Способ лигандообменного хроматографического разделения и анализа смеси энантиомеров аминокислот и способ получения алкилпроизводных оптических изомеров аминокислоты Советский патент 1983 года по МПК G01N31/08 

го хроматографического разделения и анализа смеси эчантиомеров oL -аминокис лот, включающий ввод и перемещение ана лизируемой пробы через слой сорбирующей насадки в потоке элюентв, содержа- шего ионы металла-комплексообразователя. Согласно способу в элюент добавля ют оптически активное вещество в качес ве добавки С 2 J. Однако добавление в .элюент оптически активной добавки резко удорожает проведение анализа и затрудняет щирокое внедрение метода в аналитическую практику в том числе для препаративного вы д-зления веществ..Сравнительно узкие пре делы изменения полярности элюента и ег элюирующей силы не позволяют щироко варьировать селективность разделения. Целью изобретения является удещевле ни,е, упрощение -и расширение аналитичес ких возможностей способа. Поставленная цель достигается тем , что согласно способу лигандообменного хроматографического разделения и анализа, включающему ввод и перемещение ана лизируемой пробы через слой сорбирующей нр гадки в потоке элюента, содержащего ионы металла-комплексообразователя, сор бирующая насадка составлена из обращенно-фазового сорбента с введением в состав углеводородного слоя алкилпроизводного оптического изомера с6-амино- кислоты, а элюирование проводят системо растворителей с полярностью 5,0-10,2 прт;,, рН 2-7,5. В предпочтительном варианте реализации способа в качестве растворителя для элюента используют воду. Суть изобретения иллюстрируют примеры изменения селективности и удерживания в зависимости от изменения соотношения вода-органический компонент элюента (табл. 1 и 2), температуры (табл.3 концентрации металла-комплексообразователя (табл. 4), природы органического компонента (табл. 5 и 6). Эксперименты показывают, что прове Денис процесса за указанными пределами значений параметров разделения приводит к потере селективности и ухудшению ана литических свойств хроматографической системы. На основании приведенных экспериментальных данных можно констатировать, что для рассмотренных сорбционных систем наибольшие значения удерживания характерны для сорбатов с крупными алифатическими и apoмaтичecки fи радикалами при ез1-углеродном атоме, таким образом, 1 76.4 для этих аминокислот гидрофобное взаимодействие с поверхностью сорбента вносит существенный вклад в удерживание. Об этом свидетельствует и снижение удерживания гидрофобных аминокислот с ростом концентрации, органического компонента элюента. Для гидрофильных кислот эти закономерности не соблюдаются и в ряде случаев заменяются на обратные, поскольку у таких аминокислот удерживание в значительной степени определяется координационными взаимодействиями. Роль этих взаимодействий отчетливо прослеживается при изменении концентрации меди в элюенте. Таким образом, на предложен ix стационарных фазах для лигандообменной хроматографии удерживание обусловлено образованием сорбционных тройных комплексов на поверхности сорбента, состоящих из фиксированного лиганда (молекулы стационарной фазы), иона метагшакомплексообразователя и молекулы хроматографируемой аминокислоты. Гидрофобное взаимодействие бокового радикала в молекуле аминокислоты с поверхностью сорбента приводит к существенной стабилизации сорбционных комплексов. Образование сорбционных комплексов - единственный процесс, обеспечивающий хиральноо распознавание энантиомеров. Энантиселективность у различных алкилпроизводных оптических изомеров о -аминокислот различна, например, у гистидионового кo lплекса ниже, чем у оксипропиленового фиксированного лиганда. Это можно объясниTf специфическим пространстве1шым расположением гистидинового лиганда на поверхности сорбента и неоднозначностью структуры сорбционного комплекса. Если в комплексе меди с К) -алкильными производными оксипропилеиа конфигурация атома азота однозначна, то в первичной аь.иногруппе гистидина алкильный радикал может замещать любой из двух атомов водорода, приводя к двум различным конфигурациям атома азота, которые способны превращаться друг в даже после образования комплекса с медью. Одной из этих конфигураций соответствует глициновый тип координации гистидина медью, т.е. расположение карбоксильной группы и альфааминной группы в основной координационной плоскости атома металла-комплексообразователя и имидазольного донора в аксиальной .позиции. В этом случае сорбционный комплекс расположен параллельно поверхности сорбента и подвижный лиганд D -конфигурации получает возможность вступить в дополнительные гидро(}юб|1

изаимоДойсгвпя с углеводо{юдной поверхностью сорбента.. По-видимому именно в этой структуре происхошт дискриминация энантиомерОБ подвижного лиганда, причем меньшие времена удерживания характерны для Ь -энантиомеров. Единственным исключением из этой закономерности является аспараги«овая кислота, поскольку кароксильная группа -аспарагиновой кислоты образует водородную связь с имидазоль ной группой фиксированного пиганда, что

. энергетически значительно более выгодно, чем гидрофобное взаимодействие, бокового радикала D аспарагиновой кислоты с поверхностью сорбента. Значительная доля фиксированных на сорбенте гистидиновых 1ру1шировок, вероятно, координирует ион меди по диаминовому типу с расположе- .

