Способ индикации загрязнения объектов окружающей среды химическими веществами Советский патент 1983 года по МПК C12Q1/00 

ьэ

00

1. СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ХИМИЧЕСКИМИ ВЕЩЕСТВАМИ путем воздействия пробой на гест -культуру микроорганизмов с последующим контролем изменений в культуре, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и сокращения времени индикации, пробу вводят в один конец протяженной кюветы, содержащей взвесь микроорганизмов, проявляющих эффект хемотаксиса к индицируемым веществам, измеряют перераспределение концентрации микроорганизмов вдоль кюветы и по разности концентрации микроорганизмов в контрюлируемых участках определяют степень загрязнения. (/) С -/3 -/ -/7 -л -ff

-Й7 л1,аяЛ

2,Способ по п. 1, отличающийся тем, что перераспределение концентрации микроорганизмов по кювете измеряют фотометрическим методом.

Изобретение относится к окру, жающей среды, а именно к методам оп-. ределения степени загрязненности воды, Боадуха, почвы в области промышпенной и санитарной гигиены, и может быть использовано для токсикологического контроля в пищевой, химико-фармацевтической и других отраслях промышленности.

К веществам, загрязняющим воздух, почву, воду, относятся аммиак, сероводо. род, соли тяжелых металлов (Си, N.i Н) и другие.

Известны различные способы определения загрязнений окружающей среды, в TOK-i числе с помощью простейших микроорганизмов.

Известен способ оценки токсичности сточных и природных вод, включающий инкубадию CfiEoreK a ругепоЫозс 82 в пробе и определение разниць роста в опытной и контрольной пробах l .

Наиболее к предлагаемому является способ определения загрязнения химическими веществами, о котором судят по уровню токсичности их, заключающийся в том, что пробу исследуемого материала вводят во зэзаимодействие с тест купьтзфой и инокулируют в условиях, поддерживающих хороший их рост (опыт). Затем выросшие MHKpoopraHH3Na i отфильтровывают от жидкости и количество их определяют турбидиметрически Сравнивают с количеством микроорганизмов, выросших в контрагте без исследуемой пробы, и по разнице роста в опыте и контроле определяют степень токсичности исследуемог о материала 3.

Недостатками этого способа ЯШЕЯЮТся невысокая чувствительность и длительность проведения анализа. Чувствительность способа Mtuia, так как физиологИческие процессы клетки xopoiuo защищены, от нрблагоприяттлх воздействпй, по8c(oiB8us mec oiterium к концентрации ог ./мл.

4, Способ по пп« 1и2, отличаю П1 и и с я тем, что при индикации загржзнения объектов окружакхпей среды газообразными соединениями серы в качестве микроорганизмов используют РагсгтлеCiurn cau oi-tom;B KoHneHTpalimi от 1О до 1О ед,/мл.

2

этому требуются высокие концентрации токсикантов, чтобы изменить скорость роста микроорганизмов.

Время анализа по скорости роста определяется не менее чем двойным временем генерации тест-культуры и достигает -нескольких часов и даже суток.

Целью изобретения является повышение чувствительности и сокращение времани индикации загрязнения объектов окружающей среды.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу индикации загрязнения химическими веществами объектов окружающей среды, заключающемуся в воздействии пробой на тест-культуру микроорганизмов с последующим контролем изменений в культуре, пробу вводят в один конец протяженной кюветы, заполненной взвесью микроорганизмов, проявляЮ1ДИХ эффект Хемотаксиса к индицируемым веществам, измеряют перераспределение концентрации микроорганизмов вдоль кюветы и по разности концентрации микроорганизмов в контролируемых участках -определяют степень загрязнения.

Перераспределение концентрации микроорганизмов по кювете обычно изменяют фотометрическим методом. При индикации загрязнения тяжелыми металлами в качестве микроорганизмов обычно используют BaeiC(;5 tnec qtBriUm в концентрации 10-10 ед./мл.

При индикации загрязнения объектов окружающей среды газообразными соединениями серы используют PotranieciuTri С«и61а-Ьитв концентрации 1й Гб ед./мл:

Предлагаемый способ дает возможность реализовать для индикации загрязнений принципиально более чувствительную и быструю по сравнению с известным способом тест-реакцию микроорганизмовхемотаксис , направленнор дпиженин А(1

31010128 4

под действием химических вешеств .Чувст-по чувствительности и быстроте иэвесгвителъность и быстрота этой тест-реак-ного и предлагаемого способов, подтверции связана с тем, что взаимодействиеждают это положение, клетки с химикатами происходит на ре-В таблице показана чувствительность

пепторном уровне на поверхности клетки. 5разных тест-реакиий миЕфоорганнзмсе к

Сравнительные экспериментальные данныехимикатам.

