Изобретение относится к микробиологической промьшшенкости, в частности к способам определения концентрации жизнеспособных клеток микроорганизмов.
Известен способ определения концентрации жизнеспособных клеток путем рассева на питательные среды
Ближайшим к изобретению техни.чёским решением по технической сущ.ности и достигаемому эффекту является способ определения концентрации жизнеспособных клеток микробной биомассы в процессе культивирования микроор г-анйзмбв на питательной среде Тр.
Недостатком известного способа является его продолжительность (114 суток) и низкая точность анализа, (не менее ±30%).
Цель изобретения - ускорение спо.соба и повьхление его точности.
Поставленная цель достигается тем что согласно способу определения концентрации жизнеспособных клеток микробной биомассы в процессе культиви- рования микроорганизмов на питательной среде измеряют вязкость полученной биомассы при температуре культивирования микроорганизмов, а концент-рацию жизнеспособных клеток определяют по формуле
T(a+b-Jnl))10,
Т - концентрация жизнеспособгденых клеток, мг, Л) - кинематическая вязкость
биомассы, бСт,
10
а,Ь - эмпирические коэффициенты, определяемые природой биомассы.
При этом перед измерением вязкости биомассу Фильтруют.
15
Сущность предлагаемого способа определения концентрации жизнеспособных клеток состоит в том, что для ряда микробных культур (спорообразуюцая культура Вас Ml us dendrollmus Вас.
20 thuringlensis, вегетативная культура Rhizolium pjsum) экспериментально установлена взаимосвязь Mengoiy вязкостью биомассы и количеством жизнеспособных клеток в единице объема
25 (титром) в виде
Т-(а+Ь InV)10,
(1)
Т - титр (концентрация микробгде
30 ных клеток)) кл/мл; t) - кинематическая вязкость б омассы, сСт; а,Ь- эмпирические коэффициенты определяемые природой био массн. Проводят измерение вязкости био массы капиллярным вискйзиметром, диаметр которого выбирают с учетом природы исследуемой жидкости. При наличии в жидкости остатков питательных сред жидкости фильтруют чв рез фильтр с размером ячеек, не пр вышающим диаметр капилляра вискози метра, во избежание засорения капил ляра вискозиметра. Заполненный жид костью вискозиметр термостатируют в устройстве, обеспечивающем визуа льное наблюдение истечения жидкости через капилляр при температуре не выше температуры культивирования биомассы (28-30 с) и через 10-15 мин проводят измерение времени истечения жидкости через капилля при помощи секундомера. Расчет вязкости производят по формуле (Паспорт к вискозиметру ВПЖ) , 1 98077 где г - время, с; g - ускорение силы тяжести С4981, см/с, k - постоянная вискозиметра. Расчет среднего значения вязкост исследуемой жидкости производят на основании 5-7 измерений. Параллельно измерению вязкости проводят микробиологический анализ образца исследуемой жидкости с целью определения титра (кл/мл) по стандартной методике методом последовательных разведений d вы.севом на твердую питательную среду. В результате статистической обраб ки экспериментальных данных получают .аналитическую зависимость титра исследуемой биомассы от вязкости (1 На чертеж€. приведена зависимость титра исследуемой биомассы от вязкости. Прямая линия, построенная на основании этой зависимости, является калибровочным графиком для определения tHTpa биомассы (чертеж). Пример. В лабораторных условиях измеряют зависимость вязкости от концентрации жизнеспособны клеток (титра) культуральной жидкос ти Bacillus thurIng tenstS штамм 507 и суспензии клеток того же штамма. Опыты проводят на капиллярном виско зиметре ВПЖ-1 (,03033) при посто янной температуре 20°с с диаметром капилляра 0,86. Необходимости в фильтровании жид кости нет. Заполненный жидкостью вискозиметр помещают в термостатирукицее устройство, обеспечивающее визугшьное наблюдение истечения жидкости через капилляр, вьщерживают 15 мин и проводят измерение времени истечения жидкости через капилляр вискозиметра. Затем по формуле (2) рассчитывают вязкость исследуемой жидкости. Первым этапом исследования является построение калибровочного графика Т f(). Титр суспензии клеток и культуральной жидкости определяют по стандартной методике. Титр находится в пределах (0-2)-10 кл/мп, величина вязкости при этом изменяется в пределах 1-1,8 сСт.