.нием карбоксильного донора в аксиальной позиции. Такой хелат, несомненно, также участвует в связывании подвижного лиганда в сорбционный тройной комплекс, .однако трудно предположить возможность хирального распознавания подвижного лиганда в этом комплексе.

Предложенному способу разделения и анализа соответствует ране неописанный способ получения нового класса соедине ний, алкилпроизводных оптических изоме1 ров cL-аминокислот.

Способ получения алкилпроизводных оптических изомеров cxL-аминокислоты заключается в том, что на растворенный в водно-органическом растворителе с избытком органического компонента оптический изомер об-аминокислоты воздействуют щёлочью и переводят в соль щелочного металла, затем при нагревании до температурь. ниже начала рацемизации на полученную соль воздействуют алкилгаллоидом в щелочной среде, после этого осуществляют нейтрализацию .реакционной системы - сильЬодиссоцирующей кислотой

и проводят осаждение целевого продукта.. .Следует отметить, что в качестве оптического изомера о -аминокислоты можно использовать как L так и Т) -изомеры (конфигурация функци.ональной группы влияет на. порядок выхода разделяемых энантиомеров, но не на их селективность разделения).

Пример 1. Способ получения Ы - дeцил-L-гистидина. В смеси 100 мл этанола и 40 мл воды растворяют 4,0 г едкого натра (ОД М) и 15,5 г Ь -гистидина (0,1 М). К.раствору добавляют 22,1 г 1-бромдекана и повышают температуру реакционной смеси до . Чепез 5 ч нагревания к раствору добавляют

3,О г едкого натриа (0,О75 М), и реакцию ведут в тех же условиях при интенсивном перемешивании еще 5 ч. Затем реакционную смесь охлаждают, .нейтрализуют серной кислотой до рН 7 и разбавляют водой (1,5 л). Выпавший осадок от фильтровывают промывают водой и пере- кристаллизовывают из 150 мл ropsT4ero эталона. Выход 12,1 г (41%).

Пример 2. Способ получениям -гексил--Ь-оксипропина. Условия, аналогичные примеру 1. В качестве оптического изомера об-аминокислоты используют L -оксипролин в количестве 13,1 г а вкачестве, алкилгаллоида С Н С6 в копи- честве 13,5 г. . .

Пример 3. Способ получения VJ -гексадецил-L -оксипролина. Условия, аналогичные примеру 2. В качестве галоидпроизводного предельного углеводорода используют 1-гексадецилбромид в количестве 30,3 г.

Пример 4. В случае получения стационарной подвижной фазы для лиган- дообменной хроматографии на основе аспарагиновой кислоты температура реакционной смеси не должна превышать 4550 С ввиду возможной рацемизации.

Пример 5. В результате использования предложенного метода можно получить значительное количество стационарных фаз с разными функциональными группами и разной длиной алкильного за- местителя. На примере трех щюизводных L -оксипролина (табл. 7) можно убедиться, что оптимальнрй длиной цепи алкилного заместителя применительно к большинству распространенных обращенно-фа- зовых сорбентов является десять атомов углерода (деци).

Пример 6. Одним из требований .к аналитической сорбирующей насадки является получение таких значений селективности разаеления, когда на э.(|фектйвных колоннах пики компонентов разделя емой смеси полностью разрещены и расположены -сравнительно близко друг от друга.

Это условие реализуется например, когда синтезированное вещество N -децил- Ь-гистидин. -CH-i-CH-COOH

/ HN

N/ NH

СИ

используют в качестве стационарной фазы для лигандообменной хроматографии комплексообразующих соединений. 7t00 Хроматографические свойства этого соединения неочевидны и не могут быть предсказаны теоретически, исходя из стргуктуры и известных свойств гистидина. Полученнбе соединение характеризуется следующим составом, %: С 66,42; ,.Ы 5,17; Н 10,70} О 17,71 (расчетное значение, экспериментальные значения элементного анализа соответствуют расчетным с точностью, принятой в элемёнтнсиу анализе). Полученное вещество представляет из себя кристаллы белого цвета. Мол, вес, определенный по методу Роста, 295, что соответствует приведенной формуле.Температура плавления дважды перекристаллизованного вещества , ИК-спектр полученного соединения характеризуется интенсивной полосой в области 17ОО-1750 см (характерной для карбоксильной группы) и одиночным пиком средней интенсивности в области 3300-350О см группа Н). В ходе практического испытания определено, что описанная стационарнвая фаза относится к числу фаз с наиболее равномерным распределением селективности по отношению к энантиомерам с -аминокислот. Если в задачу исследования входит разделение небольшого числа энантиомеров или даже пары оптических антиподов. а также и препаративное разделение, то можно использовать и другие фазы, полуI чаемые описанным способом. Предложенный способ получения алкилпроизводных оптических изомеров о -аминокислот для лигандообменной хроматоУдерживание и селективность разделения рацематов аминокислот (Zovbax ОНСзлюенр, вода-этанол, 10 М ацетата меди, SBC, расход элюента 2 мл/мин, фаза Ц L Hi,

