Способ определения целостности клеточных мембран микроорганизмов Советский патент 1983 года по МПК C12N13/00 

N5

о:

110

Изобретение относится к области микробиологии.

Известен микробиологический способ оценки клеточных мембран,, заключающийся в том,-что микроорганизм-ы параллельно высеваются на полный агар и на селективную питательную среду, содержащую дезоксихолат натрия, на которой клетки, имеющие повреждение поверхностных структур, не способны к размножению. Через сутки роста определяется процент поврежденных клеток путем подсчета числа колоний на чашках fl ,

Однако этот способ характеризуется длительностью, трудоемкостью и небольшой томностью. Кроме он не позволяет оценить степень поврежденности поверхностных структур, а выявляет лишь те повреждения, которые губительны для бактерий, растущих на селективной питательной среде с дезоксихолатом натрия.

Известен также биохимический метод определения состояния клеточных мембран, включающий использование сложных Препаративных методов С .

Наиболее близким к предлагаемому является способ люминесцентного спектрального анализа клеток, включаюи ий обработку суспензии клеток флуорохромом, отмывание окрашенной суспензии клеток от флуорохрома и измерение интенсивности флуоресценции в максимуме спектра ЕЗ.

Однако данный способ недостаточно точен и не дает четкой количественной характеристики целостности мембран.

Целью изобретения является повышение точности.

262

Поставленная цель достигается тем что согласно способу определения целостности клеточных мембран микроорганизмов, включающему обработку супензий клеток флуорохромом, отмывание окрашенной суспензии клеток от флуорохрома и измерение интенсивност флуоресценции в максимуме спектра, одновременно с флуоресценцией определяют интенсивность светорассеяния, а в качестве флуорохрома используют примулин, причем оценивают целостность мембран по изменению отношения интенсивности флуоресценции к интенсивности светорассеяния.

Пример. Измерения целостности мембраны проводились в процессе культивирования Е. М-17. Пробы разводили физиологическим раствором до концентрации 510° клеток/мл, К 5 мл суспензии добавляли 0,1 мл раствора приледлина (С 5 мг/мл). Через 10 мин инкубации клетки дважды отмывались центрифугированием при 3500с в течение 5 мин, затем ресуспензировались в том же количестве физиологического раствора. Интенсивность флуоресценции полученной суспензии окрашенных клеток измерялась при длине волны возбуждения Л 370 нм и длине волны регистрации А if60 нм. Измерение проводилось на флуоресцентном спектрофотометре МРГ- (Лирма HITACHI, Япония), Одновременно на этом же приборе измерялась интенсивность светорассеяния при Л 500 нм,

8 табл. 1 приведено изменение целостности клеточных мембран во время культивирования Е. coli М-17 (фактор Р ).

Таблица

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛОСТНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН МИКРООРГАНИЗМОВ, включающий обработку суспензии клеток флуорохромом, отмывание окрашенной суспензии клеток от флуорохрома и измерение интенсивности флуоресценции, в максимуме спектра, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности, одновременно с флуоресценцией определяют интенсивность светорассеяния, а в качестве флуорохрома используют примулин, причем оценивают целостность мембран по изменению отношения интенсивности флуоресценции к интенсивности светорассеяния.

Р, отн.ед, 0,,03 1,15±0,03 Ь05±0,03 0,6810,03 0,62+0,03 0,55±0,03

Таким образом, преимуществом поед- оценки целостности клеточных мембран латаемого метода является возможность в нормальном состоянии Микроорганизбыстрого получения количественной мов и после стрессовых воздействий.