концентрация, необходимая для гибели 50%клеток за J2 ч; концентрация вещества, необходимая для 50% торможения роста клеток за 1 и за 4 сут; минимальная концентрация вещества, вызывающая хемотаксис. Хемотаксическая реакция имеет место только при разности концентраций химических веществ вдоль кюветы, в противном случае движение микроорганизмов но сит хаотичный характер, и они распределены по кювете равномерно. ИсполЕ зование в предлагаемом способе удлиненной кюветы, ввод исследуемой пробы только в один ее конец.создает разность кон центраций зсимикатов по длине кюветы, что побуждает микроорганизмы, активно перемешаться в тот конец кюветы, где условия для жизнедеятельности благопри ятнее. Перераспределение микроорганизмов по кювете можно измерить фотометрическим, кондуктометрическим или другими методами. Расстояние, на котором возможно выявить перераспределение концентраций микроорганизмов, определяется техническими характеристиками соответствующих измерительных устройств и размерами микроорганизмов и составляет около 2 мм. Это расстояние бактерии могут пройти за 18О с 3J,Pcirame ciumicaucldtumaa 0,8с 4 засчетдиф-фуани вещества из пробы проникнут во взвесь микроорганизмов на расстояние 2 мм за 10 с (рассчитано по уровнению нестационарной диффузии из ограниченного объема по самым быстрым ионам). Следовательно, микроорганизмы во вс ех известных случаях могут пока- дать зону введения пробы быстрее, чем идет диффузия. Таким образом, необходимо всего от 0,8 до 180 с для получения в кювете с участка с достаточно выраженной для измерения разностью кон центраций микроорганизмов. Этим временем и определяется скорость индикаци по предлагаемому способу,/,: При реализации способа можно применять все микроорганизмы, обладающие эффектом хемотаксиса к индицируемым веществам. В каждом конкретном случае можно выбрать тот микроорганизм, кот( рый дает наибольший положительный эффект способа. Большое разнообразие микроорганизмов и их избирательность рюак- ции на определенные вещества дает возможность утверждать, что при. решении задачи индикации определенного вещества можно выбрать подходящую культуру. 51О Кроме Poircimpcium txaudalutn апробирован Hfl культурах Batieeus SuttiBiS, BociSBus me cjterium, Serraties rnarsences, Proteus . Для всех исследованных культур выявлена возможность индикации химическо го загрязнения по предлагаемому способу Предлагаемый способ реализуется следующим образом, Готовят для анализа пробу в жидкости индифферентной для используемых микроорганизмов и не вызывающей у их хемотаксиса. Водную пробу разводят при необ ходимости до концентрации, не вызывающей гибели тест-культуры, из почвы делают, вытяжку и при необходимости ее разводят; анализируемый воздуз барботи руют через ловдкостьр Готовят стаддарт ную взвесь микроорганизмов, в среде, поддерживающей подвижность клеток в течение времени индикации, например воде, физиологическом растворе, причем используют подвижные микроорганизмы, обладающие эффектом хематоксиса к индицируемь м веществам (водоросли, простейщие бактерии). Заполняют мерно , стандартной взвесью тест-культуры. уд линейную кювет}, в один ее конец вносят индицируемую пробу в количестве 1/201/5 от объема взвеси. Затем контролиру ют изменение концентрации микроорганиз мов в нескольких участках кюветы фотометрическим, кондуктометрическим или apyiTiMi методами от момента ввода пробы и до окончания индикации, которое определяется интенсивностью хемотаксического процесса, природой химических веществ и скоростью движения используемых индикаторных микроорганизмов. Измерение ведут непрерывно или дискретно и по разности концентрации микроорга низмов по длине кюветы оценивают степень загрязнения. Отсутствует необходимость в измерении абсолютного значения концентрации. Достаточно использовать косвенрпзге параметры, характеризующие величпггу концентрации микроорганизмов, например оптичсзскую плотность, электро-г проводи ость и т. п. На фиг. 1 показана зависимость вели шны хемотаксической реакции ( &Э } от концентрации ионов (с моль/л); на 4нг. 2 - зависимостр, величины хемотаксической реакции ( uJ ) от конпентрапии ионов с(С мопь/л); на фиг. 3 зависимость величины хемотаксической 5)еакции( ЛJ ) от времени (-t ) при дойсг ВИИ ионов и t{ п концентрации 2-.I. О моль/л; ча фиг, -1 - зяв1К иког:т1. випгш 8 ны хемотаксической реакции ( Д3 ) от времени ( t ) при .действии ионов сГ в концентрации 1- мопь/л; на фиг. 5 зависимость хемотаксической реакции (/ЛЭ ), а от времени при разных концен1 рациях NH,и ( 5 ) от концентрации NHj за 30 мин воздействия; на фиг. 6 - зависимость величины хемотаксической реакции (.ДЗ ) от времени вог.