При статистической обработке полученных данный устанавливают зависимость Т f (V ) в виде (1) с коэффициентами а -3 и b +10, что соответствует на графике (чертеж; участку 1. Затем по этой Кривой определяют титр образца куль туральной жидкости, для которой получают т; 48,5 с и 1,47 сСт. значение титра из калибровочного графика Т 1,1 109 кл/мл. П р и м е р 2. Определяют изменение культуральной жидкости (биомассы) культуры Вас. dendrolimus от титра. Испытывают около 50 образцов культуральной жидкости штамма 49-8 на капиллярном вискозиметре ВПЖ-1 с диаметром капилляра 0,86 мм (К 0,02743) при температуре среды . Для этого 40 мл образца жидкости Фильтруют через фильтр с размерами ячеек 0,7-0,8 мм и заливают в вискозиметр. Заполненный исследуемой жидкостью вискозиметр устанавливают в термостатирующее .устройство, аналогичное примеру 1, и вьадерживают 15 мин. Затем при помощи секундомера Зс1меряют время истечения жидкости через капилляр и по формуле (2) рассчитывают вязкость. Расчет среднего значения вязкости производят на основании данных 5-7 измерений исследуемого образца жидкости. Строят калибровочный график. Для этого параллельно измерению вязкости проводят микробиологический анализ образцов по стандартной методике, аналогично примеру 1. Затем после статистической обработки экспериментальных данных в диапазоне вязкости 2-3 сСт и титра 2-6-10 кл/мл полуают зависимость (1) с теми же, что и в примере 1,коэффициентами и b ИО (чертеж, участок П) . Полуенный график служит для определения титра образцов культуральной жидкости. Так, для образца культуральной идкости получают Т 88,2 с, 2,42 сСт. ИЗ графика находят ,3 10 кл/мл. П р и м е р 3. Определяют изменение вязкости пасты (биомассы) культуры Вас. thuringiensIS штамм 844 от титра. Паста.получается при концентр ровании культуральной жидкости путем сепарации и отличается от культураль иой жидкости меньшей влажностью и, соответственно, значительно большей концентрацией биомассы. Испытывается около 30 образцов пасты на капиллярном вискозиметре ВПЖ-2 с диаметром капилляра 1,31 мм . (к 0,3399) при температуре среды . методика измерения вязкости (фильтрация пасты, заливка вискозиметра, термостатирование, измерение времени, расчет вязкости) аналогично примеру 2, Микробиологический анализ образцов по стандартной методике про водят аналогично примерам 1 и 2. Ксшибровочный график строится после статистической обработки экспе риментальных данных (диапазон вязкое ти 3-27 сСт, титра - (б-30)-10 кл/мл в виде зависимости (1) (чертея учас гок I И ) .с такими зке коэффициентами, как- и для участков и II прямой. Полученная кривая служит для определения титра образцов пасты. Так, для образца пасты получают 66,2 с, 22,5 сСт. Из графика находят Т 28, кл/мл. Таким образом, преимуществами предлагаемого способа по сравнению с известным являются: сокращение времени определения титра микробной биомассы (15-20 мин), что позволяет в производственных условиях использовать способ в качестве экспрессконтроля и как минимум в 2 раза повысить точность контроля. Формула изобретения Способ оп1ределения концентрации жизнеспособных клеток микробной биомассы, в процессе культивирования микроорганизмов на питательной среде, отл ич ающийс я тем, что, с целью ускорения способа и повыления его точности, измеряют вяз кость-полученной биомассы, при. температуре культивирования микроорганиз мов, а концентрацию жизнеспособных клеток определяют по формуле . T()w9 . где т - концентрация жизнеспособных клеток, мл, t - кинематическая вязкость биомассы, сСт, Ojb- эмпирические коэффициенты, определяемые природой биомассы. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что перед измерением вязкости биомассу фильтруют. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Задания к практическим занятиям по микробиологии. Л., ЛГУ,.1974. 2.Большой практикум по микробиологии. Под ред. проф. г.Л. Селибера. М., Высшая школа, 1962.
