Способ определения концентрации антибиотика Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и медицине и может быть использовано при определении концентрации антибиотиков.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа и его ускорение.

В основу способа положено подавление хемотаксической активности клеток антибиотиками. Регистрируемой величиной является расстояние, на которое смещается фронт тест-культуры бактерий. Присутствие в жидкости антибиотика тормозит процесс миграции бактериальной популяции, при этом, чем выше концентрация антибиотика, тем ниже скорость миграции тактериальной полосы.

Способ определения концентрации антибиотика тилозина с использованием в качестве тест-культуры штамма Bacillus

Sphaericus - 1966 осуществляется следующим образом.

Для построения калибровочной кривой ряд одинаковых емкостей правильной формы заполняют физраствором, содержащим известные концентрации антибиотика. Размер стеклянных кювет равен 5x10x40 мм. Затем на дно каждой из кювет с помощью микрошприца наслаивают по 100 мкл суспензии вегетативных клеток тест-культуры при оптической плотности суспензии 0,3- 1,0 и выдерживают при комнатной температуре.

Через 4-5 ч в кюветах наблюдают распределение клеток, образуется полоса бактерий, мигрирующая вверх. Замеряют расстояние, на которое сдвинулась бактериальная полоса в кюветах. В соответствии с измеренными значениями строят калибровочную кривую зависимости расстояния.

Оч

ел о VI

о

ю

пройденного полосой, от концентрации антибиотика за контрольное время.

Искомую концентрацию тилозина определяют на построенной калибровочной зависимости смещения полосы бактерий Bacillus Sphaerlcus - 1966 за контрольное время (4 ч). Для этого измеряют расстояние, на которое смещается полоса бактерий через 4 ч. За это время бактериальные полосы хорошо формируются и проходят расстояние порядка 10 мм, что удобно для измерения. Из этой точки на оси ординат проводят линию параллельно оси абсцисс до пересечения с графиком калибровочной кривой, из точки пересечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс и по шкале концентраций находят искомое содержание тилозина в неизвестном растворе. В данном примере искомая концентрация тилозина равна 0,7 ед/мл.

П р и м е р 2. Концентрацию тилозина можно определять и с использованием бактерий В. subtllls - 720. Все операции, их последовательность и количественное выражение аналогичны примеру 1, Концентрация тилозина 0,7 ед/мл.

П р и м е р 3. Измерение концентрации грамицидина С с использованием бактерий В. thuringiensls - Z52 осуществляют аналогично примеру 1. Концентрация грамицидина 29-10 18 г/мл.

П р и м е р 4. Концентрацию тетрациклина определяют в соответствии с примером 1, но используют бактерии Е. coli М-17 за 4 ч,

Л р и м е р 5. Концентрацию стрептомицина определяют в соответствии с примером 1 с использованием бактерий Е. colt М-17за4ч.

Сравнительные данные по чувствительности определения концентраций антибиотиков приведены в таблице.

При этом точность определения аналогична известному способу (ошибка 10%).

Способ может быть использован для определения концентрации антибиотика в культуральной жидкости. Перед определением концентрации антибиотик экстрагируют из культуральной жидкости. Например, в случае использования культуральной жидкости, содержащей тилозин, экстракцию проводят с помощью 0,2 н раствора HCI. микробные клетки осаждают и определяют

концентрацию тилозина в жидкой фракции. Использование предлагаемого способа при сохранении точности определения позволяет повысить его чувствительность, а также ускорить определение с 18-24 до 4 ч

и менее ч (4 ч выбрано для стандартизации способа, тогда как хемотаксис можно наблюдать уже через 5 мин после введения культуры под раствор антибиотика).

20

Формула изобретения

1.Способ определения концентрации антибиотике, включающий инкубирование раствора антибиотика с суспензией тесткультуры микроорганизмов с последующим учетом результатов в сравнении с контролем, отличаю-щийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и его ускорения, в качестве тест-культуры используют микроорганизмы, обладающие хемотаксисом, суспензию тест-культуры вводят под раствор антибиотика, после инкубирования фиксируют расстояние смещения фронта тест-культуры от границы микробных клеток с раствором антибиотика и по его величине определяют концентрацию антибиотика.

2.Способ по п 1, отличающийся тем, что в качестве тест-культуры микроорганизмов, обладающей хемотаксисом, используют штамм Bacillus Sphaericus 1966, Bacillus subtllls 720, Bacillus thuringiensis Z52 или Escherichia coli M-17.

Тестовая система бактерий/антибиотик

Границы чувствительности известного способа, ед./мл

B.sphaericus/1966 тилозин B.subtll s/-720 тилозин B.thur nglensls/-752 грами цидин С

E.coli M 17/ тетрациклин E.coll M 17/стрептомицин

Хемотаксис в растворе (границы чувствительности), ед./мл

(0,1-1,4) (0,2-1,6)

(0,1-0,5) (0,2-1,2) (0.1-0.8)

Изобретение относится к микробиологической промышленности и медицине и может быть использовано при определении концентрации антибиотиков. Цель изобретения - повышение чувствительности способа и его ускорение. Для осуществления способа используют в качестве тест-культуры бактерии, обладающие хемотаксисом, например В. subtills, E. coll и другие. Разведения антибиотика разливают в пробирки или кюветы, под слой антибиотика наслаивают суспензию тест-культуры и инкубируют при комнатной температуре в течение 4 ч (оптимальное время для стандартизации способа). Затем определяют смещение фронта тест-культуры от границы с разведением антибиотика и по его величине определяют концентрацию антибиотика. Определение проводят по сравнению с контролем на основании калибровочной кривой. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

В случае с тилозином используют навеску заводского препарата бацихилла (1 ед/мл соответствует 1 мкг/мл).