Способ количественного определения фактора @ в плазме крови Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

о

ел

Изобрегение огносигся к медицине, в часгноеги к способам определения факгоров свертывания крови.

.Извесген способ определения фактсм ров X и УП, предусматривающий получение субстратной плазмы, разведение нормальной плазмы, смешивание их, определение протромбинового времени сме

си ; 13.

К недостаткам способа огносится нарушение нагивных свойств плазмы.

Наиболеё близким к предлагаемому по технической сушности и достигаемому эффекту является способ количественного определения фактора X, предусма риваюший получение субстратно%плазмы, смешивание ее с нормальной разведенной плазмой, внесение в полученную смесь активатора свертьтания и определение протромбинового времени смеси.

Согласно этому способу получают субстратную плазму (удаление из норн , мальной человеческой плазмы факторов X и УП) путем фильтрования через асбестовый фильтр разводят1юрмальную смешанную (смесь равных объемов .плазмы 5-10 здоровых людей) человеческую плазму буфером Михаэлиса (ряд разве|дений от 1:1О до 1:1000); смешивают равные объемы (по 0,1 мл) субстратной и нормальной разведенной плазмы с последующим определением протромбинового времени этой смеси; строят калибровочную кривую на основе данных, полученных при определении протромбинового времени всех приготовленных разведений нормальной плазмы определяют протромбиновое время при смешивании исследуемой (разведенной 1:10).плазмы с субстратной; содержание факторов УП и X (%) в исследуемой плазме устанавливают с помощью калибровочной кривой.

В качестве активатора свертывания используют змеиный яд 2 .

К недостаткам известного способа откосится то, что фильтрование плазмы через асбест с целью удаления фактора X попутно приводит и к удалению УП; условия фильтрования приводят к нарушенто нативных свойств использование в качестве активатора вертывания змеиного яда заметно ограничивает доступность способа и обуславивает его дороговизну; отсутствие в субтратной плазме фактора УП и нарушение ативньк свойств плазмы при фильтроании через асбест снижает качество определений.

Цель изобретения - повышение сохранности нативных свойств плазмы, а также удешевление способа.

Поставленная цель достигается тем, что, согласно способу количественного определения фактора X в плазме крови, включакнцему получение субстратной плазмы, смешивание ее с нормальной разведенной плазмой, внесение в полученную смесь активатора свертывания и определение протромбинового времени смеси, получение субстратной-плазмы осуществляют путем внесения в цитратную смешанную человеческую плазму слабоосновного анионообменного декстранового геля, содержащего диэтиламиноэтильные функциональные группы с преимущественным ионным обменом для белков с мол. мае. ЗОООО- ООООО цальгон при ионной силе 0,25М, осаждение геля осуществляют отстаиванием, далее отбирают надосадочную субстратную плазму, а в качестве активатора свертывания используют тромбопластин-кальциевую

смесь.

Пример 1 . К 50 мл нормальной смешанной цитратной плазмы чело- века (по 1 мл от донора) добавляют 5,0 мл 0 0,36 М раствора хлорида натрия. В полученную смесь вносят 5,0 мл геля ДЭАЭ-сефадекса А 5О, предварительно набухшего в 0,25 М растворе хлорида натрия. После осторожного помешивания 5 в течение 0,5 ч и осаждения гранул

геля пипеткой отбирают плазму. Полученная плазма при рекальцифицировании не свертывалась в течение 1 ч. Эту плазму используюг в качестве субстратной. 0 ОД мл нормальной смешанной человеческой плазмы, а таЮке разведенную плазму (1:1, 1:2, 1:4 и 1:8), смешивают с 0,1 мл субстратной плазмы. После инкубации на водяной бане при 5 (15 с) определяют тромбопластиновое время смеси. Для разных разведений . плазмы оно йледукнцее, с: Цельная + 0,1 мл субстратной

плазмы127+4Д

Разведенная 1:1-Ю,1 мл -- 166+5,4 1:2+0,1 мл -- 213+7,6 1:4+О,1 мл -- 285+10,6 1:8+О,1 мл -- 349+12,3 На основании приведенньсх. данных строят калибровочную кривую (график зависимости содержания фактора X в смешанной нормальной плазме от времени свертывания субстратной плазмь). За 1ОО% принято время свертывания, установленное при смешивании цельной нормальной плазмь с равным количеством субстрат Hoft.

Пример 2 . К 25 мл нормальной смешанной цитратной плазмы человека добавляют 25 мл 0,36 М раствора хлорида натрия (для достижения в плазме итогового значения ионной силы 0,2.5лл В полученную смесь вносят 25 мл геля ДЭАЭ - сефадекса А 50, предварительно набухшего в 0,25 М растворе хлорида натрия. Смесь осторожно помешивают . в течение 0,5 ч, после чего дают осест гранулам сефадекса Надосадочную плазму отбирают пипеткой и используют в качестве субстратной (лишенной фактора X). Полученная плазма при рекальцификации не свертывалась в течение 60 мин Внесение извне гомогенного препарата фактора X сокрашает время свертывания при рекальцификации до 33-35 с, что свидетельствует об отсутствии в полученной плазме фактора X. В качестве контроля для построения калибровочной кривой используют смешанную человеческую плазму, разведенную О,14 М раствором хлорида (разведения: цельная, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 ). В пробирку, установленную на водяной бане, при вносят 0,1 мл субстратной плазмы и 0,1- мл нормальной смешанной плазмы. После инкубации (15 с) вносят в йробирку тромбоплас- тин-кальциевую смесь и фиксируют время свертывания. В полулогарифмическом масштабе построят кривую разведения по зависимости тромбопластинЬвого времени от разведений нормальной стандартной , Время свертывания неразведенной плазмы принимают за 10 Пользуясь этой кривой, определяют содержание фактора X в исследуемых образцах плазмы.

При использовании предлагаемого способа для определения содержания фактора X в плазме здоровых людей (5О доноров) обнаружены индивидуальные колебания .от 87 до 105%.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет уменьшить время свертывания плазмы с 168 до 125 с, что свидетельствует о большей чувствительности приготовленной по предлагаемому способу плазм к действию фактора X; при размораживании субстратной плазмы уменьшить время свертывания ее в присутствии фактора X и тромбопластин-кальциевой смеси с 206-235 до 134-143 с, что указывает на высокую сохранность .на- тивных свойств плазмы, и снизить стоимость одного определения в 3;5 раза.

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПгаДЕЛЕНИЯ ФАКТОРА X В ПЛАЗМЕ КРСЖИ, включающий получение субстратной плазмы, смешивание ее с нормальной разведенной плазмой, внесение е полученную смесь активатора сверьтывания и опреаелевие протромбинового времени смеси, отлвчаюши и с я тем, что, с целью повышения сохранности нативных свсЛств плазмы, а также удешевления способа, получение субстратной плазмы осуществляют путем внесения в питратную смешанную челове- чёскую плазму слабоосновного анионообменного декстранового геля, содержаще- 1Х диэГиламиноэтипьные функциональные группы с преимушестванным ионным обменом для белков с мол. мае. ЗОООО20ОООО дальтон при ионной силе О,25М осаждение геля осуществляют отстаива кием, далее отбирают надосадочную субстратную плазму, а в качестве актива(Л тора свертывания используют тромбопластинкалыхиевую смесь.