действия химивеского вещества { а -Ni |6-Cu)oT кон;центрации химического вещества (6-Ni i-Cju ) за ЗО мин воздействия. Пример 1. Проводят, индидацию ионов Нс , 5 соответствующие анион и катион которых хемотаксиса у тесткультуры не вызывают, что предварительно проверено экспе|эиментально. Исследуемые концентрации испытуемых ионов готовят в среде .Лозина-Лозинского следу юшего состава, г/л: I-IO 1-10-4 КСЙ 1-10M SO4 ,-4 CaceaIlo NaHCO 32-10 Тест-культуру ParofmeciUfn ccnodatom выращивают no методике 5, отмьшают от дрожжей средой Лозина-Лозинского на центрифуге (3000 об/мин, 5 мин), вносят в стеклянную кювету размеракчи 7010-5 мм в количестве 3 мл, гричем используют взвесь микроорганизмов с концентрацией ЗООО клеток в 1 мл. В гу же кювету в один ее конец вносят индицируемое вещество в количестве 0,3 мл. Измеряют перераспределение кон.центрации pqramecium CCHUdatvJm вдоль кюветы под действием пробы фотометрическим методом в двух участках кюветы для чего используют два фотоприемника, помещенных: первый - на 26 мм от места ввода пробы, второй - на 52 мм. Измерение ведут с момента ввода пробы в течение 30 мин с интервалами в 5 мин. Степень загрязнения оценивают по разности сигналов ( flj ) от первого (J) и второго ( ЗУ ) фотоприемников, так как величина сигнала пропорциональна концентрации микроорганизмов в контролируемых участках. Знак величинь .ЛЭ характеризует положительное или отрицательное направление хемотаксической реакции, F-Pзультаты индикации ионов Hoj 5 показань на фиг 1-4, Порог чувствительности способа: для иона Htt 2 1О2мопь/л (фигЛ); 10 ° моль /л (фи г. 2 ). для иона 3 Величина хемотаксической реак11ии п;юпорциональна концентрации химичос-.ки.х веществ в широком i диапазоне последних, а именно: для от 2 1( 2 моль/л; (фиг. 1)Т для 5 от 1-1О до 1-10 моль/л, (фиг. 2). Величина ЛЭ достигает значения, под|цающегося измерению предлагаемым способом, через 2-5 мин и возрастает в тече- . кие всего времени индикации (ЗО мин в данном примере) (фиг.З и4). Для Htj величина лЭ отрицательна, микроорганизмы уходят от места ввода пробы - отрицательный хемотаксис (фиг. 1 и 3). Лля ионаЗ З 3„величина аЗ положительна , микроорганизмы остаются, соби- раются к месту ввода пробы, т.е. имеет место положительный хемотаксис (фиг. 2 и 4). Пример 2. Индикация загрязнеНИН пробы воздуха., Часто встречающимся загрязнением воздуха является аммиак, поэтому моде-( лируют загрязнение воздуха этим веществом. Готовят; смесь воздуха с аммиаком. Смесь барботируют через дистиллированную воду в течение 15 мин. Определяют концентрацию аммиака в воде по стандарт ной метчдаике (метод Несслера). Рабочие растворы с известной концентрацией аммиака готовят в среде Лозина-Лозинского разбавлением до исследуемой концентрации. Далее согласно способу проводят испытайие по методике,, данной в примере 1, Исследуют растворы аммиака в диапазоне концентраций 1, 1,7 х Х10 мопь/л. Большая концентрация (1,7 -К оль/л) вызвала гибель культуры Pctramecium саи .Rectum поэтому предлагаемым способом не определялась. Пробы с концентрациями аммиака 1,7- 1О р 1, вызывают отрицательную хемотаксическую реакцию, а с концентрацией аммиака 1,,7- Ю положительную v хемотаксическую реакцию, величины которых определяют предлагаемым способом по разности концентрации микроорганизмов по длине кюветы (по оптической j плотностиДанные экспериментов представлены на графиках фиг. 5. П р и м е р 3 Определение ионов Ni и СУ в почве. Почву моделируют отмытым песком. Песок смешивает . с навесками солей никеля и меди. Навески солей берут исходя из их растворимости в дистиллированной Воде. Смесь песка и соли помещают .в дистиллированную воду иавесгного объема и все перемешивают. Раствор соли сливают и готовят рабочие растворы со лей известной концентрации в среае Лозина-Лозинского. Далее испытание проводят по методике, данной в примерю 1. Результаты индикации представлены на графиках фиг. 6. Таким образом, испытания показали, что предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью (на несколько порядков выше прототипа) и сокреццает время индикации с нескольких часов до минут. Аналогичные результаты по чувствительности и скорости индикации предлагаемым способом подучены и на других индицируемых объектах из воды, воздуха, почвы. Кроме того, предлагаемый способ дает возможность расширить круг индицируемых вешеств за счет использования набора тест-культур, а также за счет использования как положительного, так и отрицательного эффекта хемотаксиса.

-SO ulf ffffA

30

1020

П i)ffu/f

Фиг.З -J7,«r) г, .,7-/Z7- aw 7 fJ-fO mif J.7-fO-y 20 V-fO L л1, i Ю 15 W У5 Х 5. ul, тЛ to IS 20 25 }ff t, m uI,flK -да т- .2Q , , & fBcu ffm .Q 4«7-Lw fO Ci/ fiSM л 10 Си ШР я

фиг. 6 gCfAftI )