ПРЕПАРАТ, ОБЛАДАЮЩИЙ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1998 года по МПК A61K35/74 

Изобретение относится к лекарственным препаратам, содержащим вещества или продукты реакции неизвестного строения, произведенные из бактерий, и касается разработки иммуностимулирующего препарата на основе гомоферментативных молочнокислых бактерий, повышающего иммунный статус, резистентность, стрессовую устойчивость и адаптационные возможности организма человека и животных.

В настоящее время препараты на основе молочнокислых бактерий находят широкое применение в медицине и ветеринарии для борьбы с дизбактериозами, нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта, формировании микробных биоценозов, повышения иммунологического статуса организма, лечения кишечных проявлений лучевой болезни (авт. св. СССР N 619187, 1494907, 1875690, 1813445).

Основными недостатками известных препаратов являются низкое содержание в них активного начала (концентрации жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий до 1 млрд. в 1 г), длительный цикл генерации и низкая продуктивность используемых штаммов.

Наиболее близким по назначению, достигаемому результату и строению препарата является средство, обладающее антибактериальной активностью, достигаемой за счет сочетания живой культуры ацидофильных лактобактерий и сывороточных иммуноглобулинов, взятых в одинаковых частях, при концентрации жизнеспособных микробных клеток 10⁷ 10⁸ на 0,1 г (авт. св. СССР N 1779377).

Однако этот препарат обладает следующими недостатками:
незначительное (10⁸ 10⁹) содержание микробных клеток в 1 г;
использование только одного штамма;
низкая продуктивность используемого штамма;
низкая устойчивость штамма к воздействию антибиотиков и сульфаниламидных препаратов;
малая скорость размножения культуры используемого штамма в желудочно-кишечном тракте, что потребовало для повышения эффективности препарата ввести в его состав (композицию) комплекс сывороточных иммуноглобулинов.

Цель изобретения устранение указанных недостатков путем создания лекарственного препарата, обладающего высокой биологической активностью, в том числе иммуностимулирующей способностью и способностью к подавлению патогенной и условно-патогенной микрофлоры, в состав (композицию) которого не входят сывороточные иммуноглобулины.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве штаммов, включенных в состав препарата, выбраны Streptococcus faecium М-3185 ВКПМ В-3491, Streptococcus faecium М ВКПМ В-3490, вырабатываемые в виде сухого концентрата монокультур и смешиваемые в соотношении 0,6.1,4 0,6.1,4 по количеству жизнеспособных клеток (содержание жизнеспособных клеток не менее 5•10¹² единиц на грамм).

Соотношение культур в препарате выбрано с учетом скорости развития и продуктивности штаммов. Штаммы Streptococcus faecium М-3185 и Streptococcus faecium М выделены из доминирующей микрофлоры желудочно-кишечного тракта здорового цыпленка и эпифитной микрофлоры капусты соответственно.

Культуры обладают большой удельной скоростью роста, активно продуцируют L-форму молочной кислоты, обладают ферментативным потенциалом и являются сильными антагонистами по отношению к ряду условно-патогенных и патогенных микроорганизмов: группы meseterius-subtiliscereus, маслянокислые бактерии, некоторые грибы, стафилококки, синегнойная палочка.

Для получения препарата осуществляют раздельное культивирование при оптимальных для каждого штамма молочнокислых бактерий условиях (температура, pH) на питательной среде, содержащей источники азота и углерода, по необходимости дополненной другими источниками питания и/или другими компонентами. Затем биомассу бактерий концентрируют и высушивают сублимационным способом. Получают сухую биомассу, содержащую живые клетки гомоферментивных молочнокислых бактерий в виде отдельных монокультур.

Для получения конечного продукта проводят измерение числа живых клеток на 1 г для каждой монокультуры и смешивание монокультур в соответствии с указанной пропорцией. Лекарственный препарат делят на дозы с содержанием жизнеспособных клеток 100•10⁹ (или 500•10⁹) в дозе, капсулируют и фасуют в вакуумную упаковку.

Пример 1. Приготовление препарата.

