кислота 0.003-3.0 тетраглицеролат кремния 0.0018-1.8 глицерин 0.0012-1.2