Т а б л и ц а 68 графин позволяет псяучить простым, быстрым и общедоступным методом набор фаз с широким спектром изменения селективностей по отношению к анализируемому объекту. В частности полученный таким образом N-децил-Ь -гистидин позволяет разделить значительное количество энантиомеров. Кроме того, предложенный способ дешев, обладает широкими аналитическими возможностями по сравнению с известными. Способ можно использовать как аналитический метод, в том числе в анализе окружающей ере- . ды и контроле ее загрязнений, как препаративный. Метод реализуется практическн на всех обращенно-фазовых сорбентах и готовых упакованнь1Х колоннах. Анализ можно проводить на. стандартном хроматографическом оборудовании. Следует отметить, что Предложенный способ существенно расширяет возможности аминокислотного анализа, переводя его на уровень энантиомерного анализа. Способ реализуется на стандартном хрома тографи чес ком оборудовании. Отпадает необходимость использовать дорогостоящие аминокислотные анализаторы, цена которых достигает 4ОООО руб. за один прибор. Цена отечественных приборов колеблется от 10ООО до 20000 руб. Способ, не связан с расходом дорогостоящих реактивов. Экономия при внедрении предложения при ограничении или прекращении покупки анализаторов 4000О 1200000 руб в гоД, Сокращается время (30-40 мин анализ), электроэнергия, экономятся реактивы и трудозатраты.

2,14

.

2,21

2,37

l.OO

4,29

1,00

1,00

4,92

5,67

К.

К,

KI,-1

Зависимость удерживания от состо5шия вода:этаноя. Условие эксперимента: Zoibax С, м ацетата меди, , расход элюента 2 мл/мин, фаза His

1,57

Ser 1,57

к.

0

к.

-Таблица.2

1,23

1,00

15

1004876

16 Продолжение табл. 2

со

g

со

о

О

О О

см

О О.

см

со. оГ

со

г см

h°°.

см

tСО

см

8

а

251ОО487626

Удердивание и селективность разделения рацематов аминокислот элюент: метанол вода (15:85), ацетат меди I-IO М, температура 35 С, расход элюента 2 мл/мин, фаза Hi 5

:Т а б л и ц а 5

1,00

. 0.71

l.OO

1,00

2,25

O,52

13 I4 f5 Г 6 О,960,96 ,оо1,оо Abu1.001,00 1.61,26 ,51,ОО1,ОО iVae1,21 NVet.1,26 ,631,63 3,О1 1,оо 1,00 1,26 1,ОО 1,20 1,22 1,59

. и aHanHTocQBeKTHBffocTb разделения энпнтиоморюп « -амшгокнсуют ь швисимости от ллиим пклкильного .ча лестителя (элюоит эт., 15: 8., 2.)С

кончентрапия ацетата меди , Ui СЬк-овои bRPlB)

Asp

0,39 4i 1,53

r1,32

1,51

v-0

3,18

1,81 1,11

Ato

1,14

1,27 1,58

Abu

1,52

2,10 2,62

2,34

Noe

6,14 I {57

1,66 Tijr

7,58 3,92

Nvet

1,59

6,24 8,31 NPeu

Т fl б л -. -. « 7

0,15 0,72

1,J2

1,38 6,96 0,69

3,21

9,-19

6,55 0,45

1,95

0,87 0,83

1,54

,83

2,29. 1,40

2,53

5,65

7,94 3,26

- ,47 3,55

1,63

2,43

8,64 5,96

2,63

5,1.7

P.

2,19

37,6 34,5

Trp

1,68

58,1 из обре тени я Ф op м у л 1.Способ лигандообменного хроматографического разделения и анализа смеси энантиомеров аминокислот, включающий ввод и перемещение анализируемой пробы через слой сорбиру.кнцей насадки в потоке элюёнта, содержащего ионы метаплакомштексообразователя, отличающ и и с я тем, что, с целью удешевления, упрощения и. расширения анал: тичес- ких возможностей способа, сорбирующая насадка составлена из обращенно-фазового сорбента с введением в состав углеводородного -слоя алкилпроизводного оптического изомера cL -аминокислоты, а в качестве элюёнта. используют систему. растворителей с полярностью 5,О-1О,2 при рН 2-7,5. 2.Способ получения алкилпроизводны оптических изомеров oL-аминокислоты.

Продолжение табл. 7

- - --,--.-3w--.

2,34

3,86

52,0 34,1

1,75

85,9 отличающийся тем, что на оптический изомер cL -аминокислоты, растворенный в водно-органическом растворителе с избытком органического компонента, воздействуют щелочью и переводят в соль щелочного металла, затем при нагревании до температуры ниже начала ра-. цемизации на полученную .соль воздействуют гадлоидзамещенным. алкилом в щелочной среде, после чего осуществляют нейтрализацию реакционной системы сильнодйссоциируюшей КИСЛОТ.ОЙ и проводят осаждение целевого продукта. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 825532, кл. Q О1 N 31/О8, 1979 (прототип). 2. Авторское свидетельство СССР по заявке N 28О4942/23, кл. GiOlN 31/08, 1979.,