Готовят питательную среду следующего состава,
Гидролизат дрожжей (по весу) 30
Гидролизат кукурузной муки (по содержанию редуцирующих веществ) 2
Или глюкоза техническая (по весу) 2
Автолизат дрожжевой 0,3
Вода питьевая До 100%
В питательную среду вносят 5-10% посевной культуры Streptococcus faecium М-3185 и культивируют в течение 6-8 ч при температуре 39-42^oC и pH 6,2 в режиме перемешивания. В конце ферментации титр жизнеспособных молочнокислых бактерий составляют 20-30 млрд. кл/мл. По окончании процесса ферментации клетки выделяют из культуральной жидкости. Пасту высушивают на сублимационной сушилке. Титр клеток в сухом концентрате составляет 8000 млрд. кл/г. Во втором ферментере на среде того же состава при температуре 42^oC и pH 6,6 выращивают культуру Streptococcus faecium М в течение 8 ч (5-10% посевной культуры). Культуральную жидкость сепарируют и высушивают. Титр клеток в культуральной жидкости и сухом концентрате соответственно составляет 20 млрд. кл/мл, 5500 млрд. кл/г. Для получения готового препарата смешивают сухую биомассу каждой монокультуры в соотношении 1:1 по весу, что соответствует 1,45:1 по жизнеспособным клеткам. Готовый препарат содержит 6750 млрд. кл/г.

Пример 2. Готовый препарат с содержанием 6750 млрд. кл/г делят на дозы по 0,015 г, капсулируют, фасуют в вакуумную упаковку. Каждая полученная таким образом капсула содержит 100 млрд. жизнеспособных клеток штаммов Streptococcus faecium М-3185 и Streptococcus faecium М.

Пример 3. Исследования препарата проводились в учебно-информационном и клинико-консультативном центре "Филипп Пинель" НИИ психиатрии МЗ РФ. Иммунологическая активность препарата изучалась в сравнении с существующим иммуностимулятором Е-активин. В качестве экспериментальной модели были выбраны мыши линии СВА весом 30 г. Антигеном служили эритроциты барана (ЭБ) в концентрации 1•10 (ниже субоптимальной дозы) на физиологическом растворе. ЭБ вводили однократно внутрибрюшинно в объеме 0,3 мл.

Подопытным мышам одновременно с иммунизацией 1•10 ЭБ вводили препараты в следующих дозах:
Исследуемый препарат 34,3 мг/кг перорально
Т-активин 1,7 мкг/кг подкожно
Контроль ставился по стандартной методике. Ежедневно, начиная с третьего дня после иммунизации, у мышей (опытных и контрольных) из подключичной вены брали кровь для получения сыворотки и определения титра антиэритроцитарных антител методом гемагглютинации, у обескровленных животных извлекали селезенки и готовили клеточные суспензии на среде 199. В клеточных суспензиях определяли число АОК методами: розеткообразования и локального гемолиза в геле.

Кроме того, определяли специфическую функциональную активность антителообразующих клеток (АОК) в селезенке с помощью модифицированного метода Симпсона с соавторами, в основе которого лежит степень гемолиза ЭБ, инкубируемых с АОК и комплементом (сывороткой морской свинки).

Уже с третьего дня наблюдения проявлялось иммуностимулирующее действие исследуемого препарата. Величина пула антителообразующих клеток (АОК) в селезенке экспериментальных животных (метод розеток и Эрне) под влиянием препарата превышала таковую во всех контрольных группах. Препарат был более активен и в сравнении с Т-активином.

Сравнение с применяющимся в настоящее время иммуноактиватором Т-активин позволяет сделать вывод о том, что исследуемый препарат является новым мощным иммуномодулятором.

Изобретение относится к лекарственным препаратам, содержащим вещества или продукты реакции неизвестного строения, произведенные из бактерий, и касается разработки иммуностимулирующего препарата на основе гомоферментативных молочнокислых бактерий, повышающего иммунный статус, резистентность, стрессовую устойчивость и адаптационные возможности организма человека и животных. Предлагаемый лекарственный препарат обладает высокой биологической активностью, в том числе иммуностимулирующей способностью и способностью к подавлению патогенной и условно-патогенной микрофлоры, в состав (композицию) которого не входят сывороточные иммуноглобулины. Это достигается тем, что в препарате в качестве штаммов молочнокислых бактерий выбраны штаммы Streptococcus faecium 3185-М В-3491 и Streptococcus faecium М ВКПМ В-3490, производимые в виде сухого концентрата монокультур и смешиваемые в соотношении 0,6. ..1,4 : 0,6...1,4 по количеству жизнеспособных клеток.

Препарат, обладающий иммуностимулирующим действием, содержащий живую культуру молочнокислых бактерий, отличающийся тем, что в качестве штаммов используют Streptococcus faecium М-3185 коллекционный номер ВКПМ В-3491 и Streptococcus faecium М коллекционный номер ВКПМ В-3490, производимые в виде сухого концентрата монокультур и смешиваемые в соотношении 0,6 1,4 1,4 - 0,6 по количеству жизнеспособных клеток.