Способ индикации васILLUS ceReUS Советский патент 1982 года по МПК C12N1/00 C12R1/85 

(54) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ BACILLUS CEREUS

1

Изобретение относится к микробиолопш, а именно к способам определения вида лшкроорганизма по реакции иммунофлуорещенции.

Известен способ индикации Bacillus cereus в суспензии, содержащей смешанную микрофлору, путем добавления к суспензии микроорганизмов люминесцирующих антител, отмывания от несвязавшихся антител с последующим возбуждением суспензии светом к определением интенсивности свечения 1.

Однако при снятии спектра, близкое paoioложеиие пика светорассеяния. При некотором превышении концентрации примесньк микроорганизмов в пробе над специфичньп и, приводит к наложению пика светорассеяния на пик люминесценции, гто не позволяет достоверно определить наличие искомых микроорганизмов в присутствии примеси, и снижает чувствительность способа.

Цель изобретения - повышеше точности способа.

Эта цель достигается тем, что согласно способу индикации Bacillus cereus в суспензии, содержащей смешанную микрофлору, путем добавления к суспензии микроорганиз, мов люмимесцирующих антител, отмывания от несвязавшихся антител с последующим возбуждением суспензии светом и определением интенсивности свечения, суспензию возбуждают при 365 им, дополнительно регистрируют интенсивность светорассеяния суспензии в начале пика люминесценции и наличие микроорганизма сжределяют по отношению

10 интенсивности люминесценции в максимуме пика к. интенсивности светорассеяния.

Пример. Берут суспензию микросфганизмов культуры Bacillus cereus в концентрации 2 -Ш кл/мл в количестве 4 мл.

IS В реактсф с клетками прибавляют 1 мл раствора антител (меченых флуоресцеиниэотиоцианатом) для полу%иия концентрации антител по белку равной 1-2 мг на 1 мл суспенжи. Суспензию инкубируют в течение

20 10-15 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая. Затем суспензию центрифугируют 15 мин при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасьгеают. Осадок окрашенюлх микрооргаш5змов два раза отмывают от иесвязавшихся антител 5 мл .физиологического раствора, циярифугируя, как описано выше. Отмьп-ъге клетки суспендируют (перемешивают) в новой порции физиологического раствора и переносят в флуориметрическую кювет}. Суспензию возб окдают светом в более коротковолновой области, а имегаю в области 365 mi. Снятие спекттэа ЭМИССИЙ проводят на сканирующем приборе MPS-5000, позволяющем записать спектр в об)застй от 460 до 600 нм на самописце.

Затем измеряют в относительных едгошцах интенсивность люминесценции в области 530 нм (максимум пика) и интенсивность светорассеяния в области начала пика люмикесце1Н№И 480 нм. Определяют отношение интенсивности люптинесценции к интенсивности светорассеяния.

Результаты ин.цика)1ии Bacillus cereus приведены в забл. I.

Интексивпость излуче}шя суспензии Baciilus cereus в концентрации 1 10 клеток в 1 мл в исследуемых областях 0,70 и 0,58, а отношение 0,83, Интенсивность излучения суспензии Bacillus cereus в .концентрации 2-10, обработашюй люминесцирующими антителами, 0,01 и Os42, а отношение 42. Таким образом, неокрашенная суспензия в концентрации Ч10 показывает интенсивность в области 530 нм 0,58, тогда как суспензия 2-10, окрашенная антителами, дала величину 0,42, т.е. меньшую по абсолютной велизд не. ВведеEis веллчини светорассеяШГЯ в оденлсу содзржания микроорганизмов и испбльзова ше отношаЕия люминесценщш к светорассеяшцо позволяет пол}гчить значительное правышешк отношения окрашенной культуры к неокрашенной.

Примесные микроорганизмы, в качестве которых использована культура Escherihia coii в концентращси I 10 кл/мл, обработанные люминесцирующими антителами и двухкратно огмьпъ1е физиологическим раствором, показывают интенсивности 0,14 и 0,14, а OTHomeime 1,0. Отношение окрашенных искомых микроорганизмов в 40 раз превышает отношение обработанных примесных рдажроорганизмов, тогда как интенсивность искомых, в области 530 нм превышает интенсивность примесных в этой области только в 3 раза.

Добавление npHMeciaix микроорганизмов в концентрации, в 50 и 500 раз превышающей искомые (-10 и ), дает отношение 5,4 и 3,2.

Таким образом, отношение смеси превышает отноше ше обработанных и отмытых 5 примесных клеток приблизительно в 5 и 3 раза и свидетельствует. о наличии в пробе искомых микрооргаьшзмов,

При более низких концентрациях антител можно достоверно определить наличие искои мых vniKpoopraHH3MOB в пробе.

В табл, 2 представлены результаты индикации Bacitlus cereus для малых концентраций суспензии.

S Искомые микроорганизмы в концентрации 2-10 кл/мл смеиягеают с примесными в концентрациях 510 1-10 и 5-10 кл/,-1л, а также, берут отдельно искомые 2-10 и примесные 5-10 кл/мл, Люминесцирующие

p антитела берут в концентрации 1,4 мг/мл. Суспензии с 25, 50 и 250 кратным превышением примеси над искомыми микроорганизмами дают приблизительно одинаковые интенсивности в области 530 нм, однако некоторое

3 изменение в начале пика люминесценции приводит к изменению отношения, которое снижается с )тзеличением примеси и составляет: 7, 6,6 и 5,0 при 24,0 в чистой культуре.

„ Эти же пробы, но без обработки люминесцирующими антителами, дают интенсивность в области начала пика люминесценции: 0,2, 0,2 и-0,72, а отношешхя меньше 1,0. Эти данные показывают, что у всех необработа шьзх люминесцирующими aHraTensrvn-: сус пензий. интенс вность. светорассеяния выше, чем у обработанных. Из этого сле.цует, что отношеш е исследуемых интенс Езкостей в присутствии примеси снижается, однако примесь ке. маскирует присутствие искомых ъткроорганизмов в пробе, и эта закономерность сохраняется при низких кощентравдях искомого микроорганизма в пробе.

Предлагаемый способ позволяет точно определить вид микроорганизма в объеме пробы на фоне примеси в промьшшенных услой}5ях И В санитарно-защитной зоне предприятий мякробиологичей ой промышленности где незначительно превыше 1е примесных над искомыми микроорганизмами. Способ с ус9 нехом может быть использован для стандартизации к оценки качества люминесцирующих антител, изготавливаемых в производстве.

Формула изобретения

Способ индикации Bacillus cereus в сушенЗИН, содержащей смешанную микрофлору, путем. добав)1ення к суспензия микроорганизмов люмннесцирующих антител, отмывания от несвязавшихся антител с последующим возбуждением суспензии светом и определением интенсивности свечения, отличающийся тем, что, -с целью повышения точности способа, суспенэтю возбуждают при 365 км, дополнительно регистрируют интенсивностъ светорассеяния суспензии в начале пика люминесценции и наличие микроорганиэма слределяют по отношению интенсивности люминесценцин в максимуме пика к интенсивности светорассеяния.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Рубан С. 3. Использование прямой флуо риметррн для количественной оценки в люминесцеитосерологическом методе индикации микроорганизмов. Автореф. дис. на соиск. учен, степени каид. биол. наук. М., 1974.